CN1933852A - 改进的失活的fcv疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及改进的失活的猫杯状病毒(FCV)疫苗。本发明还提供了产生稳定化的失活的FCV的方法，和这种稳定化的失活FCV在生产FCV免疫原性组合物中的用途。本发明还提供了使用根据本发明的免疫原性组合物在猫科动物，优选猫中诱导免疫应答的方法。

Description

改进的失活的FCV疫苗

相关申请的相互参照

本申请要求2004年1月21日申请的美国临时专利申请序号60/573,849的优先权。

本申请和本申请中引用的每个文件(“申请引用的文件”)，和在那些申请的文本中或者那些申请的审查期间在申请引用的文件中参考或者引用的每个文件，以及支持该审查期间提出的支持可专利性的所有论据，都在此引入本文作为参考。在该正文中还引用了多种文件(“申请引用的文件”)。每个申请引用的文件，和申请引用的文件中引用或者参考的每个文件都完整引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及改进的失活且稳定化的猫杯状病毒(FCV)免疫原性组合物。本发明还提供了产生失活且稳定化的FCV的方法，和此类失活且稳定化的FCV用于生产FCV免疫原性组合物的用途。本发明还提供了使用根据本发明的免疫原性组合物在猫科(Felidae)动物，优选猫中诱导免疫应答的方法。

发明背景

1957年首次描述了猫杯状病毒(FCV)(Fastier，L.B.(1957)Am.J.Vet.Res.18：382-389)。FCV影响许多猫科动物，高达15到20％的临床上健康的家猫携带FCV(Coutts等人(1994)Vet.Rec.135：555-556；Ellis，T.M.(1981)Australian Vet.J.57：115-118；Harbour等人(1991)Vet.Rec.128：77-80；Reubel等人，(1992)Feline Dentistry 22：1347-1360)。杯状病毒通常与另一种上呼吸道感染如猫疱疹病毒(FHV)、鼻气管炎病毒或者衣原体病在家猫和野生猫科动物中发生。FCV水平传染并且还没有证据表明存在有在妊娠期间从母亲传播到它的小猫的垂直传染(Johnson，R.P.(1984)Res.Vet.Sci.31：114-119)。FCV传染主要通过受感染的动物和健康动物之间的接触，或者在打喷嚏时通过气道进行(Wardley R C.(1976)Arch.Virol 52：243-249)。FCV对许多消毒剂有相当的抗性，从而当不存在直接接触时也会扩散。

通常已知FCV导致的疾病的特征是结膜炎、鼻炎、气管炎、肺炎和口腔上皮的起泡(vesicularization)/溃疡。其他症状包括发热、厌食、昏睡、步态僵硬和有时产生鼻和眼排出物。FCV通常影响咽喉，有时影响肺；它还可以感染肠并且已经从粪便分离。最初的体温过高期后，这些呼吸***疾病通常跟随着口腔溃疡(腭、舌、唇和鼻)、鼻炎、结膜炎、和可能地厌食和无力。FCV还可以引起肺炎、肠炎和关节痛(跛行综合征)。死亡率很高并且康复后处于长期带病毒状态。FCV导致的疾病症状的类型取决于FCV毒株；某些毒株将很少产生或者不产生疾病，而其他更具毒性的毒株导致发热、厌食、抑郁或者肺炎。一种特定毒株可以在爪上和口中引起溃疡。

杯状病毒科的猫杯状病毒是无包膜病毒，其包含单链的正义RNA基因组，该基因组为多腺苷酸化的并且大小为约7.7千碱基(Radford等人(1997)Proc.1^st Int.Symp.Caliciviruses ESVV 93-99)。FCV衣壳由单独的主要的66kDa(千道尔顿)的衣壳蛋白即p66蛋白组成。Clarke和Lambden(1997)J.Gen.Viro1.8：291-301综述了杯状病毒的分子生物学。像许多RNA病毒一样，在FCV的病毒群体内存在大的异质性。在20世纪70年代开始的通过交叉血清中和实验所阐明的抗原性变异使得可以将FCV分类成几种病毒毒株或者准种(Radford等人(1997)Proc.1^st Int.Symp.Caliciviruses ESVV 93-99)。已经鉴定并分离了一些FCV毒株，尤其毒株F9(保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号VR-782)、毒株2280(ATCC VR-2057)、毒株KCD(ATCC VR-651)、毒株CFI(ATCC VR-654)、毒株FCV-LLK和毒株FCV-M8。

由于从FCV感染康复后的长期带病毒状态，以及FCV对消毒剂的抗性，FCV具有高度传染性并且容易扩散，尤其在很接近的动物群体中，例如，在动物避难所或者兽医诊所中。因此，本领域中存在并且保持对有效FCV疫苗的强烈需求。

针对FCV的接种在20世纪70年代引入，其使用减毒的FCV毒株，主要是1958年由Bittle分离的毒株F9(Bittle等人(1960)Am.J.Vet.Res.21：547-550)或者从F9通过体外或者体内传代得到的毒株(“类F9(F9-like)”)。

也可以得到基于失活的FCY毒株的疫苗。这些疫苗主要使用毒株255和2280，它们分别在美国于1970在患有肺炎的猫中(Kahn和Gillepsie，(1970)Cornell Vet.60：669-683；Povey等人(1980)J.Am.Vet.Med.Assoc.177：347-350)和于1983年在跛行的猫中(Pedersen等人(1983)Fel.Prac.13：26-35；Pedersen N.C.和Hawkins K.F.(1995)Vet Microbiol.47：141-156)分离。

因为随着时间的抗原性转变，对于在20世纪60年代和20世纪70年代分离的疫苗毒株，如毒株F9、255或者2280产生的抗血清仅中和20世纪90年代分离的毒株的很少的分离物。例如，抗-F9血清中和43％的1990-1996期间的美国分离物，然而却中和56％的1980-89期间的分离物和86％的1958-79期间的分离物，仅中和10％的1990-96期间的英国分离物(Lauritzen等人(1997)Vet.Microbiol.56：55-63)。因此，来自老的FCV毒株的减毒和失活的疫苗不再提供对当前分离的FCV毒株的足够保护。

