CN1908159A - D－氨基酸生产菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有脱氨甲酰基酶(DCase)和D－乙内酰脲酶(DHase)酶活性的D－氨基酸生产菌株及其构建方法。该D－氨基酸生产菌株通过克隆DCase和DHase基因，将克隆的基因与适当的载体相连接，然后导入具有DCase和/或Dhase活性的宿主细胞中而获得。将该生产菌株用于转化DL－5－取代乙内酰脲以制备D－氨基酸，可显著提高反应转化率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地讲，是关于一种具有高转化活性的D-氨基酸生产菌株(转化微生物)及其构建方法。
背景技术
旋光性D-氨基酸是抗生物质的侧链和多肽类药物制备过程中所需的氨基酸，其制备方法可以是：先用D-乙内酰脲酶(DHase，又称为D-海因酶)将DL-5-取代乙内酰脲水解成相应的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸(JP-B62-30785)，然后用D-N-氨甲酰基-α-氨基酸酰胺水解酶(DCase，又称为脱氨甲酰基酶)将所得的D-N-氨甲酰基-α-氨基酸转变成相应的D-α-氨基酸(PCT/JP91/01696；WO92/10579)。上述反应可将不同的5-取代乙内酰脲转化成多种D-α-氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、D-对羟基苯甘氨酸等(Roche，HYD DOC.1999，05，06.p6)。
β-内酰胺类抗生素比如羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢洛奇等药物，具有抗菌活力强，广谱低毒等优点，是临床控制细菌感染的首选药物之一。D-对羟基苯甘氨酸(DHPG)是合成该类药物的一种重要中间体，用于制备羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢菌素的侧链，因此其制备日益受到制药和化工界的重视。
D-对羟基苯甘氨酸的制备技术按工艺路线可大致分为两类：其一是将对羟基苯甘氨酸消旋体进行光活性拆分以制备D-对羟基苯甘氨酸，称为消旋法；其二是对羟基苯乙内酰脲酶转化法制备D-对羟基苯甘氨酸，称为化学-酶法。化学-酶法是将化学合成产物，经酶催化反应而制备目的产物的方法。相比消旋法，该方法能耗低、污染少、产率高，能产生较高的经济效益及社会效益，具有广阔的应用前景。
化学-酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的方法是：用化学法合成5-对羟基苯乙内酰脲(也称为5-对羟基苯海因)，再将其经酶法转化制备得D-对羟基苯甘氨酸。其中酶法转化又包括：一酶一酸法、两菌两酶法和一菌两酶法。其中“一菌两酶法”是指利用一株菌株发酵同时产生D-乙内酰脲酶(DHase)和脱氨甲酰基酶(DCase)，利用两种酶同时作用，该串连反应将DL-对羟基苯乙内酰脲经一步操作生成D-氨基酸。相对于前两种方法，一菌两酶法只需一次发酵、一次转化，具有工艺最简单、流程短、设备投资小、污染小等优点，极具工业化应用前景。
国际上已对一菌两酶法进行了广泛的研究，筛选到了若干株能同时产D-乙内酰脲酶(DHase)和脱氨甲酰基酶(DCase)的菌株，其分布主要集中在假单胞菌属及土壤杆菌属上，如Pseudomonas sp.AJ-11220、Agrobacterium NRRL B11291等。许祯等分离了一株能转化DL-对羟基苯乙内酰脲为D-对羟基苯甘氨酸的一菌两酶菌株，克隆表达了相关基因，并对该菌进行了细菌分类学鉴定(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-154)。该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)，1995年该菌更名为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)(参见Yabuuchi E et al，1995.Ralstonia solanacearum(Smith 1896)comb.Nov.and Ralstonia eutropha(Davis 1969)comb.Nov.Microbiol Immunol.1995；39(11)：897-904)。
尽管一菌两酶法具有工艺简单、流程短等优点，但其大规模工业应用还是受到一些因素的制约。其中很重要的一点就是由于菌株的酶活力不够高，导致转化时间过长，增加了生产成本及副反应的发生。到目前为止，提高菌株酶活力的研究主要集中在克隆DHase基因和/或DCase基因，然后进行异源表达(R.Grifantini et al，Microbiology 144(4)：947-954，1998；G.J.Kim et al，Applied and Environmental Microbiology 66(5)：2133-2138，2000；Joo-Ho Park et al，Biotechnol.Prog.2000；16(4)pp 564-570)。但这种异源表达往往涉及到整个发酵工艺和转化工艺的改变。
提高现有D-氨基酸生产菌株的转化能力是拥有生产线的企业最迫切的需要，通过基因工程技术提高菌株DHase和/或DCase酶活性是一种富有前景的新途径。例如，欧洲专利EP 1568778报道了一种来源于一种土壤杆菌(Agrobacterium)染色体的DHase基因，将其克隆入宿主细胞比如土壤杆菌或者大肠杆菌后，所得基因工程菌的DHase酶活性显著提高，进而提高DL-5-取代乙内酰脲的水解反应速率。
