CN1865440A - 肥厚型心肌病致病基因的新突变及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一些肥厚型心肌病致病基因的新突变，以及它们在肥厚型心肌病治疗和诊断方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一些肥厚型心肌病致病基因的新突变，以及它们在肥厚型心肌病治疗和诊断方面的用途。
背景技术
早在19世纪中叶，法国人A.Vulpian就在镜下观察并描述了肥厚型心肌病，但是直到20世纪50年代后期，肥厚型心肌病独特的临床特点才被***地论述。它通常以不对称的左和/或右心室肥厚为特征，可累及心室的不同部位，尤以心室间隔为著，左室容积可正常或减少。典型的形态学改变为肌纤维排列紊乱。临床常表现为呼吸困难、心绞痛及晕厥，心律失常、猝死。肥厚型心肌病以往被认为是一种少见的心脏疾病，但Maron等进行的流行病学调查显示，年轻人的发病率达0.2％(Maron BJ，Gardin JM，Flack JM，et al.Prevalence ofhypertrophic cardiomyopathy in a general population of youngadults：echocardiographic analysis of 4111 s ubjects in theCARDIA study.Circulation.1995；92：785-789)。我们对中国九省市8080个正常人的超声心脏多普勒检查表明，中国人中的肥厚型心肌病亦非常常见，患者可多达0.08％(Zou Y.等，Am.J.Med.2004，116：14-18)。肥厚型心肌病至少有60％-70％以上为常染色体显性遗传，称家族性肥厚型心肌病(FHC)。分子遗传学研究发现，编码肌小节结构蛋白的基因突变是家族性肥厚型心肌病的根本病因[Seidman JG，Seidman C.The genetic basis for cardiomyopathy：from mutationidentification to mechanistic paradigms.Cell.2001；104(4)：557-67；Bonne，Carrier L，Richard P.Familialhypertrophic cardiomyopathy：from mutations to functionaldefects.Cir Res.1998；83：580-593]。
肌小节是心肌收缩的基本单位，主要由粗、细肌丝两部分组成。粗肌丝主要为肌球蛋白(myosin)和肌球蛋白结合蛋白C(MyBPC)，前者包括两条肌球蛋白重链(MHC)和两条轻链——必需/碱性轻链(MELC，MLC-1)及调节/磷酸化轻链(MRLC，MLC-2)。细肌丝包括肌动蛋白(actin)、α-原肌球蛋白(α-Tm)和肌钙蛋白复合体(TnT，TnC，TnI)。此外，肌小节成分还有肌连蛋白(titin)等。
1.家族性肥厚型心肌病致病基因
1.目前，已证实13个基因160多个位点的突变与FHC的发病有关，其中有10种是编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因(Marian AJ，Roberts R.The molecular menetic basis for hypertrophiccardiomyopathy.J Mol Cell Cardio.2001；33：655670)(表1)。
表1.家族性肥厚型心肌病致病基因的发生频率及突变类型
| 蛋白 | 基因 | 染色体定位 | 频率 | 突变 |
| β-MHCcMyBPCcTnTα-TmcTnIMLC-1MLC-2Titinα-Actinα-MHCPKA钾通道线粒体 | MYH7MYBPC3TNNT2TPM1TNNI3MYL3MYL2TTNACTCMYH6PRKAG2KCNQ4MTTI | 14q11.2-q1211p11.21q3215q2219p13.2-q13.23p21.2-p21.312q23-q24.32q24.111q14q7q22-q31.11p34线粒体 | ～50％～20％～15％～5％～5％＜5％＜5％＜5％＜5％罕见？罕见罕见 | 74个错义、3个缺失、一个无义突变13个错义、12个剪接位点、8个***/缺失突变12个错义、1个剪接位点、1个缺失突变6个错义突变7个错义、1个缺失突变2个错义突变7个错义、1个无义突变1个错义突变5个错义突变1个错义、一个移码突变1个错义突变(合并WPW)1个缺失突变(合并耳聋)异亮氨酸、甘氨酸tRNA突变 |
然而，这些突变并未囊括所有的遗传型心肌肥厚型致病基因突变。
本发明的目的在于发现新的突变，便于肥厚型心肌病的早期诊断和预防。
发明内容
本发明基于的是肥厚型心肌病致病基因中存在一些以前尚未报道的突变这一发现基础之上的。本发明提供了含有这样的突变的分离核酸。本发明还提供了可用于检测这些突变的寡核苷酸，以及利用这样的寡核苷酸检测突变的方法。本发明提供了利用这样的突变进行肥厚型心肌病诊断或者药物筛选或评估的方法。本发明另外涉及微阵列。
具体实施方式
在本发明中，术语“样品”是指来源于人类个体的任何生物学样品，包括但不限于例如细胞，组织样品如机体软组织例如骨组织、毛发等，生物学流体如淋巴液、血液、唾液、尿液和其它机体***液等。术语“分离的”意指非天然存在的。“分离的核酸”指并不与其所来源的个体基因组中相邻的5’和/或3’侧翼序列相毗邻的核酸。因此，“分离的核酸”也包括***载体内的核酸，掺入异源细胞的基因组内的核酸，或者以独立体存在的核酸。该术语还包括与其它核酸序列相连接的重组核酸。这样的重组核酸可能用于生产融合蛋白。
在本发明中，野生型基因指的是与肥厚型心肌病致病基因对应的正常基因。它们的序列在现有技术中是已知的，并列于例如Genbank数据库中。例如，野生型β-MHC基因的序列以Genbank登录号gi：M57965.1公开，在本发明中以SEQ ID NO：1表示；野生型cMYBPC基因的序列以Genbank登录号gi：Y10629公开，在本发明中以SEQ IDNO：2表示；野生型cTnT基因的序列以Genbank登录号gi：X90780公开，在本发明中用SEQ ID NO：3表示。但是，本领域普通技术人员十分清楚，由于基因的测序过程中可能存在一些错误，将会导致野生型基因的序列与本文列出的登录号指示的序列有所不同，或者核苷酸残基的编号有所变化。此时，将以最终确定的序列为准。
本发明中基因突变的表示方法如下：
“x nt1＞nt2”表示在参考序列中发生了核苷酸的置换。其中“x”指突变发生的位点，它遵循的是Genbank中相应登录号给出的野生型基因的核苷酸残基编号。“＞”表示发生了置换。“nt1”指突变前的核苷酸，即正常基因(野生型基因)中相应位点的核苷酸残基。“nt2”指突变后的核苷酸残基。例如，cTnT基因中的“4693C＞T”表示在cTnT基因中发生了置换突变，导致在相应于Genbank登录号gi：X90780(SEQ ID NO：3)列出的序列中第4693位核苷酸残基位点处的“C”被取代为“T”。
“x1-x2 del nt1...nt2”表示在参考序列的第“x1”位到第“x2”位的核苷酸位点处发生了缺失，从而缺失了“nt1”到“nt2”的核苷酸残基。例如，“14262-14264delAAG”表示第14262位到第14264位的核苷酸“AAG”被缺失了。
“x1^x2 ins nt1...nt2”表示在参考序列的第“x1”位与第“x2”位的核苷酸位点之间***了“nt1...nt2”核苷酸残基。例如，“18115^18116insGCAAG”表示在第18115位与第18116位核苷酸位点之间***了“GCAAG”。
在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的β-MHC基因或其片段，其在对应于Genbank登录号gi：M57965.1所列序列(SEQ ID NO：1)中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：10353G＞A，10429A＞C，10895A＞T，11811A＞C，13653A＞C，14449T＞C，14452G＞A，14557G＞A。
在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的cMYBPC基因或其片段，其在对应于Genbank登录号gi：Y10629(SEQ ID NO：2)所列序列中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：4826G＞A，8697G＞A，8887G＞A，12101G＞A，13261G＞A，14262-14264delAAG，14364delG，18115^18116insGCAAG。
在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的cTnT基因或其片段，其在对应于Genbank登录号gi：X90780(SE Q ID NO：3)所列序列中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：4693C＞T，4769G＞A。
在进一步的实施方案中，本发明的突变基因或片段中还含有额外的突变，包括任何已知的或将来获知的突变或核苷酸多态性。
本发明还涉及由上述突变基因或片段衍生的mRNA或cDNA或者编码的蛋白质。
本发明还涉及可与上述任一突变基因或片段或由其衍生的mRNA或cDNA或者它们的互补序列特异性杂交，但不能与相应的野生型基因序列或其互补序列杂交的核酸，例如寡核苷酸，它们可作为探针或引物用于特异性检测人类个体中的上述突变。本领域中的技术人员均清楚，探针一般具有与目的核酸的序列互补、并与包含待检测突变的核酸特异性杂交而不与具有野生型基因序列的核酸相杂交的序列。该寡核苷酸一般定位于突变位点周围，特异性地检测样品中上述突变的存在与否。优选地，所述核酸或其互补序列中含有上文所定义的任何一个或多个突变。作为例示，寡核苷酸引物或探针可设计成待检测的突变位点位于其5’或3’末端或者在中间，或者待检测的突变位点位于该引物或探针的互补序列的5’或3’末端或者在中间。在本发明的上下文中，术语“特异性检测”是指该寡核苷酸只与包含上文定义的突变的核酸或其互补序列发生杂交，而不与分别具有野生型基因序列或其互补序列的核酸发生杂交。
在突变位点涉及多个核苷酸时，寡核苷酸探针或引物可设计成使得突变位点的核苷酸序列或与其互补的序列的整个或部分包含在探针或引物的核苷酸序列中。这样，有可能利用由此制备的寡核苷酸作探针通过杂交或差异杂交的存在与否来测定突变的存在情况，或者作为引物通过扩增并随后检测(通过例如测序、限制性酶切等)突变的存在情况。
寡核苷酸探针或引物一般长度大于约10bp，例如10-100个核苷酸，优选地，其长度为15-75个核苷酸，更优选18-50个核苷酸，尤其优选为20-35个核苷酸，最优选为23-30个核苷酸。本领域中的技术人员可以很容易设计出合适的寡核苷酸探针或引物，用于突变位点的检测。至于其制备，则可通过本领域技术人员熟知的方法进行，包括但不限于例如化学合成法等。优选地，探针/引物是被可检测标记的，以便于检测。标记可以是例如生物素、荧光染料、放射性同位素等，但并不限于此。它们是现有技术中已知的，并可通过常规方法连接到探针/引物上。该核酸可以是单链的，也可以是双链的。
在本领域中众所周知，可利用引物通过添加游离核苷酸而延伸核酸序列。杂交指的是在严谨条件下与核酸序列发生选择性结合。在本文中，严谨条件是仅允许引物与含突变的核酸序列或其互补序列杂交，而不与野生型核酸序列或其互补序列杂交的条件。依照所使用的引物，普通技术人员可以通过常规实验确定相应的严谨杂交条件。在这方面有众多的现有技术可供参考，包括例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。
本发明还涉及利用设计成在扩增后将得到包含待检测突变的片段的引物进行突变检测。所述引物一般定位于突变位点周围或者其5’或3’方向1000bp、优选500bp、更优选250bp、尤其优选200bp、最优选100bp的范围内，其长度一般大于约10bp，优选为15-100bp，更优选为18-75bp，尤其优选为20-50bp，最优选为25-40bp。
还可以在本发明的寡核苷酸序列5’和/或3’末端连接一些额外的核苷酸序列。这样的寡核苷酸也在本发明的范围内。
利用这样的寡核苷酸，通过对来自人类个体的遗传材料进行扩增和随后分析，可以检测所述人类个体中所述突变的存在与否。例如，可以将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后用溴化乙锭、SYBR绿色溶液、诸如此类染色，从而以条带(DNA片段)的形式检测扩增产物。由此，可以以DNA片段的形式检测包含突变位点的基因片段。除了琼脂糖凝胶电泳以外，也可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳。进一步地，可以分离扩增产物，随后通过测序或者限制性酶切分析突变的存在与否。还有可能使用预先经诸如荧光染料等物质标记的引物进行PCR，并检测扩增产物。还可以采用不需要电泳的检测方法；在这种方法中，将扩增产物结合到固体支持物诸如微型板上，并通过荧光、酶反应、诸如此类等手段来检测目的DNA片段。
本发明提供了检测上述突变的方法，包括应用上文所述寡核苷酸探针或引物检测生物学样品，或者应用设计成在扩增后将得到包含该突变的片段的引物对扩增该生物学样品并进行检测的步骤。在检测中，通常应用待测个体的生物学样品，例如其血液，但并不限于此。在一个实施方案中，直接应用该生物学样品进行检测。例如，利用上述核酸作为引物，通过PCR法扩增包含待检测突变位点的片段。在另一个实施方案中，在检测前首先从该生物学样品分离遗传材料，例如基因组DNA，但并不限于此。检测可通过例如核酸杂交、PCR法、测序法、限制性片段长度多态性测定法等方法常规进行，但并不局限于这些方法。其条件是本领域普通技术人员所知的，或可非常容易地确定。优选地，使用如上所述制备的寡核苷酸作为引物，用DNA聚合酶扩增编码包含待检测突变位点的DNA片段。或者，将如上所述制备的探针与模板DNA杂交，从而检测那些具有感兴趣突变的DNA。可以依照常规方法来制备模板DNA，如氯化铯梯度离心、SDS裂解法、或酚/氯仿抽提。
本发明还涉及一种微阵列，其中含有上述寡核苷酸探针或引物。该寡核苷酸可以固定在固相支持物上。在一个实施方案中，所述微阵列是DNA芯片、基因芯片、微型芯片、珠阵等的形式。DNA芯片是将很多种DNA探针排列并固定在基片例如玻璃片上，然后在上面进行标记DNA的杂交、通过检测探针上的标记信号而可区分地检测完全匹配和核苷酸错配，由此对核酸进行检测。芯片的常规制备方法是本领域技术人员已知的。
本发明还涉及可用于检测上述突变的试剂盒，其中包括一种或多种相关的诊断性引物或探针和/或该突变基因特异的寡核苷酸引物，例如前文所述的寡核苷酸探针或引物。试剂盒中还可包括容器、使用说明书、缓冲液、酶和/或其它反应成分。优选地，其中还包含阳性对照和阴性对照，以便进一步确认检测结果。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于预定测定法的任何和所有成分酶或成分。这些成分的实例包括但不限于寡核苷酸、聚合酶(如Taq聚合酶)、缓冲液(如Tris缓冲液)、dNTP、对照试剂(如组织样品、用作阳性和阴性对照的靶寡核苷酸、等)、标记和/或检测试剂(荧光染料诸如VIC、FAM)、固体支持物、说明书、例示性图表和/或产品信息、抑制剂等。本发明的试剂盒可以是只包含部分必需成分的部分试剂盒。在这种情况中，使用者可以提供其余成分。本发明的试剂盒可以包含两个或多个分开的容器，每个都包含将要使用的部分成分。例如，在试剂盒中，第一个容器包含酶，而第二个容器包含寡核苷酸。酶的具体实例包括适当保存缓冲液或容器中的结构特异性切割酶。
本发明还涉及诊断肥厚型心肌病或确定肥厚型心肌病预后风险的方法，包括对个体的体外样品检测下述中的一种或多种突变的步骤：β-MHC基因中的下述突变：10353G＞A，10429A＞C，10895A＞T，11811A＞C，13653A＞C，14449T＞C，14452G＞A，14557G＞A；cMYBPC基因中的下述突变：4826G＞A，8697G＞A，8887G＞A，12101G＞A，13261G＞A，14262-14264delAAG，14364delG，18115-18116insGCAAG；或者cTnT基因中的下述突变：4693C＞T，4769G＞A。优选地，检测步骤是按照前文所述突变检测方法进行的。例如，使用位于突变位点上下游的寡核苷酸首先对包含待检测的突变位点的核酸片段进行PCR扩增。检测可通过例如PCR法、测序法、限制性片段长度多态性等进行。
本发明还涉及利用上述突变基因作为靶点筛选或评估药物的方法，包括例如对携带所述突变的细胞、组织、器官或动物个体给予一种或多种药物，并评估其一个或多个指示肥厚型心肌病状况的指标，以指示疾病改善状况。优选地，所述细胞、组织、器官或动物个体是通过基因敲除(gene knockout)或敲入(gene knockin)或者转基因的方法而得到的。基因敲除或敲入或者转基因的方法是本领域技术人员熟知的，包括例如设计两个与内源基因同源的侧翼片段。在基因敲除的情况下，两同源片段之间包含预定使体内内源基因失活的突变，从而在导入体内后，能将相应的内源基因失活。在基因敲入的情况下，两同源片段之间包含预定导入体内内源基因处的核酸，从而在导入体内后，能将目的核酸***预定的位点。操作对象可以是个体，例如小鼠。或者，操作对象也可以是细胞，例如人的心肌细胞。这样，可以在个体或细胞水平上对药物进行筛选或评估。
下面以实施例的方式对本发明作出说明。这些实施例都是示范性的，它们不以任何方式限定本发明的范围。
实施例
实施例1基因组DNA的提取
1研究对象的选择
研究对象为在中国医学科学院阜外心血管病医院诊断明确的门诊就诊或住院的肥厚型心肌病病人，共100例，经家族调查无血缘关系。其中包括肥厚型心肌病家系先证者51人，相关家系成员356人，散发病例49人。正常研究对照120例为性别、年龄匹配的健康人。入选者填写《分子遗传学研究病例调查表》，内容包括：病人联系方式、个人一般情况、临床症状、体检结果、家族史调查、实验室检查、心电图(必要时Holter)，胸片报告，超声心动图报告(必要时需心脏MRI或左室及冠脉造影结果)。建立资料数据库。
肥厚型心肌病诊断标准(WHO/ISFC 1996年公布)
(1)基本标准：超声心动图诊断的原因不明的心脏左室壁厚度大于或等于13mm；或心尖部肥厚或右室肥厚。
(2)参考标准：心电图左室高电压表现，伴/不伴II、III、avF、avL及V4V5导联病理性Q波及ST-T改变。
(3)排除标准：长期高血压、缺血性心肌病及其他可引起心室肥厚的原发性疾病。
(4)家族性肥厚型心肌病确定标准：有心肌病的家族遗传倾向，即病人(先证者)家族中有多人发病，并符合常染色体显性遗传特点。
2基因组DNA的分离
取患者肘静脉血5ml，EDTA(0.5M)抗凝，2500rpm离心10min。小心吸取上层血浆，用1.5ML的Eppendorf管分装。在血细胞中加入3倍体积的溶血液(NH4Cl 8.29g、KHCO3 1.0g、EDTA-Na2 0.03734g，加双蒸馏水至1000ml，调节PH为7.4)，摇匀，冰浴15min。2500rpm离心10min，弃上清。向细胞沉淀中加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。3000rpm离心10min，弃上清，得到白细胞，直接用于提取基因组DNA，或者于-80℃冻存备用。
如下提取基因组DNA：取白细胞，加4.5ml SE(NaCl 4.383g、EDTA-Na2 9.306g加双蒸馏水至1000ml，调节PH值为8.0)，使劲吹打，混匀。沿管壁加入0.5ml的10％SDS，然后加蛋白酶E(100mg/ml，MilliQ水)50μl，首尾轻摇10min，混匀，然后于37℃水浴过夜。第二天取出，沿管壁加3ml饱和NaCl，迅速手摇15s，使蛋白变性析出，然后于4000rpm离心10min。取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。2500rpm离心10min。取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。2500rpm离心10min，取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇后，首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。将DNA挑至管壁，用75％乙醇洗涤2遍。将DNA挑至0.5ml管中，冻干。最后加TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，调节PH为8.0)300μl，使DNA溶解，紫外分光光度计测OD值定量，4℃保存。
实施例2 PCR法筛选β-肌球蛋白重链(B-MHC)基因中的突变
所用引物及扩增条件如下表1所示(基因组序列来自Genebankdatabase，登陆号为M57965)：
表1
| 外显子 | PCR片段长度 | 引物 | PCR反应条件 |
| Exon3Exon4Exon5Exon6Exon7Exon8Exon9Exon10Exon11Exon12Exon13Exon14Exon15Exon16Exon17Exon18Exon19Exon20Exon21Exon22Exon23Exon24Exon25Exon26Exon27 | 245bp248bp200bp146bp244bp240bp223bp226bp229bp398bp267bp213bp232bp438bp180bp474bp271bp298bp285bp300bp400bp282bp221bp151bp420bp | F 5’act cca ggc aca gcc atg gg 3’R 5’gtg gac tct cac atc agc ct 3’F 5’gaa agc cca ggc tga cag ga3’R 5’ggg tgg aca tgg atg gag ca 3’F 5’gca act ggc aag tca ctg ct 3’R 5’ctc tca cct gtc agc atg ta 3’F 5’gag aag ccc cac gag agc at 3’R 5’tgg agg ctg ggg atc agg gag 3’F 5’ctg att tga ggc ttg ctg gt 3’R 5’aag aag gag gca ggt gag ag 3’F 5’cgc aga agg gag gga gaa ga 3’R 5’agt ggt gat gag ttg ggg ga 3’F 5’gga ctt gga ctg gtg gag ga 3’R 5’ggg gag aga gag aga gga ca 3’F 5’att aat ttt cct tgt gcc ca 3’R 5’caa gca gag ggg acc agg tt 3’F 5’cct cca tga gag ccg ggg gc 3’R 5’ctg ctt ttg gac ccc tgt tt 3’F 5’gga tct cac tta ccc atc at 3’R 5’ggg agg ctg agg cag gag a 3’F 5’tta cag gca tga acc aca cac c 3’R 5’gtg aac ttg aaa act ctc atc cc 3’F 5’gtc tct cct cca cct tgc ag 3’R 5’cga gtg agt gat tgt tct cc 3’F 5’acc cac ttt ctg act gct cc 3’R 5’tgg taa ggc caa aga ggc ac 3’F 5’ttg acc ata gag cag aat cc 3’R 5’ctc aga acc ttg gga gaa tc 3’F 5’gct gtg atc tta ctc aca cc 3’R 5’tgg gca gat ggg gag cca ag 3’F 5’tct ctc ctc ttt ccc ttc tgt ctc 3’R 5’tgc ctt aca cat cac cct cat tac 3’F 5’aat cag tga caa agc cag ga 3’R 5’gca gat ccc att ccc atc ag 3’F 5’cct gat ggg aat ggg atc tg 3’R 5’atg att aca aca gga aaa gc 3’F 5’tcc taa ggt aat ccc cac ca 3’R 5’ctt ttt ttc ctg aca ctg cc 3’F 5’gca gag gct cag cac tcc tt 3’R 5’gcc tca ccg cct gca ctt gg 3’F 5’ccc tcc tat ttg agt gat gtg c 3’R 5’ggt cag tat ggt ctg aga gtc c 3’F 5’aca gat ggc acc aag ctg gt 3’R 5’gat aga cat ggc ata tca ag 3’F 5’ggc tcc ttc tct cta cca gc 3’R 5’tgc ttg tac tgt tat ggg ct 3’F 5’acg agt ctc cct tac ctc ac 3’R 5’cgt ggg tgt cca gac ctc ac 3’F 5’gtg tct gac cag gca ctc at 3’R 5’agg ccg agc aga gcc tac ct 3’ | 95℃5’，94℃30”，61.5℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，56℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，59.2℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，55℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，64℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，53℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，55℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，68℃30”，72℃50”(45cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，57℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，55℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃1’，59.5℃40”，70℃1’(35cycles)；70℃10’95℃5’，94℃30”，57.4℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60.6℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’ |
