CN1880447A - 一种高通量的单克隆抗体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量制备单克隆抗体的方法,包括步骤(a)用多种免疫原对非人哺乳动物进行免疫接种;(b)将免疫接种动物的脾细胞,与骨髓瘤细胞混合,并融合形成杂交瘤细胞;(c)收集杂交瘤细胞,培养,制备成杂交瘤细胞悬液;(d)用生物芯片对杂交瘤细胞进行筛选,从而得到分别分泌针对多种所述免疫原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明方法可通过一次免疫,同时筛选得到大量针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体,因而节省了大量时间与资金。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域,更具体地涉及一种联合使用蛋白芯片、多肽芯片与组织芯片高通量地制备单克隆抗体的方法。
背景技术
目前在单克隆抗体的制备过程中,传统的方法是使用一种蛋白或抗原免疫小鼠,通过ELISA方法测定出产生抗体的杂交瘤,进行克隆建株,然后进一步对纯化的单抗进行鉴定,如需要再检测其抗原表位。这种制备方法往往只能得到一种特异性抗体。
在实际工作中,融合率高时往往获得大量的产生抗体的杂交瘤,但无法同时克隆,只能根据酶标仪读出的OD值筛选阳性细胞,进行克隆建株,这样极有可能造成得到的不同细胞株的单抗作用于同一个抗原表位。
随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序,但是从基因组到蛋白质存在转录水平、翻译水平以及翻译后水平三种调控机制,基因组学中得到的信息,并不能全面代表蛋白质表达水平。
蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律,如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题,仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多,但正是这些可变性与多样性参与和影响着整个生命过程。
传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为:(1)生命现象的发生往往是多因素影响的,必然涉及到多个蛋白质。(2)多个蛋白质的参与是交织成网络的,或平行发生,或呈级联因果。(3)在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的,并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期,国际上产生了一门新兴学科-蛋白质组学(Proteomics),它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。
抗体是研究蛋白质性质和功能及其与疾病的关系的重要工具。抗体是分析细胞蛋白质组的理想工具,不仅特异性高,而且能非常灵敏地解读出细胞裂解液标本中蛋白质的相对丰度,用针对不同细胞蛋白的各种抗体,通过定量可以监测蛋白表达谱的变化;利用抗体芯片或用同一抗体对不同组织和不同状况的同一组织进行平行筛选,可以确定差异表达蛋白,甚至是新的未知蛋白或疾病相关的蛋白。
目前有效的制备单克隆抗体方法是杂交瘤法,即包括步骤:使用一种免疫原小鼠,与骨髓瘤细胞进行融合生长,通过ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选和克隆化建株,然后进一步对获得的单抗进行鉴定。然而这种制备方法得到的单抗只能识别特定的抗原决定簇,而且实际工作中,一次融合可以获得若干个产生抗体的杂交瘤,进行筛选时需要消耗的人力等因素非常巨大。由于工作量的巨大,使得单克隆抗体的制备这项高科技技术成为人力消耗型的技术,因而在工作中也就成为了限制性因素,也成为了限速的因素。另外一个重要的方面是,对单克隆抗体的性质尤其是其识别位点的抗原决定簇识别的特异性,通常需要在获得抗体以后才能够进行进一步的验证,大大降低了单抗生产过程中的筛选效率。
假如为提高通量使用多种免疫原同时免疫,一次融合,筛选手段又受到普通ELISA筛选方法的限制。传统ELISA筛选需要使用大量免疫原包被平板,同时使用大量的细胞培养液上清进行检测,而在实际工作中,免疫原往往是很微量、很珍贵的,而且每个杂交瘤的培养上清也只有100-200微升,从实际实验操作上很难提高抗体制备的通量。
