CN1814746A

CN1814746A - 一种纳豆激酶及其编码基因与克隆和表达方法

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Publication number: CN1814746A
Application number: CN 200510005038
Authority: CN
Inventors: 钟瑾; 梁小波; 贾士芳; 孙玉芳; 陈美玲; 陈秀珠; 还连栋
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2006-08-09
Anticipated expiration: 2025-01-31
Also published as: CN100436576C

Abstract

本发明公开了一种纳豆激酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种纳豆激酶及其编码基因与其在生产纳豆激酶中的应用。该纳豆激酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有纤溶活性的蛋白质。其表达方法，是构建含有纳豆激酶基因的大肠杆菌分泌表达载体，将构建的大肠杆菌分泌表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠杆菌，诱导重组大肠杆菌使纳豆激酶基因得到表达。本发明的表达产物具有较高的纤溶活性，易纯化，稳定性好的优点，为将纳豆激酶开发生产为新型口服溶栓药物奠定了基础，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种纳豆激酶及其编码基因与克隆和表达方法

技术领域

本发明涉及蛋白及其编码基因与克隆和表达方法，特别是涉及一种纳豆激酶及其编码基因与克隆和表达方法。

背景技术

纳豆激酶是一种来源于传统发酵食品—纳豆的丝氨酸蛋白酶，近年来的研究表明其具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物。它不仅具有良好的溶栓效果，而且可经口服达到纤溶目的，同时可促进内源t-PA增加。并具有药效时间长，无抗原性，能使生物体自身纤溶酶***活化的优点，可温和、持续地提高血液的纤溶活性，对心脑血管栓塞类疾病达到方便、安全、有效的预防和治疗，其特性优于当前临床应用的溶栓药物如链激酶、尿激酶等。目前纳豆激酶主要来源于野生枯草芽孢杆菌的发酵，产量较低，培养周期长，培养基成分复杂，纯化步骤多，收率低，生产成本高。而已有的大肠杆菌表达的纳豆激酶均为非活性包涵体，变性复性耗时耗力，且活性产物收率极低。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶及其编码基因。

本发明所提供的纳豆激酶，是从枯草芽孢杆菌YF38 CGMCC No.1308中获得的。

枯草芽孢杆菌YF38 CGMCC No.1308已于2005年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1308。其菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，细胞椭圆形，可以形成芽孢，芽孢中生，革兰氏阳性。

所述纳豆激酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有纤溶活性的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由381个氨基酸残基组成，自氨基端第1位至29位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第30位至107位氨基酸残基为前导肽，自氨基端第108位至381位氨基酸残基成熟肽。

上述纳豆激酶的编码基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

序列表中的SEQ ID №：2由1327个碱基组成，其编码序列为自5’端第182至第1324位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1至第181位碱基为启动子的编码序列，自5’端第182至第268位碱基为信号肽的编码序列，自5’端第269至第499位碱基为前导肽的编码序列，自5’端第500至第1324位碱基为成熟肽的编码序列。

上述纳豆激酶的编码基因是以序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：4为引物从枯草芽孢杆菌YF38 CGMCC No.1308中克隆的。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌及扩增本发明基因中任一片段的引物均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种上述纳豆激酶的表达方法。

本发明所提供的纳豆激酶的表达方法，是构建含有纳豆激酶基因的大肠杆菌分泌表达载体，将构建的大肠杆菌分泌表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠杆菌，诱导重组大肠杆菌使纳豆激酶基因得到表达。

用于构建含有纳豆激酶基因的大肠杆菌分泌表达载体的出发载体可为pET26b、pET23b、pQTG、pGEX-6T2、pSE111等。

以pET26b为出发载体，构建的含有所述纳豆激酶前导肽和成熟肽编码基因的大肠杆菌分泌表达载体为pET26b-nkp；以pET23b为出发载体，构建的含有所述纳豆激酶信号肽、前导肽和成熟肽编码基因的大肠杆菌分泌表达载体为pET23b-nkm。

所述大肠杆菌宿主菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、E.coli DH5α、E.coli BLR、E.coli BLR(DE3)等。

诱导重组大肠杆菌表达时需加入IPTG，所加入IPTG的浓度为0.4-1.0mM，优选为0.7mM，诱导温度为15-25℃，优选为20℃，诱导时间为18-24小时，优选为20小时。

