CN1829801A

CN1829801A - 制备l－苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN1829801A
Application number: CN 200480021728
Authority: CN
Inventors: D·克鲁兹; T·赫曼; G·瑟尔巴驰; M·列平
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2006-09-06

Abstract

本发明涉及改进的使用能生产L－苏氨酸的肠杆菌科细菌发酵制备L－苏氨酸的方法。

Description

制备L-苏氨酸的方法

技术领域

本发明涉及改进的使用肠杆菌科细菌发酵制备L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸可以用于动物营养、人药品和制药工业中。

已知可以通过发酵肠杆菌科的菌株、特别是大肠杆菌来制备L-苏氨酸。由于该氨基酸非常重要，不断地进行了改进制备工艺的工作。该工艺的改进可以涉及发酵方法，例如搅拌和供氧，或者营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度，或者通过例如离子交换色谱加工达到产物形式，或者微生物本身固有的输出性质，即源于遗传的那些。

已知可以在分批方法或补料分批方法中，通过发酵肠杆菌科细菌、特别是大肠杆菌制备出苏氨酸。在分批方法中，在发酵开始时，最初地直接加入所有营养物。在补料分批方法中，将附加的营养培养基加入培养物中。可以在培养开始直接地或在已经经过了特定的培养时间后开始补料，例如当已经耗尽了与最初加入的第一种营养培养基一起加入的组分时。在发酵结束时，收获所有的发酵产物，分离包含在发酵液中的苏氨酸，并纯化或进行加工。该方法记载在，例如，专利说明书US 5,538,873、EP-B-0593792和WO 01/4525和Okamoto等(Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry 61(11)，1877-1882，1997)中。

另一种使用肠杆菌科细菌、特别是大肠杆菌制备苏氨酸的方法，记载在专利说明书US 6,562,601中。它包括，通过补料分批方法，最初培养细菌，使苏氨酸在发酵液中变浓。在特定的时间点，收获发酵罐中的一部分发酵液，即10-99％。剩余的发酵液部分保留在发酵罐中。用营养培养基补足保留在发酵罐中的发酵液，通过补料分批方法进行另一次发酵。任选地，数次进行所述的循环。

发明目的

本发明的目的是，提供改进的L-苏氨酸的发酵制备的新方法。

发明内容

本发明提供了一种发酵方法，它是，其中：

a)将能生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌接种到至少第一种营养培养基中，并培养，

b)然后，在允许L-苏氨酸形成的条件下，将至少另一种或另外几种营养培养基以一条或几条补料流连续补加到培养物中，所述的另一种或另外几种营养培养基包含至少一种碳源、至少一种氮源和至少一种磷源，并同时以至少一条或几条取料流从培养物中取出培养液，所述的取料流基本上对应着补料流或补料流总量，其中

c)将连续培养过程中的碳源浓度调节到不超过30g/l。

发明详述

根据本发明，通过上述的第一步a)中的分批方法或补料分批方法培养，可以提高生产L-苏氨酸的发酵罐的工厂产量，如果使用补料分批方法，需要采用至少一种附加的营养培养基。在所述的后续步骤b)中，将至少一种附加的营养培养基或几种附加的营养培养基以一条或几条补料流连续补加到培养物中，并同时以至少一条或几条取料流从培养物中取出培养液，所述的取料流基本上对应着补料流或补料流总量。

术语“工厂产量”应当理解为，在工厂，例如发酵罐中，以特定的产量和特定的速度或生产力或空间/时间产量制备出的产品、例如L-苏氨酸的重量或数量。这些参数很大程度上决定了工艺的成本或获利能力。

“培养液”应当理解为，使用发酵罐或培养罐，在营养培养基中培养微生物(在本发明的情况下，是能生产L-苏氨酸-的细菌)形成的微生物悬浮液。

在步骤a)的过程中，将细菌接种到至少第一种营养培养基中，并通过分批方法或补料分批方法进行培养。如果使用补料分批方法，在大于0至不超过10小时后，优选地1-10小时后，更优选地2-10小时后，特别优选地3-7小时后，补加另一种营养培养基。