综上所述,迄今为止尚没有令人满意的有效、快速地制备多种单克隆抗体的方法。因此本领域迫切需要开发有效、快速、高通量地制备针对不同抗原和/或不同抗原表位的单克隆抗体的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效、快速、高通量地制备单克隆抗体的方法,该方法可以通过一次免疫,大量制备针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体。
在本发明的第一方面,提供了一种高通量的单克隆抗体制备方法,包括以下步骤:
(a)用3-10000种免疫原对非人哺乳动物进行免疫接种;
(b)将取白上述免疫接种过免疫原的非人哺乳动物的脾细胞,与同种非人哺乳动物的骨髓瘤细胞混合,并融合形成杂交瘤细胞;
(c)收集杂交瘤细胞,培养,制备成杂交瘤细胞悬液;
(d)用选自下组的生物芯片:蛋白芯片、多肽芯片、组织芯片或其组合,其中所述的生物芯片包被有3-10000种所述免疫原的点样点,对所述的杂交瘤细胞进行筛选,从而得到分别分泌针对3-10000种所述免疫原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
在另一优选例中,在步骤(d)中,先用蛋白芯片进行筛选,再用多肽芯片进行筛选。
在另一优选例中,所述的免疫原选白下组:蛋白质、多肽、细胞、组织、细胞裂解物或抽提物、脂类、糖类、核酸、病原体、病毒衣壳、或其混合物。
在另一优选例中,所述非人哺乳动物是大鼠、小鼠。
在另一优选例中,所述的免疫原的数量为4-5000种,更佳地5-1000种。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:
(e)用上一步骤获得的杂交瘤细胞,产生单克隆抗体;
(f)分离所述的单克隆抗体得到纯化的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的步骤(e)是通过将杂交瘤细胞以细胞数为1-5×106细胞接种于小鼠,5-10天后收集小鼠腹水;或者通过培养杂交瘤细胞使其数量达到107个-1010个(更佳地2×107个-1×109个),然后取细胞上清。
在另一优选例中,所述的步骤(f)是使用蛋白G的亲和层析柱进行纯化,得到纯的单克隆抗体蛋白。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
(g)将纯化的单克隆抗体点样于芯片基片上,制得单克隆抗体芯片。
在另一优选例中,所述的生物芯片是多孔板,所述的多孔板具有4-10000个孔,每个孔内有一芯片基片,芯片基片上点样有3-10000种所述的免疫原。
在本发明的第二方面,还提供了用本发明方法筛选获得的单克隆抗体,以及用所述单克隆抗体的应用。
附图说明
图1是单克隆抗体筛选蛋白芯片或多肽芯片中一个单孔的示意图。
图2显示了本发明一个实例中的蛋白芯片。其中图2A与2B分别使用不同点阵:图2A蛋白芯片阵列采用3×3与4×4两种,图2B蛋白芯片阵列统一采用4×4。
图3显示了蛋白芯片中一个单孔。其中,该孔为4×4阵列芯片,四行从上至下分别以A、B、C、D命名,四列从左至右分别以1、2、3、4命名,其中A1与A4为阴性对照,D2、D4为阳性对照,其他12个点分别代表6种抗原(每个抗原有二个点样点)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,将常规的单克隆抗体制备技术与蛋白芯片、多肽芯片和组织芯片技术有机地结合在一起,从而首次实现了通过一次免疫,大量制备针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体。在此基础上完成了本发明。
生物芯片技术是基于生物大分子(核酸、蛋白质等)相互作用的大规模并行分析方法,已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。
蛋白芯片是检测蛋白质之间相互作用的生物芯片,它是基于抗原和抗体特异性结合的原理,利用微点阵技术及多种蛋白质结合在固相基质上,从而使传统的生物学分析手段能够在极小的范围内快速完成,达到一次实验同时分析多个生物标本或检测多种疾病的目的。蛋白质芯片技术理论上来讲,能在一次试验中,给出大量的生物学信息。
多肽芯片即是将不同长度的肽段固定在固体支持物上,通过抗体抗原特异性结合的原理对相应的样品进行检测、筛选、鉴定。
组织芯片是将例如数十个甚至数千个不同病人的组织标本集成为一个组织微阵列。
参见图1。其中显示了用于本发明的单克隆抗体筛选蛋白芯片或多肽芯片中一个单孔。其中,所述单孔为多孔板(如96孔板或384孔板)中的单孔,每孔分别设置阳性对照区域、阴性对照区域和筛选区域。在阳性对照与阴性对照区域中分别点有阳性对照点样点和阴性对照点样点。在蛋白芯片中,在筛选区域中点有相应的筛选用抗原或蛋白;在多肽芯片中,在筛选区域中点有的筛选用的抗原表位。整个芯片是由大量相同的单孔集成,或者直接以96孔板、384孔板的模式,或者是集成在其他模具上。