制备如下PCR反应基本体系(50μl)：
引物(浓度20pmol/μl) 1μl
10×buffer 5μl
TaqDNA聚合酶(2u/μl) 1μl
dNTP(10mM) 1μl
人基因组DNA 1μl
ddH2O 41μl
按照表1中的PCR条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增，并按下述步骤对PCR反应产物进行测序前纯化步骤：
(1)将50μl PCR反应产物同其6倍体积的无水乙醇与5M醋酸胺(5∶1)混合溶液混合，置于-80℃30分钟以上。
(2)14000rpm，4℃离心15分钟，吸上清弃去。
(3)加入200μl的75％酒精，14000rpm，4℃离心5分钟，吸上清弃去。
(4)室温或冷冻干燥后，加入20μl TE溶解。
(5)吸2μl点样，定量。
如下进行测序反应：
(1)反应体系(20μl)
BigDyeTM 4μl
BigDyeTM Buffer 2μl
引物(同PCR扩增引物) 10pmol/μl
(2)反应条件(根据引物的退火温度而定)：
(3)测序产物的纯化：
20μl产物中加25μl醋酸铵和125μl乙醇，置-70℃ 1小时，14,000rpm离心10分钟，弃上清，加75％的乙醇100μl，14,000rpm离心5分钟，弃上清，95℃1分钟烤干，加入2μl loading buffer，混匀，94℃变性5分钟，然后迅速置于冰上。
(4)将纯化后的测序反应产物在ABI PRISM377自动测序仪上测序。
(5)用GeneJockey、AssemblyLIGNTM、Sequencing Analysis 3.4软件阅读及核对测序图，并与以公布的基因序列相比较。由此筛选出来的基因突变列于表5中。
实施例3 PCR法筛选心脏肌钙蛋白T(cTnT)基因中的突变
所用引物及扩增条件如下表2所示(基因组序列来自Genebankdatabase，登陆号为AY044273)：
表2
| 外显子 | PCR片段长度 | 引物 | PCR反应条件 |
| Exon2Exon3，4Exon5，6Exon7Exon8，9Exon10，11Exon12，13Exon14Exon15，16 | 203bp272bp596bp292bp682bp1357bp743bp315bp667bp | F 5’tcg ctg atc tct gta caa cgg ggg-3’R 5’ggt gtc agg gca gcg gcg g-3’F 5’atg tgt gtg cag gcg tgt gtg ttt-3’R 5’cca ggg ctc cca gga ttt cca-3’F 5’tct ctg ctc tgg gtt ctg cct gat a-3’R 5’att ctc ctc caa agc tgc tgt ga-3’F 5’gcc ccc gct gcc ttc att c-3’R 5’cac cat act gca ccc tgt tcc atc a-3F 5’ggg cag tgc tgg aag att ctc tag g-3’R 5’gag gaa ggc tgt ctg gag gag gt-3’F 5’gtc cgt gga gct ggt tga aag tg-3’R 5’aat ctc ttc ctg gga cct gac cta aa-3’F 5’ctt tgt ctt cct gcc ttc tct ctg tgt-3’R 5’cag aaa gga gtt ggc ccg acc-3’F 5’gga agg agg gct ggg atg ctg-3’R 5’ctg aag ggg gct gtt ggg ga-3’F 5’cac tca gcc ccc ttc tcc cca-3’R 5’cca gct ccc cat ttc caa aca-3’ | 95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，61℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’ |
制备与实施例2基本上相似的PCR反应基本体系(50μl)，只是换用此实施例的引物。
按照表2中的PCR条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增，经常规方法分离扩增产物并对其测序。由此筛选出来的基因突变列于表5中。
实施例4 PCR法筛选心脏肌钙蛋白I基因中的突变
所用引物及扩增条件如下表3所示(基因组序列来自Genebankdatabase，登陆号为X90780)：
表3
| 外显子 | PCR片段长度 | 引物 | PCR反应条件 |
| Exon3Exon4Exon5Exon6Exon7Exon8 | 128bp163bp239bp251bp287bp239bp | F 5’ggg tcc cca ctc ctc cta-3’R 5’tcc ggc gcc tgt act ctg-3’F 5’tgc tgg ggg tgt ctt gag gt-3’R 5’cac ctg cct gct ctt tcc ca-3’F 5’gag ggt tta gaa ggg cag agg-3’R 5’ccg gga cta gaa acc tcg ca-3’F 5’ggt ctc cct gtt ttt ggt tcc c-3’R 5’tgg gtc tcc tgg gat gtg ca-3F 5’atg gag gag ttg ggt gtg cg-3’R 5’aca gcc ctt ccc ctc agc at-3’F 5’aga ctg gag agg aag aag aga ccc-3’R 5’tcc tgc cta agc cct ggg taa t-3’ | 94℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’94℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’94℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，64℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃1’(35cycles)；72℃10’ |
制备与实施例2基本上相似的PCR反应基本体系(50μl)，只是换用此实施例的引物。
按照表3中的PCR条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增，并按照实施例2的方法分离扩增产物并对其测序。由此筛选出来的基因突变列于表5中。
实施例5心脏肌球蛋白结合蛋白C基因(cMYBPC)的PCR扩增
所用引物及扩增条件如下表4所示(基因组序列来自Genebankdatabase，登陆号为Y10629)：
表4
| 外显子 | PCR片段长度 | 引物 | PCR反应条件 |
| Exon1Exon2Exon3-5Exon6Exon7-9Exon11.12exon13exon14-17exon18exon19.20exon21.22exon23exon24.25exon26exon27exon28.29exon30-.32exon33.34 | 145bp550bp1016bp344bp674bp594bp315bp915bp537bp537bp623bp525bp619bp567bp275bp770bp996bp605bp | F 5’atg gtg agt agc ctg gtg tga c 3’R 5’ccc cct caa gaa ctc ctc ct 3’F 5’tgt cct cct ctg aga aat gaa cag 3’R 5’cag caa agg caa gaa agt gtg a 3’F 5’gtg gag ggg tct ctg gtt agt 3’R 5’tct gtg tgc ctt gtg cct tct3’F 5’ggg tgc gga gcc ttg tct3’R 5’gcc ttg ggg ttt ctc tca cac3’F 5’cag ggc agg gct tct caa a3’R 5’gac aga caa gga aac caa ctc aga3’F 5’ggg tgg ggt cca ggt ctt t3’R 5’atg ccc tct cct ctc ctg tgt3’F 5’gcg gca cag agg gga ttg3’R 5’ggg cag gag gca agg cta t3’F 5’tct cgg ggc tca ctt cct c3’R 5’gtc acc tca gca tcg tca ttt tag3’F 5’cag cct aaa cct cat cct tct ca3’R 5’tgt ttc ctg tgt ctc tct ctg t3’F 5’cac ttt tac gct gcc tac ctc tg3’R 5’atc ctt gct ttt ccc tct gtg a3’F 5[‘tgg ctc tcc cgt ttc tct ga3’R 5’agc aac aca ccc gac caa gt3’F 5’agt cgg tgc cca gag atg aat3’R 5’cag cag tgt cgc agg aaa tct3’F 5’ctg tgg cgg tta gtt gga gtg3’R 5’agg atg aaa gga gac tgt3’F 5’act tga act cgg gag gca gaa3’R 5’ccc tct ctg cac ttt ttc cct a3’F 5’cag tgg gag tgg ggt gtc ag3’R 5’ggt gtc aat ggc ggg tct t3’F 5’agg gag gtt gga gct gtg ga3’R 5’tgg gga gga ctt ggc ttg t3’F 5’gga ccc aac cca cag ctc ac3’R 5’agg ctg ggg aga gga ctg c3’F 5’gga ccc ccc gag tag aaa ca3’R 5’gcc cct aca gcc tcc cat tt3’ | 95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃30”(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62℃30”，72℃40”(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62℃30”，72℃40”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，63.9℃30”，72℃40”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62.5℃30”，72℃40”(39cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，56℃30”，72℃30”(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，63℃30”，72℃90”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃40”(36cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃40”(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，56℃30”，72℃40”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，53℃30”，72℃50”(36cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，58℃30”，72℃40”(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，55.5℃30”，72℃30”(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，60℃30”，72℃40”(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，62℃30”，72℃50”(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，66.5℃30”，72℃120”(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30”，56.3℃30”，72℃50”(35cycles)；72℃7’ |
制备与实施例2基本上相似的PCR反应基本体系(50μl)，只是换用此实施例的引物。
按照表4中的PCR条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增，并按照实施例2的方法分离扩增产物并对其测序。由此筛选出来的基因突变列于表5中。
实施例6限制性片断长度多肽性(RFLP)检测
因基因某位置的碱基改变，破坏了或建立了可被限制性内切酶识别的特异性酶切位点，当该样品被特异性限制性内切酶处理后，因其与正常样品的酶切片段长度不同，在凝胶电泳时，可显示不同的迁移速度。以此原理，可进行已知突变位点的患者家系成员的基因突变筛查。此检测中使用Promega公司酶切试剂盒，并按照所附的产品说明书进行。
表5 100例肥厚型心肌病病人β-MHC、cMYBPC、cTnT及cTnI基因突变筛查结果：
| 致病基因 | 基因内位置 | 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | 转录物改变 | 频率 | 患者百分比(％) |
| MYH7(β-MHC)gi：M57965.1 | exon 3exon 5exon 14exon 14exon 15exon 16exon 18exon 18exon 19exon 20exon 20exon 22exon 22exon 22exon 23exon 23 | 5797 C＞T6739 G＞A10353 G＞A10429 A＞C10895 A＞T11811 A＞C10600 C＞T10601 G＞A13463 G＞A13653 A＞C13673 G＞C14449 T＞C14452 G＞A14557 G＞A15373 G＞A15391 G＞A | A26VR143QG425RK450TI511FK615QR663CR663HR719QQ734PG741RM822TG823ER858HE924KE930K | 错义错义错义错义错义错义错义错义错义，错义错义，错义错义，错义错义，错义， | 4211111411111121 | 24 |
| MYBPC3(cMYBPC)gi：Y10629 | exon 6exon 7exon 15intron 15exon 21exon 23exon 25exon 25exon 29 | 4295 G＞A4826 G＞A8697 G＞A8887 G＞A12101 G＞A13261 G＞A14262-14264delAAG14364delG18115^18116insGCAAG | E258KG263RG416SR668HG758D | 错义错义错义剪接错义错义密码子缺失移框移框 | 211111111 | 13 |
| TNNI 3(cTnT)gi：X90780TNNT2(cTnI)gi：AY044273 | exon 7exon 7exon 10 | 4693 C＞T4769 G＞A14035 T＞C | R145WR170QR130C | 错义错义错义 | 211 | 31 |
注：带着重色的都是新突变，共19个。
2.MHC：G425R、Q734P、M822T、G823E；cMYBPC：G263R、8887 G＞A(intron15)、R668H、G758D、18115^18116 insGCAAG(exon 29)；cTnT：R145W等突变在家系患者中发现，与肥厚型心肌病呈共分离趋势。
3.120例正常对照中未发现以上位点的突变。
上述实施例只是为了阐明、而不是限制本发明。相关领域的技术人员清楚地知道，可对本文所述的内容作其它适当的修饰和变化，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。这样的修饰和变化都落入本发明的保护范围。
序列表
<110>中国医学科学院 阜外心血管病医院
<120>肥厚型心肌病致病基因的新突变及其用途
<130>idc040150
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>28438
<212>DNA
<213>β-MHC基因
<220>
<221>misc_feature
<222>(11380)..(11380)
<223>n is a，c，g，or t
<400>1
gatctatctg gtccagacca tcctttgaac caagtggact tagtggggct gaaggaggtg 60
tggggacaaa gaacctatgg cagggcaacc ggccctcctg tctgcagcct ggcttcctca 120
attttgtgtt cctaacctaa gagctgccat tcagtgaggg cccacagtgt gtctgctgtg 180
tgtagactct gcttgtgcaa tctctaatgg cctgagtagc cctggaaaca aaatgtggct 240
atccccatgt tacagatgac aaaactggct caaagcaatt atatgactga cgtagaccac 300
acagctagaa aatggaatca ctgggtttca aagtggattt ttgtgactga ctccaaagct 360
gaccagagtg ctcatcctgt atgcttctga ggcctctggc cctccagacc ggtcactccc 420
cacaaagtct cccttttggt gagttgtgtc cctccaaaca ctccctgaag gcaagatcaa 480
cctgccctaa ctaccccaaa gtgaactagg ccagccccaa gcctgtctcc ggccctccat 540
ctctctcttt gttcacatcc atcagaaagc agagacctag agtagggaat gagagggggt 600
gcacaagtac aaaagatttt gaagcagcag gaagacgaaa gaagtacaag aaggagcagc 660
tgtttgtaaa agggaaaatc tgagacaggc agaaagctca gctccctaat cctaggctcg 720
tgtggagcca gggcagggtc ccccaaggtc agggattctg ggggcaggcg gatgggagag 780
tcagcctcca ctcctgggtg gctcccctct gccctgtgca caaacaacga gtgcctcatt 840
cctcccctgc accaagtgcc ctgcctcttc ctgccccgtt tcttccttcc ctttgggtac 900
cggatctttt ttctgattcc cctctctcca tgctgacatc gcttctaatt cgccctggtg 960
tctccctccc tcacaattac tgggagtaat tttagcaact tttcctctga actaccgctg 1020
gcgtgttcac agcaaatggc ccctgttttg gcttgacact tgatcagggt ggtgacagag 1080
tgcagacaaa gccggcacaa tgcggggagg ggaggaccgg ggcagatcac cttcctttca 1140
cttcagggcc ttatttggtc taccttgccg aagcggccct ccttccagcc tctctttatt 1200
tatagcattt tgcttgctct cctttatctt gctatcactt gtagcacact ctgcacaatc 1260
cccacccacc ccagcatggt ggggcccctg gctcactctc cccacaagga atgtgcatgt 1320
gtgcaaaggg taggcctgga tgccatttct acaaacagtt gactaaagca gtccagagca 1380
gggatctttc tttgggtcat tgttatgtcc ttattgacca gaataatgcc tggcacatag 1440
taggcactca ataaatactt gttgaatgga ggaatctgca aagctgctca gtcttcagac 1500
agcagcaagc agcaggaaga gaatcatgat gtaaccaaga gcaggtgctg gaggagctag 1560
ggagtgagtg gggatcttta aggacagcag gccctctgat ctgtctgagc gtgtgagcaa 1620