第一种营养培养基包含作为碳源的一种获多种选自下述的化合物：蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、乳糖、半乳糖、麦芽糖、木糖、纤维素水解物、***糖、醋酸、乙醇和甲醇，其浓度为1-100g/kg或1-50g/kg，优选10-45g/kg，特别优选20-40g/kg。根据本发明，将“淀粉水解物”理解为来自玉米、谷类、马铃薯或木薯的淀粉的水解产物。

可以将有机的含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物，例如氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、硝酸钾和硝酸钾钠，用作第一种营养培养基中的氮源。可以单独地或作为混合物使用氮源，其浓度为1-40g/kg，优选10-30g/kg，特别优选10-25g/kg，非常特别优选1-30g/kg或1-25g/kg。

可以将磷酸，磷酸的碱金属或碱土金属盐、特别是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐，磷酸聚合物或肌醇的六磷酸酯(也称作植酸)，或其碱金属或碱土金属盐，用作第一种营养培养基中的磷源，其浓度为0.1-5g/kg，优选0.3-3g/kg，特别优选0.5-1.5g/kg。第一种营养培养基必须另外含有金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长必需的。这些物质的浓度为0.003-3g/kg。最后，除了上述的物质外，还采用基础生长物质，例如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺素)。可以使用消泡剂来控制泡沫的发展，例如脂肪酸聚乙二醇酯。

在补料分批方法中使用的附加营养培养基通常仅仅包含作为碳源的一种或多种选自下述的化合物：蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、乳糖、半乳糖、麦芽糖、木糖、纤维素水解物、***糖、醋酸、乙醇和甲醇，其浓度为300-700g/kg，优选400-650g/kg，和任选的无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵，硝酸铵、硝酸钾或硝酸钾钠。或者，也可以分别补加这些和其它组分。

已经发现，在根据步骤b)的连续培养中，可以以单一的另一种营养培养基的形式和以许多另外的营养培养基的形式，将另外的营养培养基成分补加到培养物中。根据本发明，在至少2-10、优选2-7或2-5条补料流中的至少一条(1)补料流或在许多补料流中，将所述的另一种或另外几种营养培养基补加到培养物中。

术语“连续的”是指，基本上不间断地将一条或几条补料流加入培养物中，也就是说存在最短的、个别的暂停。个别的中断或暂停至多达最大值0.1、1、2或3小时。在根据步骤b)的连续培养中的个别的中断或暂停的总和最大是根据步骤b)的连续培养的总时间的10％、8％、6％、4％、2％或1％。

所述的另一种或另外几种营养培养基包含作为碳源的一种或多种选自下述的化合物：蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、麦芽糖、木糖、纤维素水解物、***糖、醋酸、乙醇和甲醇，其浓度为20-700g/kg，优选50-650g/kg。

所述的另一种或另外几种营养培养基还包含由下述成分组成的氮源：有机含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物，例如氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵和/或硝酸钾或硝酸钾钠。可以单独地或作为混合物使用氮源，其浓度为5-50g/kg，优选10-40g/kg。

所述的另一种或另外几种营养培养基还包含由下述成分组成的磷源：磷酸或磷酸的碱金属或碱土金属盐，特别是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐，磷酸聚合物或肌醇的六磷酸酯(也称作植酸)，或对应的碱金属或碱土金属盐。可以单独地或作为混合物使用磷源，其浓度为0.3-3g/kg，优选0.5-2g/kg。所述的另一种或另外几种营养培养基必须还包含金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长必需的，其浓度为0.003-3g/kg，优选其浓度为0.008-2g/kg。最后，除了上述的物质外，还采用基础生长物质，例如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺素)。可以使用消泡剂来控制泡沫的发展，例如脂肪酸聚乙二醇酯。

如果使用单一的另一种营养培养基，典型地将其在一条补料流中补加到培养物中。如果使用许多另外的营养培养基，在对应的许多补料流中补加它们。如果使用许多另外的营养培养基，应当注意，它们在每种情况下都可以仅仅包含一种所述的碳源、氮源或磷源，或者是所述的碳源、氮源或磷源的混合物。

