CN1922318A - 使用固相材料分离核酸的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用微流体装置和沉降试剂从样品，优选从生物样品，分离核酸的方法和试剂盒。
Description
发明背景
核酸(例如，DNA和RNA)从复合基质如血液、组织样品、细菌细胞培养基、和法医学样品的分离和纯化在遗传研究、核酸探针诊断学、法医学DNA检验、和需要核酸扩增的其它领域中是重要的方法。本领域中已知多种制备扩增过程用核酸的方法，然而，每一种方法都有各其局限性。
从全血分离DNA的最常用方法涉及使用密度梯度分离外周血单核细胞(PBMC)。虽然这种方法对于研究应用有效，但是其通常不适合用于常规的一体化高通量微流体装置。
包含非离子型清洁剂的低渗缓冲液可用于将红细胞(RBC)以及白细胞(WBC)裂解而保持细胞核完整无损。在另一种方法中，当全血经过冻融时，只有RBC裂解。完整无损的WBC或它们的核可以通过离心回收。对于将RBC裂解而不破坏WBC，还可以使用水性稀释物作为一种方法。用于RBC的选择性裂解的其它方法包括使用氯化铵或季铵盐，以及在低渗缓冲液的存在下使RBC经过低渗性休克。然而，在使用这些方法之一的常规方法中，抑制PCR的物质(如，酶抑制剂)与核和/或核酸共沉降。必需在常规的高通量微流体装置中进行分析之前除去这些抑制剂。
虽然例如煮沸、用蛋白酶类水解、暴露于超声波、清洁剂、或强碱下的处理已被用于DNA的提取，但是碱提取是最简单的方法之一。例如，美国专利5,620,852(Lin等人)描述了在短达1分钟的时间内在室温下用碱(如，NaOH)处理从全血有效提取DNA。然而，为了得到洁净的DNA，除去血红蛋白以及血浆蛋白是必要的。这已经通过使用短暂的水洗步骤实现，例如通过将血液悬浮在水中，随后进行离心，弃去上清液，然后用NaOH提取小球(pellet)(参见例如，Biotechniques，Vol.25，No.4(1998)，第588页)。用来裂解细胞的大量的水使得该方法不适合用于标准的微流体装置。
美国专利5,010,183(Kellogg等人)描述了使用碱裂解法从血液提取DNA的离心微流体基平台。该方法涉及将原始样品(如，5微升(μL)的全血或E.Coli悬浮液)与5μL的10毫摩(mM)NaOH混合，加热到95℃，维持1-2分钟以使细胞裂解，释放DNA和使蛋白质变性以抑制PCR，通过与5μL的16mM TRIS-HCl(pH 7.5)混合将裂解产物中和，将中和后的裂解产物与8-10μL的液体PCR试剂和引物混合，随后热循环。令人遗憾的是，虽然试剂量小并且适于微流体装置，但是微流体装置中DNA的下游处理仍是挑战。
另一个常规方法使用苯酚氯仿提取。然而，其需要使用有毒并具有腐蚀性的化学品，并且不容易实现自动化。
固相提取也被用于核酸分离。例如，从核酸来源分离核酸的一个方法涉及在反应容器中将二氧化硅粒子的悬浮液与经过缓冲的离液剂如硫氰酸胍混合，随后加入样品。在离液剂的存在下，核酸被吸附到二氧化硅上，通过离心使其从液相分离，用醇水混合物洗，最后使用稀的缓冲剂水溶液洗脱。二氧化硅固相提取需要使用醇洗涤步骤以除去残留的离液剂而不洗脱核酸；然而必需非常小心以除去所有痕量的醇(热蒸发或用另一种非常易挥发和易燃的溶剂洗)以防止抑制在随后步骤中用来对核酸进行扩增或改性的敏感性酶。然后用水或洗脱缓冲液洗脱核酸。这种结合、漂洗、和洗脱方法是许多市售试剂盒的原理，如Qiagen(Valencia，CA)；然而，这种方法非常麻烦并且包括多个洗涤步骤，使得其难以适用于微流体装置。
离子交换法产生高质量的核酸。然而，离子交换法导致高水平的盐的存在，必须在核酸可被进一步使用之前将其除去。
国际公开WO 01/37291 A1(MagNA Pure)描述了磁性玻璃粒子的应用和其中通过与包含离液盐和蛋白酶K的专用缓冲液培养而将样品裂解的分离方法。加入磁性玻璃粒子，包含在样品中的全部核酸结合于粒子的表面。通过若干洗涤步骤除去未结合的物质。最后，在高温下用低盐缓冲液洗脱，得到纯化的全部核酸。
还有另一个常规方法涉及将生物样品施用于疏水性有机聚合物固相上以选择性地截留核酸，和随后用非离子型表面活性剂除去被截留的核酸。另一个方法涉及用非离子型表面活性剂处理疏水性有机聚合物材料，洗涤表面，并且随后使经过处理的固体有机聚合物材料接触生物样品，以减少结合于有机聚合物固相上的核酸的量。虽然这些固相方法对于从生物样品分离核酸是有效的方法，但是仍然需要其它方法，特别是适合微流体装置的方法。
对前述公开和现有技术的讨论不构成对这些资料作为公开的、已知的或普通常识的一部分承认。
发明内容
本发明提供用于分离核酸、优选纯化和回收核酸的方法。
根据本发明分离的核酸可用于例如检测样品中具体核酸的存在的试验中。这种试验在疾病的预测和诊断、法医学、流行病学、和公共卫生中具有重要性。例如，分离的DNA可经过杂交和/或扩增，用于检测个体中传染性病毒或突变基因的存在，用于测定该个体患有传染性疾病或遗传学起源的疾病的概率。检测被筛选的数百或数千个样品中的一个样品中的传染性病毒或突变的能力对于处于疾病危险下的群体的早期诊断或流行病学有显著的重要性，例如，HIV感染、癌症、或对癌症的易感性的早期检测，或在新生儿的疾病普查中，其中早期检测可能有助于诊断和治疗。另外，本发明的方法还可以用于基础研究实验室，用于从培养的细胞或生物化学反应中分离核酸。核酸可用于酶促修饰如限制性内切酶消化、测序、和扩增。
本发明提供用于从包括核酸(如，DNA、RNA、PNA)的样品分离核酸的方法和试剂盒，所述核酸可包括在或不包括在含细胞核的细胞(如，白细胞)内。这些方法涉及从抑制剂如血红素(heme)及其降解产物(如，铁离子或其盐)最终分离核酸，抑制剂是不希望的，因为它们可以抑制扩增反应(如，在PCR反应中的情况)。
本发明的某些实施方案涉及将抑制剂保持在固相材料内或保持在固相材料上(即，使抑制剂附着于该材料)而不保持显著量的核酸。适当的固相材料通常包括具有与其连接的捕获部位(如，鳌合官能团)的任何形式(如，粒子、原纤维、膜形式)的固体基质、涂布到固相材料上的涂层试剂(优选表面活性剂)、或两者。
在一个实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含核酸的物质和抑制剂(通常包含在细胞中；所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；如果样品包括含抑制剂的细胞，则该方法包括任选地使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；形成样品(通常，为裂解样品)浓缩区；其中样品(通常，为裂解样品)浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；使样品(通常，为裂解样品)浓缩区与样品(通常，为裂解样品)次浓缩区基本上分离；使分离的样品(通常，为裂解样品)浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂(即，至少一种抑制剂的至少一部分)优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质用于释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞(所述含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同)的样品；使生物样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以及形成裂解样品的条件下接触非离子型表面活性剂；形成裂解样品浓缩区；其中样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；使裂解样品浓缩区与样品次浓缩区基本上分离；使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解细胞核用于释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和抑制剂(通常，包含在细胞中，所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；如果样品包括含抑制剂的细胞，则任选地将样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将样品(通常，为裂解样品)转移到有阀处理室；在有阀处理室中形成样品(通常，为裂解样品)浓缩区，其中样品(通常，为裂解样品)浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；使样品(通常，为裂解样品)浓缩区与次浓缩区基本上分离；将分离的样品(通常，为裂解样品)浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞(所述含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以及形成裂解样品的条件下接触非离子型表面活性剂；将裂解样品转移到有阀处理室；在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区，其中裂解样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；使裂解样品浓缩区与次浓缩区基本上分离；将分离的裂解样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解细胞核以释放核酸；和使至少一部分细胞核/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括核酸和抑制剂的样品；使样品接触固相材料使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使裂解样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地裂解如果存在的含核酸的物质以释放核酸；和通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含核酸的物质(如，细胞核)和抑制剂(通常，包含在细胞中，所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；如果样品包括含抑制剂的细胞，任选地使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；使样品(通常，为裂解样品)接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合(优选地，为表面活性剂)；在使裂解样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含核酸的物质(如，细胞核)和含抑制剂的细胞(所述细胞可相同或不同)的样品；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；使裂解样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合(优选地，为表面活性剂)；使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和抑制剂(通常，包含在细胞中；所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；如果样品包括含抑制剂的细胞，则任选地使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将样品(通常，为裂解样品)转移到分离室以接触固相材料并且使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；在使样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(它们可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将裂解样品转移到分离室以接触固相材料并且使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
本发明还提供用于实施本发明的各种方法的试剂盒。
定义
“核酸”应当具有本领域中已知的含义，并且是指DNA(如，基因组DNA、cDNA、或质粒DNA)、RNA(如，mRNA、tRNA、或rRNA)、和PNA。其可为多种形式，包括但不限于双股或单股结构、环状、质粒、相对短的寡核苷酸、肽核酸(也称为PNA)(如Nielsen等人，Chem.Soc.Rev.，26，73-78(1997)中所述的)，等等。核酸可为基因组DNA，其可包括完全染色体或染色体的一部分。DNA可以包括编码序列(如，用于编码mRNA、tRNA、和/或rRNA)和/或非编码序列(如，着丝粒、端粒、基因间区、基因内区、转位子、和/或微卫星序列)。核酸可包括任何天然存在的核苷酸以及进行人工或化学修饰的核苷酸、突变核苷酸等。核酸可包括非核酸组分，如肽(如在PNA中)、标记物(放射性同位素或荧光标识物)、等等。
“含核酸的物质”是指核酸的来源，如细胞(如，白细胞、去核的红细胞)、细胞核、或病毒、或包容含核酸的结构的任何其它组成(如，质粒、粘粒、或类病毒、古细菌)。细胞可为原核的(如，革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌)或真核的(如，血细胞或组织细胞)。如果含核酸的物质为病毒，其可包括RNA或DNA基因组；其可为致命的、减毒的、或非传染性的；并且其可感染原核或真核细胞。含核酸的物质可为天然存在的、经人工修饰的、或经人工产生的。
“分离的”是指已经从样品中的至少一部分抑制剂(即，至少一种抑制剂的至少一部分)分离出的核酸(或含核酸的物质)。这包括从其它材料如细胞组分如蛋白质、脂质、盐和其它抑制剂分离出所需的核酸。更优选地，分离的核酸为基本上纯化的。“基本上纯化的”是指分离至少3皮克/微升(pg/μL)，优选至少2纳克/微升(ng/μL)，更优选至少15ng/μL的核酸，同时使原始样品中抑制剂的量降低至少20％，优选降低至少80％，更优选降低至少99％。杂质通常是除了样品中的溶剂之外的细胞组分和细胞核组分，如血红素和相关产物(氯高铁血红素、正铁血红素)和金属离子、蛋白质、脂质、盐等。因此，术语“基本上纯化的”一般是指从样品分离出大部分抑制剂(如，血红素及其降解产物)，使得至少部分地除去能够妨碍分离的核酸的随后应用的化合物。
“附着于”或“附着”或“结合”是通过多种机制的可逆性滞留，所述机制包括较弱的力，如范德华相互作用、静电相互作用、亲合性结合、或物理截留。这个术语的使用并未暗示作用机制，并且包括吸附机制和吸收机制。
“固相材料”是指无机或有机材料，优选由重复单元制成的聚合物，重复单元可相同或不同，为有机和/或无机的、天然或合成来源的化合物。这包括均聚物和杂聚物(如，二元共聚物、三元共聚物、四元共聚物等，其可为例如无规或嵌段的)。这个术语包括纤维状或颗粒形式的聚合物，其可以通过本领域公知的方法容易地制备。这种材料通常形成多孔基质，虽然对于某些实施方案，固相还指固体表面，如聚合物材料的无孔片材。
固相材料可以包括捕获部位。“捕获部位”是指固相材料上用于附着材料的部位。通常，捕获部位包括共价连接于或以其它方式连接于(如，疏水性连接于)固相材料上的官能团或分子。
短语“涂布到固相材料上的涂层试剂”是指涂布在固相材料的至少一部分上的材料，如，涂布在原纤维基质和/或吸附性粒子的至少一部分上的材料。
“表面活性剂”是指降低其溶解于其中的介质的表面张力或界面张力的物质。
“强碱”是指在水中完全解离的碱，如，NaOH。
“聚电解质”是指作为带电聚合物的电解质，其通常具有比较高的分子量，如聚苯乙烯磺酸。