agcctagtta gggaggtgag ttctatctgc aatgagaggg ggcatgggtg gagacagata 1680
acaccaacac caacagacca gacctcccaa acccgaaagg agagacaaag tgtgattgat 1740
ttcccaaatg cagaaaagac tacccaagtc cccagccaag aagaatcgct ggcctgtgga 1800
tgaagacact ggctttgaaa tggctcaact acgtcccaag caccctttgt gcatcttaat 1860
tgccctggga aatcagggag gggtggcagt ttggagcttg gaaagctgga aggtggggac 1920
gaaaggagtt tttgcccctc atcgccaatc cttgaggttc ctacagggaa cctcagacaa 1980
cagctgtctt aggggtttcc ttccagctcc aagcagctgt attatctata gctttgagag 2040
ggtctgtctc tgtcaatggg gctgattcct cagcacctgg cagggcctgg gggggactgc 2100
cagagtctgt tctgccgggc atgttagtag cacagactac tgggataacc tcagcaactg 2160
tataccttag cactgcagag ctgcggtgtt gtcagacaca ggcccttgca gttcgtggtc 2220
tacccccact tgcctgcacc ccccttatag ctgctcaatg tcctcagact gtaccttagt 2280
gccttggtta ccaagcaacc cccacagagg ccctcctcct ggattttccc ttccctgcta 2340
tgcccacccc accttcaaaa tgtacctgct gcacccatcc cccaggcctg cctcactcct 2400
tccaagctga cagctaatca gatggactaa tcgcatgcgc ggaagagctg tgctcgggaa 2460
gaagggggag atttcacacc aaatcgtgca gtggttgcct agacacggag ccagtcaagc 2520
ttgcatgccc cgttgctaga agagcatggc atcggttgtg ttctgtgctc gtaggctggg 2580
ccccagctcc ctttcctccc ctcctttgtg gctgttcctc aggcctgcag aggggaagat 2640
ttttcctgtc ctgttactct gcctcacttg ccagaacact agtcgcctcc agctctggat 2700
aaagctgagg ctgggtgggc cagacaacag ctgtcttagg ggtctccttc cagctccaag 2760
tagttgtatt atctatagct ctgagagggt ctgtctctgg gctcaggcct ttagtacctg 2820
tggggcagag ccaggaacgt gagtcaggca aaccgctcca aactaggacc aatgcagctg 2880
ggtcctgctc tctgcgcata gggggtcccc acatctttgg aatcccagcc cacctttcca 2940
ggctaccctc cacaggccgg gctccactcc catctgctga ggtttcccac cttgaatcct 3000
gctgccccga ttagctgtat aaccttaaag aatgcactgt ccctctccat taaatgaagt 3060
gcttggatgg attgctaaag gcctgtctgg ctcggaggct tggtgcctca acacattgcc 3120
tgctggtcca aggaaatcag tgcctgagcc agagtcccca tctctaagct ccatggttat 3180
tgttcttgcc acctggctag gaaatgtcct tccagctgcc ccagtctagc tgcctcaccc 3240
tggggccatg ccccaactct gtcctaccct tctctgctgc tgacactcag ccccttccca 3300
gcttccagtt ggatacagga cctgggccag gagagcaggg aggacactgt ggaaatgcgg 3360
ccaggccatc aggggcctcg cagcagggga ctggaggggg agcagtgtcc agggccagaa 3420
gtgccctgcg ggagagccag gacattggct gcctgtggtc ttggtggtcg tggtcagttc 3480
cctctcctgc cagctgtgga atgtgaggcc tggcctggga gatatttttg ctgcactttg 3540
agccaccccg ccccctggaa ctcagaccct gcacagtcca tgccataaca atgacgacca 3600
cttccaattg tttcctagct ggagaggcgg ggaggggagc actgtttggg aaggggggga 3660
gcctggggga aatgcttcta gtgacaacag ccctttctaa atccggctag ggactgggtg 3720
ccgttggggg tgggggtgcc ctgctgcccc atatatacag cccctgagac caggtctggc 3780
tccacagctc tgtcctgctc tgtgtctttc cctgctgctc tcaggtagga gcgggagctg 3840
gaggctttac tctgggataa gggggctcca ggcttaggaa gggattcctc ttggaatagc 3900
aagcttcatg caggacttca tgcagagtac caggtccagt cactgggcac acatgtgcag 3960
gtctaaacat gggcgtatgt gccacaggag ttccataggg gcagatatct gcatctgagc 4020
atatgggacc aatatgcatt acagggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgga 4080
caagcctgca tagtctgaat gtgagaaagg gtatgtacct cactgactga tacagaaata 4140
tcaagtggga gatgtgggtg tatgatcacg tctgtgaacg aggaggttcc tttgcaggga 4200
gggagaaaga atggtggaga aggattctag gaagtgtgta tgccttcatg tgattctgtg 4260
aggcctggaa tgtgtagcta cccctgtcca tgcatgcaga ggttcttgtc tatgcctcca 4320
cgagtaatga ctgttatagt atctgtaccc tctgcagaag gaactcacag gcacgggggt 4380
gtaggatgtt ccaggtcttt gtgtactgaa gaacacgcag atgtgatcta cttacgtggc 4440
acacatcctc aaatgtgcac atttgctgtt gaggcatata tggcaccctg gggttggggt 4500
gcggattgag gtatgggaag gaagcctgtc ctcatgtgag aggcatgccc aagcagcagg 4560
catgagtgtt catcagaggg cttgtggagg gtgtttggct atgtgatggg tgtgtctgtg 4620
agaggaagcc cacagtgtct tctctctgag aatgtccaca aagtctgaca acaaaatggg 4680
gacaggatgg aaaagaagtc tctttagagt catcagactt gcattcaagt cttggctctc 4740
ccacttgttg tcatgggctc ttggccaagc aagccattta acctcgattt cctcatctgt 4800
caaatggggt gaagactgag taggagaaag tgcattgaag tgcttttaga ctggaaagtg 4860
ccgaacaaat gtgaccatta gttgtctctc agatggctca aagaaaggta ccactagatg 4920
ggtacaggca ggggtgggac catctcgcag gagtgaagag gattagggtt caggttgagt 4980
tgacacagga agctgttaga actagttctt gaggaaaaag ggaatagggt ttgaaaaaca 5040
agaaggatgg gttgggccag agaagctgac caccctttcc accttgtttt ggaagagggt 5100
ggatgctgaa gaacagagcc agggagaagc aggaaggtgg gactggtcag gtgggcacag 5160
cctgccctga cacagcctct tccctctctc caggtcccct gcaggccttg gcccctttcc 5220
tcatctgtag acacacttga gtagcccagg taagaaaagc tgaagctaga gcgttgaaaa 5280
tctagtaaga ctgggcatta gagccccaaa gccagcctat ggaactctag tttctgccat 5340
gtgctggaga gaatatcttg gctatcaaga gctacttacc tgtgaccagg gggtccaggg 5400
atagatgagg gtcagagatg gaaatagtta gatttctgct cctacagggg acctgcaggg 5460
agctcagaat gctcttcctt cccctaggag agccccagct tgaacaatag ttagttgttc 5520
cttttaccct ggcaggtttg ctaggctgct cctctggtta aggggtaacc tcaaaaggaa 5580
gggactcact ggtaactcct cttgactctt gagcatggtg ctaggttttg gggctcccac 5640
tgaaggggag agcccaggga gggaagggaa gaatgggcag atgggagggc agccagcttc 5700
tgctcactcc aggcacagcc atgggagatt cggagatggc agtctttggg gctgccgccc 5760
cctacctgcg caagtcagag aaggagcggc tagaagcgca gaccaggcct tttgacctca 5820
agaaggatgt cttcgtgcct gatgacaaac aggagtttgt caaggccaag atcgtgtctc 5880
gagagggtgg caaagtcact gccgagactg agtatggcaa ggtgggtgtc aggctgatgt 5940
gagagtccac cctggccacc tgtacacctg ggtggacaga gaggggtaca cccatgcccc 6000
atgcccatgc agacctgagg atggtcccat tctccttccc tttgggaaga atccagaccc 6060
tccaaagagc cctctccttc ccaatatccc ttctgtcttc cctgtgagat cctggttcct 6120
tctctcttga gcactattgc cctgtcactc accaactcct aaccctcttg aggaaggagg 6180
gaaagcccag gctgacagga gggcttgggt gggggctctt gcagacagtg accgtgaagg 6240
aggaccaggt gatgcagcag aacccaccca agttcgacaa aatcgaggac atggccatgc 6300
tgaccttcct gcatgagccc gcggtgctct acaacctcaa ggatcgctac ggctcctgga 6360
tgatctacgt gagtgctgca cctggcccta cgttgggatc tctgttcttg ctccatccat 6420
gtccacccca ggagccaaga gtgtcttctg tttgtgtcta ggcagggtta cactctaacc 6480
tcgtcccaac atccttggtt caattccaac actctgggga ctggcattac tcagattgag 6540
tgcatgcaga ggttttcctt tctcttcttt ctctcctggg atctttctct aactcccaaa 6600
atcaccagcc ctcccccttc gcaactggca agtcactgct ccttttctat ccccagacct 6660
actcgggcct cttctgtgtc accgtcaacc cttacaagtg gctgccggtg tacactcctg 6720
aggtggtggc tgcctaccgg ggcaagaaga ggagcgaggc cccgccccac atcttctcca 6780
tctccgacaa cgcctatcag tacatgctga caggtgagag gccctggaag gtcttcctga 6840
agggaactgg gataggccgg gagggagagg gagaaggaag ggagaagccc cacgagagca 6900
tcctgtgcag ctcctgacct ttcctcccca ccctctcccc acagacagag aaaaccagtc 6960
catcctgatc acgtgagtgt agctgctact gtattccctt tcagaatctc cctgatccca 7020
gcctccagcc ccatcaggtg tcccaggccc cgaggcatag actcagcctc tttcccccca 7080
acctcgtgcc catctccttc ttctctgacc attaccctga cccctctctt tgctctccct 7140
cttcctttct gctttccatc cccttcatgt ttttcctctc ccacctcctt cacccactct 7200
ccaactcatc acgcgtttat ccagaagctc attatcgcca tgtcttcacc tctgcatttt 7260
ctttcccttc agaaacattt cccattcttc cagccctacc aacttttccc aaaacagccc 7320
aggcccatct cccctgttta ctttgcccag ccaagcacag gtcagcctgc ccaaaccagt 7380
gccttctggt ggcatccttc ctggtgccag ccctgacctc tgtgcatcag aagacagttg 7440
tggattttgg gtgtagataa cctggcagct tcttgcccag ggctcctact ctcgggtagg 7500
cccaggcatt ctctcctgat ttgaggcttg ctggtctcca gtagtattgt tcactgccca 7560
ataagcccct gtcttcacag cggagaatcc ggagcaggga agacagtcaa caccaagagg 7620
gtcatccagt actttgctgt tattgcagcc attggggacc gcagcaagaa ggaccagagc 7680
ccgggcaagg taggcctgct gccctccaag gtcctgtacc gcagaaggga gggagaagag 7740
ctctcacctg cctccttctt ggcctctgca gggcaccctg gaggaccaga tcatccaggc 7800
caaccctgct ctggaggcct ttggcaatgc caagaccgtc cggaacgaca actcctcccg 7860
cttcgtgagt ggtccctgac cttggccttg ggacttggac tggtggagga atggtctcag 7920
atatgagcct tcccccaact catcaccact ctcttccatc tctccagggg aaattcattc 7980
gaattcattt tggggcaaca ggaaagttgg catctgcaga catagagacc tgtgagtgcc 8040
atgaatctgc taggctcagc ctaagctcac ccttgctcta gaccatctgg tcttgacctc 8100
tctctctctc ccctccctcc ctctgttttt ctcctcttta agtctctgtc tgtaggtgtc 8160
tctgtcttca ggtctacata tctgtctctc tctgagactt cctctgcatc tttctccatt 8220
tctgtctctg catggctagg tgtctttctc tgggatttct ctctgagact atttctctcc 8280
ttctgggtct ctgtttccat ctctctgtgt gatctctttg tgtctgtcca actagtctct 8340
ctggctcttc ccttccctct gccttttgct tgctacattt atcattaatt ttccttgtgc 8400
ccaaacccta acttttcttt ctctccttct tctccccacc tgttcacaga tcttctggaa 8460
aaatccagag ttattttcca gctgaaagca gagagagatt atcacatttt ctaccaaatc 8520
ctgtctaaca aaaagcctga gctgctgggt gagtcagagc caccgactga gaccaactat 8580
ctccatggca acctggtccc ctctgcttgt ggctggactc agctggcatg ccctgggttt 8640
catggcactg ctggattcaa ttcagctggg atgtggggcc aagccaagcc ctgtcctgtg 8700
ctgcttcctc aggccatgtg ctgtggcgag cagcctccat gagagccggg ggcttgtgtc 8760
ccaccctaac catgtttttt cccctagaca tgctgctgat caccaacaac ccctacgatt 8820
atgcattcat ctcccaagga gagaccaccg tggcctccat tgatgacgct gaggagctca 8880
tggccactga tgtgagtgtg tgaggaccca gccagggggt gggaggattg gcagtgaggg 8940
gcaaacaggg gtccaaaagc agagctaaga ctctggccat tggttgttta aagtggtatg 9000
gacctcctga gagccagaat gtgccctgtg atcagggtgt actggggaat ggatgaggtg 9060
agacaggact ggccagtatc tggtgttcta tcaaaccagg aagagctgaa agccatgaga 9120
cagagagaca cacaagccaa gaaacaagca tcaccgaggg agcaggacga ggagggaagg 9180
ccatgcagac ggcatggggc tggaggggct gttaggtgaa cagatgcaga caggtatgga 9240
aggccaggca ggaagcaagt gtagggccag gaagcataag tgggtaactc agaaaagctg 9300
tggccactga cactggggct gcggccaact gacgtctgct ctgctcttgc atcttacatc 9360
ctttgttttg gagttccctg catcttacat cctttgtttt ggagctcccc actgggtatg 9420
ggagtctcag aacccacagg gattaaggag acaagttttc tctccaactt acaagggatc 9480
tcacttaccc atcatacttc tttttctggg gtccgccaat atggggcctc cctacagaac 9540
gcttttgatg tgctgggctt cacttcagag gagaaaaact ccatgtataa gctgacaggc 9600
gccatcatgc actttggaaa catgaagttc aagctgaagc agcgggagga gcaggcggag 9660
ccagacggca ctgaaggtgg gaggcaggat tcttggggca gctgtaagtc atgaggcagt 9720
ctgctcagca gtatctctct tctcttttct tttttttttt ttttttgaga tggagtcttg 9780
ctctgttgcc caggctggag cgcagtggca cgatcttggc tcactgccac ctccacatcc 9840
tgggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc tggaattaca ggcatgcacc 9900
accatgcctg gctaattttt gtatttttag tagagatggg gtttcatcat gttggccagg 9960
ttggtctcaa actcctgacc tcaagtgatc cgcctgcctt ggcctcccaa agtgctggga 10020
ttacaggcat gaaccaccac acctggccag cagtcatctc tttaccaact ttgctacttg 10080
ccttttcctt ccagaggctg acaagtctgc ctacctcatg gggctgaact cagccgacct 10140
gctcaagggg ctgtgccacc ctcgggtgaa agtgggcaat gagtacgtca ccaaggggca 10200
gaatgtccag caggtgggtc catcttcaga tgataatggg tgggcagggt agggagactg 10260
gcatggtggg atgagagttt tcaagttcac tcttcccaac aaccctgctc aatatgggtc 10320
tctcctccac cttgcaggtg atatatgcca ctggggcact ggccaaggca gtgtatgaga 10380
ggatgttcaa ctggatggtg acgcgcatca atgccaccct ggagaccaag cagccacgcc 10440
agtacttcat aggagtcctg gacatcgctg gcttcgagat cttcgatgtg agttgggacc 10500
cctgggagtg ggagaacaat cactcactcg ctcccacatt caacagctat ttgcttagag 10560