根据本发明，调节补加的一种或几种另外的营养培养基，使磷/碳比(P/C比)不超过4；不超过3；不超过2；不超过1.5；不超过1；不超过0.7；不超过0.5；不超过0.48；不超过0.46；不超过0.44；不超过0.42；不超过0.40；不超过0.38；不超过0.36；不超过0.34；不超过0.32；或不超过0.30mmol磷/mol碳。

在根据本发明的方法中，以与小于30小时、优选小于25、非常特别优选小于20小时的平均停留时间相对应的速度，补加补料流或补料流总量。这里的平均停留时间是颗粒停留在连续操作的培养中的理论时间。通过反应器中的液体体积与流过量的比，描述平均停留时间(Biotechnologie[Biotechnology]，H.Weide，J.Páca和W.A.Knorre，Gustav Fischer Verlag Jena，1991)。

在根据步骤(a)的培养开始时，强势生长通常是对数生长期。对数生长期后通常是不如对数生长期强势的细胞生长阶段。

如果根据本发明的方法在步骤a)中以分批方法开始，在开始分批方法＞(大于)0-20小时、1-20小时后，1-10小时、2-10小时或3-7小时后，将另一种或另外几种营养培养基在一条或几条补料流中补加到培养物中。在开始补加所述的另一种或另外几种营养培养基时，或以时间交替的方式，即在开始补加所述的另一种或另外几种营养培养基之前或之后，开始用一条或几条取料流取出培养液。如果以时间交替的方式开始补料和开始取出，对应的时差通常最大是5小时、3小时、2小时或1小时。

如果根据本发明的方法在步骤a)中以补料分批方法，在开始补料分批方法＞(大于)0-80小时、1-80小时，1-60小时、5-50小时、6-45小时或8-40小时后，将另一种或另外几种营养培养基在一条或几条补料流中补加到培养物中。在开始补加所述的另一种或另外几种营养培养基时，或以时间交替的方式，即在开始补加所述的其它营养培养基之前或之后，开始用一条或几条取料流取出培养液。如果以时间交替的方式开始补料和开始取出，对应的时差通常是最大5小时、最大3小时、最大2小时或最大1小时。

在开始根据步骤(a)的本发明的方法＞(大于)0-100小时、1-85小时、2-80小时、3-75小时、5-72小时、10-72小时、10-60小时或15-48小时后，取料流或取料流总量基本上与补料流或补料流总量相对应，且达到根据本发明的方法的步骤b)的连续培养状态。这里的“基本上”是指，一条或几条取料流的速度对应着补料流或补料流总量的80％-120％、90％-110％或95％-105％。通过抽出和/或通过排出培养液，可以在工业上实现取出。

根据本发明，通常将至少在根据步骤(b)的连续培养过程中的碳源浓度调节至不超过30g/l、不超过20g/l、不超过10g/l，优选不超过5g/l，特别优选不超过2g/l。在根据步骤(b)的培养时间的至少75％、优选至少85％、特别优选至少95％，维持该浓度。通过现有方法，在这里确定碳源浓度。例如在购自Yellow SpringsInstruments(Yellow Springs，Ohio，USA)的YSI 02700选择葡萄糖分析仪中，检测β-D-葡萄糖。

如果适当，可以为取出的培养液提供氧气或含氧的气体，直到碳源的浓度降至小于2g/l、小于1g/l或小于0.5g/l。

在根据本发明的方法中，产率是至少31％、至少33％、至少35％、至少37％、至少38％、至少40％、至少42％、至少44％、至少46％或至少48％。在这里将“产率”定义为在培养中生产的L-苏氨酸总量与采用的或消耗的碳源总量的比。

在根据本发明的方法中，生产L-苏氨酸的空间/时间产量是至少1.5-2.5g/l/h、至少2.5-3.5g/l/h、至少2.5-大于3.5g/l/h、至少3.5-5.0g/l/h、至少3.5-大于5.0g/l/h或至少每小时5.0-8.0g/l或更多。在这里将“空间/时间产量”定义为，经过培养的总时间，在培养中生产的苏氨酸总量与培养体积的比。空间/时间产量也称作体积生产力。