“可选择性渗透的聚合物屏障”是指根据大小和电荷可选择性转运液体的聚合物屏障。
“浓缩区”是指可为小球形式，相对于次浓缩区具有较高浓度的含核酸的物质、细胞核、和/或核酸的样品区域。
如本文中使用的，“基本上分离”，特别是在将样品浓缩区与样品次浓缩区分离的情况中，是指除去样品总量的低于25％的核酸(无论其为游离的、或在细胞核内、或在其它含核酸的物质内)总量的至少40％。优选地，从样品的其余部分分离出样品总量的低于10％的核酸总量的至少75％。更优选地，从样品的其余部分分离出样品总量的低于5％的核酸总量的至少95％。
“抑制剂”是指用于例如扩增反应的酶抑制剂。这种抑制剂的例子通常包括铁离子或其盐(如，Fe2+或其盐)和其它金属盐(如，碱金属离子、过渡金属离子)。其它抑制剂可以包括蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、血红素及其降解产物、尿素、胆汁酸、腐殖酸、多糖、细胞膜、和胞质组分。在人血液中的PCR的主要抑制剂为血红蛋白、乳铁蛋白、和IgG，其分别存在于红细胞、白细胞、和血浆中。本发明的方法使至少一部分抑制剂(即，至少一种抑制剂的至少一部分)与含核酸的物质分离。如本文中讨论的，含抑制剂的细胞可与含细胞核的细胞或其它含核酸的物质相同。抑制剂可包含在细胞中或者可位于细胞外。细胞外抑制剂包括所有不包含在细胞内的抑制剂，其包括例如存在于血清或病毒中的那些抑制剂。
“优先使至少一部分抑制剂附着于固相材料”是指一种或多种类型的抑制剂比含核酸的物质(如，细胞核)和/或核酸以更大的程度附着于任选的固相材料上，并且通常不使显著部分的含核酸的物质和/或细胞核附着于固相材料上。
“微流体”是指具有一个或多个流体通道、室、或导管的装置，其具有的至少一个内部横截面尺寸(如，深度、宽度、长度、直径等)小于500μm、通常为0.1μm到500μm。在本发明使用的装置中，优选微尺度通道或室的至少一个横截面尺寸为0.1μm到200μm、更优选0.1μm到100μm、通常为1μm到20μm。通常，微流体装置包括多个室(处理室、分离室、混合室、废料室、稀释剂室、扩增反应室、加料室等)，每个室限定用于包含样品的容量；并且有至少一个分配通道连接阵列的多个室；例如，其中阵列中的至少一个室可以包括固相材料(从而其经常被称作分离室)和/或阵列中的至少一个处理室可以包括裂解试剂(从而其经常被称作混合室)。
术语“包括”及其变体在这些术语出现在指导说明和权利要求中时不是具有限制性含义。
如本文中使用的，“一”、“一个”、“该”、“至少一个”、和“一个或多个”可互换地使用并且是指一个或多个。
还在本文中，由端点表示的数值范围的叙述包括该范围内所包含的所有数目(如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容不用于描述各个公开的实施方案或本发明所有的执行。下述的描述更具体地举例说明示例性的实施方案。在本申请的几个地方，通过实施例的列举提供指导，所述实施例可以不同组合使用。在每种情况中，列举例只是代表性的，不应将其解释为排它的列举例。另外，描述了不同的实施方案，其中每个实施方案的多个元件可被用于其它实施方案，即使没有具体地描述。
附图说明
图1-2表示用于本发明某些方法中的微流体装置。
示例性实施方案的详细说明
本发明提供用于从样品，通常是生物样品，分离核酸，优选基本上纯形式的核酸的多种方法和试剂盒。本发明提供用于从包括核酸(如，DNA、RNA、PNA)的样品分离核酸的方法和试剂盒，所述核酸可包括在或不包括在含细胞核的细胞(如，白细胞)中。
应该理解，虽然该方法涉及从样品分离核酸，但是该方法未必是从含核酸的物质(如，细胞核)除去核酸。也就是说，可能需要另外的步骤，以进一步从例如细胞核分离核酸。
本发明的方法涉及最终使核酸与抑制剂如血红素及其降解产物(如，铁盐)分离，抑制剂是不希望有的，因为它们可抑制扩增反应(如，在PCR反应中的情况)。更具体地，本发明的方法涉及使样品中的至少一部分核酸与至少一种抑制剂的至少一部分分离。优选的方法涉及除去包含核酸的样品中的基本上所有的抑制剂，使得核酸是基本上纯的。例如，含铁的抑制剂的最终浓度不大于约0.8微摩尔(μM)，其为常规PCR***中可容许的存在水平。
为了从全血得到洁净的DNA，通常期望除去血红蛋白以及血浆蛋白。当红细胞裂解时，释放血红素和相关化合物，它们抑制Taq聚合酶。全血中正常的血红蛋白浓度为每100毫升(mL)15克(g)，基于此，经过溶血的全血中的血红素的浓度为约10毫摩(mM)。为了使PCR令人满意地进行，应当将血红素的浓度降低到微摩尔(μM)水平。这可以通过稀释实现，或通过使用例如与抑制剂结合的物质除去抑制剂而实现。
通常，将包含核酸的样品在流通(flow-through)容器中进行处理，虽然这种容器不是本发明的必需要求。优选地，对于本发明的某些方法，处理设备为微流体结构。
样品
本发明的方法可用于从各种样品，特别是生物样品，分离核酸，所述样品如体液(如，全血、血清、尿、唾液、脑脊液、***、或滑液淋巴液)、不同组织(如，皮肤、毛发、舌苔、粪便、瘤、或器官如肝或脾)、细胞培养物或细胞培养物上清液等。样品可为食物样品、饮料样品、发酵肉汤、用于疾病或病症的诊断或处置或监控或治疗的临床样品、法医学样品、农业样品(如，得自植物或动物)、或环境样品(如，土壤、污物、或垃圾)。
生物样品为具有生物来源或生化来源的那些。适于本发明方法中的那些生物样品可来自哺乳动物、植物、细菌、或酵母菌源。生物样品可为单独的细胞形式或为组织形式。细胞或组织可以来自离体培养。重要地是，本发明的某些实施方案使用未经任何预处理(如，裂解、过滤等)的全血作为感兴趣的样品。
对于某些实施方案，样品如全血可以通过离心进行预处理，并且从血液分离白细胞(即，血沉棕黄层)并用作本发明方法中的样品。
对于某些实施方案，样品可在其经历本发明的处理之前经历超速离心以浓缩样品。
样品可为溶解或分散在水或有机介质中的固体样品(如，固体组织)，或已经从中将核酸提取到水或有机介质中的固体样品。例如，样品可为器官匀浆(如，肝、脾)。因此，样品可以包括预先经过提取的核酸(特别是如果其为固体样品的话)。
样品的类型不是本发明的限制。然而，通常，样品包括含核酸的物质和需要与核酸分离的抑制剂。在这种上下文中，含核酸的物质是指各种细胞(如，白细胞、细菌细胞)、细胞核、病毒、或包容含核酸的结构的任何其它组成(如，质粒、粘粒、或类病毒、古细菌)。在这种方法的某些优选实施方案中，含核酸的物质包括细胞核。在某些实施方案中，当这种细胞核与本文所述的固相材料接触时为完整无损的(即，基本上未裂解的)。
在某些实施方案中，样品可为部***解的(如，预裂解以释放抑制剂)，在这种情况下，本发明的方法可能需要裂解或完全裂解。因此，样品可包括游离(如，不在细胞内)的核酸和游离(如，不在细胞内)的抑制剂。
分离的(即，与抑制剂分离的)核酸可用于(优选不经进一步纯化或洗涤)多种应用(如，扩增、测序、标记、淬灭、限制性内切酶消化、连接、逆转录酶、杂交、DNA印迹、RNA印迹等)。具体地，其可用于测定主体的基因组。其可用于诊断样品中微生物(如，细菌、病毒)的存在，并且随后可用于监控和/或治疗由微生物引起的对样品来源的损伤。本发明的方法、材料、***、和试剂盒特别适于制备在高通量或自动化处理(特别是微流体***)中使用的扩增技术(如，PCR、LCR、MASBA、SDA、和bDNA)用核酸提取物。因此，对于本发明的某些实施方案，分离的核酸被转移到扩增反应室(如微流体装置中的PCR样品室)中。
可根据本发明从不纯的、部分纯的或纯的样品分离核酸(即，与抑制剂分离)。原始样品的纯度不是至关重要的，因为可从甚至非常不纯的样品分离出核酸。例如，可从不纯的生物流体样品如血液、唾液、或组织得到核酸。如果期望较高纯度的原始样品，可使样品在经历本发明的方法之前根据本领域技术人员公知的任何常规方法进行处理。例如，可以处理样品，使得在样品经历本发明的方法之前除去某些杂质，如不溶性物质。
如本文所述分离的核酸可具有任何分子量并且为单股形式、双股形式、环形、质粒等。可将多种核酸彼此分离(如，从DNA分离RNA，或从单链DNA分离双链DNA)。例如，可使用本发明的方法分离具有约10到约50个碱基长度的小的寡核苷酸或核酸分子、具有约1000个碱基到约10,000个碱基长度的较长分子、甚至具有约50kb到约500kb的大分子量核酸。在一些方面中，根据本发明分离的核酸可优选具有约10个碱基到约10万个碱基。
含核酸的样品可具有不同的容量。例如，使用的容量可大到1升或小到1μL或更小。样品的大小通常取决于用于实施该方法的设备。对于微流体结构，其通常具有非常小的容量，如优选10μL(优选不大于100μL)。应该理解，如果经过预处理如通过浓缩，可使用更大容量的样品。
对于低拷贝数基因，通常需要更大的样品容量以保证感兴趣的序列存在于样品中。然而，更大的样品量具有更大量的抑制剂，并且通常使其自身不适于微流体结构。因此，对于低拷贝数的情况，可能需要使用100μL或更大的容量，以得到可重现的结果；然而，由于较高的样品容量，每个微流体装置所处理的样品数可能减小。
在本发明的方法中，用于浓缩含核酸的物质的离心步骤对于低拷贝数样品是有用的。然而，虽然核酸浓度在处理室的底部显著增加，但是抑制剂浓度仍然较高。虽然在上清液中除去大部分抑制剂，即血清和被破坏的RBC中的蛋白质(如，血红素和血红素相关产物)，但是样品的含核酸的浓缩区仍然有显著量的抑制剂存在；然而，核酸与抑制剂的比非常高，产生核酸相对浓缩的样品。可使该样品浓缩区接触任选的固相材料，如本文中所述的，以除去残留的抑制剂。
对于高拷贝数基因，可使用小达2μL的样品容量，但是使用更大容量(如，20μL)时重现性更好。在较小容量的情况中，可以得到较高的通过量(即，每个微流体装置处理的样品数)。在较大容量(如，20μL)的情况中，可能没必要经历用于浓缩含核酸的细胞的预旋转步骤。
对于某些实施方案，施用于固相材料上的含核酸的样品可为任何量，该量由固相材料的量决定。优选地，施用于固相材料上的样品中核酸的量低于固相材料的干重，通常为约1/10,000到约1/100(重量，核酸/固相)。施用于固相材料上的样品中核酸的量可例如多达100克或低达1皮克。
优选从本发明方法分离的所需核酸为最初施加的样品中全部核酸的量的至少20％，更优选至少30％，更优选至少70％，最优选至少90％。因此，本发明的某些优选方法提供以高回收率从样品回收所需核酸。另外，根据本发明可定量地回收极少量的核酸分子。回收率或收率主要取决于样品的质量而不是方法本身。因为本发明的某些实施方案提供不需要从大容量浓缩的核酸制备法，因此本发明避免了核酸损失的危险。
在PCR样品中具有太多的DNA可能对DNA的扩增有害，因为有太多的错引部位(misprimed site)。这产生许多线性或按指数方式扩增的非目标序列。因为扩增的特异性随着非目标DNA量的增加而消失，不以任何显著程度发生目标序列的指数积聚。因此，希望控制进入每个PCR样品中的DNA的量。DNA的量通常不超过1微克/反应，通常为至少1皮克/反应。PCR混合物中典型的最终DNA浓度为0.15纳克/微升到1.5纳克/微升。在微流体装置的情况中，可以在提纯之后、PCR之前将样品分流，使得每个样品具有适量的DNA。或者，可以将样品在如以下更具体描述的包括装有调节阀的处理室的样品处理装置(具体为微流体装置)中进行足够地稀释，使得每个PCR混合物中存在适量的DNA。在诊断装置中，因为白细胞的量可显著不同，很难事前预测要被分离的DNA的量。然而，有效范围为每200μL血液含3微克(μg)到12μg的DNA。对于血沉棕黄层，有效范围为每200μL血沉棕黄层含25μg到50μg的DNA。
裂解试剂和裂解条件
对于本发明的某些实施方案，在处理过程中的一些时间点，将样品内的细胞裂解，特别是含核酸的细胞(如，白细胞、细菌细胞、病毒细胞)，以释放细胞的内容物并形成样品(即，裂解产物)。本文的裂解为各细胞的膜的物理破裂，是指外层细胞膜的和当存在核膜时核膜的物理破裂。这可以使用标准技术进行，如通过蛋白酶水解随后使蛋白酶热灭活；用表面活性剂(如，非离子型表面活性剂或十二烷基硫酸钠)、胍盐、或强碱(如，NaOH)处理；物理破坏(如，用超声波)；煮沸；或加热/冷却(如，加热到最低55℃(通常到95℃)并冷却到室温或以下(到8℃))，其可以包括冷冻/解冻处理。通常，如果使用裂解试剂，其处于水介质中，虽然如果期望时可以使用有机溶剂。
可以将全血中的红细胞(RBC)裂解而不破坏白细胞(WBC)，通过使用水(即，含水稀释物)作为裂解试剂用于释放抑制剂。或者，还可使用氯化铵或季铵盐破坏RBC。还可以使用低渗缓冲液通过低渗性休克裂解RBC。可以通过例如离心回收完整的WBC或它们的细胞核。
通常，可使用更强的裂解试剂如表面活性剂用于裂解RBC以及含核酸的细胞(如，白细胞(WBC)、细菌细胞、病毒细胞)，以释放抑制剂、细胞核、和/或核酸。例如，可使用非离子型表面活性剂裂解RBC以及WBC，而不破坏细胞核。可使用非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、和两性离子表面活性剂裂解细胞。特别有用的是非离子型表面活性剂。如果期望，可使用表面活性剂的组合。可以将非离子型表面活性剂如TRITON X-100加入到含蔗糖和镁盐的TRIS缓冲液中，用于细胞核的分离。
用于裂解的表面活性剂的量足够高，以有效裂解样品；还要足够低，以避免例如沉淀。用于裂解过程的表面活性剂的浓度基于样品的总重量通常为至少0.1重量％。用于裂解过程的表面活性剂的浓度基于样品的总重量通常不大于4.0重量％，优选不大于1.0重量％。通常优化该浓度以在尽可能最短的时间内达到完全裂解，得到的混合物为PCR相容的。实际上，加入到PCR鸡尾酒中的制剂中的核酸应该很少抑制或几乎不抑制实时PCR。
如果期望，可以将缓冲液与表面活性剂混合使用。通常，这种缓冲液提供pH至少为7、通常最高为9的样品。
通常，可以使用甚至更强的裂解试剂，如强碱，以裂解包含在含核酸的细胞(如白细胞)中的任何细胞核。例如，美国专利5,620,852(Lin等人)描述的方法可适于本发明的某些方法，其涉及在室温下用碱处理(如，NaOH)在短达1分钟的时间内从全血提取DNA。通常，有多种强碱可用在碱裂解法中产生有效的pH(如，8-13，优选13)。强碱通常为氢氧化物，如NaOH、LiOH、KOH；具有含四价氮阳离子(如，季铵)的氢氧化物；以及碱如叔胺、仲胺或伯胺。通常，强碱的浓度为至少0.01当量浓度(N)，并且通常最高为1N。通常，然后将混合物中和，特别是如果核酸经历PCR的话。在另一种方法中，可在用碱裂解之后加热以进一步使蛋白质变性，随后将样品中和。
还可以在加热下使用蛋白酶K，随后在更高的温度下使蛋白酶K热灭活，用于从细胞核或WBC分离核酸。
还可以应用市售的裂解试剂和中和剂，如根据微流体尺寸按比例缩小的Sigma的Extract-N-Amp Blood PCR试剂盒。可使用更强的裂解溶液如得自GenPoint(Oslo，Norway)的POWERLYSE，用于使难以裂解的细菌如葡萄球菌、链球菌等裂解，以有助于本发明的某些方法。
在另一种方法中，可使用煮沸法裂解细胞和细胞核，释放DNA，并且同时沉淀血红蛋白。上清液中的DNA无需浓缩步骤可直接用于PCR，使得这种方法可用于低拷贝数样品。
对于感染性疾病，可能需要分析得自全血的细菌或病毒。例如，在细菌的情况中，白细胞可能与细菌细胞结合的形式存在。在使用微流体装置的方法中，有可能裂解红细胞以释放抑制剂，然后在进一步裂解之前通过例如离心分离出细菌细胞和白细胞。这种含核酸的细胞(细菌的和白细胞的细胞/细胞核)的浓缩部分可进一步移动到包含固相材料的室中，用于除去抑制剂。然后，可以将例如细菌细胞裂解。
可使用热实现细菌细胞的裂解。或者，可以使用酶催法(如，溶菌酶、变溶菌素)或化学法进行细菌细胞的裂解。优选细菌细胞通过碱裂解法进行裂解。
使使用细菌用来繁殖质粒在基因组的研究、分析分子生物学、制备分子生物学等中是常见的。在包含质粒的细菌的情况中，存在得自细菌和质粒两者的遗传物质。可以使用本发明的方法进行提纯操作，用于从基因组DNA分离细胞蛋白质和细胞碎片。如此得到的包含质粒DNA的上清液称为“澄清的裂解液”。可以使用多种方法将澄清裂解液进一步纯化，如阴离子交换色谱、凝胶过滤、或用醇沉淀。