ccagctgtgg accagacatg ggaaggcagt ggggactgtg tggtgacaga ggcagtcatt 10620
ttctctgtct tcaggggaag ccctccttca ctgccttgac atggagggga ccagccacgc 10680
cctgctgggc tcaggcacag tggacgggca cagccccaat ggccactcac acccactttc 10740
tgactgctcc cacccctcat gccccctgca gttcaacagc tttgagcagc tctgcatcaa 10800
cttcaccaac gagaagctgc agcagttctt caaccaccac atgtttgtgc tggagcagga 10860
ggagtacaag aaggagggca tcgagtggac attcattgac tttggcatgg acctgcaggc 10920
ctgcattgac ctcatcgaga aggtgcctct ttggccttac cacctgaatt ctccctgcac 10980
acccaacaag aacaccatag acaaaatagc agcccctctc ccttctgggg aatataaaaa 11040
tagaaggggc tgaaggatcc gagcccttgg ttccagagcc tatgttgtgc tgagcaccca 11100
ggacagggtg gcaccaggga cagctgattt cccaggggct tgaaagtgga cacatggagg 11160
atgggcacct gcatgatgac ctcccacacc tgcatgttta ttgggcctgg tttatgcatc 11220
caaggatcag gaagtgtgag ggtggtgtag gggatcataa gagtgcacct attttcaacc 11280
ctagcatctc aggcatctgg gtcgtggagt ggtgtgtaca gcatcgatag aatccatatt 11340
cccagacttt cacaaagtcc ttctgtcatc agacaaaatn ctccaccttg aaccggttcc 11400
agtcagtaga taactgtact cagagctgag cctactacct taacacccaa catggcacct 11460
ccacgagcaa gtatattgac catagagcag aatccatgtc cacctgtgtg aaggacactc 11520
agtgatgctc tctcctgctt cctcagccca tgggcatcat gtccatcctg gaagaggagt 11580
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gcaaatccgc caacttccag aagccacgca atatcaaggg gaagcctgaa gcccacttct 11700
ccctgatcca ctatgccggc atcgtggact acaacatcat tggctggctg cagaagaaca 11760
aggatcctct caatgagact gtcgtgggct tgtatcagaa gtcttccctc aagctgctca 11820
gcaccctgtt tgccaactat gctggggctg atgcgcgtaa gtagggactg aggctcccgg 11880
tacagaggag cagggattct gccaaggttc tgagccaggt caattgctac accccaccac 11940
ttcaatgtca ggttgtaccc caaggtttac agactcagtg ggatggaact gggtgaagaa 12000
actgaggcag ccacattgaa ggcctaccag gggcaaatgc cagcaaggat gtaaagaggg 12060
gctgtgatct tactcacacc ctacctcccc acactgatgc ttcttttgtt gactctcctt 12120
cctgcagcta ttgagaaggg caaaggcaag gccaagaaag gctcgtcctt tcagactgtg 12180
tcagctctgc acagggtgag tgggacacag ccccagccaa cttggctccc catctgccca 12240
accccaccca gccccaccct tccctgcctt gttcatcccc tactcctccc gttccctgtc 12300
tccttggtgc attcgggacc attttcactc tgtcttctct tcccgtcatc tcctggcctc 12360
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tccttatccc tgtctccccc agggcccctt catctctgtg acttctcgaa ttctctccat 12480
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gctccaccca tccccacttt gtacgttgta tcatccctaa tgagacaaag tctccaggtg 12660
aggccacaaa ctagggccaa cccactgctg ggcatacacc gccctgggaa caggacctcc 12720
taggacatct ccctacctac caccacagtg gtttccaaac cacattcttc tcctcccatc 12780
ccgcatgagg cctcccaggg tacctccctc tcagcgctac cttgcacttg cagtgtgtaa 12840
tgagggtgat gtgtaaggca ctctgatgga cattacctca tcagtggccc tacaaccccc 12900
tggatagctg gttgtccaag acagaatctt agttcaactt taaatttacc tgcagaacca 12960
cttaagcccc caatgagaca tattcaaatt gttaatccat ttttggctaa ttaggagaca 13020
gaggctcagg gacctgggtt caagacctgg ctctgttctt gatcagctta gtgaacttgg 13080
cctgtcccgt aacccctctg ggcttaattt actcatctag aacattggat atatctgttc 13140
tggctaccac ctatgataat aggtgtgaat catataaaaa aggaatgtga aagcctttta 13200
gttaaaaatg tggctagaag aaaatgaaac aaatgattat tactaactga cttgctaaga 13260
ttacaagcta atcagtgaca aagccaggat cagaacccag aacttcagtc cagtgttctc 13320
acagactcct cctacttcct tcttgccaca ggcgtgatgg acaaccccct ggtcatgcac 13380
cagctgcgct gcaatggtgt gctggagggc atccgcatct gcaggaaagg cttccccaac 13440
cgcatcctct acggggactt ccggcagagg tgggtatgag ggtgcaccag agctcataga 13500
acagggggag ccaggctgcc ctgatgggaa tgggatctgc aggtgaccct agaattctat 13560
gggcagagca gatcactgca gagcatgggt gactctggac acttccctcc tcaggtatcg 13620
catcctgaac ccagcggcca tccctgaggg acagttcatt gatagcagga agggggcaga 13680
gaagctgctc agctccctgg acattgatca caaccagtac aagtttggcc acaccaaggt 13740
gaggaaagga gactaattaa ttaaaggaag acatctcttt tccattgact cctctgatgc 13800
ttttcctgtt gtaatcatct tagcaaaatc tcttacctgt atgctacccc tcccagtgga 13860
acatctagca ccactcccct catcccagct ccagctgcca ttgacctcct ccctgcaatc 13920
cttttctagg ctgttaccct tcctaaggta atccccacca tctctttccc tcgtacccct 13980
ccctagtcat ggccaacaca caccttgcct gcaggtgttc ttcaaggccg ggctgctggg 14040
gctgctggag gaaatgaggg acgagaggct gagccgcatc atcacgcgta tccaggccca 14100
gtcccgaggt gtgctcgcca gaatggagta caaaaagctg ctggaacgta ggtgagagat 14160
ctcaagagga ggtttcccgc ttctctgagg cccaggctgg ttcaggggca gtgtcaggaa 14220
aaaaagctca gcagatcttc aaacacagag acctgcagga ggggctcata tgaacacact 14280
gcagtcacag ggtcagaggc ctcaggaagg gtgggaggga tgaaggaaat gggatattcc 14340
caaggtttca ggacctcagg taggaaggag gcagaggctc agcactcctt tcaatgggcc 14400
cctgcagaga ctccctgctg gtaatccagt ggaacattcg ggccttcatg ggggtcaaga 14460
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agaaggagat ggcctccatg aaggaggagt tcacacgcct caaagaggcg ctagagaagt 14580
ccgaggctcg ccgcaaggag ctggaggaga agatggtgtc cctgctgcag gagaagaatg 14640
acctgcagct ccaagtgcag gcggtgaggc tcctgggcta ctgttggctc ttccaccctg 14700
ctctgccttc acttcccaca accctgcacc tccctgcaca ggggctcact gtcttgttcc 14760
ttcagtcaga ggactctggg atcaacactt ctaaagacct ccaaagaggt ccctcaggag 14820
gaggaaaggg cagagggaaa agagctgact tttaaaagca caggctttct acttgggttc 14880
aacctagata cacagcttaa ttattttgtg accttgggca gaccatgcat catctttgag 14940
cctcaatttc ctctagacag ggaataaagc tgtccatttc attaagccat catacataag 15000
tgcttggcat cagcaaatgc aattcccacc cttcgatgga ggagaccaga ggaagaggtc 15060
cagatgaaga tttctggttc ctttcctctc tgctcccctc cccagtgttc ccaagttata 15120
ctatcctgaa actcttcccc tccccatact tctgaagctc ttgccaagtg gggatatcct 15180
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ctgggcctgg gctgtgccct tatgaaggtt gtccagggca gagatccagg tcccatcccc 720
cagcgccctc ccaggccagc tttatctcag ttgctgatac ccagcctgag gtccttggag 780
gacaaatttg gccacattcc aagtaggcag acttccccgc cccctgccaa gggcccgaaa 840
tggttggggg aaagggagct gggttcatca cgggtgtctc caagcaggga aagtggacac 900
atgcagaaaa agtcttgttg ggaggtcagg accacagccc tggctctccc gactgctagc 960
tgtgtgatct tggaggagcc gcttagcttc tctgagcctc agtgtcctcc tctgagaaat 1020
gaacagaata actgcaacta cctcagagaa ctggtagagt attacgtgag gggatgcata 1080
gaaagtgcta gcacagtatt tactgagagg ggctgcaggg gcggggtgca cgctccaacc 1140
aggggccgct gtagcctcca cctggccctt cagtctcagc ctttagcaag aagccacggt 1200
cagtggaagt ggccgcaggc agccctgccg tgttcgaggc cgagacagag cgggcaggag 1260
tgaaggtgcg ctggcagcgc ggaggcagtg acatcagcgc cagcaacaag tacggcctgg 1320
ccacagaggg cacacggcat acgctgacag tgcgggaagt gggccctgcc gaccagggat 1380
cttacgcagt cattgctggc tcctccaagg tcaagttcga cctcaaggtc atagaggcag 1440
gtaagatcct gatcagcctt ccctgagttt gggctgctgg gggagggcag cccagcgact 1500
ctccatccat ccagggaaca ggaggtgctt tcacactttc ttgcctttgc tgtggctgtg 1560
ccccccgcca ggaacgccct ttcccccttt tctgcacatg acctctctga tacccccatg 1620
tgccatcctg gcttgttcca gccatggggt agtgggagag atgaacaaga cacaacccca 1680
ctctccccct gcagacctcc ctggggagat gacctgcaca gacggccggg aagccccagg 1740
agctgtggat gaggggagtg cagcccagtc tgaggggctg ctctaaggct ggggcagagc 1800
agggatggac ctggagctgt tcagggcaga tgcagaggac atgggaagtg atggcctggg 1860
acggggagga gaatgtgaga ggcaggctgg ctctccagct cagcatgagc tgcctctgag 1920
gggcccaggc agcgggagga cagccatggc agactttcct catccacagc gggctcatgg 1980
gtccaatgct caggagagag agggtggagg ggtctctggt tagtggctgc accacgactc 2040
ccatctgatc ccctccagag aaggcagagc ccatgctggc ccctgcccct gcccctgctg 2100
aggccactgg agcccctgga gaagccccgg ccccagccgc tgagctggga gaaagtgccc 2160
caagtcccaa aggtgagagg ggctgggcag ggaggggcag gatccgtggg tagggcgtgt 2220
ccagggcagg tctcaaaagc ctttgctggg ccaggtgcgg tggctcaggc ctataatccc 2280
cagtactttg ggaggccgag gtgggcggat catgaggtca ggagattgag accatcctgg 2340
ctaacatgat gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa attagccggg cgtggtggcg 2400
ggcacctgcg gtcccagcta acttgggagg ctgaggcagg agaatggtgt gaacctggga 2460
ggcggagctt gcagtgagcc gagattgtgc ctctgcactc cagcctgggt gacagagcaa 2520
gactccatct caaacaaaca gaaaaagcct ttgctcacag ggtcaagctc agcagctctc 2580
aatggtccta cccctggagc ccccgatgac cccattggcc tcttcgtgat gcggccacag 2640
gatggcgagg tgaccgtggg tgagtgtgag ctgctgtgcc cagcattggg gtgggaaggg 2700
ggggcagcag gacactcccc aagccgggcc tgtcgccctg cctttgcagg tggcagcatc 2760
accttctcag cccgcgtggc cggcgccagc ctcctgaagc cgcctgtggt caagtggttc 2820
aagggcaaat gggtggacct gagcagcaag gtgggccagc acctgcagct gcacgacagc 2880
tacgaccgcg ccagcaaggt gggccagcac ctgcagctgc acgacagcta cgaccgcgcc 2940
agcaaggtgg gtccaccggg gtcgtggaga cacggagaga ggggacatgg agagccctag 3000
aaggcacaag gcacacagag ggcaccatga gacccagagg cacacacgag ctgcaagcaa 3060
ggggtgtggg gaatctggga ggcaggtgga ggggccaggg gcccacaggg agatcccgga 3120
ggcctggggg ccagggagtg catgaggctc atgggagcac tgtcggggac ctgggagact 3180
tggtggacat gatcacctca agggggcacc taataaggtt tggccggggg tgggggggcg 3240
cccagggtgg tcaggaagcc tggaggacac tgtgaagcat gggggcacca gctagtgggg 3300
ttgtaaagcc ccgggatggg tgagtatcag ggctaagggc tcaagggact ctcagggatt 3360
aaccagaaca attcctcatt atacagacac ggaaaccaaa gcttgagagg ttaagtggct 3420
gctccaaggt cacttagaca taggcctaga accttaagcc ttcgtttttt gtgttttgtt 3480
tttttccgcc ctgcccacca gaaccttaag gcttaagtcc ccttgtttgt tcactccaag 3540
cctctgcttt tcccaacctt ccccagtcct gggctaggca agggggcctc tagcaagaga 3600
ggccaacatg ttctgctgtg cggggctgtg cattgcacaa aagcctgtat ttcaccacaa 3660
ccgtgtgcca gcagatggca atcatgggtt tcgagatagt cccctttctc tgtacaaaaa 3720
ctctgtatgg gttaactaaa gcctgagggt gcgaagatcg atgagcattt gtcactccca 3780
gcctccttta aatatatata tatatatata atttgagaca gggtctcgct ctgtcgctca 3840
ggctggagtg cagtggctca atctcggctc actgcaacct ccacctcctg ggttcaagcg 3900
attctcccac ctcagcctcc cgagtagctg aaactagagg tgtgcaccac catacttggc 3960
taattttcgt tatttttagt agagacggaa tttcaccacg ttggccaggc tggtctggag 4020
ctcctggtct tatgtgatcc gcccgcctca gcctcccaaa gtggggatta caggcctgag 4080
ccaccgcgcc cggccactcc cagtctcctt taagggtgcg gagccttgtc tcccggcccc 4140
tggtgtcccc tgacgccccg tccctccatg cacacaggtc tatctgttcg agctgcacat 4200
caccgatgcc cagcctgcct tcactggcag ctaccgctgt gaggtgtcca ccaaggacaa 4260
atttgaatgc tccaacttca atctcactgt ccacggtgag ggggccctgg tgtctgtcct 4320
gggctcgggc tccccatggg tcctggtctc ctacctcctt ttcccaacac taaggaggat 4380
gcctcgtccc atccagacat gagtgctggc cacgtgccca gtgctgcaca cacagggtgt 4440
gagagaaacc ccaaggcttg cagggtaggc gtgggggctt agggctgaat ccgggtctca 4500
tctgggtggg actctgtttt atcatcttgg tgtcacggct cctggcccac ggcctggcac 4560
tgtctgaatg tttgggcgat gggtgaaggt gagttgagag atgggtggga attggggaca 4620
ataaaccgtc ccacctgctg gtaccttgac cctgggaaag gctgggaagg tgagatcctg 4680
gggcagatgc ccagcctcat ggggtcatga atgggcaagt ctgtgaatac tcagaggccg 4740
cccccagggc agggcttctc aaacggcccc tctgaagccc cttcccccat ctctccaccc 4800
tttgaaccca gaggccatgg gcaccggaga cctggacctc ctatcagcct tccgccgcac 4860
gtgagtggcc atcctcaggg cctgggggag ccagtgctgg agtctgaggc ccttcagggt 4920
ctcgactggg ggtcagggct ggggatgatt tgcggggcgg aactgaagtc agtgggggct 4980
gcaggggaga gcaagcttcc caggcaggtg aggatactga gtctaacccc cacaggagcc 5040