在本发明中,通过优化单克隆抗体制备中的抗原免疫条件,将生物芯片技术,即组织芯片、蛋白芯片与多肽芯片联合作为一种筛选平台应用于单克隆抗体的制备,可以达到一次免疫大量制备针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体。
在一个优选例中,本发明的高通量单克隆抗体制备方法,包括以下步骤:
(1)使用3-10000种(较佳地4-1000种)免疫原(如蛋白质、多肽)同时免疫小鼠。例如,使用细胞、组织和细胞裂解物、提纯天然或重组表达的蛋白、合成多肽或者其混合物免疫非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠)。免疫方式为本领域的常规免疫,必要时可加强免疫;
(2)取小鼠的脾脏制成细胞悬液,与骨髓瘤细胞按常规的比例(如5∶1-2∶1)混合,在融合剂作用下制备杂交瘤细胞,收集融合杂交瘤细胞,培养一段时间(如7-8天),制备成悬液;
(3)用根据需要事先制备的针对不同完整抗原和/或抗原表位的生物芯片(包括蛋白芯片、多肽芯片和/或组织芯片),对所培养的杂交瘤细胞进行抗体有效性的筛选,筛选得到具有稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系;
(4)将得到的杂交瘤细胞系以细胞数为1-5×106细胞注射到Balb/C小鼠,等待一周左右后取小鼠腹水,或者将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中培养至数量达到107以上,取细胞上清;
(5)使用ProteinG的亲和层析柱对小鼠腹水或细胞上清进行纯化,得到纯的单克隆抗体蛋白;
(6)使用得到的一系列单克隆抗体制备生物芯片,进行肿瘤的检测以及蛋白质组研究。
在另一方面,本发明还公开的一种制备用于本发明方法生物芯片的制备方法,它包括以下步骤:
(1)对于蛋白芯片而言,根据欲筛选的单克隆抗体,将不同细胞裂解物、提纯天然或重组表达的蛋白集成为一个微阵列;
(2)对于多肽芯片而言,根据欲筛选的单克隆抗体,使用生物信息学手段分析可能的抗原表位,合成不同长度多肽,集成为一个微阵列;
(3)对于组织芯片而言,有目的地或随机选择数十个甚至数千个不同病人的组织标本集成为一个组织微阵列;
(4)联合芯片,是将以上三种生物芯片同时构建在一张芯片的不同区域;
至于固相生物芯片载体或液相生物芯片载体的预处理以及生物芯片的封闭与后期处理,可采用生物芯片领域的常规技术。
在一个优选例中,利用蛋白芯片、多肽芯片和/或组织芯片进行筛选的过可包括以下步骤:
(1)蛋白芯片的筛选
a.将不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入蛋白芯片的表面,蛋白芯片固定了不同已知抗原标志物,芯片上的重复区域加入不同的细胞悬液,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在蛋白芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.对于使用荧光染料标记的抗鼠特异性抗体,蛋白芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的蛋白芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
f.重复实验,得到的阳性克隆分别针对不同抗原,建立杂交瘤细胞库。
(2)多肽芯片的筛选
a.使用前面建立的针对不同抗原的杂交瘤细胞库,将不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入多肽芯片相应多肽抗原的表面,多肽芯片的不同区域固定了不同的多肽抗原,芯片上的重复区域加入不同的细胞悬液,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在多肽芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.使用荧光染料检测的多肽芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的多肽芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
f.重复实验,得到的阳性克隆分别针对不同抗原表位,建立相应的杂交瘤细胞库。