在可被结合在微流体装置中的细菌培养物的方案的具体例子中，将E.Coli细胞培养物离心并再悬浮在TE缓冲液(10mM TRIS、1mMEDTA，pH 7.5)中并通过加入0.1M NaOH/1％SDS(十二烷基硫酸钠)裂解。通过加入1体积的3M(三摩尔)乙酸钾(pH 4.8)终止细胞裂解，并且将上清液离心。将细胞裂解产物进一步纯化，得到洁净的质粒DNA。
血浆和血清代表了提交用于分子检验的包括病毒的大多数样本。在全血进行分级之后，血浆或血清样品可用于提取病毒(即，病毒粒子)。例如，为了从病毒分离DNA，在微流体情况中，有可能首先通过将血液离心分出血清。使用在以下更具体描述的调节阀，可以将单独的血清注入到另一个室中。然后可将血清离心以浓缩病毒，或者可在使用例如本文中所述的固相材料除去抑制剂之后直接用于随后的裂解步骤。固相材料可以吸收溶液，使得病毒粒子不通过材料。然后可以用小的洗脱体积洗脱病毒粒子。通过加热或通过酶促或化学方法将病毒裂解(例如通过使用表面活性剂进行裂解)并且用于下游的应用如PCR或实时PCR中。在其中需要病毒RNA的情况中，可能需要将核糖核酸酶抑制剂加入到溶液中，以阻止RNA降解。
固相材料
对于本发明的某些实施方案，已经发现抑制剂附着于固相(优选聚合物)材料，该材料包括任何形式(如，粒子、原纤维、膜形式)的固体基质，优选其具有与其连接的捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上(即其至少一部分)的涂层试剂(优选表面活性剂)、或两者。涂层试剂可为阳离子、阴离子、非离子、或两性离子型表面活性剂。或者，涂层试剂可为聚电解质、强碱、或可选择性渗透的聚合物屏障。如果期望，可使用涂层试剂的不同组合。
可用于本发明的方法的固相材料可包括例如保留抑制剂如血红素和血红素降解产物(特别是铁离子)的多种有机和/或无机材料。这种材料用捕获部位(优选螯合基团)官能化、涂有一种或多种涂层试剂(如，表面活性剂、聚电解质、或强碱)、或两者。通常，固相材料包括有机聚合物基质。
通常适当的材料是化学惰性的、物理和化学稳定的、并且与多种生物样品相容。固相材料的例子包括二氧化硅、氧化锆、氧化铝珠、金属胶体如金、例如已经通过巯基化学进行官能化处理用于产生捕获部位的覆金片材。适当的聚合物的例子包括例如聚烯烃和氟化聚合物。通常在应用之前将固相材料洗涤以除去盐和其它杂质。其可以干燥储存或者储存在水悬浮液中备用。优选固相材料用于流通容器中，诸如例如移液管、注射器、或大型柱、微量滴定板、或微流体装置中，虽然还可以使用不涉及这些容器的悬浮法。
可用于本发明的方法的固相材料可包括多种形式的多种材料。例如，其可为松散的或被固定的粒子或小珠形式、纤维、泡沫、玻璃料、微孔膜、膜、或具有微复制(microreplicated)表面的底物形式。如果固相材料包括粒子，优选它们为均匀的、球状的、和刚性的，以保证良好的流体流动特征。
对于本发明的流通应用，这种材料通常为松散的多孔网络形式，用于允许大分子均匀地和不受损害地进出，并且用于提供较大的表面积。优选地，对于这种应用，固相材料具有比较高的表面积，诸如例如，超过1平方米/克(m2/g)。对于不涉及使用流体装置的应用，固相材料可以是或不是多孔性基质。因此，膜也可用于本发明的某些方法中。
对于使用粒子或小珠的应用，可以将它们引入到样品中或将样品引入到粒子/小珠的床中并通过例如离心从中除去。或者，可以通过多种方法(如，喷雾干燥)将粒子/小珠涂布(如，图形涂布)到任选地涂有粘合剂的惰性底物(如，聚碳酸酯或聚乙烯)上。如果期望，可以将底物微复制，用于增加表面积和增强提纯。还可以用氧等离子体、电子束或紫外辐射、加热、或电晕处理方法进行预处理。底物可在微流体装置的储库上用作例如覆盖膜，或层压于覆盖膜上。
在一个实施方案中，固相材料包括原纤维基质，其可具有或没有陷入其中的粒子。原纤维基质可以包括多种纤维中的任一种。通常，纤维在水相环境是不溶的。其例子包括玻璃纤维、聚烯烃纤维(特别是聚丙烯和聚乙烯微纤维、芳族聚酰胺纤维、氟化聚合物纤维(特别是聚四氟乙烯纤维)、和天然的纤维素纤维。可使用纤维的混合物，其对于核酸的结合可为活性的或非活性的。优选地，原纤维基质形成具有至少约15微米、并且最大为约1毫米，更优选最大为约500微米厚度的料片。
如果使用粒子，则粒子在水性环境中通常是不溶的。它们可由一种材料或多种材料的组合制成，如在覆层粒子中。它们可为可膨胀的或不可膨胀的，虽然优选它们在水和有机液体中为不可膨胀的。优选地，如果粒子用于附着，其由不膨胀的疏水性材料制成。它们可以根据对核酸的亲合性进行选择。一些水可膨胀的粒子的例子在美国专利4,565,663(Errede等人)、4,460,642(Errede等人)、和4,373,519(Errede等人)中描述。在水中不可膨胀的粒子在美国专利4,810,381(Hagen等人)、4,906,378(Hagen等人)、4,971,736(Hagen等人)、和5,279,742(Markell等人)中描述。优选的粒子为聚烯烃粒子，如聚丙烯粒子(如，粉末)。可使用粒子的混合物，其对于核酸的结合可为活性或非活性的。
如果使用覆层粒子，涂层优选是不溶于水和不溶于有机溶剂的不可膨胀的材料。涂层可附着或不附着核酸。因此，覆层的基础粒子可为无机或有机的。基础粒子可包括对其共价结合有有机基团的无机氧化物，如二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆等。例如，可使用共价结合的有机基团，如具有不同链长(C2、C4、C8、或C18基团)的脂肪族基团。
包括原纤维基质的适当的固相材料的例子在美国专利5,279,742(Markell等人)、4,906,378(Hagen等人)、4,153,661(Ree等人)、5,071,610(Hagen等人)、5,147,539(Hagen等人)、5,207,915(Hagen等人)、和5,238,621(Hagen等人)中描述。这种材料可购自3M Company(St.Paul，MN)，商业名称为SDB-RPS(Styrene-Divinyl Benzene Reverse PhaseSulfonate，3M Part No.2241)、阳离子-SR膜(3M Part No.2251)、C-8膜(3M Part No.2214)、和阴离子-SR膜(3M Part No.2252)。
特别优选包括聚四氟乙烯基质(PTFE)的那些。例如，美国专利4,810,381(Hagen等人)公开了固相材料，其包括：聚四氟乙烯原纤维基质，和陷入在基质中的不可膨胀的吸附性粒子，其中不可膨胀的吸附性粒子与聚四氟乙烯的重量比为约19∶1到4∶1，并且另外其中复合的固相材料具有20到300毫牛顿/米的净表面能。美国专利RE36,811(Markell等人)公开了固相提取介质，其包括：原纤维基质，和陷入在基质中的吸附性粒子，其中粒子包括超过30到最多100重量％的多孔性有机粒子，和少于70到0重量％的多孔性(涂覆有机层或无涂层的)无机粒子，吸附性粒子与PTFE的重量比为40∶1到1∶4。
特别优选的固相材料得自3M Company，St.Paul，MN的商业名称EMPORE下。EMPORE技术的基本原理在于使用任何吸附剂粒子产生负载有粒子的膜、或碟形物状物的能力。粒子在聚四氟乙烯的惰性基质(90％吸附剂：10％PTFE，以重量计)内紧密地结合在一起。PTFE原纤维不以任何方式妨碍粒子的活性。EMPORE膜制造工艺产生的提取介质，与在常规固相提取(SPE)柱或柱体中使用的由相同大小的粒子制备的介质相比，可得到更致密、更均匀的介质。
在另一个优选实施方案中，固相(如，微孔性热塑性聚合物载体)具有以由原纤维连接的间隔开的、随机分散的、具有不均匀形状的、各向等大的多个热塑性聚合物粒子为特征的微孔性结构。粒子彼此间隔，在它们之间提供微孔的网络。粒子通过从每个粒子辐射到相邻粒子的原纤维彼此连接。粒子或原纤维中的一种或两种可为疏水性的。优选的这种材料的例子具有较高的表面积，如通过汞表面积技术测量经常高达40米2/克，和最大约5微米的孔径。
这种类型的纤维材料可通过涉及利用诱导相分离的优选技术产生。这涉及在足够形成均匀混合物的温度下用不混溶的液体熔体混合热塑性聚合物，从溶液形式形成具有所需形状的制品，将成形的制品冷却以便诱导液体和聚合物的相分离，并且最终将聚合物固化和除去显著部分的液体，留下微孔性聚合物基质。这种方法和优选的材料在美国专利4,726,989(Mrozinski)、4,957,943(McAllister等人)、和4,539,256(Shipman)中详细描述。这种材料称为热致相分离膜(TIPS膜)并且是特别优选的。
其它适当的固相材料包括在美国专利5,328,758(Markell等人)中公开的非织造材料。这种材料包括含压缩或融合颗粒的非织造料片(优选吹制的微纤维)，其包含高吸附效率的色谱级粒子。
其它适当的固相材料包括被称为HIPE Foams的那些，其在例如美国专利公开2003/0011092(Tan等人)中描述。“HIPE”或“高内相乳液”是指包括连续的活性相(通常为油相)、和不与油相混溶的不连续相或共连续相(通常为水相)的乳液，其中不混溶相占乳液的至少74体积％。由HIPE制成的许多聚合物泡沫通常为相对开孔的。这意味着大多数或所有的孔都与相邻的孔畅通无阻地相通。这种基本上开孔的泡沫结构的孔在孔间具有窗口，其通常足够大，以允许液体在泡沫结构内从一个孔转移到另一个孔。
固相材料可以包括用于捕获抑制剂的捕获部位。在本文中，“捕获部位”是指共价连接于固相材料上的基团(如，官能团)或非共价(如，疏水性)结合于固相材料上的分子。
优选地，固相材料包括捕获抑制剂的官能团。例如，固相材料可以包括螯合基团。在这里，“螯合基团”为多分支的并且能够与金属原子或离子(虽然抑制剂可能通过或可能不通过螯合机制保持在固相材料上)形成螯合络合物的那些。螯合基团的引入可以通过多种技术实现。例如，非织造材料可以容纳用螯合基团官能化的小珠。或者，非织造材料的纤维可直接用螯合基团进行官能化。
螯合基团的例子包括例如-(CH2-C(O)OH)2、三(2-氨基乙基)胺基团、亚氨基二乙酸基团、次氮基三乙酸基团。可以通过多种技术将螯合基团引入到固相材料中。它们可通过材料的化学合成被引入。或者，可以将包含所需的螯合基团的聚合物涂布(如，图形涂布)到惰性底物(如，聚碳酸酯或聚乙烯)上。如果期望，可以将底物微复制，用于增加表面积和增强提纯。还可以用氧等离子体、电子束或紫外辐射、加热、或电晕处理方法预处理。底物可在微流体装置的储库上用作例如覆盖膜，或层压于覆盖膜。
螯合固相材料为市售的并且可在本发明中用作固相材料。例如，对于本发明的某些实施方案，优选包括螯合基团如亚氨基二乙酸(为钠盐的形式)的EMPORE膜。这种膜的粒子在美国专利5,147,539(Hagen等人)中公开并且可作为EMPORE Extraction Disks(47mm，No.2271或90mm，No.2371)购自3M Company。对于本发明的某些实施方案，优选包括螯合基团的铵衍生化的EMPORE膜。为使碟形物状物处于铵形式，可以将其用50mL的0.1M乙酸铵缓冲液(pH 5.3)洗，随后用几种试剂水进行洗涤。
其它螯合材料的例子包括但不限于交联的聚苯乙烯小珠，其可得自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)的商业名称CHELEX下；具有三(2-氨基乙基)胺、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、聚胺和聚亚胺的交联的琼脂糖小珠；以及购自Rohm and Haas(Philadelphia，PA)的商业名称DUOLITE C-467和DUOLITE GT73下的螯合离子交换树脂；AMBERLITE IRC-748、DIAION CR11、DUOLITE C647。
CHELEX 100螯合树脂为包含亚氨基二乙酸酯基团(-N-(CH2-C(O)OH)2)的苯乙烯二乙烯基苯二元共聚物，其对于多价金属离子具有高亲合力并且可用于本发明的某些方法中，虽然在微流体装置中实施的方法中不那么合乎需要。
通常，固相材料上的螯合基团的所需浓度密度为约0.02纳摩/平方毫米，虽然认为宽范围的浓度密度是可能的。
其它类型的捕获材料包括阴离子交换材料、阳离子交换材料、活性碳、反相、正相、苯乙烯-二乙烯基苯、氧化铝、二氧化硅、氧化锆、和金属胶体。适当的阴离子交换材料的例子包括通常为氯化物形式的强阴离子交换剂如季铵、二甲基乙醇胺、四价的烷基胺、三甲基苄基铵、和二甲基乙醇苄基铵；和弱的阴离子交换剂，如多胺。适当的阳离子交换材料的例子包括强的阳离子交换剂如磺酸，通常为钠盐形式；和弱的阳离子交换剂如羧酸，通常为酸的形式。适当的碳系材料的例子包括EMPORE碳材料、碳珠。适当的反相C8和C18材料的例子包括用十八烷基或辛基进行封端的二氧化硅小珠，和具有C8和C18二氧化硅小珠的EMPORE材料(得自3M Co.，St.Paul，MN的EMPORE材料)。正相材料的例子包括羟基和二羟基。
也可将市售的材料进行改性或直接用于本发明的方法中，特别是用于微流体装置中。例如，例如，可以将得自商业名称LYSE ANDGO(Pierce，Rockford，IL)、RELEASE-IT(CPG，NJ)、GENE FIZZ(Eurobio，France)、GENE RELEASER(Bioventures Inc.，Murfreesboro，TN)、和BUGS N BEADS(GenPoint，Oslo，Norway)的固相材料，以及Zymo小珠(Zymo Research，Orange，CA)和Dynal小珠(Dynal，Oslo，Norway)作为固相捕获材料结合到本发明的方法中，特别是结合到微流体装置中。
在这种方法的某些实施方案中，固相材料包括涂层试剂。优选涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合。在这种方法的某些实施方案中，固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入基质中的吸附性粒子、和涂布在固相材料上的涂层试剂，其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合。
适当的表面活性剂的例子列举如下。
适当的强碱的例子包括NaOH、KOH、LiOH、NH4OH，以及伯胺、仲胺、或叔胺。
适当的聚电解质的例子包括聚苯乙烯磺酸(如，聚(4-苯乙烯磺酸钠)或PSSA)、聚乙烯基膦酸、聚乙烯基硼酸、聚乙烯基磺酸、聚乙烯基硫酸、聚苯乙烯膦酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、木质素磺酸盐、角叉菜胶、肝素、硫酸软骨素(chondritin sulfate)、及其盐或其它衍生物。
适当的可选择性渗透的聚合物屏障的例子包括聚合物如丙烯酸酯、丙烯酰胺、吖内酯、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、多糖。这种聚合物可为多种形式。它们可为水溶性的、水可膨胀的、水不溶性的、水凝胶形式等。例如，聚合物屏障可以制备为使得其起到作为较大粒子如白细胞、细胞核、病毒、细菌、以及核酸如人基因组DNA和蛋白质的过滤器的作用。这些表面可由本领域技术人员通过适当地选择官能团、通过交联等进行改造而适于根据尺寸和/或电荷进行分离。这种材料容易购得或可由本领域技术人员容易地制备。
优选地，将固相材料用表面活性剂涂布而不过量洗涤掉任何表面活性剂，虽然如果期望的话可以洗掉其它涂层试剂。通常，涂布可以多种方法进行，如浸渍、辊涂、喷涂等。然后通常在应用之前将加载有涂层试剂的固相材料在例如空气中干燥。
特别需要的是涂有表面活性剂、优选涂有非离子型表面活性剂的固相材料。这可以根据实施例部分中提到的操作实现。虽然不打算受理论的限制，但是认为表面活性剂的加入增加固相材料的湿润性，其允许抑制剂渗透进入固相材料中并与其结合。