为了获得纯度更高的纳豆激酶，诱导大肠杆菌表达后可用简单的纯化方法，如离子交换层析即可对表达产物进行纯化。

本发明利用基因工程的方法，在大肠杆菌中分泌表达了一种来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶，表达产物具有较高的纤溶活性，易纯化，稳定性好，解决了枯草芽孢杆菌发酵周期长、产物纯化复杂以及以往大肠杆菌表达只得到非活性包涵体，活性产物收率极低的问题，为将纳豆激酶开发生产为新型口服溶栓药物奠定了基础，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1A为38号菌的菌落形态

图1B为38号菌的菌体形态

图2为阳性克隆载体pUC18-nkl的构建示意图

图3为大肠杆菌分泌表达载体pET26b-nkp的构建示意图

图4为分泌表达的纳豆激酶的SDS-PAGE图谱

图5为分泌表达的纳豆激酶的Western-blot分析结果

图6为分泌表达的纳豆激酶的活性图

图7A为标准品尿激酶的纤溶活性标准曲线

图7B为蛋白酶抑制剂对分泌表达的纳豆激酶活性的影响

图7C为温度对分泌表达的纳豆激酶活性的影响

图7D为pH值对分泌表达的纳豆激酶活性的影响

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、枯草芽孢杆菌YF38 CGMCC No.1308的分离和鉴定方法

一、纳豆激酶产生菌的分离与鉴定

1、纳豆激酶产生菌的分离

选取云南省易门食品厂、广东合山兴球食品厂、四川永川荣美食品厂和四川富顺顺定食品厂顺义分厂生产的五种豆豉，并按如下方法分离出不同产品中的纳豆激酶产生菌：取适量豆豉进行研磨，经无菌水稀释、离心后，将上清液涂布于LB平板，37℃培养8-12小时后，挑取单菌落，用平板划线法将其保存，同时接种于含有LB液体培养基的试管中37℃振荡培养8-12小时。最后取从五种产品中分离出的单菌落的培养上清液进行纤溶活性检测，获得纤溶活性最高的菌株，其中38号菌株的活性最高。

2、菌种的鉴定

1)形态观察

在37℃培养24小时的LB平板上(图1A)，38号菌株的菌落呈规则的圆形，边缘微有叶状齿，不透明。挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果(图1B)表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，染色均匀，可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。

2)理生化性质鉴定

参照伯杰氏细菌学鉴定手册对38号菌的生理生化性质进行鉴定，结果如表1所示，表明38号菌是一株芽孢杆菌(Bacillus)，将其命名为YF38

表1 38号菌株的生理生化特征

特性	结果	特性	结果
特性	结果	特性	结果	葡萄糖产酸***糖产酸木糖产酸甘露醇产酸厌氧生长运动性V.P反应	++++-++	pH5.7的培养基上生长7％NaCl上生长淀粉水解柠檬酸盐的利用还原NO₃ ^-→NO₂ ^-酪素分解酪氨酸分解过氧化氢酶反应	++++++-+

实施例2、纳豆激酶全基因的克隆

一、PCR扩增纳豆激酶全基因

根据已知的纳豆激酶基因序列设计引物，引物序列如下(引物序列两端包含限制性内切酶Eco RI和Sal I识别位点)：

引物1：5′-gcg gaa ttc gta tga aaa tag tta-3′

引物2：5′-gta gtc gac tcc ggt gct tgt gaa-3′

以YF38 CGMCC No.1308菌株的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增纳豆激酶基因，PCR反应条件为：94℃1min，54℃1min，72℃1.3min，共30个循环。反应结束后取2μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外检测在1900bp处有一条明显的条带，其分子量大小与纳豆激酶全基因的大小一致。

二、含有豆激酶全基因的克隆载体pUC18-nkl的构建与鉴定

将步骤1的PCR产物用100％乙醇沉淀，将沉淀经70％乙醇洗涤后室温晾干使乙醇挥发干净，将其溶于重蒸水中，加入限制性内切酶Eco RI和SalI，在37℃酶切3小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳回收经酶切的PCR产物，并用DNA纯化试剂盒(北京博达泰克生物基因技术有限公司)对其进行纯化，再将纯化产物与经相同酶酶切并经过纯化的大肠杆菌质粒载体pUC18用T₄DNA连接酶在16℃反应20小时进行连接。将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选重组子，挑取具有氨苄青霉素抗性的转化子，用碱裂解法提取质粒，质粒经过酶切和PCR鉴定，证明获得了含有PCR产物的阳性克隆载体，将其命名为pUC18-nkl，其构建过程如图3所示。对克隆载体pUC18-nkl进行测序，测序结果表明该克隆载体含有包括纳豆激酶启动子、信号肽、前导肽及成熟肽的正确基因序列及阅读框架，证明扩增得到了具有序列表中SEQ ID №：2核苷酸序列的纳豆激酶全基因，序列表中的SEQ ID №：2由1327个碱基组成，其编码序列为自5’端第182至第1324位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1至第181位碱基为启动子的编码序列，自5’端第182至第268位碱基为信号肽的编码序列，自5’端第269至第499位碱基为前导肽的编码序列，自5’端第500至第1324位碱基为成熟肽的编码序列。