美国专利号6,534,066描述了新的FCV毒株用于生产FCV疫苗的用途。在这些毒株中，FCV毒株431(保藏在CNMC，保藏号I-2166)是一种分离物，该分离物的抗血清显示出能中和许多异源野外分离物。这与历史上的疫苗毒株(如F9和FCV-255)相反，历史上的疫苗毒株的抗血清中和非常有限数目的最近的野外FCV分离物。

多数商业FCV疫苗是减毒的疫苗。仅可以得到很少的失活疫苗，所有这些疫苗都含有佐剂。Povey和同事(Povey等人(1978)FelinePractice 8(3)：35-42)描述了用于小猫的***失活的并含有佐剂的FCV制剂。

当疫苗被失活时，通常通过化学处理，用诸如***或者甲醛、β-丙醇酸内酯、吖丙啶、二元吖丙啶的试剂，在热处理存在或者不存在下进行失活。例如，在美国专利号6,534,066中，将FCV通过吖丙啶失活并用水包油乳液作为佐剂。美国专利号6,355,246描述了从猫尿中分离的减毒的FCV疫苗。FCV的失活可以通过用甲醛或者二元吖丙啶(BEI)处理实现。值得注意地，美国专利号6,355,246没有涉及或者为技术人员提供失活FCV的方法。

迄今使用的抗FCV的失活的疫苗需要或者优选在疫苗或者免疫原性组合物中存在佐剂来提高免疫应答和诱导针对猫群体中出现的异源FCV毒株的更好的保护。然而，存在佐剂的疫苗比无佐剂的疫苗诱导更高比率的局部不良反应(Gobar等人，(2002)JAVMA 220(10)：1477-1482)，因此增加了注射部位与疫苗有关的纤维肉瘤的风险(Baker R.J.(1998)Feline Practice 26(5)：18-20)。

当前，无佐剂的FCV疫苗为经修饰的活疫苗，通常含有F9毒株。对接种后的杯状病毒病(calicivirosis)的一些研究已经阐明了FCVF9的残留毒性(Dawson等人，(1993)Vet.Rec.132：346-350)。尽管仅存在一种FCV血清型，但是已经观察到FCV分离物之间的高抗原性变异并且经常鉴定到新的野外分离物(Lauritzen等人，(1997)Vet.Microbiol.56：55-63)。该高抗原性变异通常导致基于F9疫苗的抗血清中和FCV的失败率增加。此外，FCV经修饰的活毒株与野外新的抗原性变体的出现有关(Radford等人，(1997)Vaccine 15(12/13)：1451-1458)。因此，这些经修饰的活疫苗的安全性是有问题的。

因此，本领域中仍然需要有效的、失活的、无佐剂的FCV疫苗或者免疫原性组合物，其具有提高的安全性并且能够诱导针对异源FCV毒株的强烈的免疫应答。

发明概述

以前的失活FCV疫苗或者免疫原性组合物通常包含FCV病毒体和病毒衣壳降解产生的蛋白质级分的混合物。本发明人已经发现，对于无佐剂的疫苗或者免疫原性组合物，必需限制病毒衣壳的降解和尽可能保持完整的病毒体。

已经令人惊奇地发现，将FCV用失活病毒的失活试剂处理并用可以稳定病毒体的甲醛处理，可以得到失活的FCV组合物，其甚至在缺乏任何佐剂时也具有良好功效。不希望被任何具体理论束缚，认为甲醛的存在稳定了病毒衣壳。病毒衣壳的稳定性增加导致在长期贮存期间和施用于动物之前FCV疫苗或者免疫原性组合物的稳定性增强。类似地作用以稳定病毒衣壳的其他化合物可以代替甲醛使用。

本发明的第一方面提供了针对猫杯状病毒(FCV)的失活的、稳定的、无佐剂的免疫原性组合物，其包含通过一种或多种失活试剂失活并且通过醛化合物稳定的FCV，其中该醛化合物包含线性C1-C5烷基链，并且其中免疫原性组合物与可接受的载体或者赋形剂混合。

优选地，所述赋形剂或者载体是兽医学上可接受的。在另一实施方案中，免疫原性组合物是冷冻干燥的并且与冻干赋形剂或者载体混合。

优选的失活试剂可以选自吖丙啶、乙酰基吖丙啶、2-甲基吖丙啶和β-丙醇酸内酯。优选地，失活试剂是吖丙啶。

当吖丙啶用作失活试剂时，吖丙啶以约0.5mM到约20mM，优选约1mM到约10mM的浓度存在。

当醛化合物包含线性C1烷基链时，该醛化合物包含一个醛基。当醛化合物包含线性C2-C5烷基链时，该醛化合物包含两个醛基。在备选实施方案中，两个醛基之一可以被酮基或者环氧基替代。醛化合物可以选自甲醛、缩水甘油醛、戊二醛、乙二醛或者甲基乙二醛。当醛化合物是甲醛时，甲醛以约0.05g/l到约0.8g/l存在。优选地，甲醛以约0.1g/l到约0.5g/l存在。

另一实施方案还包含含有巯基的中和化合物(例如，硫代硫酸盐和半胱氨酸)。本发明还包含至少一种FCV毒株，其中失活并稳定至少一种或者所有FCV毒株。FCV毒株可以选自FCV F9、FCV 255、FCV2280、FCV 431、FCV G1、FCV LLK、FCV KCD、FCV CFI、FCV M8和FCV US 100869(ATCC保藏号FCV PTA 5930)。

在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含来自猫类病原体的至少一种非FCV免疫原，所述猫类病原体可以选自猫疱疹病毒(FHV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒和衣原体。优选地，来自猫类病原体的至少一种非FCV免疫原包含活的减毒的微生物或者表达来自猫类病原体的至少一种非FCV免疫原的重组载体。