在类似于根据本发明的发酵方法中，当然以特定的产率和特定的空间/时间产量(体积生产力)制备产物。在根据本发明的方法中，可以以至少31重量％的产率和至少1.5-2.5g/l/h的空间/时间产量制备L-苏氨酸。从上面的陈述，可以自动得到产率和空间/时间产量的其它关联，例如，至少37％的产率和至少2.5g/l/h的空间/时间产量。

在培养过程中，将温度调节至29-42℃，优选33-40℃。可以在正常压力下，或任选地在增压下，优选地在0-1.5巴的增压下，进行培养。将氧分压调节至5-50％，优选约20％大气饱和度。在该过程中，搅拌培养物，并供氧。可以用25％氨水将pH调节至pH约6-8，优选6.5-7.5。

运行根据本发明的方法至少约72小时，优选100至≥300，特别优选200至≥300小时。在根据本发明的方法中，培养体积交换了至少一半、至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少6次、至少8次、至少10次、至少12次。

从取出的培养液中，可以分离、收集或浓缩L-苏氨酸，并任选地进行纯化。

通过完全地(100％)或几乎完全地(即超过或大于(＞)90％、＞95％、＞97％、＞99％)取出培养液中含有的细菌生物量，并在产品中较多地留下发酵液中的其它组分，即达到30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％或90％-100％，优选大于或等于(≥)50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或≥95％或者也完全地(100％)的程度，也可以将取出的培养液(＝发酵液)制成产品。

为了取出或分离出生物量，采用了分离方法，例如离心、过滤、倾析、絮凝或其组合。

然后，通过已知的方法，例如通过旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、反渗透、纳米过滤或其组合，稠化或浓缩得到的肉汤。

然后，通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾粒化的方法或通过其它方法，处理该浓缩的肉汤，生成较佳地自由流动的、细碎的粉末。然后，通过合适的压缩或成粒方法，又可以将该自由流动的、细碎的粉末转化成粗糙的、容易自由流动的、可储存的且很大程度上无尘的产品。通过该方式，去除的水总量达到大于90％，所以产品中的水含量小于10％、小于5％。

不一定以这里所述的次序进行所述的工艺步骤，但是可以任选地以工业上适当的方式进行组合。

通过阴离子交换色谱和随后的茚三酮推导法，可以分析L-苏氨酸和其它氨基酸，如Spackman等(Analytical Chemistry，30：1190-1206(1958))或it can be carried out by reversed phase HPLC，as described by Lindroth等(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))所述。

选自埃希氏菌属、欧文氏菌属、普罗威登菌属和沙雷菌属的能生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌适用于实现本发明的方法。埃希氏菌属和沙雷菌属是优选的。要提及的是，特别是埃希氏菌属大肠杆菌和特别是沙雷菌属的粘质沙雷菌。

所述细菌含有至少一个拷贝的thrA基因或等位基因，其编码苏氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I一高丝氨酸脱氢酶I。在这方面，在文献中提到了“反馈”抗性的或也脱敏的变体。这样的细菌典型地对苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性(Shiio和Nakamori，Agricultural and Biological Chemistry 33(8)，1152-1160(1969))。对“反馈”抗性的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I变体的生化研究，记载在例如，Cohen等(Biochemical和Biophysical ResearchCommunications 19(4)，546-550(1965))和Omori等(Journal ofBacteriology 175(3)，785-794(1993))中。如果适当，苏氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I是过表达的。

现有技术已经充分描述了过表达的方法，例如Makrides等(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))。通过使用载体，使拷贝数增加了至少一个(1)拷贝。可以使用的载体是质粒，例如记载在例如US 5,538,873中。也可以使用的载体是噬菌体，例如噬菌体Mu，如EP 0 332 448所述，或噬菌体lambda(λ)。通过将另一个拷贝整合进染色体的另一个位点一例如噬菌体λ的att位点，也可以实现拷贝数的增加(Yu和Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307公开了，通过在染色体苏氨酸操纵子的上游整合表达盒或启动子，例如tac启动子、trp启动子、lpp启动子或噬菌体λ的PL启动子和PR-启动子，可以实现表达的增强。可以以相同的方式使用噬菌体T7的启动子、gear-box启动子或nar启动子。也可以使用这种表达盒或启动子，如EP 0 593 792所述，以过表达质粒-结合的基因。通过使用lacIQ等位基因，又可以控制质粒-结合的基因的表达(Glascock和Weickert，Gene 223，221-231(1998))。通过去除苏氨酸操纵子的弱化子(Park等，Biotechnology Letters 24，1815-1819(2002))或通过使用thr79-20突变(Gardner，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 76(4)，1706-1710(1979))或通过thrS基因的突变，其编码苏氨酰基-t-RNA合成酶，如Johnson等(Journal of Bacteriology 129(1)，66-70(1977)所述，可以类似地实现过表达。通过所述的方法，特定天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I蛋白变体的胞内浓度比原始菌株增加了至少10％。