实施例3、本发明的纳豆激酶在大肠杆菌中的表达

一、大肠杆菌分泌表达载体pET26b-nkp的构建

根据纳豆激酶的前导肽和成熟肽的编码序列设计引物，引物序列如下引物序列两端包含限制性内切酶EcoRI和SalI识别位点)：

引物3：5′-gac gaa ttc gat ggc cgg aaa aag cag t-3′

引物4：5′-gta gtc gac tcc ggt gct tgt gaa-3′

以含有纳豆激酶全基因的载体pUC18-nkl为模板，在引物3和引物4的引导下进行PCR扩增，扩增条件均为：94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环。反应结束后将PCR产物进行沉淀和酶切，再将酶切产物纯化后与用相同酶酶切并经纯化的载体pET26b(Novagen)用T₄DNA连接酶在16℃反应20小时进行连接。将连接产物用氯化钙法分别转化大肠杆菌BL21(DE3)与BL21(DE3)plys，用卡那霉素筛选得到转化子，转化子经过酶切、PCR以及DNA测序验证，得到含有纳豆激酶前导肽和成熟肽编码基因的大肠杆菌分泌表达载体pET26b-nkp，其构建过程如图3所示。

二、大肠杆菌分泌表达载体pET23b-nkm的构建

根据纳豆激酶的信号肽、前导肽和成熟肽的编码序列设计引物，引物序列如下引物序列两端包含限制性内切酶EcoRI和Sal I识别位点)：

引物7：5′-gac gaa ttc gat ggc cgg aaa aag cag t-3′

引物6：5′-gta gtc gac tcc ggt gct tgt gaa-3′

以含有纳豆激酶全基因的载体pUC18-nkl为模板，在引物6和7的引导下进行PCR扩增，扩增条件与步骤1同。反应结束后将PCR产物进行沉淀和酶切，再将酶切产物纯化后与用相同酶酶切并经纯化的载体pET23b(Novagen公司)用T₄DNA连接酶在16℃反应20小时进行连接。将连接产物用氯化钙法分别转化大肠杆菌BL21(DE3)与BL21(DE3)plys，用氨苄青霉素筛选得到转化子，转化子经过酶切、PCR以及DNA测序验证，得到含有纳豆激酶信号肽、前导肽和成熟肽编码基因的大肠杆菌分泌表达载体pET23b-nkm。

三、纳豆激酶在大肠杆菌中的分泌表达及其表达产物的鉴定

1、纳豆激酶在大肠杆菌中的分泌表达

1)纳豆激酶在大肠杆菌中分泌表达条件的优化

将经过验证的分别整合有大肠杆菌分泌表达载体pET26b-nkp和pET23b-nkm的转化子接种于含有LB液体培养基的试管中37℃振荡培养12-24小时，再按1％接种量接种于装有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，分别对在20℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度为0.1mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM和诱导4h、8h、12h、16h、20h下诱导表达的上清液进行活性测定，结果表明工程菌在20℃、0.7mM IPTG浓度下诱导20h，活性可达最高。

2)纳豆激酶在大肠杆菌中的分泌表达

按上述优选的分泌表达条件，将转化子(以只含有空载体的工程菌为阴性对照)37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6时加入0.7mM IPTG在20℃进行诱导表达，20h后取样，离心后对上清液和经超声破碎的沉淀分别按下述方法进行活性测定。

2、表达产物的鉴定

1)SDS-PAGE检测

采用Tris-甘氨酸电泳***进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％)。取诱导表达的样品上清液10μL，加入样品缓冲液10μL(含100mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，200mmol/LDTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，水浴煮沸5min，20μL全部上样。将分子量标准及诱导前样品用同样方法进行处理。然后用25mA稳流电泳，约2h后停止电泳，将胶在考马氏亮蓝染色液(含45％甲醇，45％水，10％乙酸，0.25％考马氏亮蓝)中染色1h，再用脱色液(含30％甲醇，10％乙酸，60％水)脱色2h。结果如图4所示，泳道1为蛋白分子量标准(97.4kD、66.2kD、43.0kD、31.0kD、20.1kD、14.4kD)，泳道2为诱导表达上清，泳道3为诱导表达的沉淀，表明在20℃下经IPTG诱导表达后，在上清液中产生分子量大小约为28000Da的蛋白，与纳豆激酶大小相符。