本发明的第二方面提供了失活和稳定FCV的方法，其包括步骤：将FCV与失活试剂和醛化合物反应，其中醛化合物包含线性C1-C5烷基链，并且回收失活并稳定的FCV。优选的实施方案通过大小排阻层析、超速离心和选择性沉淀回收失活并稳定的FCV。

在本发明的另一方面，提供了生产用于长期贮存的针对FCV的失活的、稳定的、无佐剂的免疫原性组合物的方法，其包括将本发明的失活并稳定的FCV以足够诱导对FCV的免疫应答的量与冻干赋形剂混合，并冷冻该组合物。

另外一方面提供了生产针对FCV的失活的、稳定的、无佐剂的免疫原性组合物的方法，其包括将本发明的失活并稳定的FCV以足够诱导对FCV的免疫应答的量与兽医学上可接受的赋形剂或者载体混合。

本发明还提供了在猫科动物中诱导针对FCV的免疫应答的方法，其包括对猫科动物施用本发明的失活的、稳定的、无佐剂的免疫原性组合物，从而在猫科动物中诱导免疫应答。

本发明的另一方面提供了在猫科动物中诱导针对FCV和来自猫类病原体的至少一种非FCV免疫原的免疫应答的方法，其包括对猫科动物施用本发明的失活的、稳定的、无佐剂的免疫原性组合物，和来自另一种猫类病原体的至少一种非FCV免疫原，从而在猫科动物中诱导免疫应答。

这些和其他实施方案公开在下面的发明详述中或者根据发明详述是显然的并且被发明详述所包括。

附图简述

下面的发明详述作为实例给出，并且不意在将本发明限制于所描述的特定实施方案，结合附图可以理解发明详述，附图中：

图1显示了在所施用的每种类型的组合物攻击后两周内总临床得分的平均值(根据实施例3)。

图2显示了在所施用的每种类型的组合物攻击后两周内对猫观察的最大临床得分的平均值(根据实施例3)。

图3显示了每组和每天平均抗-FCV255中和抗体滴度(表示为log₁₀)(根据实施例4)。

图4显示了每组的总体得分(根据实施例4)。

图5显示了每组和每天平均攻击后FCV分泌，表示为log₁₀CCID₅₀/ml(根据实施例4)。

发明详述

注意到在本公开内容中，特别在权利要求中，术语如“包含”等等可以具有其在美国专利法中所认为的含义，例如，它们可以表示“包括”，等等；并且术语如“基本上由…组成”具有美国专利法中所认为的含义，例如，其允许没有明显陈述的要素，但是排除在现有技术中发现的或者影响本发明的基本特征或者新颖特征的要素。

术语“免疫原性组合物”涵盖任意组合物，其一旦在本发明的条件下施用于靶物种，就能够诱导针对FCV的免疫应答。术语“疫苗”意在表示能够诱导有效保护的组合物。靶物种为猫科动物，优选猫。

本发明涉及失活的、稳定的、无佐剂的FCV免疫原性组合物或者疫苗，其包含受到失活试剂或者稳定化醛化合物的处理的FCV。优选的一组稳定化化合物是具有线性烷基C1-C5链的醛，当链是C1时，该醛包含一个醛基，当链是C2-C5时，该醛包含两个末端醛基，并且当链是C2-C5链时，任选地一个醛基可以被酮基或者环氧基替代，并且该免疫原性组合物或者疫苗与冻干赋形剂或者载体混合冻干，或者与兽医学上可接受的赋形剂或者载体混合。

“失活试剂”是能够通过不可逆反应阻断病毒繁殖的试剂，该不可逆反应主要是，但不限于与病毒核酸反应，其不实质性影响病毒的免疫原性性质。失活试剂的优选实例是吖丙啶和酰胺衍生物(例如，乙酰基吖丙啶)、2-甲基吖丙啶、β-丙醇酸内酯。在优选实施方案中，失活试剂是吖丙啶。

在优选实施方案中，通过吖丙啶失活FCV。吖丙啶的终浓度可以为约0.5mM到约20mM，优选约1mM到约10mM。温度可以为约2℃到约40℃，优选约5℃到约30℃。

优选的稳定化醛化合物与蛋白质的氨基(例如，赖氨酸、精氨酸或者组氨酸上的氨基)和羟基(例如，酪氨酸上的羟基)反应并且可以在两个蛋白质间和/或在一个蛋白质内形成键。稳定化醛化合物优选选自甲醛、缩水甘油醛(或者2，3-环氧-1-丙醛)、戊二醛(或者1，5-二醛-戊烷)、乙二醛(1，2-二醛-乙烷)、甲基乙二醛(或者丙酮醛)。在优选实施方案中，稳定化醛化合物是甲醛。

当甲醛用作稳定化醛时，终浓度可以为约0.05g/l到约0.8g/l，优选约0.075g/l到约0.6g/l，更优选约0.1g/l到约0.5g/l。温度可以为约2℃到约37℃，优选约2℃到约22℃，更优选约4℃到约7℃。

为了调节稳定化条件(温度、稳定化醛化合物的浓度和持续时间)，可以进行FCV病毒体的定量。可以使用定量病毒体的任何合适的技术，例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，使用对FCV衣壳蛋白特异的单克隆或者多克隆抗体。在ELISA定量前，可以用技术人员已知的技术从处理的病毒培养物中分离病毒体，所述技术例如为大小排阻层析、在蔗糖梯度上的超速离心、在氯化铯梯度上的超速离心、和选择性沉淀，例如，聚乙二醇(PEG)沉淀。

用于免疫原性组合物或者疫苗的FCV悬浮液优选含有失活前每剂约10^8.5到约10¹¹CCID₅₀，更优选失活前每剂约10⁹到约10¹⁰CCID₅₀。完成失活和/或稳定后，可以通过本领域技术人员已知的中和方法，例如，通过加入含有巯基的中和化合物(例如，硫代硫酸盐、半胱氨酸)可以从悬浮液中除去失活试剂和/或稳定化醛化合物。