tggctggagg tggtcggcgg atcaggtacc cctgccccag gccctacctg caccatccgc 5100
agacccccag gggtctgaga cgggtgggag cccaatctgg ctagtgtccc tttctccctc 5160
cccactccac tcccatcctg ctcctaatcc ctttccagtc cctcactgca gcctcactgg 5220
gggtccctct ccatagtgat agccatgagg acactgggat tctggacttc agctcactgc 5280
tgaaaaagag gtgagtcctg ggtggcagtt cctggggcat ctggtgaggc ctggctccaa 5340
atcccagcac tgtggtttgc cagctgtgtg accctgagca caacactgca cctctctgag 5400
ttggtttcct tgtctgtcga ggggatgatc ccagtgtgga aggagttaaa gggctctgca 5460
gacattatgt cccgtcaaca gtcatcctca cagtgtcccc cacggccact ccacacttga 5520
ggctgcaaaa gctccctccg taaactccgg ggacccagaa ggaacagaga gagggtcccc 5580
agagctgcag ggtctaccag gtcggcccaa ctgacttatg ttctctctgc cctctctctc 5640
cctctccccc ggcccctcca ttatggctgc tgctgctgtg gcccagagag taagaatcgg 5700
ggtctgggtg tttgggggcg gcagggcgct ggtgggtgca gaggggattc ccgtcccctc 5760
tctgagaggc tgtggtgaga gactcagagc agggtgcggc tccccacgga caggggtgag 5820
tctctgtgcc ttgggcttct cctgccaccc acctatctgt cagagcttag gagggataag 5880
aaaaagtaat gcacacagga ggtcctgcca gagcctccgg agcagcatgg gtgccccaca 5940
acacagggag tgcaagtgcg gaaaataggg aggaagtaaa ggcccatggg tggggtccag 6000
gtctttgagg gaaggtggcc atacctctca tgtgccacct accctttctc ccacccccac 6060
ccctggagca gcagtttccg gaccccgagg tgagtgccca acatagcaca gcaccctcat 6120
cacccctaat tctgccagga gcccctccag atccccagcc cctcttcagc tcccttggcc 6180
cccagtcctg cctggcctgg gacccagagc agctccagct gccccaccag aagggaaggg 6240
gcagagggac aggggtggct acagctcctt ggtcctgggc ccaggaagcc ccgcccaggg 6300
ggctgcagtc ttgcccccgg ccacagccta gactgcggga cacagggact cgaagctgga 6360
ggcaccagca gaggaggacg tgtgggagat cctacggcag gcacccccat ctgagtacga 6420
gcgcatcgcc ttccagtacg gcgtcactga cctgcgcggc atgctaaaga ggctcaaggg 6480
catgaggcgc gatgagaaga agagcacagg ttagcccttc ctcagaggga gaggaagagg 6540
gcacaggcta gcccttccct acacaggaga ggagagggca taggttagcc cttccccaca 6600
ggggagagga gagggcacag gttagccccc cacctcgtcc acatacatgg aaagagcgga 6660
gtccggcttt agcacagaga ctcacaggaa acaagagccc aggttaaccc ctccttgtgt 6720
agaaaaagcc aagaatgccc aggttagccc cttaccacag agatagaaga gaagagcaaa 6780
agttaggcca ggacagccac aaggaaaagg acagagctca ggttaaccct cctcaccaag 6840
gaaaaatcag gctacacttt ctttctctac cctcttctga aaagaaatga agcccggtta 6900
accctctcca cacccaaaag aaaagggaag aggcccgcta agcctggaga gccacacaca 6960
ggcaaagaac agagcctggc taatctttct ctcaggcaaa caaagcagga tggcttgggt 7020
taactaccct cacccccagg cagatggaaa gaggagagcc caggaatagc ccttctccac 7080
tgaggggttg acagggcggg tgtgaccggg aaagcagggg tctcacatgc cttctcccca 7140
ccatgtctgg gtctagcaca gggcctggca cacacctcga gcgctctata aacaccgact 7200
gaatggaggg gtcagcttcc atgcaggata tgggagacaa gcccctccca aagcacacac 7260
acaaaacaca cacgatcatg gggacgggga gaggagctgg ttagtccctc cctgctgacc 7320
tcccccaggc cccttatccc tctgccctgc ctccctgttg tctcagcctc actgggtttc 7380
ccatcacccc atcgctaggt ggcctggccc ttaccggcac gtggcccatt taagccaggg 7440
atcccctgaa tgccacaact gtctctggta ctcctgaact gctgagccca gaagggcaca 7500
agccannnnn nnnnnntggg caacagaggt gctagtggag cgctgggaag gagtacacac 7560
aactcagggt gctgagagaa gagaaggcac agcgtcccag ccccagttct ctgacaagtt 7620
ctttctttct ggaagcccta acccatcctg agctgagcag gtggagagga ccccaaggaa 7680
gacagaagga caagtcagac agacagagac aaggaggtgg gttgacacat agacacagat 7740
aaagaaatga agacaccatg cctgtaatcc cagcactttg ggaggctgag gcgggcgcat 7800
cacctgaggt caggatttca agaccagccc ggccaacatg gtaaaacccc gtctctacta 7860
aaaatacaaa aattagctgg gcgtggtggc acatgcctgt aatcccagct atcgggaggc 7920
cgaggcagga gaatcacttg aacctgggag gcagaggttg cagtgagcca agatggcggc 7980
cattgcatcc agcctggccc acagagcaag atttgtccga aaacaaccaa cagacacacc 8040
aaccaaccta aagaaataga gacacagaga agtggaagcg gggcggcaca gaggggattg 8100
gaggggggga cctgggcccc agccacagcc acagtagctt ggcctggggg agcagggtgc 8160
gggcggtggg gtggccgggg ctgaggggtg gtgctcagcc tttcagaaga agctggagcc 8220
ggcctaccag gtgagcaaag gccacaagat ccggctgacc gtggaactgg ctgaccatga 8280
cgctgaggtc aaatggctca agaatggcca ggagatccag atgagcggca ggtgcagcct 8340
ggggtgggga gggggctcgg gtggaggtgg ggacccccat agccttgcct cctgcccctc 8400
tccacatgcg tatctctgac tcggtgtggc tctcagcccc atctctctgg gcctaatttc 8460
ccatcctttt gctcctgccg gtccctctct ctctctcctt ttgtctcggg gctcacttcc 8520
tcccgtcggg aacacttcaa cggccccttc tgttctacag caagtaagtt cccctctgga 8580
tggcttgggg tggggggcac agggattatc acggggcgca ctgggcccgg aggggtgtcc 8640
gcagctttcc tgccacttcc ctgcggcccc cacccaggta catctttgag tccatcggtg 8700
ccaagcgtac cctgaccatc agccagtgct cattggcgga cgacgcagcc taccagtgcg 8760
tggtgggtgg cgagaagtgt agcacggagc tctttgtgaa aggtgggcct gggacctgag 8820
gatgtgggaa cctggggagg agatggcctc aggggagcca accctcatgc tcaccctgcc 8880
tggacagagc cccctgtgct catcacgcgc cccttggagg accagctggt gatggtgggg 8940
cagcgggtgg agtttgagtg tgaagtatcg gaggaggggg cgcaagtcaa atggtgagtt 9000
ccagaagcac ggggcatggg tgttgggggc atctgcccag aagaggccac agcacttgcc 9060
acccacccac ccggctaggc tgaaggacgg ggtggagctg acccgggagg agaccttcaa 9120
ataccggttc aagaaggacg ggcagagaca ccacctgatc atcaacgagg ccatgctgga 9180
ggacgcgggg cactatgcac tgtgcactag cgggggccag gcgctggctg agctcattgt 9240
gcagggtgag cctggctggg ggggcacatg aggctttagg gcttggaccc ctcagccccc 9300
accccaccta gccctgtagg ggagcaggca aacctgggct caaggcctct gtgaccttgg 9360
gcctttgaca gcctaaacct catccttctc atctctaaaa tgacgatgct gaggtgaccg 9420
ctccagaggg tactgagagg gtcatacggg cctggtgagc atcaccaccc ctcagacact 9480
tgaggttcct tatgtgcact gcaccatcac aggcaaacat ggcacacaca ggcacacgtg 9540
ttttcacatg cccacatgca cccagacacg tgcgcaccag cgcccatggg cccacacgcc 9600
ctccacaggg attcacgcca cacccacaca ccctcccgag ctcaatggct ctgccctgcc 9660
ctgcagaaaa gaagctggag gtgtaccaga gcatcgcaga cctgatggtg ggcgcaaagg 9720
accaggcggt gttcaaatgt gaggtctcag atgagaatgt tcggggtgtg tggctgaaga 9780
atgggaagga gctggtgccc gacagccgca taaaggtgtc ccacatcggg cggtgagtgt 9840
gcagggcagg tggatgggac aggtggagac tgagatggag acagagagag acacagggag 9900
aaacagagag agagagataa agacaggtgg acagagaggc agatgcacag agacaggaca 9960
gagactgaga cagagaccca cagagaggga gaaacagaca gacccaaaaa gacaaagaga 10020
cagaaagaca gaaatagttc tatagagaca gaaagatatg cacagggagg cacacacata 10080
ggagagttcg tcagagacag agaagaacag agggacagag acaaagaggc agcaggggag 10140
agacacggac ggggtcgaga gctccccagc accctccccc agcttgtgac cagggcaggg 10200
caggaggcca ccaaggaggc cggctctggc cagaggccct cactgcctct cccgccctct 10260
tgctcatccc tggagcaact gggctggcct gctgggccca agttcacaga gattaatgag 10320
acccagcccc tgcccagtct ccaagggccc agccaaggag atgctttgat gtagaaatca 10380
cttttacgct gcctacctct gaaggcacat taaaaagctg gaaaattaga taatatagaa 10440
aaaaaaaggc atttttaaaa atcagaatac caacaagcca ggacaaggtg agggcctcct 10500
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gccactgctc ccctgcaggg tccacaaact gaccattgac gacgtcacac ctgccgacga 10620
ggctgactac agctttgtgc ccgagggctt cgcctgcaac ctgtcagcca agctccactt 10680
catgggtgag cctgctccag ggtagggtgg gtcggggcag tggggccagg agcccctgtc 10740
actgggccct gcctttgccc ccgtgctact tgctcttcct tctcttgcag aggtcaagat 10800
tgacttcgta cccaggcagg gtaagtcttg gggcccctga gtcttggttc tgctcacttt 10860
cccgcaaccc acccacgcag gcctcccctc cactcacaga gggaaaagca aggatcaaaa 10920
ttgggggtcc tggggcccag ctccagcttt gccactcatg accatgggtc aattataatc 10980
tctgtgagcc tcagtttcct cttctctaaa atgggaaccc tgatagtgcc acctcatagg 11040
atagttataa agatgaggtg acatgatgta tcagacctgt caagtgctgt cacactgtga 11100
ctgttattat tacatctttt cttcttcttc cttttttttt atttttattt tttttgagac 11160
ggattctccc tctgtcgccc acgctggaga gaagtggcgc gatctcggct cactgcaagc 11220
tccgcctccc aggttcacac cactctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggactacag 11280
gcgcccgcca ccatgcccag ctaattattt tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac 11340
catgttagcc aggatggttt cgatctcctg atctcatgat ctgcctgcct cggcctccca 11400
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gggcagattc ttgatttatt tggccaggga acccttttaa tgtgtgcatg tgtgcgtgca 11520
tgtgtgcgcg cgtgcgtgtg tgtgcatgtg tctgtgtgtg tatgtatata tgtgtgtctg 11580
tgtctgtgtg tgtgcgtgta tgtatgtgta tttgtgtctg tgtgcatgtg tgtgtctgtg 11640
tgtgcatgtg tgtatgtgta tgtgtgtctg tgtgtatgtg tatatgcgtg tgtgtgtgtg 11700
tattgtgtgt gtgtgtatgt gtgtggcaag acactgatgt tcccccagtt ttcaaaatgc 11760
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gaatgttcca gatcttggtt ggattaataa ttgcatgggt gtattcatct gtcagaactc 11880
agcctactgt cagatctgag cataaactat acctcaatac aaatctaaaa aaccaataac 11940
caggggccca ggctcttgag cagccccgcc ccagtgacct gtgctcctcc tggctctccc 12000
gtttctctga actacattgt gtcttctgca gaacctccca agatccacct ggactgccca 12060
ggccgcatac cagacaccat tgtggttgta gctggaaata agctacgtct ggacgtccct 12120
atctctgggg accctgctcc cactgtgatc tggcagaagg ctatcacgca ggtactgtgg 12180
gtccctcctc agtctcccca tctataagat gggtgtgtgg aaccagccaa gtgctaggac 12240
ctgctgcaca ccccacccac atgtgcacgc cctgctgttg gctaccccat gggagagact 12300
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cgcttccagg ctgagtcagc tcctctgctc cctacttccc tcctgccctg ttcccagggg 12420
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cgggtgtgtt gctgccccca gcagggctcc ctgtgggacc ctcacacctc agccagaggg 12660
tctctgttga agttgctgat gcccatcaca aggatgtgga caccctctca ttaccaggaa 12720
cccctcatga ctgggctgct ccctggctcc cttcatccta agctgaccat gaccttgacc 12780
ttgtgctccc tctcaactca ggagtagttt ctgagacact tttctgccag tgtagctgcc 12840
ggggtcttgc tcctgcctgg cactgttggt tcttctgaag gctggggtct tgaggggtcc 12900
tcatgatagc tcacctgaga ggaacaggtg gttcccccag gtcccgtgcc aaatcaagaa 12960
aggcgagccc ctgccttcag tcggtgccca gagatgaatt gtactagaat attgtggatt 13020
cagtcttccc acagactgtg ttccccccat ggacccccgg gacatctggc tgttgggagg 13080
ctgcaaggac ctcctgggtc tgacttggat ctcaccccaa ctctgcaccc ccccagctgc 13140
tgtgtgagac cgagggccgg gtccgcgtgg agaccaccaa ggaccgcagc atcttcacgg 13200
tcgagggggc agagaaggaa gatgagggcg tctacacggt cacagtgaag aaccctgtgg 13260
gcgaggacca ggtcaacctc acagtcaagg tcatcggtga ggccggccgg ggtccaagct 13320
ggagaacaca gaggggcagc cccaaggagg gcccatccgt tcgctcattc agccactcga 13380
caaacatcac gggcatgctc cctgagccga gcggcaacag gacaggtttt tctgcccaaa 13440
aggagccccg ctctggggga gatggaggca gatgcatcca gcagatttcc tgcgacactg 13500
ctgtacatga gccatgtcca gagtgccgtg ggagcactga gcagagagcc atccctgtgc 13560
ctgggggtga tgcctttagg aggctgagaa gatggtgagg aaaggcatcc caggcagagg 13620
aaactgtgta caaaggggtg gaggagggaa agggcctttt gggtgtggag aatgaatgaa 13680
acatgtcagg agaggactgg gtggggttgg gaggatcaga gccaggacag gggtgaatat 13740
gggcagtgag aagccttaaa gggttgacgg agggctggcg acatgatcag aaatgcatcc 13800
tgttggagac cagcctggac aacacagtgg agactccata tcactaaaaa aaaaaaaaaa 13860
aaggaaaaga agaaagaaat gcattctaga aagatctctt tggatctggg ggtggtgggg 13920
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tacgatggcg ggcagcccat cctgggtgag tgcaagggca ccggatggag gtgtgagggc 14160
gccaaacaga tccgagggaa ggtggtgtgg ggatgcctgg gttccagacc agagctgcca 14220
cctcccctga gccaggctac atcctggagc gcaagaagaa gaagagctac cggtggatgc 14280