优选用于固相材料的涂层试剂为水基溶液，虽然如果期望的话可以使用有机溶剂(醇等)。涂层试剂加载量应该足够高，使得样品能湿透固相材料。然而，其不能太高，使得涂层试剂本身被显著洗脱。优选地，如果涂层试剂用核酸洗脱，在洗脱的样品中含不超过约2重量％的涂层试剂。通常，涂层溶液的浓度在溶液中可低达0.1重量％的涂层试剂，和在溶液中高达10重量％的涂层试剂。
表面活性剂
非离子型表面活性剂。有多种适当的非离子型表面活性剂为已知的，其可用作裂解试剂(上述讨论的)、洗脱剂(如下讨论的)、和/或作为固相材料上的涂层。它们包括例如聚氧化乙烯表面活性剂、羧酸酯表面活性剂、羧酸酰胺表面活性剂等。市售的非离子型表面活性剂包括正十二烷酰基蔗糖、正十二烷基-β-D-吡喃葡糖苷、正辛基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、正十二烷酰基蔗糖、正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正癸基-β-D-硫代麦芽糖苷、正庚基-β-D-吡喃葡糖苷、正庚基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、正己基-β-D-吡喃葡糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡糖苷、正辛酰基蔗糖、正辛基-β-D-吡喃葡糖苷、环己基-正己基-β-D-麦芽糖苷、环己基-N-甲基-β-D-麦芽糖苷、洋地黄皂苷，和得自商业名称PLURONIC、TRITON、TWEEN下的那些，以及许多其它市售的和在Kirk Othmer Technical Encyclopedia中列举的那些。其例子在以下表1中列举。优选的表面活性剂为聚氧化乙烯表面活性剂。更优选的表面活性剂包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。
表1
| 表面活性剂商品名 | 非离子型表面活性剂 | 供应商 |
| PLURONIC F127 | 改性的乙氧基化的醇和/或丙氧基化的直链醇 | SigmaSt.Louis，MO |
| TWEEN 20 | 聚氧化乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯 | SigmaSt.Louis，MO |
| TRITON X-100 | 叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 | SigmaSt.Louis，MO |
| BRIJ 97 | 聚氧化乙烯(10)油烯基醚 | SigmaSt.Louis，MO |
| IGEPAL CA-630 | 辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇 | SigmaSt.Louis，MO |
| TOMADOL 1-7 | 乙氧基化醇 | Tomah ProductsMilton，WI |
| Vitamin E TPGS | d-α-生育酚聚乙二醇1000 | EastmanKingsport，TN |
还适当的是在美国专利公开2003/0139550(Savu等人)和2003/0139549(Savu等人)中公开的类型的氟化非离子型表面活性剂。其它非离子型氟化表面活性剂包括购自DuPont(Wilmington，DE)的商业名称ZONYL下的那些。
两性离子表面活性剂。已知多种适当的两性离子表面活性剂，其可用作固相材料上的涂层、作为裂解试剂、和/或作为洗脱剂。它们包括例如烷基酰胺甜菜碱及其胺氧化物、烷基甜菜碱及其胺氧化物、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、两性甘氨酸酯、两性丙酸酯、平衡的两性多羧基甘氨酸酯、和烷基多氨基甘氨酸酯。蛋白质根据pH具有带电或不带电的能力，因此在合适的pH，优选pI为约8-9的蛋白质，如改性的牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶原，可以作为两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的具体例子为得自Sigma的商业名称CHAPS下的胆酰胺基丙基二甲基丙磺酸铵。更优选的表面活性剂包括N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐。
阳离子表面活性剂。已知多种适当的阳离子表面活性剂，其可用作裂解试剂、洗脱剂、和/或作为固相材料上的涂层。它们包括例如季铵盐、聚氧化乙烯烷基胺、和烷基胺氧化物。通常，适当的季铵盐包括至少一个较高分子量的基团和两个或三个较低分子量的基团，它们连接于共用氮原子以产生阳离子，并且其中电子平衡的阴离子选自卤化物(溴化物、氯化物等)、乙酸根、亚硝酸根、和低级烷基磺酸根(甲磺酸根等)。氮上的较高分子量取代基经常为包含约10到约20个碳原子的高级烷基，较低分子量的取代基可为具有1到约4个碳原子的烷基如甲基或乙基的低级烷基，其在有些情况下可被取代，如被羟基取代。一个或多个的取代基可以包括芳基部分或可被芳基取代，如苄基或苯基。可能的较低分子量取代基也可包括约1到约4个碳原子的低级烷基，如甲基和乙基；带有一个羟基端基的被取代的低级聚烷氧基部分，如聚氧化乙烯部分，并具有以下通式：
R(CH2CH2O)(n-1)CH2CH2OH其中R为结合于氮上的(C1-C4)二价烷基，n表示约1到约15的整数。或者一个或两个这种具有末端羟基的低级聚烷氧基可直接结合于四价氮，而不是通过前述低级烷基结合于氮。用于本发明的有用的卤化季铵表面活性剂的例子包括但不限于得自Akzo Chemical Inc.的甲基-双(2-羟乙基)椰油基氯化铵或油烯基氯化铵(分别为ETHOQUAD C/12和O/12)和甲基聚氧化乙烯(15)十八烷基氯化铵(ETHOQUAD 18/25)。
阴离子表面活性剂。已知多种适当的阴离子表面活性剂，其可用作裂解试剂、洗脱剂、和/或作为固相材料上的涂层。可使用的阴离子型表面活性剂包括磺酸盐和硫酸盐，如烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基苯醚硫酸盐、烷基磺基乙酸盐、仲烷基磺酸盐、仲烷基硫酸盐等。这些中有许多可以包括聚烷氧基化基团(如，环氧乙烷基团和/或环氧丙烷基团，其可为无规、有序或嵌段的布置)和/或阳离子的平衡离子如Na、K、Li、铵、质子化叔胺如三乙醇胺、或季铵基团。其例子包括：烷基醚磺酸盐，如购自Stepan Company，Northfield，IL的商业名称POLYSTEP B12和B22下的十二烷基醚硫酸盐，和购自Nikko Chemicals Co.，Tokyo，Japan的商业名称NIKKOL CMT30下的甲基牛磺酸钠；购自Clariant Corp.，Charlotte，NC的商业名称HOSTAPUR SAS下的仲烷基磺酸盐，其为(C14-C17)仲烷基磺酸钠(α-烯烃磺酸盐)；甲基-2-磺基烷基酯，如甲基-2-磺基(C12-C16)酯钠和购自Stepan Company的商业名称ALPHASTE PC-48下的2-磺基(C12-C16)脂肪酸二钠；作为都购自Stepan Co.的十二烷基磺基乙酸钠(商业名称LANTHANOL LAL)和十二烷基磺基琥珀酸二钠(商业名称STEPANMILD SL3)下的烷基磺基乙酸盐和烷基磺基琥珀酸盐；和烷基硫酸盐，如购自Stepan Co.的商业名称STEPANOL AM下的十二烷基硫酸铵。
另一类有用的阴离子表面活性剂包括磷酸盐，如烷基磷酸盐、烷基醚磷酸盐、芳烷基磷酸盐、和芳烷基醚磷酸盐。这些中有许多可以包括聚烷氧基基团(如，环氧乙烷基团和/或环氧丙烷基团，其可为无规、有序或嵌段的布置)。其例子包括单-、二-和三-(烷基甘油醚)-o-磷酸酯，通常是指购自Clariant Corp.的商业名称HOSTAPHAT 340KL下的trilaureth-4-磷酸盐；和购自Croda Inc.，Parsipanny，NJ的商业名称CRODAPHOS SG下的PPG-5 ceteth 10磷酸盐；以及烷基和烷基酰胺基烷基二烷基胺氧化物。胺氧化物表面活性剂的例子包括商业名称AMMONYX LO、LMDO、和CO下的那些(都购自Stepan Co.)，其为十二烷基酰胺基丙基二甲基胺氧化物、和十六烷基胺氧化物。
洗脱技术
对于使用用于保持抑制剂的固相材料的实施方案，可以使用多种洗脱剂洗脱包括含核酸的物质(如，细胞核)和/或释放的核酸的样品的更浓缩的区域。这种洗脱剂可以包括水(优选不含核糖核酸酶的水)、缓冲液、表面活性剂(其可为阳离子型、阴离子型、非离子型、或两性离子型表面活性剂)、或强碱。
优选地，洗脱剂为碱性的(即，pH大于7)。对于某些实施方案，洗脱剂的pH为至少8。对于某些实施方案，洗脱剂的pH为最高10。对于某些实施方案，洗脱剂的pH为最高13。如果洗脱的核酸直接用于扩增过程如PCR，则洗脱剂应该配制为使得各组分的浓度不会抑制酶(如，Taq聚合酶)或者阻止扩增反应。
适当的表面活性剂的例子包括上述的那些，具体地，为被称为SDS、TRITON X-100、TWEEN、氟化表面活性剂、和PLURONICS的那些。表面活性剂通常在水基溶液中被提供，虽然如果期望的话可使用有机溶剂(醇等)。优选洗脱剂中表面活性剂的浓度基于洗脱剂的总重量最低为0.1重量/体积％(w/v％)。优选洗脱剂中表面活性剂的浓度基于洗脱剂的总重量为不大于1w/v％。可以任选地将稳定剂如聚乙二醇与表面活性剂一起使用。
适当的洗脱缓冲液的例子包括TRIS-HCl、N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、3-[N-吗啉代]丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N′-双[2-乙磺酸](PIPES)、2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、TRIS-EDTA(TE)缓冲液、柠檬酸钠、乙酸铵、碳酸盐、和碳酸氢盐等。
优选地，洗脱剂中洗脱缓冲液的浓度最低为10毫摩(mM)。优选地，洗脱剂中表面活性剂的浓度不大于2重量％。
通常，优选使用碱性溶液实现含核酸的物质和/或释放的核酸的洗脱。虽然不打算束缚于理论，但是认为，与用水洗脱相比较，碱性溶液可改善抑制剂的结合。碱性溶液还促进含核酸的物质的裂解。优选地，碱性溶液的pH为8到13，更优选为13。高pH的来源的例子包括NaOH、KOH、LiOH、四价氮基氢氧化物、叔胺、仲胺、或伯胺等的水溶液。如果碱性溶液用于洗脱，通常将其在随后的步骤中用例如TRIS缓冲液中和，以形成准备好用于PCR的样品。
碱性溶液的使用可以选择性地破坏RNA，以允许对DNA进行分析。否则，可以向制剂中加入核糖核酸酶以使RNA灭活，随后将核糖核酸酶热灭活。类似地，可以加入脱氧核糖核酸酶用于选择性地破坏DNA并且允许对RNA进行分析；然而，可以将不破坏RNA的其它裂解缓冲液(如，TE)用于这种方法中。还可以向用于经历实时PCR的RNA制备的制剂中加入核糖核酸酶抑制剂如RNAsin。
洗脱通常在室温下进行，虽然较高的温度可以产生较高的收率。例如，如果期望的话，洗脱剂的温度可最高为95℃。洗脱通常在10分钟内进行，虽然优选1-3分钟的洗脱时间。
装置和试剂盒
用于本发明的方法的装置的例子包括由公司如Millipore，Inc.(Bedford，MA)、Bio-Rad，Inc.(Hercules，CA)、Osmonics，Inc.(Westborough，MA)、和Whatman Inc.(Clifton，NJ)提供的标准实验室过滤器支架。本发明的方法可以在通过离心、吸力、压力的方式促进溶液通过固相材料运动的过滤装置(称为流通装置)中进行。其它装置包括微量滴定板和微流体装置。
本发明也提供试剂盒，其可以包括有或者没有支架(例如过滤器支架如针筒式滤器支架或离心过滤器支架、或用于在每个端部具有保持颗粒所用的材料的玻璃料的柱)的固相材料、裂解试剂(特别是表面活性剂如非离子型表面活性剂，纯的或在溶液中)、和用于结合抑制剂和洗脱核酸的指导说明。优选地，本发明提供包括流通容器(更优选，微流体装置)的试剂盒，在流通容器中具有固相(优选聚合物)材料，并且优选具有非离子型表面活性剂。
本发明的试剂盒内可以包括的其它组分包括常规试剂，如洗液、偶联缓冲液、淬灭缓冲液、封闭缓冲液、洗脱缓冲液、等等。本发明的试剂盒内可以包括的其它组件包括常规设备，如离心柱、筒芯、96孔滤板、针头式过滤器、收集单元、注射器、等等。
试剂盒通常包括包装材料，其是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料可以通过公知方法构造，优选用于提供无菌的不含污染物的环境。包装材料可具有用于显示试剂盒内容物的标签。另外，试剂盒包含用于指示如何使用试剂盒内物质的指导说明。如本文中使用的，术语“包装”是指固体基质或材料，如玻璃、塑料、纸、箔等。
“指导说明”通常包括明确的表达，描述本发明的不同方法，包括裂解条件(如，裂解试剂类型和浓度)、试剂和要混合的样品的相对量、试剂/样品混合物的保持时间、温度、缓冲条件、等等。
虽然上述方法可用于各种装置中，但是优选的装置的各种示例性实施方案在美国专利公开2002/0047003(2003年4约25日公开，Bedingham等人)中描述。
用于本发明的方法的优选装置包括微流体装置。它们通常使用在其中布置有一体化的微流体通道网络的主体结构。在优选的方面，微流体装置的主体结构包括两个或多个分隔层的集合体，所述两个或多个分隔层在适当地配合或结合在一起时形成本发明的微流体装置，如包含本文中所述的通道和/或室。通常，有用的微流体装置包括顶部分、底部分、内部部分，其中内部部分基本上限定了装置的通道和室。通常，室包括阀(如，阀隔片)并且称为有阀的室。
用于本文某些实施方案的特别优选的装置称为调节阀装置，其在2003年12月12日提交的标题为“Variable Valve Apparatus and Method”的申请人的受让人的待决美国专利申请10/734,717中公开。在这种调节阀装置中，阀结构允许除去装载于处理室(即，有调节阀的处理室)内的样品材料的选定部分。选定部分的除去通过在预定位置在阀隔片中形成开口而实现。
优选阀隔片足够大，以允许根据处理室中样品材料的特征调节开口的位置。如果在形成开口之后旋转样品处理装置，则更靠近旋转轴的选定部分的材料通过开口离开处理室。样品材料的其余部分不能通过开口离开，因为其比开口距离旋转轴更远。
可以根据在处理室内检测的样品材料的一种或多种特征在一定的位置处在阀隔片中形成开口。优选处理室包括将光传入和/或传出的处理室的检测窗。检测的样品材料的特征可以包括例如样品材料的自由表面(表征处理室中样品材料的容量)。在自由表面径向向外的选定距离处在阀隔片中形成开口，可以提供从处理室除去选定容量的样品材料的能力。
对于可以分离为不同组分的样品材料如全血，样品处理装置的旋转可引起血浆和红细胞组分的分离，从而可选择性地除去组分到例如不同的处理室中。
在一些实施方案中，有可能通过在一个或多个阀隔片中的选定位置处形成开口而除去选定的样品材料等分样品。选定的等分样品容量可以根据开口之间的径向距离(相对于旋转轴测量)和开口之间的处理室的横截面积测定。
优选阀隔片中的开口在没有物理接触的情况下形成，如，通过激光切除、聚焦光加热等。结果，优选形成开口而不穿透样品处理装置的最外层，从而限制了样品材料从样品处理装置渗漏的可能性。
在一个方面中，本发明在样品处理装置(如微流体装置)中使用有阀处理室，有阀处理(如，加热、混合、裂解、混合流体)室包括具有处理室容积的处理室，处理室容积位于样品处理装置的相对的第一和第二主侧面之间，其中处理室占据样品处理装置中的处理室区域，并且其中处理室区域具有长度和与长度垂直的宽度，并且另外其中长度大于宽度。装有调节阀的处理室还包括位于处理室区域内的阀室，阀室位于处理室容积和样品处理装置的第二主侧面之间，其中通过将阀室和处理室分隔的阀隔片使阀室与处理室隔离，并且其中处理室容积的一部分位于阀隔片和样品处理装置的第一主侧面之间。检测窗位于处理室区域内，其中检测窗能透过选定的电磁能，该选定的电磁能被引入和/和引出处理室容积。