在D-氨基酸的生产过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的缺点，导致中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对羟基苯甘氨酸产率低。因此DCase是两步酶法反应***中的一个关键酶、限速酶，如何提高生产菌株的DCase以及DHase酶活性，从而获得将DL-5-取代乙内酰脲转化为D-氨基酸的高转化菌株已成为本技术领域研究和努力的方向。
发明内容
本发明的首要目的就在于提供一种D-氨基酸生产菌株(转化微生物)，相比现有的生产菌株，该菌株具有显著较高的D-氨基酸转化活性。
本发明的另一目的在于提供上述高转化活性的D-氨基酸生产菌株的构建方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种D-氨基酸生产菌株，具有DHase和DCase酶活性，其特征在于，该生产菌株克隆了含有DCase和/或DHase基因的载体。
所述载体的宿主细胞选自：皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、PseudomonasKNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK 1415。
优选的，所述宿主细胞是皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens NRRL B11291或者土壤杆菌Agrobacterium KNK712。
本发明的D-氨基酸生产菌株的构建方法包括：克隆DCase和DHase基因，与适当的载体相连接，将重组载体转入可产生DHase和DCase的宿主细胞中，进而得到生产菌株。
上述方法中，优选的载体为可在多种宿主体内复制的载体即广宿主载体；特别优选的广宿主载体为pWB5。
优选的，所述载体通过结合转移、三亲本杂交或电击转化的方法导入宿主细胞。
所述DCase和/或DHase基因源自：皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、PseudomonasKNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK 1415。
优选的，所述宿主细胞与所述提供DHase和/或Dcase基因的微生物为同一种微生物；
特别优选的，所述宿主细胞为皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291或者土壤杆菌Agrobacterium KNK712。
优选的，所述D-氨基酸为D-对羟基苯甘氨酸。
与现有D-氨基酸生产菌株相比，本发明的通过在现有微生物中增加DHase和DCase基因的方法获得的菌株可显著提高其DCase和DHase酶活性，从而提高其转化D-氨基酸的能力。
本发明的的D-氨基酸生产菌株，由于导入的重组载体中含有野生型菌体染色体的控制酶表达的相关基因，用来进行D-氨基酸的制备时，发酵用培养基按照野生型菌发酵配制，转化底物的温度等各项参数均参照野生型菌的发酵，不需要额外补加诱导剂，不需要改变现有的生产工艺，即可大幅度提高底物的转化效率，因而具有非常广阔的应用前景。
具体实施方式
为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而并非对本发明的任何形式的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中，所述生产菌株是指克隆了DCase或/和DHase基因的D-氨基酸生产用菌株，也称为工程菌或者基因工程菌。
以下实施例中，除非特殊说明，所述“培养基”均指LB培养基，其成分为：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％，当制备平板和斜面时在其基本成分中加入2％琼脂。
实施例1、源于皮氏罗尔斯顿菌的DHase和DCase基因的克隆
设计一对引物：
PDD-U：5′-GGAGCTCTAGATCCGACCCT-3′(添加了XbalI位点)；和
PDD-D：5′-ACCAAAGCTTCGCCCGATG-3′(添加了HindIII位点)，
以含有DHase和DCase完整表达元件的载体pXZ-total(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)：149-154)为模板，进行PCR扩增。
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec，53℃45sec，72℃3min 30循环；72℃10min；16℃30min。
PCR反应结束后参照分子克隆进行0.9％琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用上海生工生物工程技术服务有限公司(上海生工)生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)回收2.7kb左右的片段。
实施例2、重组载体pYY05的构建
2.1、由MMYY08(CGMCC 1597)制备质粒pWB5
由LB平板上接种MMYY08菌于3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；12000rpm离心收集菌体，弃上清。
沉淀加0.1ml溶液I(1％葡萄糖，50mM EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合，置冰上5分钟；然后加入0.2ml溶液II(0.2mM NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5分钟；接着加入0.15ml预***液III(5mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5分钟；最后以12000rpm离心5分钟，取上清液于另一新离心管。
以苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)颠转混匀抽提一次，取上层液体；用两倍体积无水乙醇沉淀，于零下20度放置半小时；12000rpm离心5分钟，弃上消；沉淀用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体(室温RT干燥15～20min)；最后将沉淀溶于20～40μlTE液(或纯水)中，所得即为pWB5载体。
2.2、酶切DNA片断
按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤(参见www.takara.com.cn)，将实施例1中获得的DNA片断经过限制性内切酶Xbal I和HindIII双酶切。
酶切产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳后，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)回收3.2kb左右的片段。
2.3、载体pWB5酶切
按照步骤2.1的方法，将载体pWB5进行Xbal I和HindIII双酶切。酶切产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳后，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(Cat.NO.SK 1132)回收22kb左右的片段。
2.4、含DHase和DCase基因的载体构建
按照宝生物公司2004-2005产品目录操作要求及步骤，将步骤2.1和步骤2.2得到的酶切产物(DNA片断)用T4连接酶16℃连接过夜。
将连接过夜的DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有四环素(50μg/m1)的LB平板上筛选阳性克隆株。
提取阳性克隆株的质粒，进行DNA测序。经验证，重组子已包含有步骤2.1中的酶切核苷酸片断，该核苷酸片断序列与登陆号genebank AF320814相同的DHase和DCase基因，命名为pYY05。
实施例3、重组载体pYY05转化皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii
3.1、转化大肠杆菌pYY05/DH5α的构建
3.1.1、大肠杆菌DH5α(ATCC 53868)的培养
从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右。将该菌悬液以1∶100～1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3小时至OD600＝0.5左右。
3.1.2、感受态细胞的制备
a)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。
b)弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。
c)弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，得感受态细胞悬液。置于-70℃冰箱中保存备用。
3.1.3、重组载体pYY05转化大肠杆菌DH5α
A、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
B、加入pYY05质粒DNA溶液8μl(含质粒40ng)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
C、42℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3～5分钟。
D、向管中加入1ml LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌表达质粒编码的抗生素抗性基因(四环素)。
E、将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含四环素(Tc，10μg/ml)的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
F、长出的转化子即为pYY05/DH5α。
3.2、转化大肠杆菌pRK2013/Mm294的构建
3.2.1、大肠杆菌Mm294的培养
从LB平板上挑取新活化的E.coli Mm294(ATCC 33625)单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右。将该菌悬液以1∶100～1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。
3.2.2、感受态细胞的制备
a)将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。
b)弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。
c)弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5分钟，得感受态细胞悬液。置于-70℃冰箱中保存备用。
3.2.3、载体pRK2013转化大肠杆菌Mm294
A、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