agctgaactt cgacctgatt caggagctga gtcatgaagc gcggcgcatg atcgagggcg 14340
tggtgtacga gatgcgcgtc tacgcggtca acgccatcgg catgtccagg cccagccctg 14400
cctcccagcc cttcatgcct atcggtgagc ctgcctggcc tggtcctgcc ccccgccccc 14460
tccccagtta aaaacctcca ataatagcag gtgctctgca ggcagccatg ctagacactc 14520
acatccacag tctcctttca tcctcgactg gggatactca gccgcatttt acagatgagg 14580
aaacaggctc caagcagtta aatgacctgc ttgagatctc ccagctggtt ggggtggagc 14640
tgactctcac actacgccga cccctagttc acgtttcaag cctctctttc catgtctaca 14700
aaatgggaat aatgacactg cctatctcag agagctgtta ggatgatatg ggatgaccag 14760
gcaggccatc tggcatctaa caggtgctca ataaatgttc attgtcccct gttctccaca 14820
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actgggagaa cctgtccttg ggtgtgagcc cagctggttg gcattaaagg gtttaacctg 1560
ggcccccgta agtgtaaccc ttgtcccatc ccaccccaac accccatctt gggacaagcc 1620
ttgctctgtg cccaggagtg gtagagaaag attcccttgg tttctagttt ctcctgggca 1680
ggctgaggac tattcaggga gggggttgcc tggtgtgtaa ggaatttcag agcacattcc 1740
tggcctgctg tagccgggaa gctacctgcc ctcccaaatt ccttttctga cccatgtctt 1800
agagggcgaa tcttccttct ctctgcaaaa gtggaatctg agaggatcag gttgctggct 1860
gcctcctatt tctgaccccc acttccactc ttcctgccct ctccccatcc ccttaccccc 1920
gctctcctgg tgggctaaca gctgttggct taggaaaatc ccattcgagt gctggggaca 1980
aggactgagg ggtggggcct gtgtttctca gaaactcgga gactgtttct acagggacag 2040
aactcaaggc tctcctgctt tgtagttggt taactgaagt cagagaggct aggtgactta 2100
aataaggcca cacagcaaaa tctgggtttt aagcccagat tttttgaccc caaggtcagt 2160
atgccttatg ccttctattg tctttgcttt actccccaag aaaggtgacc ctgtgaacgt 2220
gttaggcttc caacacgtgt tggctatgaa tgcattaggc tagaaagctg cctgtggaag 2280
tgggtgggac ttgggtgtga ggacacaggt gtttcaggac attctggttc cttgccctgc 2340
caggttcttg actctctccc attctgcagc ccccagtctc agcccacctc tttcccctgc 2400
atcaggtcct gcctttgagc cactggcatg gtggtgtcct ctgggctggc tgaaagccct 2460
cctccatcct gcatgtctgc atgctatttt tgggagctgg atggtgcccc caggaacagg 2520
gagaggagtc caagctgctc tgtcctcctg tgaggcccca gcaccatgcc cagtggctct 2580
gaactggtgg aagggcagag taggagagga gagagaaagc tagaagctat gcgcccaggc 2640
tggccatgca cggttcctct gagaattttc tccctcccac tgagggacaa gcttctcctg 2700
gggctcaggt aggagctcct caagttctca agtcactagt tctggccgct cccctggggc 2760
tttgggtaac aattgtcagc cccacccatc ctagggttag gaaggctatt ctctttggcc 2820
actctcatcc taagacctat ttggagaacc tctggggttt gagtcttttt ttcagcagaa 2880
tgaggcttga tcccgcatta tagcacctcg cacatttgat gtctcttctt ctcacccact 2940
caccccaccc tgggggttgg ggcaaaaaag tggctcagag ctgcggttca gagctccttg 3000
taaacaaggc tcctccctca ctgtcctcac cctgctccag cagagggagc agcggaagga 3060
ccactctgct gcagccatgc ttgtttctaa cccagcagaa ctggacataa tgggaacagg 3120
gtctgaagac aatcaatcca ggctgcagtg ggtgctgagt ctggggaagc ctccacctgg 3180
aggggcagct gggcagtggc agctcccttg gaatggctca gcctctggac atcaccccac 3240
ccaaccagag ccctggctct tgctggatgt ccacagatga gtgcctggga ttggtctcag 3300
ccactatggg ggggatgtgc agggagaggt gatgagggag tgagcaggac tgtctatgtg 3360
cctctgtcct catcctgagg cttgggtctg aaattggtgc tgcagcactg gcacgcgtga 3420
gtggggcagg aggtgggcag caggggagga gcattggagg gtggtcctga gcatcatttg 3480
gattcttctc ccgcctcact ttagcctcac tctcacataa ccctgtccat tctctccctt 3540
ggaagccaac atcaggaagg ctgtggagct ggcatattgc actataacag aggctgctgt 3600
tcacgtttca aacaacgtga ttgtgtccct ggagcagtgc actgtcatgg ccccggaggg 3660
ttgggtcata gtagttatta gctgaatgcc tacacttcac actacctctg ttcctcacac 3720
ctacccaaga agagcagtaa tttcacagca aagagagctg agatgtgggg aggttaagtg 3780
accttgccaa ggtcgcaggc aaacgcatgc tggagccagc attcaaaacg agattagtct 3840
cacactcaag tgcttgctct ctgccccctc cctgtgatta cacgcgcact gtaacacctg 3900
acgttgccta atgccttccc cttttgttaa tgtcaactgg agcctcgtaa agaccctgag 3960
tagccaggat gtgtacactt tatctccatg agacagagaa aggactgagg tttggagatg 4020
ttaaaaagac tcgcctaaac accctcggca agctaatgga agaggatctg aatctagatt 4080
atctgttccc agtgcagtga gaagatgatc tcagaatgag ttccctgggg gaacattttt 4140
ttaatcggaa ttttcattga cataattaaa gactagtaca cagttgtctt taataacgag 4200
cgtttacaca cggtgcctag tttctcccga gggcaacatt tgcaaaatta gtactatatc 4260
aaaaccaaga ttggacatca atacaatcaa tctatgatct tattcagatt tgcccacaat 4320
tgcaccatgt gtatgtgaaa ctctaaacaa ctttaacctg tggaggttca cgtatccatc 4380
accacagtct acatactgaa aagatcccaa accacaagga tcccccctgt gtgctttgat 4440
ttatttattt agagacaagt tctcactcat ttgtccaggc cagtctcttg gggtgcccaa 4500
agaccttttg tccaggtctc acttttgtcc agcacacatg gaatgggtgc ggtggctcac 4560
gcctgtaatc tcagcacttc gagaggctga ggcaggagga tcccttgagc ctgggagttc 4620
gaaacagcct gggcaatgtg gcaaaatccc agctttacta aaaatacaaa aattagtcgg 4680
gcatggtggt gcacaactat agtcccagca actcaggagg ctgaggtggg agaatcgctt 4740
gagcccagaa ggttgaggct gcagtgaggc tttgtgcagt gaagatttgt acagtgctga 4800
acagatcctg tggagtgggg gtgggcagag tggatggaaa ggttgagaaa ctgcagacat 4860
tgtcttgagt gtcacaaatg gaaatgcagc atcccaggca gtattgcctg ttcaggggca 4920
aggaacgaag tggacatcag caggtggcct tgctgccatg tgggtgtcac tatctccccc 4980
agcaggggag aaaacaggct ttttgttgca ggtcacacag ctcatgaggg gtggaactag 5040
attcacccta ggcctcgctg atctctgtac aacgggggcc agagctcttc tgaggaaggc 5100
aggcttccct ttgtacctgc actgactttt ttctcctttt ggagggagag cagagaccat 5160
gtctgacata gaagaggtgg tggaagagta cgaggaggag tgagtatctg gagcatcttg 5220
cctgagtggg gtcctctccc gccgctgccc tgacacctgg tccaggagcc tcccagctgt 5280
ccctcggatt ctgggtagaa gtagctgtgt gtgttttggg caccccgagg agagatatag 5340
ccatttcctt tccactcctg tacccctggg ttgtagatcc caggcagagc acaggccgag 5400
agacttcggg aagcacagag gttcagctcc agggtcatca gtgtccttgg ccagtcttgg 5460
ctaggggcca tgaacagaga agctgagatg ttgggtctcc tgaaactgac tgaggaaggt 5520
tcagtgactc tccagaggca cagagctgat tatgcccccc aaaccccagc tcagaaccca 5580
gtgttatcac cctgtcttgg atccctactc tctcatgaca gtgccctgcc cacagtccta 5640
tcccagaggg aaaccagggg gtgggacaca gccaatccaa taactacaga ggatagtggt 5700
caccagggag gagacagagg tataggcacg gctactgccc tcacagaact tactcttgtt 5760
gagatgttaa gacataaact gggagaagaa attagcaact gggggcctgg tgtggagggc 5820
gggctgttgg tagtgtagga gttctgagga gagggagatc aggggctgga atagtcaggg 5880
ggctgtgtgg agaaggcagg tcttacctgt gtagaatttg gaaagataag agatttggga 5940
gagggcagga ctttctagaa aggggtacag cttgggcaaa gatggaaaga gtaagtgagc 6000
agaacgctgg tgagaccaag ctggctgggg cggaggcttg cggaggatgg taggaggcag 6060
ccctgcatga gaacggcagg ccaggctagt gggtgtcatt gcaaggtggg cagggcagcg 6120
tggactccac taggcaacaa gggaaaagaa agggggatta tctttgggga aaggccagtg 6180
tgtgcatgtg tgtgcaggcg tgtgtgtttg catgtgcttg tgtgcgagct actgacagtg 6240
tttcctgttg ctctcaggga gcaggaaggt aagcgtaaac gtgtgtactc atttggatca 6300
aagacagcct ggttcgaaac tgacccacct cttctctctt ctcttgctgc ctggacttct 6360
cttctgagca gaagcagctg ttgaaggtat gtgcctcagg caggtggaga gccagaaagg 6420
ggcaggctca gcaatgtgga aatcctggga gccctgggaa agcagctcat ctgtccctgc 6480
tcctcactct cagctgagca agatcctcca acaacagtgc cttctaaaat gggaatcagt 6540
cctacctggg ttgctcgggt cttgaggcaa acgatttaaa cctgtctctt ctgtctgcca 6600
tttgcttcaa acacactgat cacttttccc aatttttttt gcttcttctc ccttttatca 6660
tgggaaattt taaatgcaca taaaggtagc aataataata ataatggccc cccctgccca 6720
aggtacccat taccagcttc aacaatcatc atcttagggc cagtcttctt tcctctatac 6780
tccaccttcc accagttatt ttggagcaga catccaaaat tgttcccagg caccatgtca 6840
gttcacgctt caagatttcg ctacaccgta tctctaagag ataagcacta cttaaaaacc 6900
ataaccacaa tgccatgata tgccccaaaa gattccattt agtaatttct caaatgcgat 6960
tgtgagtatg aaattgctca gtgatctgag acgtcttatc tcggcatgaa gatttgtcat 7020
gattctgagc ttgcagaggc ccctcttgct gctcctatgc tgatcggtta acccatcgcc 7080
ctcctcagct gtgggtccca catctccctg aaagaacgcc ctcaccttcc cttcttcctg 7140
agagcttggc acatggaaat gactcagagg cttcactcca gtcctccccc tgcaccccag 7200
gcaggtggac cctgcctttt agtggctcag gtatcacttc agcatgtggc atgtagatat 7260
taggagaagg gtctctatga aggtccaagg ggggagccag gtggccccgc ccttgctccc 7320
catggctcct agggaaaatg gggaccctcc tgcacattta gggctgttcc agggctgtct 7380
ggccaaagag gagacagaag agaaattcac aggagaaact gaaagaggcc acaggcgtct 7440
tttttggttt ttaaggaaca ccagatactt cagaagctat cagaaatata tttttgaata 7500
aaaaatctaa ctggctccaa attctgctgt gttccctgaa cagactcttg atatgatatc 7560
ccttcctttg ttttggagga ttttccactt ccttataaca ggtttagggt ggtggagttt 7620
gagacataga tctctggatt tgggaccaat ctgcctgcca cacacagtag aatttggctg 7680
tgagttagca gagtcattct ccactgtgct ggggcctgag ccgtgtagca tctgccttgc 7740
ttgccatgaa tagacgagac ttgcctccca cacagttgag gatctggctg caaatgatca 7800
agagagagca acgtctagat gggtgtccac taagcctgca ggatagataa tgccaggtgt 7860
ccttcttcca ggagaggaat tgttccactt gctggaactg tttttttggg cagatatttg 7920
tacgtagaac aactgttgta gatgcagcct ctttccttag atttataatg ctggaccctt 7980
cttagatggg gcagcatcct cccaacaggc cgggcaaatc tcccctgggg ccaggctctc 8040
caatgaggct ttctaaagtg tgactcctgg aaactggaca tagtttgcag gatacccaag 8100
agcctcattc agagcaggaa catgggcagg ctcgttgagg gcaggaaatt tgatggaaga 8160
gaattgtccc ccactctctg ctctttaggg gcctctgtct tagtaagaag gaggccaagg 8220
ctctgtcgtc tagaggcatt gcagttacca cagatcgcat gctcctcttg tgccaggcac 8280
ctgctgggcg ctctatgcac gctaggtcat tcagtcctca ccacggctga gaagtgagta 8340
gaatgattcc cattttactg atgaggcacc tgaggctcag ggaagtaact gagagttgcc 8400
cctgttgctg gaaagtagtg gcttgggaat tggaatgccg gcctaactcc aaagcccaca 8460
ctcttaaaac cactgcgctg ggtggctgct cctgccgcgg gctctctgct cccagactaa 8520
cctgtctcgc ttttcccctc cgctgcggcc actccctgaa cctcagaaga ggaggactgg 8580
agagaggacg aagacggtag tacagccttt ccttctgtgg tgctttctgc tgcctgctgt 8640
cccaagtgca gcctccttgt ccaggggccc tgttctgggg gctggggggt gtgagtaggc 8700
ggcagggacg gagtgggtca gtcgtttcct cccctgcctc ccaggggcca ggatcacagt 8760
tccaagctga tcatcatgcc tgaacttcag ggccactggc tcctcttcct ggttcctgga 8820
tccttcccct gggttgggtg gtgggaggga ccaaggctag ctggtctccc aagctgctcc 8880
aaatgtggcc atagagggga cctggcacct ggaagacagc agcgccaccc tgcccccgcg 8940
cacaccccag tgttccatgc tgggccctcc ttaggagctg gacagcacca agcagggtgg 9000
ccaggtgttg gttggggggt ctggggacag agtcctctgg agagcagcca gggagactgg 9060
aaatagccag agcaggaagg acatgacgtc agccttcaga tgcgccctgc tgatggggag 9120
cacaggacca aggcaaggga gtgagaccag ggcttaattt tagaaagtgc gttctgacag 9180
ctatatctca agatgcagta ggtgggttgg ggaggcagta agctccccat ccttgggatg 9240
ttgcatggcc actgggtggg ctggggtata ttatatagag aaatgacacg tcagatgagg 9300
tggcagaggt gtgaacaaga tggcctaaag gtagacccca caatggccat gtccttcctc 9360
gctagccctc tgctttcaca ctttctagaa ggatcatttt gaggtaagac tcctgcaggg 9420
atcaaataaa aggcatctcc aggcttcaga gaggactcag acctgggaag ggaggacaga 9480
gggaatgaag gccaaccctt ctcccacgat ggtgtcttcc tcctgtctga ggtttttctt 9540
ctccctctgc caagaggcac ccacttccca gtgcatcagt gaacaggcat cacagaacac 9600
ttcctacagg cacagcccag gccaggcggc atcctgtctc ccttatctgt ttgtctgtct 9660
gtctacacca agtgcctgag tgagatgggg gccacatcct gccaaacaaa tagatgaaaa 9720
tagaaaaatc ctgcccactt tctggatagt acgaagatcc agatattgag tgtgccatcc 9780
agccacacag tcgtactctt ttggtttctt tgagatgtgg attgagggtg tctagagtca 9840
ctaggttcag gacaggagct tctggacacc tcggcttaag cagagcatgt tctgtggtgc 9900