当然,也可直接用多肽芯片对杂交瘤细胞悬液进行筛选。
(3)组织芯片的筛选
a.将前面得到的针对不同抗原以及不同抗原表位的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入组织芯片的表面,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在组织芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.使用荧光染料检测的组织芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的组织芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
f.重复实验,阳性结果说明该抗原在组织芯片包括的组织中表达,分别建立相应的杂交瘤细胞库。
当然,也可直接用组织芯片对杂交瘤细胞悬液进行筛选。
对于筛选出的杂交瘤细胞,可用常规方法生产单克隆抗体并进行纯化。例如在一个优选例中,单克隆抗体蛋白生产和纯化过程包括以下步骤:
(1)将得到的杂交瘤细胞系以细胞数为1-5×106细胞注射到Balb/C小鼠,等待一周左右后取小鼠腹水,或者将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中培养至数量达到107以上,取细胞上清;
(2)使用ProteinG的亲和层析柱对小鼠腹水或细胞上清进行纯化,得到纯的单克隆抗体蛋白。
用本发明方法制备单克隆抗体,既可应用于蛋白质组研究,也可应用于临床药物与诊断试剂的开发。
本发明的主要优点在于:
第一,免疫接种可使用3-10000种(较佳地4-1000种)免疫原(包括天然抗原或者使用天然组织或其裂解物等),从而通过实现一次(或少数)免疫,得到大量针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体,总体成本可成倍下降。
第二,操作简单,不需要重复免疫小鼠,不需要重复融合,节省了大量时间与成本。
第三,使用抗原免疫小鼠的时候,可使用少量天然蛋白或组织,芯片制作的时候可以使用重组蛋白或合成多肽,但是筛选得到的抗体为抗天然抗原表位的抗体,节省了大量抗原与资金;
第四,生物芯片的应用实现了高通量的筛选,大大促进抗体的制备和研究过程;
第五,提供的大量单克隆抗体为蛋白质组研究提供了有效的研究工具,为临床药物、诊断试剂的开发提供了原料。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
肿瘤标志物单克隆抗体的高通量制备
一、小鼠免疫与杂交瘤细胞制备
(1)选取已知的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA242、CA50、CA724石种肿瘤标志物,作为制备单克隆抗体的抗原;
(2)向小鼠腹腔注射总量200微克的抗原,每种40微克,抗原已经和福氏完全佐剂等体积混合,两周后加强免疫,抗原总剂量为200微克,抗原与福氏佐剂等体积混合,两周后,向小鼠腹腔注射20微克混合抗原,一周后,向小鼠尾静脉注射20微克混合抗原;
(3)末次免疫后第三天取小鼠的脾脏制成细胞悬液,与骨髓瘤细胞按一定的比例混合,在融合剂作用下制备杂交瘤细胞,收集融合杂交瘤细胞,培养7-8天,制备成悬液;
二、蛋白芯片的制备
使用肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA242、CA50、CA724五种肿瘤标志物制备蛋白芯片。
(1)蛋白芯片的制备采用膜芯片,使用点样仪按一定的阵列顺序将上述五种抗原点阵到以集成在96孔板中的膜上,同时设置阳性与阴性对照;
(2)使用5%奶粉(含0.1%吐温)37℃封闭一小时,洗涤后置4度保存待用。
结果:
制得的蛋白质芯片如图2A和2B所示。其中图2A与2B分别使用不同点阵:图2A蛋白芯片阵列采用3×3与4×4两种,图2B蛋白芯片阵列统一采用4×4。
三、杂交瘤细胞的蛋白芯片筛选
a.由于前面制备的蛋白芯片为96孔板形式,将前面得到的杂交瘤细胞库的不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板上的各孔)50微升加入蛋白芯片相应的孔中,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在蛋白芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以辣根过氧化物酶标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.使用辣根过氧化物酶底物进行显色,肉眼观察,或者以相应的扫描仪进行扫描。