B、加入pRK2013质粒(DSMZ 5599)溶液8μl(含质粒40ng)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
C、42℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
D、向管中加入1ml LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌表达质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素)。
E、将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含卡那霉素(Km，50μg/ml)的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
F、长出的转化子即为pRK2013/Mm294。
3.3、三亲本杂交法构建转化菌株
将转化大肠杆菌pYY05/DH5α、皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii MMR003(CGMCC1596)和转化大肠杆菌pRK2013/Mm294分别接入含有四环素(Tc，10μg/ml)、氨苄霉素(Ap，50μg/ml)、卡那霉素(Km，50μg/ml)的培养基中于37℃、28℃和37℃下培养过夜。
测定O.D.值，当三种菌的O.D.值大致为1∶1∶1后，取等量的三种菌体混合生长于覆盖有滤膜的培养基上面，于30℃培养48小时至72小时后将滤膜上的菌体用培养基洗下。
将菌液稀释100倍后涂布于含有Apr(50μg/ml)Kmr(50μg/ml)Tcr(40μg/ml)的三抗培养基上选出转化子。筛选得到的转化菌株命名为Ralstonia pickettii MMYY01(以下简称为MMYY01)，该菌株并已于2006年1月24日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为：CGMCC 1595。
实施例4、MMYY01与野生型皮氏罗尔斯顿菌的转化性状比较
4.1、培养基制备
取葡萄糖20.0克，玉米浆10.0克，氯化钠3.0克，七水硫酸镁0.5克，硫酸铵1.0克，氯化钴0.1克，DL-5-甲硫乙基海因20ml，水1000ml，调pH7.0-7.2，然后再加十二水磷酸氢二钠4.0克，磷酸二氢钾1.0克，溶解后分装入250ml三角瓶中，每瓶装50ml。1.0公斤高压蒸汽灭菌30min后备用。
4.2、菌体培养
将-70℃冰箱中保存的MMYY01和野生型菌Ralstonia pickettii接种于新鲜LB(含10μg/ml Tc)固体培养基上，28℃培养过夜。
接入含相同浓度抗生素的液体LB培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％的接种量将菌液接入100ml液体培养基中，30℃、180转/分摇床振荡培养30小时。
4000转/分离心30分钟，收集菌体。
4.3、转化5-对羟基苯海因
取发酵获得的新鲜湿菌体MMYY01和野生型菌MMR003各3克，分别悬浮于100毫升0.1M、pH8.0的磷酸缓冲液中，得菌悬液。
分别投入3克DL-5-对羟基苯海因，用氮气将瓶中的氧气置换完全后，于40℃振荡转化。按表1所示的时间间隔取样，用HPLC测定测定底物DL-5-对羟基苯海因和转化产物D-对羟基苯甘氨酸的含量。
4.4、转化结果比较
HPLC检测条件：取约1ml的反应液，离心以除去不溶解的底物，取上清500μl与500μl醋酸中止液混合，以中止反应。取适量混合液，稀释25倍后12000转/分钟离心，取上清以进行HPLC的测定。
HPLC测定中，甲醇∶水＝20∶80，以含磷酸2.25mM，磷酸二氢钾20mM，pH5.0的溶液为流动相，流速为1.0ml/in，检测210nm处各物质的峰高和保留值，绘制标准曲线。菌株转化效率比较见表1：
表1、转化过程中产物浓度变化比较
工程菌MMYY01
| 转化时间(小时) | 0.5 | 1 | 1.72 | 2.47 | 4.05 | 5.72 | 6.72 | 7.72 | 8.63 |
| 产物浓度(mg/ml) | 5.162 | 8.679 | 14.02 | 17.19 | 21.28 | 22.8 | 23.69 | 24.72 | 25.34 |
| 转化率(％) | 19.5 | 32.29 | 52.96 | 64.94 | 80.39 | 86.13 | 89.5 | 93.39 | 95.73 |
野生型菌
| 转化时间(小时) | 0.5 | 1 | 1.88 | 2.63 | 4.13 | 5.88 | 6.88 |
| 产物浓度(mg/ml) | 1.85 | 3.46 | 5.66 | 7.80 | 10.44 | 12.66 | 13.5 |
| 转化率(％) | 6.99 | 13.07 | 21.38 | 29.47 | 39.44 | 47.83 | 51 |
| 转化时间(小时) | 7.93 | 8.72 | 19.63 | 20.57 | 22.38 | 31.63 |
| 产物浓度(mg/ml) | 14.17 | 14.23 | 13.61 | 13.66 | 13.86 | 13.71 |
| 转化率(％) | 53.53 | 53.76 | 51.42 | 51.6 | 52.36 | 51.79 |
从上表可以看出：工程菌MMYY01经过8小时的连续转化，其底物转化率能达到95％左右，而相同条件下野生型菌Ralstonia pickettii经过22小时甚至30小时，其底物转化率也只能达到50％左右。可见工程菌在不需要额外补加诱导剂、不需要改变现有的生产工艺的前提下大幅度提高了底物的转化效率。
实施例5、重组载体pYY05转化根癌农杆菌
5.1、根癌农杆菌培养