合适的thrA-等位基因记载在US 4,278,765中，且可以以菌株MG442的形式，从俄国工业微生物国家中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM，Moscow，Russia)得到，登记号CMIM B-1628。其它合适的thrA等位基因记载在WO00/09660和WO 00/09661中，且可以在登记号KCCM 10132和KCCM10133下从韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(KCCM，Seoul，Korea)得到。另一种合适的thrA等位基因存在于菌株H-4581中，它记载在US 4,996,147中，且可以在登记号Ferm BP-1411下从国家高等工业科技研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)得到。最后，其它thrA等位基因记载在US 3,580,810中，且可以以保藏在ATCC的菌株ATCC 21277和ATCC 21278的形式得到。另一种等位基因记载在US 3,622,453，且可以在登记号ATCC 21272下以菌株KY8284的形式从ATCC得到。另外，WO 02/064808描述了另一种thrA等位基因，它以菌株pGmTN-PPC12的形式保藏在KCCM，登记号KCCM 10236。

如果适当，使用充分已知的常规地使用诱变物质诱变细胞的方法，例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或甲磺酸乙酯(EMS)或诱变射线，例如紫外线，并随后选择苏氨酸类似物(例如AHV-抗性的变体)，可以分离出能编码“反馈”抗性的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I变体的thrA等位基因。这样的诱变方法记载在，例如，Shiio和Nakamori(Agricultural and Biological Chemistry 33(8)，1152-1160(1969))或Saint-Girons和Margerita(Molecular andGeneral Genetics 162，101-107(1978))或已知的手册J.H.Miller(AShort Course In Bacterial Genetics.A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，USA，1992)、特别是第135-156页中。Shiio和Nakamori，例如，在室温(即通常约16-26℃)用0.5mg/ml MNNG(在0.1M磷酸钠缓冲液中，pH 7)处理了大肠杆菌细胞悬液约15分钟，以产生突变。Miller推荐，例如，对于每2ml细胞悬液(在0.1M TRIS缓冲液中，pH7.5)，在37℃的温度用30ul EMS处理5-60分钟。可以以明显的方式，修改这些诱变条件。在典型地含有2-10mM AHV的最小琼脂上选择AHV-抗性的突变体。然后可以克隆对应的等位基因，并进行测序，并可以检测由这些等位基因编码的蛋白变体的活性。如果适当，也可以直接地使用生产的突变体。词语“直接地”是指，生产的突变体可以在根据本发明的方法中用于制备L-苏氨酸，或者可以对这些突变体进行其它修饰，以提高产出性质，例如，苏氨酸降解的弱化或苏氨酸操纵子的过表达。

也可以以相同的方式使用体外诱变的方法，例如记载在，例如已知的手册Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA，1989)。也可以在商业上以所谓的“试剂盒”的形式得到相应的方法，例如，Papworth等(Strategies 9(3)，3-4(1996))所述的由Stratagene(La Jolla，USA)生产的″QuikChange定位诱变试剂盒″。

这些诱变方法当然也可以用于其它基因、等位基因或菌株或目标和任务，例如，对L-苏氨酸抗性的突变体的生产和分离。

能编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I变体的那些thrA等位基因是优选的，与没有L-苏氨酸的情况下的活性相比，所述的变体在有10mM-苏氨酸存在的情况下，具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的高丝氨酸脱氢酶活性，和/或在有1mM-苏氨酸存在的情况下，其具有至少60％、至少70％、至少75％或至少80％的高丝氨酸脱氢酶活性。在适当时，在有10mM-苏氨酸存在的情况下提及的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I变体的天冬氨酸激酶活性是没有L-苏氨酸的情况下的活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。