对于蛋白芯片显示阳性的杂交瘤细胞,使用有限稀释法进行克隆化实验,得到的细胞株继续使用蛋白芯片进行筛选,筛选到分别针对CEA、CA19-9、CA242三种抗原的相应抗体细胞株。
结果:
一个芯片单抗的结果如图3所示。该孔为4×4阵列芯片,四行从上至下分别以A、B、C、D命名,四列从左至右分别以1、2、3、4命名,其中A1与A4为阴性对照,D2、D4为阳性对照,其他12个点分别代表6种抗原,包括免疫用到的CEA、CA19-9、CA242、CA50、CA724五种肿瘤标志物和重组表达蛋白质P8,每种抗原两重复。检测样品为杂交瘤细胞株的培液。
整块芯片工作良好,其中对于抗原CEA结果为阳性的杂交瘤细胞培养液,通过有限稀释法进行克隆化,最终得到分泌针对抗原CEA的抗体的细胞株3株。另外,对于3株分泌抗CEA抗体的杂交瘤细胞,进一步用表位多肽的多肽芯片进行筛选和鉴定,发现2株针对同一个表位,而另一株针对不同的表位。
对于抗原CA19-9结果为阳性的杂交瘤细胞培养液,通过有限稀释法进行克隆化,最终得到分泌针对抗原CEA的抗体的细胞株2株。
对于抗原CA242结果为阳性的杂交瘤细胞培养液,通过有限稀释法进行克隆化,最终得到分泌针对抗原CEA的抗体的细胞株2株。
对于抗原CA50结果为阳性的杂交瘤细胞培养液,通过有限稀释法进行克隆化,最终得到分泌针对抗原CEA的抗体的细胞株1株。
对于抗原CA724结果为阳性的杂交瘤细胞培养液,通过有限稀释法进行克隆化,最终得到分泌针对抗原CEA的抗体的细胞株2株。
实施例2
可识别胃癌肿瘤标志物的单克隆抗体的高通量制备和纯化
一、小鼠免疫与杂交瘤细胞制备
(1)取人的胃癌组织,用高速组织破碎机切碎后离心,获取总蛋白,作为制备单克隆抗体的抗原;
(2)将抗原注入小鼠腹腔进行免疫,免疫方式为常规免疫,必要时可加强免疫;
(3)取小鼠的脾脏制成细胞悬液,与骨髓瘤细胞按一定的比例混合,在融合剂作用下制备杂交瘤细胞,收集融合杂交瘤细胞,培养7-8天,制备成悬液;
二、生物芯片的制备
(1)使用来自不同病人的胃癌组织标本以及相应的阴性对照,制备组织芯片;
(2)使用已知的肿瘤标志物抗原,制备蛋白芯片,蛋白芯片的制备可以采用固相芯片与液相悬浮芯片两种形式;
(3)根据已知的肿瘤标志物抗原的氨基酸序列,分析其可能的抗原表位,设计合成相应的多肽,制备多肽芯片,多肽芯片的制备分为固相芯片与液相悬浮芯片两种形式;
(4)以上生物芯片的制备过程,主要包括样品的准备,芯片基质的活化与预处理,芯片的固定、封闭以及后期处理等过程,基本上与实施例1相同。
三、单克隆抗体的筛选
1.组织芯片的筛选
(1)将不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入组织芯片的表面,芯片上的重复区域加入不同的细胞悬液,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
(2)使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
(3)在组织芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
(4)使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
(5)使用荧光染料检测的组织芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的组织芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
(6)重复实验,得到的阳性克隆建立杂交瘤细胞库。
2.蛋白芯片的筛选
a.将前面得到的杂交瘤细胞库的不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入蛋白芯片的表面,蛋白芯片固定了不同已知抗原标志物,芯片上的重复区域加入不同的细胞悬液,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在蛋白芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.对于使用荧光染料标记的抗鼠特异性抗体,蛋白芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的蛋白芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