可以通过本领域技术人员已知的技术从悬浮液中除去失活试剂和/或稳定化醛化合物，或者备选地，回收失活且稳定化的FCV，所述技术例如为大小排阻层析、在蔗糖梯度上的超速离心、在氯化铯梯度上的超速离心、和选择性沉淀，例如，聚乙二醇(PEG)沉淀。

病毒失活和稳定化后，可以在处理步骤中伴随地实现从悬浮液中回收病毒体，该处理步骤除去失活试剂和/或稳定化醛。在备选实施方案中，可以在分开的步骤中回收失活且稳定化的病毒体，该分离的步骤不与除去失活试剂和/或醛化合物的步骤相伴。该病毒体回收步骤可以通过本领域技术人员已知的技术实现，例如，大小排阻层析、在蔗糖梯度上的超速离心、在氯化铯梯度上的超速离心、和选择性沉淀，例如，聚乙二醇(PEG)沉淀。

根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含至少两种失活并且稳定化的FCV毒株的组合，或者至少两种FCV毒株的组合，其中至少一种FCV毒株被失活和稳定化。

优选地，FCV毒株选自最近从野外分离的FCV毒株。优选的毒株包括毒株431(保藏在CNCM，保藏号为I-2166)；或者与由保藏在CNCM、保藏号为I-2282的杂交瘤分泌的单克隆抗体44反应的任何毒株；见美国专利号6,534,066)，FCV G1(保藏在CNCM，保藏号为I-2167)(CNCM＝″国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale deCultures de Microorganismes)″，Pasteur Institute，Paris，France)，FCV US100869(也称作FCV PTA 5930；2004年4月22日保藏在ATCC)(ATCC＝″美国典型培养物保藏中心″，Manassas，Virginia，USA)，和更一般地在出版物中描述的任何新的高度毒性的株系(Pedersen等人(2000)Vet.Microbiol.73：281-300；Schorr-Evans等人(2003)JFMS 5：217-226；Hurley等人(2003)Vet.Clin.Small Anim.33：759-772)。在优选实施方案中，免疫原性组合物或者疫苗包含失活并稳定化的FCV 431(或者与单克隆抗体44反应的任何毒株)和失活且稳定化的FCV G1。在另一优选实施方案中，免疫原性组合物或者疫苗包含失活且稳定化的FCV US 100869(ATCC保藏号FCV PTA 5930)。可以用于或者加入本发明的其他FCV毒株包括，但不限于，FCV F9、FCV 255、FCV 2280、FCV LLK、FCV KCD、FCV CFI和FCV M8。

失活且稳定化的FCV免疫原性组合物或者疫苗可以容易地与用于其他猫类疾病的活的减毒或者失活的疫苗或者免疫原性组合物组合。因此，本发明的另一目标是无佐剂的组合的免疫原性组合物或者疫苗，其包含至少一种稳定化并且失活的FCV和至少一种用于在宿主中诱导针对至少一种其他猫类病原体的免疫应答的非FCV免疫原性组分，其中所述非FCV免疫原性组分可以是来自另一种猫类病原体的免疫原或者表达该免疫原的重组载体，其中无佐剂的组合的免疫原性组合物或者疫苗与冻干赋形剂或者载体混合冻干，或者与兽医学上可接受的载体或者赋形剂混合。优选冻干形式。

在优选实施方案中，无佐剂的组合的免疫原性组合物或者疫苗包含非FCV免疫原性组分，其为活的减毒微生物形式或者表达来自猫类病原体的至少一种免疫原的重组载体的形式。重组载体可以是质粒或者病毒载体；例如，该载体可以是痘病毒、腺病毒、或者疱疹病毒。优选冻干形式。

额外的非FCV猫类病原体优选选自猫鼻气管炎病毒或者猫疱疹病毒(FHV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒或者猫细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒和衣原体(例如，Chlamydophila felis)。

优选地，组合的免疫原性组合物或者疫苗除了非FCV免疫原性组分之外还组合至少一种FCV免疫原性组分，如：

-FHV、FPV、FeLV和衣原体

-FHV、FPV和FeLV

-FHV、FPV和狂犬病病毒

-FHV、FPV和衣原体

-FHV、FPV、衣原体和狂犬病病毒

-FHV和FPV

-FHV和衣原体

-FHV。

在这些多种组合的优选实施方案中，对于FHV、FPV和衣原体使用减毒的活微生物，对于FeLV使用表达FeLV基因的重组载体。重组载体可以是金丝雀痘病毒(例如，如美国专利号5,753,103中描述的vCP97)，其表达env和gag/pol FeLV基因。对于狂犬病病毒，可以使用重组载体，特别是表达G糖蛋白狂犬病病毒基因的金丝雀痘病毒(例如，美国专利号5.843.456中描述的vCP65)。

本发明的另一目标是失活并稳定FCV的方法，其包括将FCV与失活试剂和稳定化醛化合物反应，该稳定化醛化合物由线性烷基C1-C5链形成，当链为C1时，该醛包含一个醛基，当链为C2-C5时，该醛包含两个末端醛基，并且任选地，当链为C2-C5链时，一个醛基可以由酮基或者环氧基替代。失活试剂和稳定化醛化合物和它们的使用条件的优选实施方案如上述。

本发明的方法包括在适宜的宿主细胞中培养FCV，用失活试剂和稳定化醛化合物处理。FCV病毒的培养和繁殖优选用猫类细胞进行，更优选用Crandell-Reese猫肾或者CRFK细胞(可以从美国典型培养物保藏中心以保藏号CCL-94得到)进行，感染复数(MOI)为每个细胞2到0.01细胞培养感染剂量50％(CCID₅₀)，优选0.5CCID₅₀/细胞。