在另一个方面，本发明提供允许从装有调节阀的处理室选择性除去一部分样品的方法。该方法包括提供如上所述的样品处理装置(如，微流体装置)，在处理室中提供样品材料；通过检测窗检测处理室中样品材料的特征；在沿着处理室长度的选定位置处在阀隔片中形成开口，其中选定的位置与检测的样品材料特征相关。该方法还包括通过在阀隔片中形成的开口只将一部分样品材料从处理室转移到阀室中。
示例性方法1
在一个实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法。在这个示例性方法中，抑制剂包含在细胞内，但是应该理解，情况并不总是这样，本发明的方法可使用这种样品。
该方法包括：提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；形成裂解样品浓缩区；其中裂解样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；使裂解样品浓缩区与次浓缩区基本上分离；使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步将含核酸的物质裂解以释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同，虽然它们通常是不同的。也就是说，含核酸的物质和含抑制剂的细胞可能相同。例如，如果样品为血沉棕黄层，则含核酸的物质可为白细胞，其同时包括细胞核和抑制剂两者。如果使用裂解白细胞的细胞膜而不裂解其中的细胞核的裂解试剂(如，非离子型表面活性剂)，则释放抑制剂而细胞核完整无损，其也被考虑为是本文所定义的含核酸的物质。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞(所述含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同)的样品；使生物样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以及形成裂解样品的条件下接触非离子型表面活性剂；形成裂解样品浓缩区；其中样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；使裂解样品浓缩区与样品次浓缩区基本上分离；使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解细胞核以释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同，虽然它们通常为不同的细胞。也就是说，含细胞核的细胞和含抑制剂的细胞可能相同。例如，抑制剂可以包括核蛋白以及细胞蛋白。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(所述含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将裂解样品转移到有阀处理室；在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区，其中裂解样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；使裂解样品浓缩区与次浓缩区基本上分离；将分离的裂解样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(优选螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。如以上讨论的，含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同，虽然它们通常是不同的。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞(所述含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂的条件下接触非离子型表面活性剂以形成裂解样品；将裂解样品转移到有阀处理室；在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区，其中裂解样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；使裂解样品浓缩区与次浓缩区基本上分离；将分离的裂解样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(优选螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。如以上讨论的，含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞可相同或不同，虽然它们通常是不同的细胞。
在这种方法的某些实施方案中，含核酸的物质包括细胞核，并且该方法包括从固相材料分离至少一部分细胞核。也就是说，完整无损的细胞核接触固相材料。
在这种方法的某些实施方案中，从固相材料分离至少一部分含核酸的物质(如，细胞核)和/或核酸包括将含核酸的物质(如，细胞核)和/或核酸转移到扩增反应室(如，PCR样品室)中。
在这种方法的某些实施方案中，固相材料上的涂层试剂包括表面活性剂。优选地，表面活性剂为非离子型或两性离子型表面活性剂，更优选地，为非离子型表面活性剂。
在这种方法的某些实施方案中，分离至少一部分含核酸的物质(如，细胞核)和/或核酸包括用洗脱剂从固相材料洗脱至少一部分含核酸的物质(如，细胞核)和/或核酸。
在本发明的这种方法的某些实施方案中，如果期望，该方法可以包括进一步使用第二裂解试剂裂解含核酸的物质(如，细胞核)。
或者，在这种方法的某些实施方案中，洗脱剂也是裂解试剂。对于同时洗脱和裂解，优选强碱，如NaOH。对于只洗脱而不裂解，优选水或TE缓冲液。对于预裂解样品的洗脱，可使用任何洗脱试剂(即，洗脱剂)。
参考图1，适用于这些实施方案的微流体装置的优选实施方案包括加料室10、任选的混合室12、有阀处理室14、包括固相材料的分离室16、洗脱剂室18、废料室20和任选的扩增反应室22。包括这种有阀处理室的微流体装置在2003年12月12日提交的申请人的受让人的标题为Variable Valve Apparatus and Method的待决美国专利申请10/734,717中公开。这些室为彼此流体相通的，使得样品可以被加载到加料室10，然后样品可被转移到混合室12，或者如果其不存在，则样品被直接转移到有阀处理室14中。如果样品例如与裂解试剂预混合(即，预裂解)，则不需要混合室12。或者，混合室12可以包括裂解试剂，例如为预置的(并且通常为干燥的)形式。可以通过多种方法将样品在有阀处理室14中进行浓缩，通常通过离心。有阀处理室14的阀通常布置为使得样品浓缩区(其包括所需的含核酸的物质和/或核酸和抑制剂)可以基本上与样品次浓缩区(其也可包括抑制剂和少量所需的含核酸的物质和/或核酸)分离。样品次浓缩区通常被转移到废料室20。样品的更浓缩区被转移到分离室16用于接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料。然后将洗脱剂室18中的洗脱剂转移到分离室16，以除去至少一部分所需的含核酸的物质和/或核酸。在一些情况中，又可以将细胞核储存用于以后使用。在某些实施方案中，这种材料可以被直接转移到扩增反应室22，用于例如进行PCR过程。扩增反应室22可以任选地包括预置的(并且通常为干燥的)用于扩增反应(如，PCR)的反应物。
示例性方法2
在另一个实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法。在这个示例性方法中，抑制剂包含在细胞内，但是应该理解，情况并不总是这样，本发明的方法可使用这种样品。
该方法包括：提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(其可相同或不同)的样品；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；使裂解样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(它们可相同或不同)的样品；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；使裂解样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(它们可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将裂解样品转移到分离室以接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；在使样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
在另外的实施方案中，本发明提供从样品分离核酸的方法，该方法包括：提供微流体装置，其包括加料室、和包括固相材料的分离室；提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞(它们可相同或不同)的样品；将样品置于加料室中；使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；将裂解样品转移到分离室以接触固相材料使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位(如，螯合官能团)、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
如以上对于示例性方法1所讨论的，示例性方法2的实施方案的含核酸的物质和含抑制剂的细胞可相同或不同，虽然它们通常是不同的。也就是说，含核酸的物质和含抑制剂的细胞可能相同。同样，在示例性方法2中，样品可以包括游离的核酸和游离的抑制剂。
在这种方法的某些实施方案中，从固相材料分离含核酸的物质(如，细胞核)(和/或如果已经从含核酸的物质分离，则为核酸)包括将含核酸的物质(如，细胞核)(和/或核酸)转移到扩增反应室(如，PCR样品室)中。
在这种方法的某些实施方案中，固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂，其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合。
在这种方法的某些实施方案中，分离包括用洗脱剂从固相材料洗脱至少一部分含核酸的物质(如，细胞核)(和/或核酸)。
参考图2，适用于这些实施方案的微流体装置的优选实施方案包括加料室30、任选的混合室32、包括固相材料的分离室36、洗脱剂室38、和任选的扩增室42。这些室为彼此流体相通的，使得样品可以被加载到加料室30中，然后样品被转移到混合室32，或者如果不存在混合室32的话，则样品被直接转移到分离室36中。如果样品例如与裂解试剂预混合(即，预裂解)，则不再需要混合室32。或者，混合室32可以包括裂解试剂，例如以预置的(并且通常为干燥的)形式。将裂解样品转移到分离室36中用于接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料。然后将洗脱剂室38中的洗脱剂转移到分离室36，以除去至少一部分所需的含核酸的物质和/或核酸。可以用强碱洗脱样品，用于进一步裂解。在一些情况中，在使用强碱裂解之后，可以将样品在高温(95℃)下加热几分钟，使得对PCR有抑制作用的蛋白质变性，随后使用试剂如TRIS缓冲液中和，用于在PCR之前调节样品的pH。或者，可以将洗脱的样品转移到另外的用于使用其它方法(如，加热、蛋白酶K)进一步裂解的室中。或者，如果期望，这些试剂可为预置的(并且为干燥的)。在某些实施方案中，这种材料可以被直接转移到扩增反应室42中用于例如进行PCR过程。扩增反应室42可以任选地包括预置的用于扩增反应(如，PCR)的反应物。
另外的实施方案
在涉及使用微流体装置的这种方法的某些实施方案中，将样品置于加料室中发生在使样品接触第一裂解试剂之前。或者，将样品置于加料室中发生在样品接触第一裂解试剂之后。第一裂解试剂可为例如水或非离子型表面活性剂。
如果需要另外的裂解以从含核酸的物质(如，细胞核)释放核酸，可使用其它裂解条件。例如，其包括在任选加热的条件下使含核酸的物质经历强碱处理。强碱通常为NaOH，但是可以是其它强碱，如KOH、LiOH、NH4OH，以及伯胺、仲胺、或叔胺。通常，温度为室温。如果使用碱，则包含释放的核酸的样品需要调整其pH，特别是如果核酸要经历随后的扩增过程。因此，本发明的某些实施方案包括调整样品的pH通常到至少7.5，通常到不大于9。
在涉及使用微流体装置的这种方法的某些实施方案中，第一裂解试剂为非离子型表面活性剂。在这种方法的某些实施方案中，加料室包括第一裂解试剂(如，预置的(并且通常为干燥的)非离子型表面活性剂)并且在将样品置于加料室中时发生样品接触第一裂解试剂。
或者，可以将样品转移到随后的其中具有第一裂解试剂(优选为非离子型表面活性剂)的处理室中。例如，样品接触第一裂解试剂(优选为非离子型表面活性剂)在混合室中发生，在充分的混合下进行以破坏细胞膜和释放细胞核和抑制剂，以形成裂解样品。应该理解，如果使用“第一”裂解试剂，该方法不必须使用“第二”裂解试剂；相反地，本文中使用的术语“第一裂解试剂”是与如果使用的任何另外的裂解试剂相区别。
如上所述，在缓冲液(特别是TRIS缓冲液)中加入蔗糖可有助于细胞核的分离。缓冲液也可包括镁盐和表面活性剂如TRITON X-100。这也可为白细胞的裂解提供良好介质。另外，在某些情况下，当需要收集细胞核时，特别是在微流体装置内，使用细胞核存储缓冲液可能有用。细胞核存储缓冲液可以在例如缓冲液(如，TRIS缓冲液)中包括蔗糖、镁盐、EDTA、二硫苏糖醇、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、和/或甘油并且允许细胞核的稳态存储。
在涉及使用微流体装置的这种方法的某些实施方案中，在有阀处理室中形成样品浓缩区包括将处理室中的样品离心。通常，使样品浓缩区与样品次浓缩区分离包括通过阀将样品次浓缩区转移到废料室。当使用微流体装置时，例如维持2分钟的400rcf的离心速度通常为合乎需要的，尽管可使用更高的转速和/和更长的旋转时间。
可以将非离子型表面活性剂如TRITON X-100预置(并且如果期望可均匀地干燥)在微流体装置的混合室中，使得例如当样品(如，血液)与表面活性剂混合几分钟时发生裂解。在其它情况下，可以在引入到混合室中之前将表面活性剂的稀溶液与样品(如，血液)预混合。
在其它情况下，在不使用非离子型表面活性剂时，可使用水或者氯化铵用于红细胞的裂解。在混合室中发生裂解之后，在相对低的速度将白细胞离心下来。
在本文中所述的方法的某些实施方案中，样品可为全血。然后通常将全血分离为各组成部分并且将包含白细胞的部分(通常称为血沉棕黄层)分离并且裂解以释放细胞核和/或核酸。例如，在某些实施方案中，该方法可以包括将全血离心(如，在有阀处理室中)以形成血浆层(经常在上层)、红细胞层(经常在下层)、和包括白细胞的界面层，并且除去显著部分的界面层(即，血沉棕黄层)。然后可使血沉棕黄层经历进一步处理。
在某些实施方案中，可以使用常规方法从全血分离血沉棕黄层。然后可将血沉棕黄层用作本文中所述的方法中的样品。
除上述的固相材料之外，可以将其它类型的固相材料，特别是小珠，引入到本发明的多个实施方案的微流体装置中。例如，可以用适当的基团将小珠官能化，用于分离特定的细胞、病毒、细菌、蛋白质、核酸等。可以通过离心和随后的分离从样品分离小珠。小珠可以设计成具有用于分离的适当的密度和尺寸(纳米到微米)。例如，在病毒捕获的情况中，可在从血清样品中除去少量残留的抑制剂之前或之后使用识别病毒的蛋白质外壳的小珠捕获和使病毒浓缩。