f.重复实验,得到的阳性克隆分别针对不同抗原,建立杂交瘤细胞库I,芯片结果呈阴性的克隆建立杂交瘤细胞库II,以进行进一步研究。
3.多肽芯片的筛选
a.使用前面建立的针对不同抗原的杂交瘤细胞库I,将不同的杂交瘤细胞悬液(对应96孔细胞培养板或384孔细胞培养板上的各孔)加入多肽芯片相应多肽抗原的表面,多肽芯片的不同区域固定了不同的多肽抗原,芯片上的重复区域加入不同的细胞悬液,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
b.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
c.在多肽芯片上加入抗鼠特异性抗体,抗体以荧光染料或者显色或化学发光酶催化底物中的一种或一种以上标记,37℃湿盒中孵育30-60分钟;
d.使用磷酸盐缓冲液洗涤芯片3-5次;
e.使用荧光染料检测的多肽芯片直接以芯片扫描仪进行检测,使用显色或化学发光酶催化底物标记的多肽芯片,加入显色液反应后,以相应的扫描仪进行检测;
f.重复实验,得到的阳性克隆分别针对不同抗原表位,建立相应的杂交瘤细胞库III。
四、单克隆抗体蛋白的纯化
(1)将得到的杂交瘤细胞库II、III的杂交瘤细胞系以细胞数为1-5×106细胞注射到Balb/C小鼠,等待一周左右后取小鼠腹水,或者将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中培养至数量达到107以上,取细胞上清;
(2)使用ProteinG的亲和层析柱对小鼠腹水或细胞上清进行纯化,得到纯的单克隆抗体蛋白。
(3)纯化自杂交瘤细胞库III的抗体为针对已知抗原已知抗原表位的单克隆抗体;
(4)将纯化自杂交瘤细胞库II的抗体点样于材质为玻璃或PVDF膜等平面基质或者偶联到聚苯乙烯微珠上,制得单克隆抗体芯片,用于蛋白质组研究。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种单克隆抗体制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)用3-10000种免疫原对非人哺乳动物进行免疫接种;
(b)将取自上述免疫接种过免疫原的非人哺乳动物的脾细胞,与同种非人哺乳动物的骨髓瘤细胞混合,并融合形成杂交瘤细胞;
(c)收集杂交瘤细胞,培养,制备成杂交瘤细胞悬液;
(d)用选自下组的生物芯片:蛋白芯片、多肽芯片、组织芯片或其组合,其中所述的生物芯片包被有3-10000种所述免疫原的点样点,对所述的杂交瘤细胞进行筛选,从而得到分别分泌针对3-10000种所述免疫原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(d)中,先用蛋白芯片进行筛选,再用多肽芯片进行筛选。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的免疫原选自下组:蛋白质、多肽、细胞、组织、细胞裂解物或抽提物、脂类、糖类、核酸、病原体、病毒衣壳、或其混合物。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述非人哺乳动物是大鼠、小鼠。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的免疫原的数量为4-5000种。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法还包括步骤:
(e)用上一步骤获得的杂交瘤细胞,产生单克隆抗体;
(f)分离所述的单克隆抗体得到纯化的单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤(e)是通过将杂交瘤细胞以细胞数为1-5×106细胞接种于小鼠,5-10天后收集小鼠腹水;或者通过培养杂交瘤细胞使其数量达到107个-1010个,然后取细胞上清。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤(f)是使用蛋白G的亲和层析柱进行纯化,得到纯的单克隆抗体蛋白。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,还包括步骤:
(g)将纯化的单克隆抗体点样于芯片基片上,制得单克隆抗体芯片。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的生物芯片是多孔板,所述的多孔板具有4-10000个孔,每个孔内有一芯片基片,芯片基片上点样有3-10000种所述的免疫原。
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