稳定化醛化合物的加入可以在失活步骤之前、期间或者之后进行。失活试剂和/或稳定化醛化合物的中和可以如前述进行。

稳定化的失活FCV病毒体可以通过常规浓缩技术，例如，通过超滤从悬浮液浓缩和/或回收，然后任选通过常规纯化方法纯化，所述纯化方法例如为大小排阻层析、在蔗糖梯度上的超速离心、在氯化铯梯度上的超速离心或选择性沉淀(例如，在聚乙二醇(PEG)存在下)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物或者疫苗包含冷冻干燥的稳定化且失活的FCV和冻干赋形剂或者载体，其可以包括氨基酸，例如谷氨酸，或者糖类，例如乳糖，和其混合物，例如SPGA(蔗糖/磷酸盐/谷氨酸盐/白蛋白；也参见欧洲专利申请序号0.496.135)。失活且稳定化的FCV可以在约5℃长期保存，或者备选地，根据技术人员已知的技术进行冷冻或者冷冻干燥(或者冻干)。

因此，为了生产本发明的免疫原性FCV组合物，FCV生长于在适宜的猫类细胞系(即，CRFK细胞)上的细胞培养物中，生长到足够产生足量病毒悬浮液以生产免疫原性组合物的滴度。根据本领域公知的方法收获FCV。杯状病毒然后可以浓缩，冷冻，并保存在-70℃，或者冷冻干燥并保存在4℃。

本发明的另一目标是生产免疫原性组合物或者疫苗的方法，其包括提供足够诱导免疫应答的量的失活且稳定化的FCV，并冷冻干燥所述FCV(可能加入冷冻干燥稳定剂)或者通过将所述FCV与兽医学上可接受的赋形剂或者载体混合作为液体形式。合适的赋形剂为例如，水、等渗溶液、盐水(如，但不限于，NaCl和磷酸缓冲盐水(PBS))、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、甘油、乙醇等等，和它们的组合。此外，如果希望，疫苗可以含有少量辅助物质，如，但不限于，湿润剂或者乳化剂，和pH缓冲剂。

根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂，但不是必需的。优选地，本发明的组合物包含失活并且稳定化的FCV，其甚至在缺乏佐剂时也具有免疫原性。然而，如果希望，本发明的组合物中可以包括可接受的佐剂。可接受的佐剂是水溶性佐剂。此类可接受的佐剂可以为丙烯酸或者甲基丙烯酸的聚合物，马来酸酐的聚合物和烯基衍生物的聚合物，免疫刺激序列(ISS)，尤其具有一个或多个非甲基化的CpG基序的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman D.M.等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：2879-2883；WO-A1-98/16247)，水包油乳液，尤其在M.Powell，M.Newman编著的″Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach″，PlenumPress 1995的147页中描述的SPT乳液，和该书183页上描述的MF59乳液，含有季铵盐、细胞因子或者它们的组合或者混合物的阳离子脂类。

本发明的另一目标是免疫猫科动物，优选猫，包括新生猫、小猫、雄猫、雌猫、和怀孕的雌猫，以抵抗FCV疾病的方法，该方法包括施用根据本发明的无佐剂的失活且稳定化的FCV免疫原性组合物或者疫苗。

本发明的另一目标是免疫猫科动物，优选猫，包括新生猫、小猫、雄猫、雌猫、和怀孕的雌猫，以抵抗包括FCV疾病的至少两种猫类疾病的方法，该方法包括施用无佐剂的组合疫苗，其包含根据本发明的失活且稳定化的FCV，和来自另一种猫类病原体的至少一种非FCV免疫原或者表达来自另一种猫类病原体的至少一种非FCV免疫原的重组载体。

不同的途径可以用于施用根据本发明的免疫原性组合物或者疫苗。这些途径包括，但不限于，肠胃外途径、口鼻的、肌内、皮内、皮下和粘膜(例如，经口)途径。优选的施用途径包括皮下或者肌内注射途径。可以通过任何工具施用疫苗或者免疫原性组合物，该工具包括但不限于，注射器、无针头注射装置。无针头注射器可以用于经皮递送(皮内和皮下和可能地肌内递送)。使用无针头注射***，通过递送FCV免疫原性组合物必需的体积确定剂量体积，并且剂量体积可以为0.1ml到1ml。

使用注射器，疫苗和免疫原性组合物的剂量体积通常为0.2到2.0ml，优选约1.0ml。猫可以从约6周龄时接种。可以进行两次或者更多次施用，例如，相隔3-5周。优选地，可以例如每年进行加强施用。备选地，可以用仅1次注射使猫接触抗原。

将通过下面的非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：通过甲醛失活FCV

CRFK细胞(Crandell-Reese猫肾细胞，可以从美国典型培养物保藏中心以CCL-94得到)在37℃下培养在2升的滚瓶(850cm²)中，使用改良的Eagle培养基(MEM，Gibco BRL)，其补加2.5％乳清蛋白水解产物和5％胎牛血清。每个滚瓶加入300毫升MEM培养基中的细胞悬浮液，其含有约100,000个细胞/ml。3天后，细胞层变得汇合。然后将细胞培养基用无血清的MEM替换，并以0.5CCID₅₀/细胞的感染复数(MOI)加入毒株431 FCV病毒。病毒培养物在37℃下保持24到48小时，直到对整个细胞层得到了致细胞病变效应。收获病毒悬浮液，然后在具有1.5μm的孔隙率的滤器上澄清并保存在5℃。收获时FCV病毒滴度为8.5+/-0.3log₁₀ CCID₅₀/ml。

将病毒悬浮液用浓度为8mM的吖丙啶在22℃失活18小时。通过将36g氢氧化钠小片溶解在257.5ml蒸馏水中并加入87.5g溴乙胺(BEA)来制备吖丙啶，对应于约1.2M吖丙啶溶液。在失活结束时，通过加入终浓度为0.5g/l的甲醛并在5℃(+/-3℃)保持24小时来稳定部分的失活的病毒悬浮液。部分的失活的病毒悬浮液保持不稳定化，作为对照悬浮液。