将D-氨基酸生产用菌株--根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291接种于50mlLB液体培养基于30℃培养过夜。第二天按1∶100的比例接种于1L的LB液体培养基中，于30℃培养，并检测其OD600。
5.2、感受态细胞的制备
当OD600达到0.6±0.005时，迅速将摇瓶置于冰上30分钟，以抑制菌体的进一步生长。接着4℃、4000转每分钟，离心15分钟后，迅速弃去上清，将沉淀用10％甘油洗涤，并于4℃4000转每分钟，离心15分钟，弃去上清。重复操作一次后将洗涤后的菌体尽量吸干，之后用10％甘油重悬至终体积2ml左右，然后按照每管80μl或40μl的量分装，于-70℃保存备用。
5.3、电击转化感受态细胞
室温下使分装的感受态细胞融化，与2μl实施例2得到的重组载体pYY05混和，置于冰上2分钟。将混合物移至冰冷的电击转化杯中。调节电击仪，使电脉冲为25μF，电压2.5kV，电阻200欧姆。启动电击仪，电击转化。
脉冲结束后，在室温下加入LB培养基。将细胞转至微量离心管中，30℃振荡培养1小时。然后将细胞涂布于含有四环素(10μg/ml)的LB平板上，于30℃静置培养30小时，筛选得转化子。筛选得到的转化菌株命名为MMYY06。
实施例6、工程菌MMYY06与野生型菌NRRL B11291的DHase和DCase酶活比较
6.1、菌体培养
将-70℃冰箱保存的MMYY06和Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291菌种取出，置于新鲜LB(含10μg/ml Tc)固体培养基上，30℃培养30小时。接入含相同浓度抗生素的液体LB培养基中30℃振荡培养过夜后，按1％的接种量将菌接入液体培养基中(添加2％的DL-5-甲硫乙基海因)，30℃、180转/分摇床振荡培养30小时后，取样测酶活。
6.2、酶活性检测
测酶活的方法及计算公式如下：将1ml菌体离心，弃上清。菌体用1ml 0.1M、pH8.0的磷酸缓冲液悬浮，取400μl与测活反应液(测定DHase酶活及整体酶活时为：1％DL-5-对羟基苯海因，溶剂为0.1M、pH8.0的磷酸缓冲液；测定DCase酶活时为：3％N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸酰胺，溶剂为0.1M、pH8.0的磷酸缓冲液)混合，于40℃反应30分钟。
反应完成后立即与800μl 1M的盐酸终止反应，12000转每分钟离心3分钟，进行HPLC测定。HPLC测定条件与步骤4.4相同。
6.3、酶活力定义
DHase酶活力定义为：在40℃的条件下每分钟转化1微摩尔DL-5-对羟基苯海因生成N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸酰胺所需的菌体的量。
DCase酶活定义为：在40℃的条件下每分钟转化1微摩尔N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸酰胺生成D-对羟基苯甘氨酸所需的菌体的量。
整体酶活定义为：在40℃的条件下每分钟转化1微摩尔DL-5-对羟基苯海因生成D-对羟基苯甘氨酸所需的菌体的量。
6.4、酶活性比较结果
检测结果如表2所示，由表中看出，MMYY06的DHase酶活是其野生型菌的23倍，DCase酶活提高了12％，整体酶活提高了10倍以上。相比野生型，工程菌MMYY06转化5-对羟基苯海因的效率大大提高。
表2、工程菌和野生型根癌农杆菌的酶活比较
| 菌种 | DCase酶活(U/ml) | DHase酶活(U/ml) | 整体酶活(U/ml) |
| NRRL B11291 | 0.027854929 | 0.001889957 | 0.000314221 |
| MMYY06 | 0.031012831 | 0.04381321 | 0.004984063 |
实施例7、重组载体pYY05转化土壤杆菌Agrobacterium KNK712
7.1、土壤杆菌培养
将D-氨基酸生产菌株--土壤杆菌Agrobacterium KNK712(购自日本kaneka公司)接种于50ml LB液体培养基中，于30℃培养过夜。第二天按1∶100的比例接种于1L的LB液体培养基中，于30℃培养，并监测其OD600。
7.2、感受态细胞的制备
当OD600达到0.6±0.005时，迅速将摇瓶置于冰上30分钟，以抑制菌体的进一步生长。接着4℃、4000转每分钟，离心15分钟后，迅速弃去上清，将沉淀用10％甘油洗涤，并于4℃4000转每分钟，离心15分钟，弃去上清。重复操作一次后将洗涤后的菌体尽量吸干，之后用10％甘油重悬至终体积2ml左右，然后按照每管80μl或40μl分装，于-70℃保存备用。
7.3、电击转化感受态细胞
室温下使分装的感受态细胞融化，与2μl实施例2得到的重组载体pYY05混和，置于冰上2分钟。将混合物加至冰冷的电击转化杯中。调节电击仪，使电脉冲为25μF，电压2.5kV，电阻200欧姆。启动电击仪，电击转化。脉冲结束后，与室温下加入培养基。将细胞转至微量离心管中，30℃振荡培养1小时。然后将细胞涂布于含有四环素(10μg/ml)的LB平板上，于30℃静置培养32小时，筛选得转化子。筛选得到的转化菌株命名为MMYY07。
实施例8、工程菌MMYY07与野生型菌的DHase和DCase酶活比较
8.1、菌体培养
将-70℃冰箱中保存的MMYY07和野生型土壤杆菌取出，置于新鲜LB(含10μg/ml Tc)固体培养30小时左右，接入含相同浓度抗生素的液体LB培养基中，30℃振荡培养过夜后，按1％的接种量将菌接入液体培养基中(添加2％的DL-5-甲硫乙基海因)，30℃、180转/分摇床振荡培养30小时，取样测酶活。
8.2、酶活性检测
按照步骤6.2和6.3的方法测酶活。
8.3、酶活性比较结果