可以在病毒被捕获在小珠上之前或之后使用固相材料除去抑制剂，如本文中所述的。处理这些之外，可以如在＿＿＿提交的标题为“METHODS FOR NUCLEIC ACID ISOLATION AND KITS USING AMICROFLUIDIC DEVICE AND CONCENTRATION STEP”的美国专利申请＿＿＿(Attorney Docket No.59801US002)中公开的使用浓缩/分离/任选的稀释步骤降低抑制剂的量。这种浓缩/分离/任选的稀释步骤可用于本文中所述的多种方法和样品。
可以通过裂解从分离的病毒粒子提取出核酸。因此，小珠可以提供在微流体装置内的特定区域中浓缩相关材料的方法，还允许从捕获粒子洗涤不相关材料和洗脱相关材料。
这种小珠的例子包括但不限于交联的聚苯乙烯小珠，其可得自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)的商业名称CHELEX下，具有三(2-氨基乙基)胺、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、聚胺和聚亚胺的交联的琼脂糖小珠；以及购自Rohm and Haas(Philadelphia，PA)的商业名称DUOLITE C-467和DUOLITE GT73下的螯合离子交换树脂；AMBERLITE IRC-748、DIAION CR11、DUOLITE C647。这些小珠还适合用作如上所述的固相材料。
小珠的其它例子包括购自商业名称GENE FIZZ(Eurobio，France)、GENE RELEASER(Bioventures Inc.，Murfreesboro，TN)、和BUGS NBEADS(GenPoint，Oslo，Norway)下的那些，以及Zymo小珠(ZymoResearch，Orange，CA)和DYNAL小珠(Dynal，Oslo，Norway)。
其它材料也可用于病原体捕获(如，病毒粒子、细菌)。例如，聚合物涂层也可在本发明的某些实施方案中用于分离特定的细胞、病毒、细菌、蛋白质、核酸等。这些聚合物涂层可以被直接射流喷雾在例如微流体装置的覆盖膜上。
可以通过使抗体共价连接在小珠表面上而将病毒粒子捕获在小珠上。抗体可以用于对抗病毒的外壳蛋白质。例如，DYNAL小珠可用于共价连接抗体。或者，合成聚合物如阴离子交换聚合物可用于浓缩病毒粒子。市售的树脂如viraffinity(Biotech Support Group，East Brunswick，NJ)可用于涂布小珠或在微流体装置内的选定位置上用作聚合物涂层，以浓缩病毒粒子。BUGS N BEADS(GenPoint，Oslo，Norway)可用于例如细菌的提取。在这里，这些小珠可用于捕获细菌如葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(E coli)、沙门氏菌(Salmonella)、和Clamydia原生小体。
因此，在本发明的一个实施方案中，当样品包括病毒粒子或其它病原体(如，细菌)时，微流体装置可以包括病毒捕获小珠或其它病原体捕获材料形式的固相材料。更具体地，在一种情况中，病毒捕获小珠可只用于病毒或细菌的浓缩，例如随后将小珠分离到另一个室中，并以病毒或细菌的裂解结束。在另一种情况中，小珠可用于病毒或细菌的浓缩，随后在相同的小珠上裂解和捕获核酸，将小珠稀释，将小珠浓缩，分离小珠，并且在洗脱捕获的核酸之前重复该过程多次。
如果核酸的下游应用是使其经历扩增过程如PCR，则优选用于该方法的所有试剂都与这种过程相容(如，PCR相容的)。另外，PCR促进剂(facilitators)的加入可能有用，特别是用于诊断目的。此外，在扩增之前将要扩增的材料加热可能是有利的。
在其中没有完全除去抑制剂的实施方案中，可以加入缓冲液、酶、和PCR促进剂，它们帮助在抑制剂存在下的扩增过程。例如，可以使用对抑制剂更具耐受性的不同于Taq聚合酶的酶，如rTth，从而为PCR扩增提供巨大的益处。可加入牛血清白蛋白、甜菜碱、蛋白酶抑制因子、牛运铁蛋白等，已知它们可以进一步有助于扩增过程。或者，可以使用市售的产品如Novagen′s Blood Direct PCR Buffer试剂盒(EMDBiosciences，Darmstadt，Germany)，用于从全血直接扩增而无需大规模的纯化。
通过以下实施例进一步说明本发明的目的和优点，但是不应将在这些实施例中叙述的具体材料及其量、以及其它条件和细节理解为过度地限定本发明。
实施例
实施例1A：固相材料的制备：没有TRITON X-100的氨形式
将3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于玻璃过滤器支架中。根据打印在包装说明书上的方法将萃取碟形物转化为氨的形式。
实施例1B：固相材料的制备：具有TRITON X-100的氨形式
将3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于玻璃过滤器支架中。根据打印在包装说明书上的方法将萃取碟形物转化为氨的形式。将碟形物置于小瓶中并浸在1％TRITON X-100(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液(0.1克(g)的TRITON X-100在10mL水中)中，在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker(Barnstead/Thermolyne，Dubuque，IA)上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1C：固相材料的制备：具有TRITON X-100的Anion-SREmpore螯合膜
将3M No.2252 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并浸在1％TRITON X-100溶液(0.1g的TRITON X-100在10毫升(mL)水中)中，在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1D：固相材料的制备：具有TRITON X-100的C8螯合膜
将3M No.2214 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并浸在1％TRITON X-100溶液(0.1g的TRITON X-100在10毫升(mL)水中)中，在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1E：固相材料的制备：具有TRITON X-100和FR-2025的螯合膜
将3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并浸在1％TRITON X-100溶液(0.1g的TRITON X-100在10毫升(mL)水中)与0.1％FR-2025(3M，St.Paul，MN)为50/50的混合物中，并在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1F：固相材料的制备：具有TRITON X-100和FC-4430的螯合膜
将3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并且悬浮在1％TRITON X-100(0.1g的TRITON X-100在10毫升(mL)水中)与0.1％FC-4430(3M，St.Paul，MN)为50/50的混合物中，并在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1G：固相材料的制备：具有TRITON X-100和PSSA的螯合膜
将3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于玻璃过滤器支架中。根据包装说明书上打印的方法将该提取用碟形物转化为氨形状。将碟形物置于小瓶中并且浸在1％TRITON X-100(0.1g的TRITONX-100在10毫升(mL)水中)与1％PSSA(聚(4-苯乙烯磺酸钠)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(将20重量％PSSA储备液在不含核糖核酸酶的无菌水中稀释到1重量％)为50/50的混合物中，并在ThermolyneVari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1H：固相材料的制备：具有TRITON X-100的Cation-SREMPORE螯合膜
将3M No.2251 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并且浸在1％TRITON X-100溶液(0.1g的TRITON X-100在10mL水中)中，在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例1J：固相材料的制备：具有TRITON X-100的EMPORE螯合膜
将3M No.2241 EMPORE Extraction螯合用碟形物置于小瓶中并且浸在1％TRITON X-100溶液(0.1g的TRITON X-100在10mL水中)中，在Thermolyne Vari-Mix Model M48725 Rocker上混合约6-8小时。将碟形物置于玻璃过滤器支架上，通过施加真空约20分钟(min)干燥，然后在室温(约21℃)下干燥过夜，注意不要进行洗涤和漂洗。
实施例2：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机(Brinkmann，Westbury，NY)中在400 rcf离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将这个材料转移到3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取用碟形物加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色为从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(pH 7.4)中。
实施例3：使用氨化的螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在实施例1A中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(pH 7.4)中。
实施例4：使用具有TRITON X-100的氨化的螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(pH 7.4)中。
实施例5A：在用固相材料处理之前通过对全血进行离心而浓缩基因组DNA：从管顶部分离样品
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。从离心管的顶部取出二(2)μL的等分试样并转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例5B：在用固相材料处理之前通过对全血进行离心而浓缩基因组DNA：从管底部分离样品
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。从离心管的底部取出二(2)μL的等分试样并转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例5C：通过使用固相材料的处理纯化基因组DNA：从管的顶部分离样品—没有浓缩步骤
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。从离心管的顶部取出二(2)μL的等分试样并转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例6A：通过将全血离心随后进行QIAamp提纯浓缩基因组DNA：从管顶部分离样品
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。从离心管的顶部取出二(2)μL的等分试样并加入到198μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。根据在QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook，第27页(Qiagen，Valencia，CA)中所述的“Blood and Body Fluid Spin Protocol”用72μL的水洗脱，得到洁净的DNA。
实施例6B：通过将全血离心随后进行QIAamp提纯浓缩基因组DNA：从管底部分离样品
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。从离心管的底部取出二(2)μL的等分试样并加入到198μL的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。根据在QIAamp DNA Bloodmini Kit Handbook，第27页(Qiagen，Valencia，CA)中所述的“Blood and Body Fluid Spin Protocol”用72μL的水洗脱，得到洁净的DNA。
实施例6C：通过QIAamp提纯收集基因组DNA：从管顶部分离样品一不经离心
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。从离心管的顶部取出二(2)μL的等分试样并加入到198μL的1X磷酸盐缓冲盐水(PB S)中。根据在QIAamp DNA Bloodmini Kit Handbook，第27页(Qiagen，Valencia，CA)中所述的“Blood and Body Fluid Spin Protocol”用72μL的水洗脱，得到洁净的DNA。
实施例7A：抑制剂/DNA对PCR的影响：在固定的DNA浓度下改变抑制剂浓度
在强化纯的人基因组DNA之前制得抑制剂的系列稀释物，以便研究抑制剂对PCR的影响。向10μL的15纳克/微升(ng/μL)人基因组DNA中加入1μL的不同的Mix I(纯的或其稀释物)(样品7-没有加入抑制剂，7D-纯的，7E-1∶10、7F-1∶30、7G-1∶100、7H-1∶300)并涡旋。取得每个样品的二(2)μL等分样品用于20μL的PCR。结果如表2中所示。
Mix I：向一百(100)μL的全血中加入1μL的纯的TRITON X-100。将溶液在室温(约21℃)下培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信在进行下一步之前其是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf离心约10分钟。从微量离心管的顶部取得约80μL并指定为Mix I。
实施例7B：抑制剂/DNA对PCR的影响：在固定的抑制剂浓度下改变DNA浓度
向10μL的人基因组DNA中加入1μL的1∶3稀释的Mix I(如上所述的)。研究的DNA浓度如下：样品7J-15ng/μL、7K-7.5ng/μL、7L-3.75ng/μL、7M-1.5ng/μL。从每个样品取得二(2)μL的等分样品用于20μL的PCR。结果如表2中所示。
实施例7C：抑制剂/DNA对PCR的影响：未加入抑制剂的DNA