2)Western-blot鉴定

用与步骤2)相同的方法进行SDS-PAGE，电泳结束后不对胶染色，进行Western-blot分析，具体方法为：将胶用蒸馏水冲洗并在电转移液(10mM碳酸氢钠，4mM碳酸钠，pH9.5，10％甲醇)中浸润，用电转移的方法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，转移在冰浴中进行，电流200mA，电转移时间约2.5h；转有蛋白的硝酸纤维素膜在溶液III(3-5％BSA，用溶液I(20mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl，1mM EDTA，0.1％Tween-20，0.04％NaN₃)配制)中4℃封闭8-12h，然后与一抗(用从B.SubtilisYF38中纯化的纳豆激酶为抗体制备)溶液37℃保温1h，用溶液I洗膜三次，每次10min；与二抗(羊抗兔，华美生物工程公司)溶液37℃保温1h；用溶液I洗膜三次，每次10min；水冲洗一次，溶液II冲洗一次；最后加入10mL溶液II和底物(50mg/mLNBT 66ul，50mg/mL BCIP 33uL)，37℃避光显色5-10min；结果如图5所示，泳道1为诱导表达上清，泳道2为只含有空载体的菌株诱导后的上清液，泳道3为蛋白分子量标准(97.4kD、66.2kD、43.0kD、31.0kD、20.1kD、14.4kD)，泳道4与泳道2同，泳道5与泳道1同，在28000Da大小处出现一特异的杂交条带(箭头所指)，表明重组菌经IPTG诱导表达后，上清液中产生的纤溶活性物质能够与纳豆激酶的抗体特异性相互作用，进一步证明获得了正确表达的纳豆激酶。

实施例4、本发明纳豆激酶的性质及活性鉴定

一、表达产物纳豆激酶的性质鉴定

对实施例3中经离子交换层析纯化的表达产物纳豆激酶分别进行蛋白酶抑制剂抑制试验，温度稳定性和pH稳定性分析，具体方法为：

取等量经纯化的表达产物纳豆激酶分别与蛋白酶抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、leupeptin、EGTA和EDTA在37℃保温作用30min后，测定其纤溶活性，尿激酶标准曲线如图7A所示，结果如图7B所示，表明PMSF几乎可完全抑制纳豆激酶的纤溶活性，而leupeptin、EGTA、EDTA对纳豆激酶的活性影响较小，表明所表达的纳豆激酶为典型的丝氨酸蛋白酶。

调节经纯化的纳豆激酶溶液的pH值使之分别为2、4、6、8、10、12，均置于4℃处理48小时，测定其纤溶活性，结果如图7C所示，在pH低于6或者高于12时其纤溶活性几乎完全丧失，而在pH 6-8之间则保持了较高的纤溶活性，表明所表达的纳豆激酶对pH比较稳定，且活性最适pH值为8。

将等量含经纯化的纳豆激酶的溶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃和70℃处理30min后测定其纤溶活性，结果如图7D所示，在60℃处理后酶的活性几乎没有丧失，表明该酶对温度稳定，且活性的最适温度为50℃。

二、纤溶活性的测定

首先制作纤维蛋白检测平板，具体方法为：取10mL巴比妥钠缓冲液(含0.05M巴比妥钠，0.09M NaCl，0.0017M CaCl₂，0.0007M MgCl₂)熔化琼脂糖(0.6％)，再取10mL相同缓冲液溶解人血纤维蛋白原(中国药品鉴定检验所)(20mg/mL)，分别于45℃保温45min和10min后，向琼脂糖溶液中加入10μL凝血酶(中国药品检验鉴定所)溶液(0.1BP/μL)混匀，然后迅速与人血纤维蛋白原溶液混合，倒入水平无菌培养皿，室温放置1h后，用打孔器打孔，即可使用。取10μL样品(重组子的发酵上清液、经超声破碎的沉淀和只含有空载体的工程菌上清液)注入小孔，37℃温育16-18h后，如图6所示(图中1-9分别表示：B.subtilisYF38，E.coliBL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)plys，E.coli BL21(DE3)/pET26b-nkp，E.coliBL21(DE3)plys/pET26b-nkp，E.coli BL21(DE3)/pET23b-nkm，E.coliBL21(DE3)plys/pET23b-nkm，E.coli BL21(DE3)/pET26b，E.coli BL21(DE3)/pET23b)，用游标卡尺测定透明圈的直径，用尿激酶为标准品制作纤溶活性标准曲线(图7A)，通过比较计算得到发酵液的纤溶活性单位。结果发酵上清液的纤溶活性可达165尿激酶单位/mL，而沉淀及只含有空载体的工程菌的上清液均没有纤溶活性，表明表达产物纳豆激酶均以活性形式存在于发酵上清液中。