检测结果如表3所示，由表中看出，MMYY07的DHase酶活与野生型AgrobacteriumKNK712相比，提高了5.4％，DCase酶活提高了18.5％。可见，相比野生型，工程菌MMYY07转化5-对羟基苯海因的效率大大提高。
表3、工程菌和野生型土壤杆菌的酶活比较
| 菌种 | DCase酶活(U/ml) | DHase酶活(U/ml) |
| KNK712 | 2.838922 | 3.356089171 |
| MMYY07 | 3.365239 | 3.538202537 |
以上分别以具有DHase和DCase酶活性的皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291和土壤杆菌Agrobacterium KNK712为宿主细胞，通过将含有DHase和DCase基因的重组载体转化而构建得到相应生产菌株。相比野生型菌株，它们的DCase和DHase酶活性均得到大幅度提高，相应地，其转化D-氨基酸的能力也大大提高。因此，本发明的D-氨基酸生产菌株的构建方法及其获得的生产菌株具有非常广阔的应用前景。
上文所列的各相关文献均以全篇引入本申请作为参考。本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明之精神与范围的前提下，对上述描述的任何修饰都是允许的。同样，类似的情况也包括在权利要求中。
Claims (12)
1、一种D-氨基酸生产菌株，该菌株具有DHase和DCase酶活性，其特征在于，所述生产菌株克隆了含有DCase和DHase基因的载体。
2、如权利要求1所述的生产菌株，其特征在于，所述生产菌株选自：皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、Pseudomonas KNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK1415。
3、如权利要求2所述的生产菌株，其特征在于，所述生产菌株是皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291或土壤杆菌Agrobacterium KNK712。
4、如权利要求1所述的生产菌株，其特征在于，所述DCase和DHase基因从以下菌株克隆：皮氏罗尔斯顿菌Ralstoniapickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRLB11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、Pseudomonas KNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK 1415。
5、如权利要求4所述的生产菌株，其特征在于，所述DCase和DHase基因从皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291或土壤杆菌Agrobacterium KNK712克隆。
6、一种权利要求1所述D-氨基酸生产菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
克隆DCase和DHase基因，与适当的载体相连接，然后将重组载体转入可产生DCase和DHase的宿主细胞中，进而获得D-氨基酸生产菌株。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DCase和DHase基因源于下述微生物：皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRLB11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、Pseudomonas KNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK 1415。
8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体为pWB5。
9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体通过结合转移、三亲本杂交或电击转化的方法导入宿主细胞。
10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞与提供DCase和DHase的微生物为同一种微生物。
11、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自：皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia pickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、Pseudomonas KNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌Agrobacterium KNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK1415。
12、如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是皮氏罗尔斯顿菌Ralstoniapickettii、根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291或土壤杆菌AgrobacteriumKNK712。
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