向每个DNA样品中加入1μL的水代替抑制剂制备以下样品：样品7N-15ng/μL、7P-7.5ng/μL、7Q-3.75ng/μL、7R-1.5ng/μL。从每个样品取得二(2)μL的等分样品用于20μL的PCR。结果如表2中所示。
表2
| 样品编号 | Ct(一式两份样品) | 样品编号 | Ct(一式两份样品) |
| 7 | 19.1019.06 | 7K | 29.1630.22 |
| 7D | 13.9429.50 | 7L | 30.4729.96 |
| 7E | 27.3926.22 | 7M | 28.4326.16 |
| 7F | 21.4420.66 | 7N | 20.0519.80 |
| 7G | 19.9019.30 | 7P | 20.7420.54 |
| 7H | 19.9020.08 | 7Q | 21.9521.88 |
| 7J | 28.4528.61 | 7R | 22.6723.10 |
实施例8A：从固相材料回收细胞核
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到2μL的白细胞(PBMC)中。将溶液短暂地涡旋并在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约1分钟。将三(3)μL置于在实施例1B中制备的螯合膜上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟。向提取膜加入十三(13)μL的0.077MNaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于13μL)。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40毫摩尔(mM)的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例8B：不使用固相材料回收细胞核
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到2μL的白细胞(PBMC)中。将溶液短暂地涡旋并在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约1分钟。向溶液中加入十(10)μL的0.1M NaOH并在室温(约21℃)培养约5分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例8C：后来用细胞核强化的样品
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到2μL水中。将溶液短暂地涡旋并在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约1分钟。将三(3)μL置于在实施例1B中制备的螯合膜上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟。向提取膜加入十三(13)μL的0.077M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于13μL)。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。将二(2)μL的白细胞(PBMC)加入到溶液的10μL等分试样中并在室温(约21℃)培养约5分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例9A：使用固相材料从全血分离基因组DNA的方法：用NaOH从固相材料提取
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的0.083摩尔(M)的NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。向溶液的10μL等分试样加入五十(50)μL的1X TE缓冲剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。向溶液中加入三百(300)μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)。
实施例9B：使用固相材料从全血分离基因组DNA的方法：用水从固相材料提取
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十二微升(12μL)的水。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。向溶液的10μL等分试样加入五十(50)μL的0.1M NaOH并在室温(约21℃)培养约5分钟。向溶液中加入三百(300)μL的40mM的TRIS-HCl(pH7.4)。
实施例10：在用TRITON X-100处理的氨化的螯合固相材料上从全血分离基因组DNA
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将该物质转移到在实施例1B中制备的提取膜，确保材料均匀分布在膜的表面上。允许材料在膜上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取膜加入十三(13)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例11：使用Anion-SR螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)mL浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1C中所述制备的3M No.2252 EMPORE Anion-SRExtraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取用碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例12：使用C8螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)mL浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1D中所述制备的3M No.2214 EMPORE C-8 Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例13：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1E中所述制备的3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例14：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1F中所述制备的3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的O.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例15：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)mL浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1G中所述制备的3M No.2271EMPORE Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例16：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1H中所述制备的3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例17：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一(1)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约10分钟。分离并弃去上清液，留下离心管底部的约二(2)μL的浓缩物质。将该物质转移到在如实施例1J中所述制备的3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物上，确保材料均匀分布在碟形物的表面上。允许材料在碟形物上干燥约2-5分钟，直到强烈的红色变深。向提取碟形物加入十二(12)μL的0.083M NaOH。将溶液在移液管末端上下混合2-3次并在混合之后除去(虽然可能得到少于12μL)。从膜除去的样品的颜色从无色变为淡绿色。如果溶液呈泡沫状，则将其在4,000转/分钟(rpm)离心1分钟。取出2μL的等分试样并将其加入到10μL的40mM的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例18：使用安装在微流体装置上的具有TRITON X-100的氨化的螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将二(2)μL的纯的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。将溶液在室温(约21℃)培养约5分钟，将溶液间歇地涡流(每20秒进行约5秒)。观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约2分钟。将顶部溶液抛弃，留下管底部的4μL。向4μL的浓缩材料中加入4μL的核糖核酸酶水并将样品充分混合。然后将样品置于如申请人的受让人在2003年12月12日提交的待决美国专利申请10/734,682中所述的微流体装置(图1)上的进样口中。将溶液在500rpm离心5分钟以清洗包含如实施例1B中所述制备的3M No.2271 EMPORE Extraction螯合用碟形物的室，使用10％X-100代替1％TRITON X-100作为加料溶液。将0.1MNaOH的五(5)μL等分试样加入到不同的进样口中并在1000rpm离心5分钟，用于如上所述对室进行清洗。将0.1M NaOH的十(10)μL等分试样加入到相同的进样口中并将溶液在2500rpm离心10分钟。取出5μL并将其加入到1.5μL的1M的TRIS-HCl(pH 7.4)中。
实施例19：使用螯合固相材料从全血分离基因组DNA的方法
将一百(100)μL的全血加入到一百(100)μL的2％TRITON X-100中。将溶液充分混合然后观察溶液以确信其在进行下一步之前是透明的。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下离心约2分钟。从顶部除去溶液的95μL等分试样并抛弃。将包含浓缩材料的最后五(5)μL置于如实施例1B中所述制备的3M No.2271 EMPOREExtraction螯合用碟形物上，使用10％TRITON X-100代替1％TRITONX-100作为加料溶液。在溶液浸在碟形物中之后，将样品用0.1M NaOH的二十(20)μL等分试样提取。将溶液在Eppendorf Model 5415D离心机中在400rcf下短暂地离心。将样品的十一(11)μL等分试样在95℃加热3分钟，然后加入到三(3)μL的1M TRIS-HCl(pH7.4)中。
实施例20：从全血分离基因组DNA的方法
将五(5)μL的全血加入到十(10)μL的10mM NaOH中。在培养1分钟之后，将样品在95℃加热3分钟。将16mM TRIS-HCl(pH 7.4)的五(5)μL等分试样加入到10μL的样品中。
结果
表3报告了根据QuantiTech SYBR Green PCR Handbook第10-12页中关于制备10μL PCR样品(在10μL SYBR Green Master Mix中的2μL样品、4μL的β-肌动蛋白、4μL的水)的指导，在ABI 7700 QPCRMachine(Applera，Foster City，CA)上得到的实施例1-17、19、和20的结果；实施例18的结果根据关于制备10μL PCR样品(在5.5μL的不含核糖核酸酶的无菌水中的2.5μL样品、1μL的10x Factor V Leiden ReactionMix、和1μL的10x Factor V Leiden Mutation Detection Mix)的LightCycler Factor V Leiden Mutation试剂盒的包装说明书第2-3页在LightCycler 2.0(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)上得到。在Horizon 11-14 Electrophoresis Machine(Gibco BRL，G aithersburg，MD)上运行1％的琼脂糖凝胶(谱带亮度-+模糊、+++亮)。在405nm下在SpectraMax Plus384分光光度计上(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA.)进行光谱测量。每个样品的二个、三个、或四个数值表示一式两份、一式三份的、或一式四份。
表3
| 样品 | Ct | 谱带 | 405nm(平均值) |
| 在0.1M NaOH/40mM TRIS-HCl缓冲液中的1.5ng/μL人基因组DNA | 16.9220.67 | ++++++ | - |
| 在水中的1.5ng/μL人基因组DNA | 19.0118.67 | ++++++ | 0 |
| 在水中的1.5ng/μL人基因组DNA | 16.1816.28 | ++++++ | - |
| 实施例4 | 17-20(得自对多个样品的分析) | ++++++ | 0.24 |
| 实施例3 | 26、28 | + | - |
| 实施例2 | 28、27 | 无 | - |
| 实施例5A | 2828 | ++ | 0.37 |
| 实施例5B | 17、18 | ++++++ | 0.24 |
| 实施例5C | 2426 | ++++ | - |
| 实施例6A | 2324 | ++ | 0 |
| 实施例6B | 1718 | ++++++ | 0 |
| 实施例6C | 2121 | ++++ | 0 |
| 实施例7A和7B1∶36稀释的Mix I | - | - | 2.63 |
| 实施例7A和7B1∶360稀释的Mix I | - | - | 0.38 |
| 实施例7A和7B1∶3600稀释的Mix I | - | - | 0.036 |
| 实施例7A和7B1∶36000稀释的Mix I | - | - | 0 |
| 实施例8A | 22211822 | +++ | - |
| 实施例8B | 22211821 | ++ | - |
| 实施例8C | 20202122 | - | - |
| 实施例9A | 2119 | - | 0.0190.007 |
| 实施例9B | 2528 | - | 0.0290.074 |
| 实施例10 | 26.8626.11 | +++ | - |
| 实施例11 | 24.8720.38 | - | - |
| 实施例12 | 26.7426.04 | - | - |
| 实施例13 | 26.01 | - | 0.245 |
| 实施例14 | 19.82 | - | 0.377 |
| 实施例15 | 27.9230.04 | ||
| 实施例16 | - | - | 0.07 |
| 实施例17 | - | - | 0.918 |
| 实施例18 | 27.39(工作台对照) | - | - |
| 实施例19* | 23.72、24.03 | - | - |
| 实施例20* | 30.35、30.56 | - | - |