含有选自下述元件的肠杆菌科细菌是更合适的：选自opal、ochre和amber，优选rpoS基因中的amber的终止密码子，和选自opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，优选amber抑制基因的t-RNA抑制基因。amber突变优选地位于根据RpoS基因产物的氨基酸序列的位点33处。优选地，使用supE作为amber抑制基因。这些细菌记载在PCT/EP02/02055中。在登记号DSM 15189下，可以从DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen[德国微生物和细胞培养物中心](Braunschweig，Germany)得到在rpoS基因和抑制基因supE中含有所述突变的菌株。

在现有技术中可以发现rpoS基因的核苷酸序列。与登记号AE000358相对应的rpoS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。相关的RpoS基因产物或蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在SEQID NO.3中，再现了rpoS等位基因的核苷酸序列，其在与RpoS基因产物或蛋白的氨基酸序列的位点33相对应的核苷酸序列位点处含有amber类型的终止密码子，二者分别对应着SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。现有技术记载了抑制基因supE，且如SEQ ID NO.4所示。

不能在好氧培养条件下分解苏氨酸或使用它作为氮源的肠杆菌科细菌是更合适的。“好氧培养条件”应当理解为这样的条件，其使发酵培养物中的氧分压在90％、优选95％、非常特别优选99％的发酵时间中大于(＞)0％。这种菌株是，例如，Okamoto(Bioscience，Biotechnology and Biochemistry 61(11)，1877-1882(1997))所述的菌株KY10935。不能分离氮地分解苏氨酸的菌株通常具有弱化的苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)，其由tdh基因编码。该酶已经记载在Aronson等(The Journal of Biological Chemistry 264(9)，5226-5232(1989))。弱化的tdh基因记载在，例如，Ravnikar和Somerville(Journal of Bacteriology，1986，168(1)，434-436)，US5,705,371，WO 02/26993和Komatsubara(Bioprocess Technology19，467-484(1994))等中。

合适的tdh等位基因记载在US 5,538,873中，且可以在登记号1876下，以菌株B-3996的形式从俄国工业微生物国家中心(VKPM，Moscow，Russia)得到。另一种tdh等位基因记载在US 5,939,307中，且可以在登记号NRRL B-21593下，以菌株kat-13的形式从农业研究服务专利培养物中心(Agriculture Research Service PatentCulture Collection)(Peoria，Illinois，USA)得到。最后，tdh等位基因记载在WO 02/26993中，且以菌株TH21.97的形式保藏在NRRL，登记号为NRRL B-30318。在登记号CGSC 6945下，可以从大肠杆菌品种中心(E.coli Genetic Stock Center)(New Haven，Conn.，USA)得到能编码缺陷型苏氨酸脱氢酶的等位基因tdh-1::cat1212。

至少部分地需要异亮氨酸的肠杆菌科细菌(″渗漏表型″)是更合适的，通过加入浓度为至少10、20或50mg/l的L-异亮氨酸或浓度为至少50、100或500mg/l的L-苏氨酸，可以满足该需要。

“需要或营养缺陷型”通常应当理解为指这样的事实，作为突变的结果，菌株已经彻底丧失了野生型功能，例如酶活性，且生长需要添加补充物，例如氨基酸。“部分需要或部分营养缺陷型”是指，作为突变的结果，野生型功能，例如来自氨基酸的生物合成途径的酶的活性，受到削弱或弱化，但是没有彻底消除。在没有补充物的情况下，具有部分需要的菌株典型地具有比野生型降低的生长速度，即大于(＞)0％且小于(＜)90％、50％、25％或10％。在文献中，该关系也称作“渗漏”表型或“泄漏”(Griffiths等：An Introduction to GeneticAnalysis.第6版，1996，Freeman and Company，New York，USA)。

具有这样的异亮氨酸部分需要的菌株记载在，例如WO 01/14525中，且以菌株DSM9906的形式保藏在KCCM，登记号KCCM 10168。需要异亮氨酸的能分泌或生产苏氨酸的菌株通常具有弱化的苏氨酸脱氨酶(E.C.Number 4.3.1.19)，其由ilvA基因编码。苏氨酸脱氨酶也称作苏氨酸脱水酶。能实现部分异亮氨酸营养缺陷型的弱化的ilvA基因记载在，例如US 4,278,765中，且可以以菌株MG442的形式得到，在登记号B-1682下保藏在VKPM。