cagacacggg tgaaacttct gggctggaaa gttgggaatg aggtggagtc ccatcatcag 9960
ggagtttgcc gggatgagtg gggctaagct gggtggcggg aggtagccga cagtcaaaac 10020
caagaatggc agccccccag cacgttgttg cccccaaatt catctggacc tagacgtctt 10080
gacccccatc cccactcccc gctgcccatt ctctgctctg ggttctgcct gatagcatga 10140
gtggggcctg cttcttcact ctgtctgctt cacttctcca gagcaggagg aggcagcgga 10200
agaggatgct gaagcagagg ctgagaccga ggagaccagg gcagaaggta agtctctggt 10260
tgagggtgca ggggcctcag ggggtggcga gagcccctgg agccattcct gaggcagtaa 10320
gaaacccccc agaacaggct ttcccatgtg cacctgactc tcctattgac taagattcaa 10380
ccattgattg cccaatcaac aaacgttgac ccagcgcttc tcttgtgtca ggcagtcttg 10440
ggtccagggg aatgtgtgtg tgagagacag ctctgtaacc ccaaaaacca acagagtgca 10500
tcttggctag ggcttatctg tggggaaggc tcttgctggt ggcggagggg gggacttgag 10560
ctcagaacaa ggaccttgat tgatttctcg tgtttcattt agaagatgaa gaagaagagg 10620
aagcaaagga ggctgaaggt aaggatatca ggagagaggt acaagggagg caaaggaacc 10680
cctcacagca gctttggagg agaatgccca cagtgctctt tccagggaag tggatgtgca 10740
ctgagagggt ttgggagagg agaggacaga acttggtggc acttccaaag ttttagatgt 10800
tgagctttca actttgcccc ttctcccaga gaagttgcat tggtggcacc cagtgggaga 10860
ggggaccatt gtccagcccc ctggtctgga cagagcaatg ggacccagaa gtcatatcca 10920
cacatgaagc tcctagagct taggtgaaat cacttgtagg atgtggtgtc cgtaggatga 10980
aatcccaatg catagatggt catggtgggt cattgctgca gtcatcgtca tgctgcagcc 11040
ttcaccaggg ttctaagtgg tcccagtcac ttctccaaag gggaggggac aaccagctgg 11100
ggcttggaat catgtcatca gcttctgccc tgtggccacc gggaagtcca aggggtaaca 11160
aagaaggcaa agacctggga ggggattcta gggccaggac ccttggggac ctttccaaag 11220
gccttgtcac tgtgaagcac aagagaagca aaattgcttt gcccagaact ggtgagtgag 11280
agaaggcttt gtgtgaagtt ccacactgcg tgagtgtgtg ccctgcagaa ctctatggga 11340
gggggagtgt ggcatctgca gcccccgctg ccttcattct cctggatgct tctggaatca 11400
gggctcccca gtgccgggag ggactcactg tgcagatggg gaaatggaaa tccacaggga 11460
tctagctcat cgagggcgga gttgggacca cttctggggc ccctgaccca tggctgtgtg 11520
cttctatctc ctccagatgg cccaatggag gagtccaaac caaagcccag gtgagtgggg 11580
aggcacctgg gtagagccgg gagcagaggc tcagggagag aggatgatga tggaacaggg 11640
tgcagtatgg tgcagtggac acgggctggg ggtttggtgg gcacagagca ccacagtaca 11700
gttgtacaag ttgtgtactg cacaagcgtc tcttcctaag ggagtgagtg agggctgaat 11760
tccacccaac actccatcac caatcgtgca ccctagcagg gatggggcta tgttcttcta 11820
gaggaagggc cctgaacgga cactctcctc tctcacagta tggccagaac accctcctcc 11880
atggccgagg tgggaccttg ggattaaggg aagcaaattg tggggagcca aacaatgaaa 11940
ccgtgccagc ataggcatgg cggcttcaga gagctgagag agggcaggac ggcttggtgc 12000
cacacacgtg aagcccacct gaaggtggtg tgtgctgggg ggggctgggg gatagggagc 12060
atttcccttt ttatgatgcc aaccctgcca gcagaggttg acccatggca cctctgccca 12120
ctcacaggct cttcccattt cagtggggcc ttctgaaacc agcccaagac atcccagatc 12180
catttatttg cccagtgcct tcccccttcc tggcctcttg tgcactgcgg tatctcattt 12240
cagctccaca cacctgaggg cagatgggga catgaagaat cagagaaccc ctgggtctca 12300
gtatgtgttg ggaccaggac caaactgcaa gactcccagg ttcatggcca gtttctgcgg 12360
ggtccaccag gggatttgaa gtccaagaag catggcatct tgtcacagct tctttgattc 12420
caagttgtgt ggctttgagc aagtcattct acctccctga gcctcagttc tcctaagtga 12480
gattaacggt acccacttca tgggcatatc atgagcatga agtgaaatag catatgtgaa 12540
agagctttgt gtattcccag gtgctgagca aggctgagga ctgccattgt tgacgtcagt 12600
gttactatca ttgctgtggt tggtcggggc agtgctggaa gattctctag gaaggatcag 12660
gccctgcctg tcctggacac cctcagtccc tgggtccaga atggggctga tgctgactat 12720
tcctctctcc aacaggtcgt tcatgcccaa cttggtgcct cccaagatcc ccgatggaga 12780
gagagtggac tttgatgtaa gcggtggctg tgggttgagt aggcctgggc tggggatagt 12840
cccaagggcc ctcagtgaca gagattttgt gaccttgggc tggggtagag cataggtggg 12900
atggggtgca gcacagccag gctgggtgcc catccatgag cgtggtcctg ggttcaggcc 12960
acagttaccc cttccctggc caggcgccat gccctgccag aggtcttttg cactgcgttg 13020
ggggtgtcta gcccacccat ctctcctctg gactctttgg agtggcagcc tctgagccgc 13080
agcggtccac ccacaggaca tccaccggaa gcgcatggag aaggacctga atgagttgca 13140
ggcgctgatc gaggctcact ttgagaacag gaagaaagag gaggaggagc tcgtttctct 13200
caaagacagg atcgtaggtg tccagtctgc ccacctaaca ttctctgatg gcccagtctg 13260
tcctccatcc cttttgtgag gccccacctc ctccagacag ccttcctcgg cgcctcaaac 13320
ccagctaggt gtgaggtctc cttcagaggc cctccagcat tctgcacagc tcctgcagcc 13380
ctgactggtt tctcgggtcc ctgccttccc tccccatcct actggatgct ccttgactgc 13440
cagagctgag tctgatctgt ttcaggcctc ccccagggcc taattcaggc ccgggctgtg 13500
gactgattgg tcacaggcct gctgcgccac ccctgccctt gcctcctctt cccccgcaga 13560
tgaaggggag tgtgacctgc agaatcccac atccttctcc tgcagagcgt ggaggctgct 13620
ttgattgctt ttgtttctcc ccatcaaact tgccttccca cagacatgct gctctggctg 13680
gagcaatgac ttggccatct atccaagcat atggcacaga gcagctgcca gggcagggtg 13740
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cagtctcacc atgaggaatg ttggaggtgg gtcactgcag gtaccctggt gtgcacgtcc 13860
gtggagctgg ttgaaagtgg aggcccttgg aggccgggca ccattgcttc aagactctgg 13920
aaggaaccct cccccaggaa ttcccttgcc accccatgca ggtttctgta cctgcgatgt 13980
caccttctcc ctatgcacac ctgggtgggc tttgcctctt ctccttagga gaaacgtcgg 14040
gcagagcggg ccgagcagca gcgcatccgg aatgagcggg agaaggagcg gcagaaccgc 14100
ctggctgtga gtgaccccta gcccaggccc atggaggccc cccatgctcc cagctcctgc 14160
tgggccccca ggcccctctc tattcatcaa catgaatgaa atcagtcaag agacaatatt 14220
ggccgggtgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtaga 14280
tcacttgagg ttgggagttc gagaccatcc tgaccaacgg agaaaccctg tctctactaa 14340
aaatacaaaa ttagccaggc gtggtggcac atgccggtca tcctagctac tcaggaggct 14400
gaggcaggag aatcgcttga acccaggagg caaggttgca gtgagccgag gtcatgccat 14460
tgcactctag cctgggcaac aagagtgaaa ctccaactca aaaaaaaaaa aaaaggaaaa 14520
aaaagagaca atatcaatat caacctagga agtgctgggc attgtcttgg ctctgataat 14580
acatcagcaa acaagacaga aatgcctgcg tccttatgaa cgtgttattt tataagactc 14640
tccagccctc atcccttccc cagtgcagac ttcgtgggaa ccgaaggccc cgtagctctc 14700
ttcctgtgca gctgctgaag gcatttccag agcaacaggt cttccagggg cactcccagc 14760
ttaaggggat gacgagacct cacatttggg aatcaggacc tcattcaatc acgcagtcat 14820
ttctcagtca gtggactcct gtgggccagc actgtgctgg gagctaccct ctcagaaagc 14880
tccttgctga gcggagagaa agctgaactc acccataaag accacaagct tcagcccaga 14940
atcagggttt ccaatccttt cccctaattt gctttcttcc tccctgctgt aaatcaggaa 15000
gagagggctc gacgagagga ggaggagaac aggaggaagg ctgaggatga ggcccggaag 15060
aagaaggctt tgtccaacat gatgcatttt gggggttaca tccagaaggt aggtagggag 15120
cagcaggggt tgccaggaga tcctagtata gccctgagga atgaggtgtc cactgcagca 15180
ggtagacttt aggtcaggtc ccaggaagag attcccagct gctgtgggtg gaagactgag 15240
gtctcctcat gcccagccct gagctggttt tcagcctgac cgcggcttgc actaggaggg 15300
gcttgctggg gtagggggct acaggcagag cctggggcac caatggtgcc ccccatgcct 15360
ggctccagca gtgctcagga gcccccaagg aggctgggtg cagctggaag agccttgtgc 15420
ctagagtcag agctctagtt ggagacccag ctctgccaca tacagttgtg tgaccttttg 15480
caacctctga gcctcggttt cctcaactgg cactcatatt gcctgccttg atgctttgag 15540
aagctcaaat gagctaccat ggaaagtgtc tatgtgccac acagatgtga ggttgtttgt 15600
tcctggaaac tcactctcga tccctaactt ttgtgcccca ttcctcctag gtcctccatt 15660
ctcgagggag gagggatatg tgaaattgat tttctctagg tagtgaagga atcaaaacat 15720
tttcttagat ttccagctta gtccctagct caggactagg ccaccccctg cctctgcccc 15780
catggtgacc acaccagcca agactttggc atcaaagtct tcatgctacc gaacagcccc 15840
tgctgtaacc ctcagaccca cgtcctagta aacccggctg actacagcga gtatctgaat 15900
cttctcttcc atgtctctcc ttgcctttgt cttcctgcct tctctctgtg tctctgttgc 15960
cgtcttggtc tttttctatg ggcctctctc tcatggtttc ccggtttagc aggcccaggt 16020
gggtaccaaa aacctcaagc cttcttcctc cccatagttt tggagagctc cctgggaggg 16080
gaaggcgcct tgctggaggg gaggagtgaa gagattgggc tggctgggga ggggggaagc 16140
tggtgagagg tgaaagagat tagttaggca aagaaggaag agactgacgt gatccttctt 16200
gcccctacct cagtttccct agggaataca tgtagttggt agttgggggg tgtggcagga 16260
agaagagcat aagaacctgg ccctcctgca ggccttgctc cacccccagg gggtttgggg 16320
agggttaggg gacagggagg gggcaatctg gccagtttac tctgcttccc acaccctcca 16380
gacagagcgg aaaagtggga agaggcagac tgagcgggaa aagaagaaga agattctggc 16440
tgagaggagg aaggtgctgg ccattgacca cctgaatgaa gatcagctga ggtgggggct 16500
gggaggaatg gtcctggggc actgcccgca tctgctctgg gaggggtcgg gccaagggca 16560
cttcttgctg tgagccacca gagggcagga ctgcctcaca tattttccca tggcaagttt 16620
ggtgggacca gagctgggcc ccagcaggtc gggccaactc ctttctgggc tttgctgatg 16680
gggaaagaga actgagcagg tgccccaccc ctctgagctt cacctaccca cctgcacacg 16740
ggtgtcagga caggggattg aactagatgc tctcctgcgc cagaagggct tctcctgctc 16800
cccgcttgtt cttggaactt tgccctggca gtccctggtg tccgttcctg agcactgggt 16860
gctgccgtct ggtccccagg ctgggtcagg cccagggggt gggctggggt acccttggca 16920
ggcctggagg tgggaaggag ggctgggatg ctgggggctg ggccgggacc aggacggagg 16980
cccaggaggg ccctttctta ctggacctcc ccattctcac ccttgcccgt gcagggagaa 17040
ggccaaggag ctgtggcaga cgatctataa cttggaggca gagaagttcg acctgcagga 17100
gaagttcaag cagcagaaat atgaggtggg ccgccatgct gtccccgccc agcatctcca 17160
tctcacactc ctcctggttc actgggtccg gtaatactgc tgcaggtccc tgggtccctg 17220
tccctattcc ccaacagccc ccttcagctc ctgcatctgc ccctgctgcc tggccttcag 17280
cagtgttcca tgtccaccgc attgacgact gcttgctgga agtgtctgag agctcgctgg 17340
ggctgagcag agacactttc ctggtgttcc aaccctgggg gtctccaaca cgttgaggca 17400
gcagctcagt gatctgagct ggttacaagg accaggatgc accaagccag gacccccagt 17460
ggaaggggag tgctgccaac agagaggtgc ttctccccac atacacccaa ggtcctggtg 17520
tgggcacaat taggctgagc ctcaagctca cagtctttcg gagtcctatg tgcactaatg 17580
agggtcttag gtgaacagac accaggcaag gaaatggctt agaggacact gatgctgcat 17640
accggagctt agacctgggc gccagtcctt ccttacccac cacccccgag ccccggtccc 17700
agggcctctt tgctacctaa gggaagaatt cagcttcccc tggaaggtct cctttgctgc 17760
tcctgccaaa ccactcctcc ctgggcaaga agcccctcgc tgggcaggct caggctgcag 17820
tggctacagg gtactcccac ctcccaatac ggagagaggc tgtattgcct ggtgacagtg 17880
gcatggactt tggagccata atgcctgggt tgaatttcta cctgtgcccc tcactggctg 17940
tgtgacattg ggtgagttag tccactgttc cttgcctcca tttccacagg taacactaca 18000
atatacttca gagggtgatt gtgagggtta cagagataat actaattgtt attattgcta 18060
tagtgttcca accactgttc caagcatgtc ccatgtatta acttactatg ccctcatagc 18120
agccctatgg gttcatatct gggaaggtgc tcaggacaga gcctggcacc cactaaatgc 18180
tcagcaggtg tcagccattg ttatggcctc tctagtcctg tgccttccac ttttttctct 18240
ttttttggtt ccacactgaa ctctgcaccg gccaacagga cacagatttg ccaaactttg 18300
gggcagcacc ctgcaggggt ggtgcatggg gatgctactg ctcaaagggc acagcttccg 18360
ggatggtggg cagctgggca ggggtgcccc agaggggtct ggggctgggc tgctaggagg 18420
gctccatgac acagcctcca gctttgtgcc cagctctcag aggcccttct tatgggactc 18480
tcatatcctg aacctattat ggccctggga ccccacagtg ggaggcccat gaggcatcct 18540
ggaagcttct ccttggcttc tgcctgtggt acacgggccc ctcctgaccc ttaactatcc 18600
taacccctcc tactcttcca tgctcctcct tctcctcctg cactgctgca ctcagccccc 18660
ttctccccat ccccaggcca cctgggacct gagccagtca gctccagcgt tgctctttgt 18720
ccttcccact tttcttgcag atcaatgttc tccgaaacag gatcaacgat aaccagaaag 18780