一部分的失活并稳定化的病毒悬浮液和一部分的对照悬浮液在聚乙二醇(PEG)存在下进行选择性沉淀。以6％的浓度向悬浮液加入PEG6000，在5℃(+/-3℃)搅拌3小时。然后以约1330g离心悬浮液90分钟。分离并回收含有可溶性p66蛋白质的上清液和含有病毒体的沉淀物。将沉淀物溶解在不含钙和镁的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。

失活步骤结束后2到3天，通过ELISA滴定来定量失活且稳定化的病毒悬浮液、对照悬浮液、上清液和溶液中的沉淀物之中的FCV p66蛋白质。将抗-FCV多克隆抗体包被在滴定板上，加入不同稀释度的失活且稳定化的病毒悬浮液、对照悬浮液、上清液和沉淀物溶液，进行ELISA滴定。滴定板在37℃保持3小时，然后用洗涤缓冲液洗涤滴定板，随后加入偶联过氧化物酶的对FCV p66衣壳蛋白特异的单克隆抗体。滴定板在37℃进一步温育1小时，之后用洗涤缓冲液洗涤滴定板。于20℃向经洗涤的滴定板加入100μl TMB溶液(5，5’-四甲基联苯胺)，黑暗中在20℃保持30分钟。通过每孔加入50μl 2M硫酸阻断颜色形成。通过光学测量ELISA滴度并表示为log₁₀OD₅₀(光密度50％)，其对应于给出50％最大光密度的稀释度的以10为底数的对数。ELISA滴度的标准差为0.07。

表1：失活后FCV病毒体的降解

	失活，不稳定化	失活，且稳定化
			不进行PEG沉淀的病毒悬浮液中的总p66蛋白质	2.81	2.36
上清液中的p66蛋白质(可溶性p66)	2.55	2.18
			沉淀物中的p66蛋白质(病毒体上的p66)	1.95	2.62

这些结果证明了不存在稳定化时的失活后FCV病毒体降解和甲醛的稳定作用。

实施例2：多种条件下甲醛对FCV的稳定效果

基本上如实施例1中描述的，培养FCV 431株系。

测试了三种失活方法：

1)约4mM浓度的吖丙啶在20℃下24小时，

2)约8mM浓度的吖丙啶在20℃下24小时，

3)约8mM浓度的吖丙啶在5℃下24小时。

通过0.1g/l到0.5g/l的多种终浓度的甲醛在5℃(+/-3℃)下稳定病毒悬浮液5天。对照悬浮液不含有甲醛。

选择性PEG沉淀之前和之后，如实施例1中描述的，通过ELISA滴定法定量FCV p66蛋白质。ELISA滴度表示为log₁₀OD₅₀。

表2：FCV p66蛋白质的ELISA滴度

甲醛，5天，5℃	吖丙啶
										4mM，20℃，24h			8mM，20℃，24h			8mM，5℃，24h
	总蛋白质	可溶性p66	病毒体上的p66	总蛋白质	可溶性p66	病毒体上的p66	总蛋白质	可溶性p66	病毒体上的p66
										0.5g/l	2.15	1.53	1.56	1.96	1.37	1.09	2.11	1.42	1.38
0.1g/l	2.38	1.88	1.56	2.24	1.87	0.98	2.27	1.72	1.35
										0g/l	2.41	1.86	1.34	2.14	1.85	0.82	2.3	1.76	1.14

这些结果证明了0.1g/l和0.5g/l甲醛溶液在多种失活条件下的稳定效果。

实施例3：失活的FCV病毒体的免疫原性

基本上如实施例1中描述的，培养、失活和稳定FCV 431毒株。通过大小排阻层析将该病毒悬浮液分离成两种级分，其分别含有病毒体(也称作病毒p66级分)和可溶性p66蛋白质(也称作可溶性p66级分)。分离后，两种级分保存在5℃。

制备共12种疫苗，其含有稀释或者未稀释(1/1、1/4和1/16)并用1ml PBS(磷酸缓冲盐水；没有钙并且没有镁)配制的1ml病毒p66级分；稀释或者未稀释(1/1、1/4和1/16)并用1ml水包油乳液(石蜡油，脂肪醇醚和多元醇，聚氧乙烯脂肪酸)配制的1ml病毒p66级分；稀释或者未稀释(1/1、1/4和1/16)并用PBS配制的1ml可溶性p66级分；稀释或者未稀释(1/1、1/4和1/16)并用水包油乳液配制的1ml可溶性p66级分。

未稀释的疫苗含有约对应于10ml粗制病毒培养物的蛋白质量。通过加入无钙和镁的PBS稀释病毒p66级分和可溶性p66级分。

将24只无特定病原体的(SPF)小猫(每只约8-9周龄)随机分成12组并用2ml这些疫苗皮下施用两次，这两次相隔28天。没有观察到与p66蛋白质的注射量相关的效应。下面的结果反映自在第46天用FCV 431毒性株系经口鼻途径攻击的所有猫(每只鼻孔0.25ml，和0.5ml经口，10^5.5CCID₅₀/ml)。

在攻击后2周观察到临床病征。用于计算临床得分的评分如下：

表3：接种的猫的临床得分

参数	观察	得分
			直肠温度	T°＜39.5℃	0
39.5℃≤T°＜40℃	1
		T°≥40℃		2
一般身体状况	正常				0
		抑郁	1
	口鼻溃疡			缺乏	0
直径＜5mm		1
			直径为5到10mm	2
直径＞10mm
			鼻炎	严重鼻排出物	1
粘液脓性的鼻排出物	2
		结膜炎		严重排出物	1
粘液脓性的排出物	2
			龈炎	存在	1
跛行	存在	1