*实施例19-20的阳性对照是根据QIAamp DNA Blood Mini KitHandbook第27页中所述的“Blood and Body Fluid Spin Protocol”从二百(200)μL全血中提取的DNA，在200μL水中洗脱，并且具有23的Ct值。在这些实验中对阴性对照(NTC或无模板对照)没有进行扩增。
本发明的多种改变和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，而不脱离本发明的范围。应该理解，本发明不受本文提出的示例性实施方案和实施例的过度限制，并且这种实施例和实施方案只是作为例子存在，本发明的范围仅由如下本文中提出的权利要求限制。
Claims (47)
1.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括含核酸的物质和抑制剂的样品；
形成样品浓缩区；其中样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；
使样品浓缩区与样品次浓缩区基本上分离；
使分离的样品浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地裂解含核酸的物质以释放核酸；和
使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
2.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
形成裂解样品浓缩区；其中裂解样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；
使裂解样品浓缩区与裂解样品次浓缩区基本上分离；
使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和
使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
3.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞的样品；
使生物样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以及形成裂解样品的条件下接触非离子型表面活性剂；
形成裂解样品浓缩区；其中样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；
使裂解样品浓缩区与裂解样品次浓缩区基本上分离；
使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解细胞核以释放核酸；和
使至少一部分细胞核和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
4.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；
提供包括含核酸的物质和抑制剂的样品；
将样品置于加料室中；
将样品转移到有阀处理室；
在有阀处理室中形成样品浓缩区，其中样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；
使样品浓缩区与样品次浓缩区基本上分离；
将分离的样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地裂解含核酸的物质以释放核酸；和
使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
5.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
将样品置于加料室中；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
将裂解样品转移到有阀处理室；
在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区，其中裂解样品浓缩区包括含核酸的物质和抑制剂；
使裂解样品浓缩区与裂解样品次浓缩区基本上分离；
将分离的裂解样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和
使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
6.权利要求5的方法，其中含核酸的物质包括细胞核并且该方法包括使至少一部分细胞核与固相材料分离。
7.权利要求5的方法，其中使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离包括将含核酸的物质和/或核酸转移到扩增反应室。
8.权利要求7的方法，其进一步包括使细胞核和/或核酸经历扩增反应。
9.权利要求5的方法，其中使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离包括用洗脱剂从固相材料洗脱至少一部分含核酸的物质和/或核酸，任选地加热含核酸的物质和/或细胞核，和任选地调节pH。
10.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；
提供包括含抑制剂的细胞和含细胞核的细胞的样品；
将样品置于加料室中；
使样品在有效破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以形成裂解样品的条件下接触非离子型表面活性剂；
将裂解样品转移到有阀处理室；
在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区，其中裂解样品浓缩区包括细胞核和抑制剂；
使裂解样品浓缩区与裂解样品次浓缩区基本上分离；
将分离的裂解样品浓缩区转移到分离室与固相材料接触，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使分离的裂解样品浓缩区接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解细胞核以释放核酸；和
使至少一部分细胞核和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离。
11.权利要求10的方法，其中使至少一部分细胞核和/或核酸与固相材料分离包括将细胞核和/或核酸转移到扩增反应室。
12.权利要求11的方法，其进一步包括任选地加热细胞核和/或核酸、任选地调节pH、和使细胞核和/或核酸经历扩增反应。
13.权利要求10的方法，其中将样品置于加料室中发生在样品接触非离子型表面活性剂之前。
14.权利要求10的方法，其中加料室包括预置的非离子型表面活性剂并且样品接触非离子型表面活性剂发生在将样品置于加料室中时。
15.权利要求10的方法，其中将样品置于加料室中发生在样品接触非离子型表面活性剂之后。
16.权利要求10的方法，其中样品接触非离子型表面活性剂在混合室中在充分混合以破坏细胞膜并释放细胞核和抑制剂以形成裂解样品的条件下进行。
17.权利要求10的方法，其中在有阀处理室中形成裂解样品浓缩区包括对处理室中的样品进行离心。
18.权利要求17的方法，其中使裂解样品浓缩区与裂解样品次浓缩区分离包括通过阀将裂解样品次浓缩区转移到废料室。
19.权利要求10的方法，其中涂层试剂包括表面活性剂。
20.权利要求10的方法，其中使至少一部分细胞核和/或核酸与固相材料分离包括用洗脱剂从固相材料洗脱至少一部分细胞核和/或核酸。
21.权利要求20的方法，其中洗脱剂为裂解试剂。
22.权利要求10的方法，其中使用第二裂解试剂进行另外的裂解步骤。
23.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括核酸和抑制剂的样品；
使样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使裂解样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地裂解如果存在的含核酸的物质以释放核酸；和
通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
24.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
使裂解样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
在使裂解样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；和
通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
25.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
使裂解样品接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；
使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和
在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
26.权利要求25的方法，其中含核酸的物质包括细胞核。
27.权利要求25的方法，其中涂层试剂包括表面活性剂。
28.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供微流体装置，该微流体装置包括加料室、和包括固相材料的分离室；
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
将样品置于加料室中；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
将裂解样品转移到分离室以接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；
在使样品接触固相材料之前、同时、或之后任选地进一步裂解含核酸的物质以释放核酸；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
通过用洗脱剂洗脱使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离，条件是洗脱剂不是非离子型表面活性剂。
29.从样品分离核酸的方法，该方法包括：
提供微流体装置，该微流体装置包括加料室、和包括固相材料的分离室；
提供包括含核酸的物质和含抑制剂的细胞的样品；
将样品置于加料室中；
使样品在有效破坏细胞膜并释放抑制剂以及形成包括含核酸的物质和抑制剂的裂解样品的条件下接触第一裂解试剂；
将裂解样品转移到分离室以接触固相材料，使得至少一部分抑制剂优先附着于固相材料；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
使至少一部分含核酸的物质与附着了至少一部分抑制剂的固相材料分离；和
在分离含核酸的物质之后，进一步裂解含核酸的物质以释放核酸。
30.权利要求29的方法，其中含核酸的物质包括细胞核。
31.权利要求29的方法，其中使含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离包括将含核酸的物质和/或核酸转移到扩增反应室。
32.权利要求31的方法，其进一步包括使含核酸的物质和/或核酸经历扩增反应。
33.权利要求29的方法，其中将样品置于加料室中发生在样品接触第一裂解试剂之前。
34.权利要求29的方法，其中加料室包括第一裂解试剂并且样品接触第一裂解试剂发生在将样品置于加料室中时。
35.权利要求29的方法，其中将样品置于加料室中发生在样品接触第一裂解试剂之后。
36.权利要求29的方法，其中在有阀处理室中形成样品浓缩区包括对处理室中的样品进行离心。
37.权利要求29的方法，其中固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂，其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合。
38.权利要求29的方法，其中第一裂解试剂为非离子型表面活性剂。
39.权利要求29的方法，其中分离包括用洗脱剂从固相材料洗脱至少一部分含核酸的物质。
40.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
第一裂解试剂；
固相材料，该固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求2的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
41.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
第一裂解试剂；
固相材料，该固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求24的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
42.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
非离子型表面活性剂；
固相材料，该固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求3的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
43.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
非离子型表面活性剂；
固相材料，该固相材料包括聚四氟乙烯原纤维基质、陷入在基质中的吸附性粒子、和涂布到固相材料上的涂层试剂；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求25的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
44.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
第一裂解试剂；
微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求5的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
45.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
第一裂解试剂；
微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求28的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
46.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
非离子型表面活性剂；
微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求10的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
47.用于从样品分离核酸的试剂盒，该试剂盒包括：
非离子型表面活性剂；
微流体装置，该微流体装置包括加料室、有阀处理室、和包括固相材料的分离室；其中固相材料包括捕获部位、涂布到固相材料上的涂层试剂、或两者；其中涂层试剂选自表面活性剂、强碱、聚电解质、可选择性渗透的聚合物屏障、及其组合；和
指导说明，用于根据权利要求29的方法将样品裂解和使至少一部分含核酸的物质和/或核酸与固相材料分离。
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