tgtaagtgtc tgaggtcatt ctcgcctagc cctccccctg ccccctcctt ccctaccttc 18840
cagctatccc attcctcctt ggagggcccc aggctcccag cccttcctcc tctgcttcag 18900
cccacaggtt tccttctctg gctcctccgg ggcctcgtgc ttctctccct gtggcctctg 18960
cttgctggtg ggggtgaaat gtggggcgga gaagcttccc tccagcctca ggctgctgtc 19020
ctattctgcc cctggaggca gctccagcct gctcctctcc cctttggcac cccagtccta 19080
ccccagccgc atggtgacct actaccctgc ctgtgtctcc atgtcactgc gtcctgcttc 19140
ccctgcagct ccaagacccg cgggaaggct aaagtcaccg ggcgctggaa atagagcctg 19200
gcctccttca ccaaagatct gctcctcgct cgcacctgcc tccggcctgc actcccccag 19260
ttcccgggcc ctcctgggca ccccaggcag ctcctgtttg gaaatgggga gctggcctag 19320
gtgggagcca ccactcctgc ctgcccccac acccactcca caccagtaat aaaaagccac 19380
cacacactga ctggcatttc tgtcacgtcc ccttcagaga gagagagaaa ctgaggcgag 19440
accctgctct cacaggtccc cggtgtctgc caagctctaa ggagctttcc cctgtctggt 19500
ctccctgctt gcctctagct ggggagaggg tggagggccc agggtgcagc ccaggaggca 19560
ggagcagtgg aaagggcttc agatcattgc tcctgggagt caccaaaaca gcacatggga 19620
aaagtgctgt tgagggggac agagtgttcc ctgcatgagt cactcactgg agaacaatgc 19680
aggactcttc ggatggttcc cgttctcttt ctcctcctag ccagggccct aggaaccagg 19740
tgtctgaggg acagggagct cttgaggaag gaaggaaggc cagttttatt gggcagctat 19800
tcaggcctga gttgttgaga ggtgtgggtt agtctgggtg cctcagtttc cccctcccat 19860
gatctgcaca tcctcgaggg cttaagtcac agggtcctga gctgaagagg acagcttggt 19920
ggcatggatt tcagttggca gaaagacaag gaaacgatga gagggcacca tcctcctctc 19980
cagaggagag cctgagacga cacattctct tgaccctcca ttcctttgtc aggcgtggaa 20040
tttcccccaa ttcctgattc cttcccttgg ctccccactt gccatccatc agcaagtgcc 20100
tcatgagctg tgtctggaaa ggcttcctgt ggtctcccag ccagagcaaa tccatttctg 20160
cttgctagag catgtgctgt cacagctatg ccatccaatg ccacactctg ttagacgggt 20220
ctcttcctgc aggcgtggct ctcatgctcc caggagacaa tgcagacatg ttatcctgtg 20280
ctgtatgcca agcactggga tccatgtagt gagagatgaa gaggaaatgg tccttgggcc 20340
acagggaggg gcttagcctg gggtctcggc ctcatttctt attcattcat tcgttcagtc 20400
attcaaatac ctcctgagca ccaactatgt gctagacact gtgttgggtg tggggtgctg 20460
tgatttaagc cagcacatcg ctcatggagc tcacagagct cacatccagc agcagggaga 20520
cagcaagcag aggtcccagc cctgggtgac aggggcgggt ggggggtgcg atgctgggga 20580
gaggcatagc cacgcaccac acctggccct ggcaggtggg aaggctttct ggaggaaaga 20640
gtgtctaggc cgagtaccag agggtgagga gggggaagtc aaggggaaga ggttgggggt 20700
ggggctggga acggcacata gaaagtttga gaagcaagag ccagcatggt gtgtttgaag 20760
agatatagtt attagcagaa tccaagcatc ttctggtggg gacaagaagg ctccatcata 20820
aatgccccca aaatggacag ggaggcagga cgcaggcctc aggcccaagg agggctgtca 20880
ccacgggctc tgggagaccc actggcagct cctggcacgc accagcccta ctatctcagt 20940
ttgccggata ggacagctgg ggcagtgccc tagcccctct ccccataaag gggcactgca 21000
cctctacccc cacctgccgc cttggctcca ccgcctatgc ctcagtgtct ccttggtgca 21060
acaagaggtc atgatgggcc gtgtgtctgg ggccctgtct cctgctcccc ctctcccagc 21120
agggtccttg tgaccatttc tctagtacag cggtccccaa cctttttggc accaaggacc 21180
agtttcttgg aagactattt ttccatggac aggggtgggg tggggaagaa aagtaggggt 21240
gggtgggtgg gggtggtttc aggatgaaac tattccactt cagatcgtca ggcaatagat 21300
tctcgtaagg agtatgcacc ctagatccct cgcatgcaca gttcacaata ggtttcacac 21360
tcctatgaga atctaatgct gctggctgct gatctgacaa gaggtggagc tcaggccgtc 21420
atgctcgccc acccacagct cacctgctgt gcagcctggt tcataacagg ctatagactg 21480
gtagagtctg gtccacggtg cagaggttgg ggacccctgc tctagtagat gtggtctctc 21540
ttttaaaaat tgtgcccagg ccgagcgcgg tggctcatgc ctgtaatccc agcactttgc 21600
gaggccgagg caggcacatc atgaggtcag gagatcaagg ccatcctggg caacatggtg 21660
aaaccctgtc tttactgcac tccagcctgg caacagaacg agactccgtc tcaaaaaaaa 21720
aattagctgg gcatggtggc gcgtgcctgt agtagggctc gggaggctga ggcaggggaa 21780
tcgctcaaaa aaaaaaaaca actgtgccca gaggtgggca cagaagacac ccttgccctc 21840
cgactctgaa aagcccctaa gaccagatcc cacttaatct cttttctcct aaggtcacct 21900
ggtgttcagg aaagaacttc ggagtgtccc aggcgctgcc cccatggggg cctcacccag 21960
ttgaggtccc catcccatca tcttaagagg aacaccacag gttaacccaa gcgctgcctc 22020
taggcaggag atctgcagac acctggtctg catggaacct ggagcactaa tccataagtg 22080
gagcctggga aggggacctt gtcctatccc aggacagagg agaaagcaag tgagtgtcag 22140
ggtgcagggg cacacctggt ccatcagccc agtgcaggga gtcctgccaa tttcaaaagg 22200
caagggtggg ggcttcagac caagtggtcc tgtgctctcc ccataatatt gctagggaac 22260
agaaagatca tggatgtgtg cacagaacac actgagatag cttcacagat agggcctcca 22320
cacaccctcc tcagttcacc caccacttcc atcattcttg tgcttatgat ggtcctgaac 22380
caaacgttga aggtgcagca gtggccaaga gctgtcctgg gcctcctgac aactgaggag 22440
ctggatgcag cggggtgagt tgacgcccac ccagacactc tgacccccac tgtccccact 22500
gtcccctgca gggacctccc tctatgcctc tcagatccca tctcactgta ctttcgatcc 22560
atgacccatt gcctcatggg cctctcagca ccctgtgtac accaaatgct cagggaaaat 22620
tacttgcagg ctcttctcag ccctgagtca gaggtgaaga ctcttccgcc atcctgtcat 22680
cagattcgtt ctcctaacaa gctcgcatcc tgggcagagc ttgttcgtgt gatgcccact 22740
ttagaggtag agctgggaga gaacaaggtg ttcccccagg gctccttcgc ctgggaatcc 22800
agctcctcca gctggagccc cgatgctctg aagctagagc ctcactttct cccatcaaac 22860
tctggctctg ccccttccca gctctgggat tttggtcaaa ttccttgcct tctctgtgct 22920
gaagttcccc tatctaaaca atggggattg ttatgaaggc taaatgaaat aaacatgcag 22980
caactagcac agtgcttagt gcatagtgtg taatcagcac gagccactgc tactgccttt 23040
tggatgaaaa cacgttatta gcctttctca agggctcaag gtctgcagaa gaagagttca 23100
cccatgctgg gtctgggctg gctcctcctt gcctgtgtgg ttttagggaa cccttcaatg 23160
gctcctcttt cctcctggat tccacggcct ggtcttctcc ctcaccagat aggccaccag 23220
gggttggggg tgggtgggat ttgctgctac ggactgtccc tcctggcacg tggttcagcg 23280
tgtgccactg tctggatgga ggtgccagaa cttgttccca ggccaggctc cactccctac 23340
tctgcagctt gatttctggg aaaggtgggg cagggcctga gcttccaggg aacctgccct 23400
ggttggggga aatagctggg ctcagggata ggtctcaggg ccaggctctc taataggctc 23460
ctgttgggta tggggcaggc tgggggtgca ggggagacca ggctggaccc catgttccca 23520
cagtgtagcc acgggcactc acttgcttct ctgggcttgg cttctcctct gaaagtccag 23580
tctgccctgt catccctacc aggaggaaga ctaagtgtga atttggggaa aatgctgctg 23640
atctgggtca gctcgtcttc tccccctgca cacataccct tcatgtgttt ctcgctctgc 23700
gccccccacg caggcactgg gccagctact ttacatatgt tctctccagc caaccatcca 23760
cagtccccag atcacaccgc atgttgcaga tgaggaaact gaggtacaga gagtttaggc 23820
aacatgccaa gggccattca gttagtaagt ggcaaagctg ggatttgaac ccaggtctat 23880
gtgacgccag agccaggatt cttcctaaca tgtggatctt gtagattgag gagcatccca 23940
aatctcccca gattgcagtg cttgggccag aatcagagcc tcccgtgggc tgacttgggg 24000
tgagggcaca gggcaggagt ccaggagctt gaccctctct gctgccctcc agctgcccac 24060
ctgggacctg acaggaggag atgtgctatg tctagcacat ggaggcggcc tctggaggga 24120
acagtagagg tggggttgag tggggctcta cccagggtgc aagagaatca ttggccagcc 24180
tcctccttct tgggagtaat tataccccat acctgtgtcc cagagtagtt ggggggatct 24240
gtgggtcatg gaagcacctg tcattacctt gtctgtgggt tacccctcga ctctgcaaag 24300
atagtgagta aacctcaggg tgggcagaat cctgggtcta gatgccagca gggcctatct 24360
ggctgttgtt gggggtggca gaggtgcttt agggaccctc tgcagtctac ctccagcctt 24420
acttttcagc caaatggagc tagctacttt tgtttctcca gcatgtccta tgctctccca 24480
cctctgcatg gctttttctt gcccttcttt ctgtctctgc ctatccaact gccctccgcc 24540
ttcctcaggg cctcgatgaa gtccctgttt ctccaagaag cctttgggac tccctcctga 24600
gcacctgggg cttcctgagc accagcgatg cctctggtga tgccttaaga gccgcacatt 24660
gaaggcccat tcactctggg cctcctgtgg ttcacagaaa ccaggactgg gtgcccagcc 24720
cagacctccc tgcctggcac tgttcccagg gcttcagccc cacccacctg ctcatcccag 24780
gttctcagct cccaccccag catctacagg aatttaaatt gctctcaaat gaagactcag 24840
gagaaaaatg tttccatact tgtgcagagc gccctgacct ggggcggggg ttgggggaag 24900
tagccccagc tccgccctgt ggccctgccc tcagtgctgg ccttggccac actggccaca 24960
cctgcagcac gccccaatcc caaagcagtt ttccccgtaa agccaggcct gagcaatgca 25020
aacctgaaga agcctggggc taggctgggg ctgctcttca ggaacgcagt gggcggggtg 25080
ggagaggtgg tgtgattccc aggctgagag gtgctgagat tgtgctgggt ttgctaaatg 25140
tgggacaggg agacctgttt aggatgagct gcctcacccc gtcctctccc cacccatccg 25200
taccctgcca attcccagaa gatgatgcca gctaggaatg caggttgatg aagataaagg 25260
cagaaggtca cttcacttct acctgggggc aatagacaaa gcagtgtttc cctctgaact 25320
tcacacagag actcctctgg ccccacatct cccacctgtt caggcccagg tgatgtggtg 25380
agcagtggtt tctgctggga gacacttggc ataatttgta agccagctac atgataatac 25440
taacaaatga tatttgcctc catatattag gcacctatcg tgtgccatat actatgttac 25500
gtaatttatg tccactctct aattacagta acatgcaaaa ttaggtccta tataataact 25560
ccattttata cacaaggaaa ctgaggctca gagaagttag gtgactcatc caaggtcata 25620
cagggcagga tcctgattac tgtattttta ttacaatgtt aaaattattt gaatggtaca 25680
cttcctacca aatcaagtca ggcatctgat agaaacaaag aaaagcatat tttcaagaag 25740
tcccttctgt attttagcca acaaatattt gaataatttc tgattatata atgcaaagta 25800
cgagtgcatc gatccttatc atagaaaaac ttgtgtgaaa taatgttcaa atttgtctat 25860
tgcaaaaatt tgatcactca cctgggaaat ctggaattag gaatgtaaga tcttaccact 25920
gcctcttgct catataaagt ggcttgtgaa ttcacctagc cctcatccca ctcagttgcg 25980
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cctgggttgt tcatccgtag atcccagtgg cctccatgca tgggaatgaa tacaggagaa 26100
aaatcattct caaattagat gatcttgttt aaggtttgat cttttaaata tcaaatatca 26160
gagagggaaa atatggcaaa ctaatcacat tagagttgca ttgtctttca cagttgtcaa 26220
agcactgtaa caagtccata ggatagtaac tttagaaaaa gaagaccttt gatcttggaa 26280
gggtcatacg tttacctcgc tcacatcata tcgatgcaag cattaaatct gcttgataac 26340
caatgtttct attagaaaat aggggtcact gacacattgg ttcagtcatt gtgtaaatcc 26400
aacacatatt tattaaacac atactctatt ctaggtactg gctagttatc agggttatac 26460
ctgaggacag accaagactg tttcctacct tcataaacaa gaggagaaaa gtattaaaca 26520
gacattagat cactggatag atagatagat gatagataga tagatagata gatagataga 26580
tagatagata gatagatagg agatagagat aggtgacaga tggatagatg gatagataga 26640
tagcagatag aaaagagata ggtagataga tgggaggaag gtagatagat agagataggt 26700
ggatacatac atgcatatat gcatagacac agacacatgt atgtacagat atagatatac 26760
atatgcagtg cctgggtctc aaattgtaaa aagagaaacc cagaggaaaa cagcagtgtg 26820
ctgtgaaaga gaacaggttg acataactta aacggagttt ggatgaggaa gcgtc 26875
Claims (10)
1.一种分离的突变β-MHC基因或者其片段，其在对应于Genbank登录号gi：M57965.1列出的序列(SEQ ID NO：1)中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：10353G＞A，10429A＞C，10895A＞T，11811A＞C，13653A＞C，14449T＞C，14452G＞A，14557G＞A。
2.一种分离的突变cMYBPC基因或者其片段，其在对应于Genbank登录号gi：Y10629列出的序列(SEQ ID NO：2)中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：4826G＞A，8697G＞A，8887G＞A，12101G＞A，13261G＞A，14262-14264de1AAG，14364de1G，18115-18116insGCAAG。
3.一种分离的突变cTnT基因或者其片段，其在对应于Genbank登录号gi：X90780列出的序列(SEQ ID NO：3)中的下述位置处，含有选自下组的一个或多个突变：4693C＞T，4769G＞A。
4.权利要求1-3中任一项的突变基因或片段，其中还包含额外的突变或核苷酸多态性。
5.由权利要求1-4任一项的突变基因或片段编码的蛋白质。
6.一种核酸，其可与权利要求1-4中任一项的突变基因或片段或者其互补序列特异性杂交，但不能与相应的野生型基因或其互补序列的核酸杂交。
7.一种试剂盒，其中包含权利要求6所述的核酸，以及使用说明书。
8.一种检测权利要求1-3中任一项所限定的突变的方法，包括应用权利要求6所述核酸作为探针或引物检测生物学样品，或者应用设计成在扩增后将得到包含该突变的片段的引物对扩增该生物学样品并进行检测的步骤。
9.一种微阵列，其中包含权利要求6所定义的核酸。
10.一种筛选或评估药物的方法，包括对携带权利要求1-4中任一项所述突变基因的细胞、组织、器官或动物个体给予一种或多种药物，并评估其一个或多个指示肥厚型心肌病状况的指标，以指示疾病改善状况。
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