序列表

<160>2

<210>1

<211>381

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

<400>1

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser

35 40 45

Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly

50 55 60

Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr

85 90 95

Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr

100 105 110

Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr

115 120 125

Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser

130 135 140

His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

145 150 155 160

Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly

165 170 175

Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro

180 185 190

Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn

210 215 220

Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala

225 230 235 240

Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly

260 265 270

Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser

275 280 285

Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val

290 295 300

Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr

305 310 315 320

Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val

340 345 350

Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr

355 360 365

Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln

370 375 380

<210>2

<211>1327

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(B.subtilis)

<400>2

gtatgaaaat agttatttcg agctctctac ggaaatagcg agagatgata tacctaaata 60

gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccatct attacaataa 120

atgcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt tttaaaagga gagggtaaag 180

agtgagaagc aaaaaattgt ggatcagctt gttgtttgcg ttaacgttaa tctttacgat 240

ggcgttcagc aacatgtctg cgcaggctgc cggaaaaagc agtacagaaa agaaatacat 300

tgtcggattt aagcagacaa tgagtgccat gagttccgcc aagaaaaagg atgttatttc 360

tgaaaaaggc ggaaaggttc aaaagcaatt taagtatgtt aacgcggccg cagcaacatt 420

ggatgaaaaa gctgtaaaag aattgaaaaa agatccgagc gttgcatatg tggaagaaga 480

tcatattgca catgaatatg cgcaatctgt tccttatggc atttctcaaa ttaaagcgcc 540

ggctcttcac tctcaaggct acacaggctc taacgtaaaa gtagctgtta tcgacagcgg 600

aattgactct tctcatcctg acttaaacgt cagaggcgga gcaagcttcg ttccttctga 660

aacaaaccca taccaggacg gcagttctca cggtacgcat gtcgccggta cgattgccgc 720

tcttaataac tcaatcggtg ttctgggcgt agcgccaagc gcatcattat atgcagtaaa 780

agtgcttgat tcaacaggaa gcggccaata tagctggatt attaacggca ttgagtgggc 840

catttccaac aatatggatg ttatcaacat gagccttggc ggacctactg gttctacagc 900

gctgaaaaca gtagttgata aagcggtttc cagcggtatc gtcgttgctg ccgcagccgg 960

aaacgaaggt tcatccggaa gcacaagcac agtcggctac cctgcaaaat atccttctac 1020

tattgcagta ggtgcggtaa acagcagcaa ccaaagagct tcattctcca gcgtaggttc 1080

tgagcttgat gtaatggctc ctggcgtgtc catccaaagc acacttcctg gaggcactta 1140

cggcgcttat aacggaacgt ccatggcgac tcctcacgtt gccggagcag cagcgctaat 1200

tctttctaag cacccgactt ggacaaacgc gcaagtccgt gatcgtttag aaagcactgc 1260

aacatacctt ggaagctctt tctactatgg aaaagggtta atcaacgtac aagcagctgc 1320

acaataa 1327

Claims

1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)YF38 CGMCC No.1308。

2、一种纳豆激酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有纤溶活性性的蛋白质。

3、编码权利要求1所述纳豆激酶的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

5、含有权利要求3或4所述基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌及扩增权利要求2或3所述基因中任一片段的引物。

6、一种权利要求1所述纳豆激酶的表达方法，是构建含有纳豆激酶基因的大肠杆菌分泌表达载体，将构建的大肠杆菌分泌表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠杆菌，诱导重组大肠杆菌使纳豆激酶基因得到表达。

7、根据权利要求6所述的纳豆激酶的表达方法，其特征在于：用于构建所述含有纳豆激酶基因的大肠杆菌分泌表达载体的出发载体为pET26b、pET23b pQTG、pGEX-6T2、pSE111。

8、根据权利要求7所述的纳豆激酶的表达方法，其特征在于：所述大肠杆菌分泌表达载体为pET26b-nkp或pET23b-nkm。

9、根据权利要求6-8任一所述的纳豆激酶的表达方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、E.coli DH5α、E.coli BLR和E.coli BLR(DE3)。

10、根据权利要求6-8任一所述的纳豆激酶的表达方法，其特征在于：所述诱导重组大肠杆菌表达时需加入IPTG，所加入IPTG的浓度为0.4-1.0mM，诱导温度为15-25℃，诱导时间为18-24小时。