总临床得分是在攻击后2周内于猫中观察到的所有临床病征的和。在下表和图1中显示了每种类型疫苗的总临床得分的平均值。

表4：每种类型疫苗的平均总临床得分

	病毒p66级分	可溶性p66级分
			PBS	17.17	29.33
乳液	16.17	20.83

最大临床得分是在攻击后2周内于对猫的观察中得到的最高临床得分。下表和图2中给出了每种类型疫苗的最大临床得分的平均值。

表5：每种类型疫苗的最大临床得分

	病毒p66级分	可溶性p66级分
			PBS	2.33	4.67
乳液	2.83	2.83

对于病毒p66级分/PBS和可溶性p66级分/PBS组所得最大临床得分的平均值之间存在显著差异(P-值，p＝0.0495)。

这些结果证明，不存在佐剂时，失活的病毒体保持免疫原性。相反，可溶性p66蛋白质仅在佐剂存在下诱导良好的免疫原性应答。

实施例4：用失活的FCV接种猫

培养FCV431，将其基本如实施例1描述的用吖丙啶失活并通过甲醛的作用稳定化。对FCV G1毒株应用相同的步骤。

组合疫苗(疫苗A)包含每剂5.60log₁₀ CCID₅₀的减毒的猫鼻气管炎病毒(FHV-1)、每剂4.17log₁₀ CCID₅₀的减毒的猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、每剂8.29log₁₀ CCID₅₀的金丝雀痘vCP97重组载体(表达env和gag/pol FeLV基因)(见US-A-5.753.103)、每剂4.8log₁₀ ELD₅₀的减毒的衣原体、每剂8.7log₁₀ CCID₅₀的失活且稳定化的FCV 431(失活前FCV的等价滴度)、每剂8.7log₁₀ CCID₅₀的失活且稳定化的FCVG1(失活前FCV的等价滴度)和生理水。

8到9周龄的18只无特定病原体的小猫随机分成3组(每组6只)。组A的小猫用一剂疫苗A接种。组B的小猫用含有冻干形式的经修饰的活的FCV F9毒株、经修饰的活的FHV-1和经修饰的活的FPV的商业疫苗与含有失活的FeLV和Carbopol佐剂的商业疫苗的混合物接种，该含有失活的FeLV和Carbopol佐剂的商业疫苗作为冻干的商业疫苗的稀释剂。组C的小猫保持不接种，作为对照。通过皮下途径施用疫苗两次，相隔28天。最后一次接种后4周，所有猫都通过口鼻途径用FCV 255毒性异源株系(Scott FW.Am.J.Vet.Res.1977.38(2).229-34)攻击(0.25ml/鼻孔和0.5ml经口，10^8.2CCID₅₀/ml)。

在攻击后2周内观察抗-FCV255中和抗体、动物体重、直肠温度、一般状况、全身和局部症状和病毒分泌。在下表和图3中给出杯状病毒抗体滴度(表示为log10)。

表6：根据组的抗体滴度

	D0	D28	D56	D70
					组A	0.20	0.20	1.13	2.23
组B	0.20	0.62	1.28	2.43
					组C	0.20	0.20	0.20	2.83

在第0天，抗体滴度在所有组中都为阴性。

注射一次疫苗后，除了组B中，接种的猫都没有发生血清转化。第二次注射后，所有猫都具有中和抗体滴度。攻击时(D56)的平均抗体滴度在接种组之间无差异(Tukey检验)但是显著高于对照组

(ANOVA，p＝0.0002)。

用于总体得分计算的评分如下：

表7：接种的猫的总体临床得分

参数	观察	得分
			直肠温度	T°≥39.5℃	1
T°≤37℃	2
		一般身体状况*		抑郁	2
死亡	10
			口鼻溃疡*	小并且数目很少	1
大且很多
		鼻排出物*		轻微	1
大量	2
			眼排出物*	存在	1
体重	体重减轻	2

*一般身体状况、口鼻溃疡、鼻排出物和眼排出物的得分之和代表了图4中所示的临床症状得分。

临床得分结果在下表和图4中给出。

表8：接种的猫的临床得分

	组A	组B	组C
				直肠温度	2	1	3
体重减轻	18	20	22
				临床症状	4	43	116

除了一只外，所有对照猫都表现出典型的FCV感染临床症状。用Tukey检验进行成对比较表明组A是唯一与对照组显著不同的接种组。

收集咽部拭子并测试病毒分泌。FCV分泌结果(表示为log10CCID₅₀/ml)在下表和图5中给出。

表9：接种的猫中FCV的分泌水平

	D56	D58	D60	D62	D64	D67	D70
								组A	1.20	2.20	2.28	1.62	1.70	1.45	1.70
组B	1.20	1.95	1.37	1.45	1.53	1.28	1.37
								组C	1.28	3.12	3.20	3.45	2.87	2.20	1.62

攻击后，在所有组中都观察到病毒分泌，但是与对照组相比，在接种组中病毒分泌减少(ANOVA，p＜0.00001)。接种组之间没有差异(Tukey检验)。

两种疫苗都通过强有力地减轻临床症状和病毒分泌来保护猫抵抗异源FCV 255攻击。本发明的疫苗的保护水平至少与商业的经修饰的活F9疫苗一样好。这表明使用失活且稳定化的FCV疫苗，在缺乏佐剂的情况下可以得到抗FCV的有效接种，并且保护水平至少与用商业的活疫苗得到的水平一样好。

还证明了失活且稳定化的FCV431/G1和其他疫苗组分(猫鼻气管炎病毒、猫传染性全白细胞减少病毒、猫白血病病毒和衣原体)之间的体内相容性。

从而已经详细描述了本发明的优选实施方案，将理解通过所附权利要求限定的本发明不受到上面描述中给出的特定细节的限制，因为其许多不背离本发明的精神或范围的显然的变通方案是可能的。

Claims (40)

1.针对猫杯状病毒(FCV)的失活的、稳定化的、无佐剂的免疫原性组合物，其包含通过一种或多种失活试剂失活并通过醛化合物稳定的FCV，其中该醛化合物包含线性C1-C5烷基链，并且其中免疫原性组合物与可接受的赋形剂或者载体混合。

2.权利要求1的组合物，其中所述赋形剂或者载体是兽医学上可接受的。

3.权利要求1的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的并且与冻干赋形剂或者载体混合。

4.权利要求1的组合物，其中所述失活试剂选自吖丙啶、乙酰基吖丙啶、2-甲基吖丙啶和β-丙醇酸内酯。

5.权利要求4的组合物，其中所述失活试剂是β-丙醇酸内酯。

6.权利要求4的组合物，其中所述失活试剂是吖丙啶并且吖丙啶以约0.5mM到约20mM存在。

7.权利要求4的组合物，其中所述失活试剂是吖丙啶并且吖丙啶以约1mM到约10mM存在。

8.权利要求1的组合物，其中所述醛化合物包含线性C1烷基链并且其中该醛化合物包含一个醛基。

9.权利要求1的组合物，其中所述醛化合物包含线性C2-C5烷基链并且其中该醛化合物包含两个醛基。

10.权利要求9的组合物，其中所述两个醛基之一被酮基或者环氧基替代。

11.权利要求1的组合物，其中所述醛化合物选自甲醛、缩水甘油醛、戊二醛、乙二醛或者甲基乙二醛。

12.权利要求11的组合物，其中所述醛化合物是甲醛并且甲醛以约0.05g/l到约0.8g/l存在。

13.权利要求11的组合物，其中所述醛化合物是甲醛并且甲醛以约0.1g/l到约0.5g/l存在。

14.权利要求1的组合物，其还包含中和化合物，其中该中和化合物包含硫代硫酸盐和半胱氨酸。

15.权利要求1的组合物，其还包含至少一种额外FCV毒株，其中至少一种或者两种FCV毒株被失活和稳定化。

16.权利要求15的组合物，其中所述至少一种额外FCV毒株选自FCV US 100869(FCV PTA 5930)、FCV F9、FCV 255、FCV 2280、FCV431、FCV G1、FCV LLK、FCV KCD、FCV CFI和FCV M8。

17.权利要求1的组合物，其还包含至少一种来自猫类病原体的非FCV免疫原。

18.权利要求17的组合物，其中猫类病原体选自猫疱疹病毒(FHV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒和猫衣原体。

19.权利要求17的组合物，其中来自猫类病原体的至少一种非FCV免疫原包含活的减毒的微生物或者表达来自猫类病原体的至少一种免疫原的重组载体。

20.失活并稳定FCV的方法，其包括步骤：将FCV与失活试剂和醛化合物反应，其中该醛化合物包含线性C1-C5烷基链，并回收失活并稳定化的FCV。

21.权利要求20的方法，其中失活试剂选自吖丙啶、乙酰基吖丙啶、2-甲基吖丙啶和β-丙醇酸内酯。

22.权利要求21的方法，其中失活试剂是β-丙醇酸内酯。

23.权利要求21的方法，其中所述失活试剂是吖丙啶并且吖丙啶以约0.5mM到约20mM存在。

24.权利要求21的方法，其中所述失活试剂是吖丙啶并且吖丙啶以约1mM到约10mM存在。

25.权利要求20的方法，其中所述醛化合物包含线性C1烷基链并且其中该醛化合物包含一个醛基。

26.权利要求20的方法，其中所述醛化合物包含线性C2-C5烷基链并且其中该醛化合物包含两个醛基。

27.权利要求26的方法，其中所述两个醛基之一被酮基或者环氧基替代。

28.权利要求20的方法，其中所述醛化合物选自甲醛、缩水甘油醛、戊二醛、乙二醛或者甲基乙二醛。

29.权利要求28的方法，其中所述醛化合物是甲醛并且甲醛以约0.05g/l到约0.8g/l存在。

30.权利要求28的方法，其中所述醛化合物是甲醛并且甲醛以约0.1g/l到约0.5g/l存在。

31.权利要求20的方法，其还包括将失活且稳定化的FCV与中和化合物反应，其中该中和化合物包含硫代硫酸盐和半胱氨酸。

32.权利要求20的方法，其中通过大小排阻层析、超速离心和选择性沉淀回收失活且稳定化的FCV。

33.权利要求20的方法，其还包括在冻干赋形剂中冷冻干燥失活且稳定化的FCV的步骤。

34.生产失活的、无佐剂的免疫原性组合物的方法，其包括将权利要求1的失活且稳定化的FCV以足够诱导对FCV的免疫应答的量与兽医学上可接受的赋形剂或者载体混合。

35.生产用于长期保存的失活的、无佐剂的免疫原性组合物的方法，其包括将权利要求1的失活且稳定化的FCV以足够诱导对FCV的免疫应答的量与冻干赋形剂混合并冷冻该组合物。

36.在猫科动物中诱导针对FCV的免疫应答的方法，其包括对猫科动物施用权利要求1的失活的、稳定化的、无佐剂的免疫原性组合物，从而诱导免疫应答。

37.在猫科动物中诱导针对FCV的免疫应答的方法，其包括对猫科动物施用权利要求17的失活的、稳定化的、无佐剂的免疫原性组合物，从而诱导免疫应答。

38.在猫科动物中诱导针对FCV和至少一种来自猫类病原体的非FCV免疫原的免疫应答的方法，其包括对猫科动物施用权利要求1的失活的、稳定化的、无佐剂的免疫原性组合物和至少一种来自另一种猫类病原体的非FCV免疫原，从而诱导免疫应答。

39.权利要求38的方法，其中所述至少一种额外猫类病原体选自猫疱疹病毒(FHV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒和猫衣原体。

40.权利要求38的方法，其中所述至少一种来自猫类病原体的非FCV免疫原包含活的减毒的微生物或者表达来自猫类病原体的至少一种免疫原的重组载体。

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