其它弱化的ilvA基因记载在，例如WO 00/09660，且可以以菌株DSM 9807的形式得到，在登记号KCCM-10132下保藏在KCCM。

Komatsubara(Bioprocess Technology 19，467-484(1994))描述了其它弱化的ilvA基因。

合适的和新的苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列包含，例如，SEQ ID NO.6的序列，其可以含有远离位点286处的谷氨酸的任意氨基酸。优选地用谷氨酸替换赖氨酸(E286K)。

术语“氨基酸”更具体地指选自下述的蛋白原的L-氨基酸，包括它们的盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。

SEQ ID NO.8显示了苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列，其含有在位点286处的氨基酸赖氨酸；相关的核苷酸序列显示在SEQ ID NO.7中。它含有在位点856处的核碱基腺嘌呤。

另一种合适的苏氨酸脱氨酶是Lee等(Journal of Bacteriology185(18)，5442-5451(2003))所述的变体，其中丝氨酸替换了在位点97处的苯丙氨酸(S97F)。其它合适的苏氨酸脱氨酶是Fischer和Eisenstein(Journal of Bacteriology 175(20)，6605-6613(1993))所述的变体，其具有至少一种选自下述的氨基酸替换：在位点46处的天冬酰胺替换为天冬氨酸(N46D)，在位点66处的丙氨酸替换为缬氨酸(A66V)，在位点156处的脯氨酸替换为丝氨酸(P156S)，在位点248处的甘氨酸替换为半胱氨酸(G248C)和在位点266处的天冬氨酸替换为酪氨酸(D266Y)。

通过至少一个碱基对或核苷酸的***或缺失诱变，或通过编码区的至少一个密码子的***或缺失，或通过转换或颠换诱变将终止密码子整合进ilvA基因的编码区，可以分离出等位基因，其中ilvA基因的表达通常被完全消除。该方法也可以应用于能编码苏氨酸脱氢酶的其它基因、等位基因或开放读码框，例如，tdh基因。

对L-苏氨酸和/或L-高丝氨酸抑制生长抗性的肠杆菌科细菌是更合适的。苏氨酸-抗性的菌株和其制备记载在，例如，Astaurova等(Prikladnaya Biokhimia Microbiologiya(1985)，21(5)，485，其英文翻译作：Applied Biochemistry and Microbiology(1986)，21，485-490))。Austaurova描述的突变体对40mg/ml L-苏氨酸是抗性的。另外，例如，菌株472T23，其可以在有5mg/ml L-苏氨酸存在的情况下生长，且同时是L-高丝氨酸抗性的，记载在US 5,175,107。菌株472T232可以在登记号BKIIM B-2307下从VKPM得到，和在登记号ATCC 9801下从ATCC得到。另外，菌株DSM 9807，其可以在含有7％L-苏氨酸的固体营养培养基上生长，记载在WO 00/09660。菌株DSM9807可以在登记号KCCM-10132下从KCCM得到。最后，菌株DSM 9906，其可以在含有60％-70％L-苏氨酸发酵目液的培养基中生长，记载在WO01/14525。菌株DSM 9906可以在登记号KCCM-10168下从KCCM得到。

已知(见EP 0994 190 A2和Livshits等(Research inMicrobiology 154，123-135(2003))，对L-苏氨酸和L-高丝氨酸的抗性，是由rhtA基因的增强引起的。通过增加该基因的拷贝数，或通过使用rhtA23突变，可以实现该增强。

EP 0 994 190 A2公开了，rhtB基因的增强会实现对L-高丝氨酸和L-苏氨酸、特别是对L-高丝氨酸的抗性，并提高苏氨酸生产。通过在称作N99的菌株中过表达RhtB基因产物，可以使最低抑制浓度从250ug/ml增加到30,000ug/ml。

EP 1,013,765A1公开了，rhtC基因的增强会造成对L-苏氨酸的抗性，并提高苏氨酸生产。将能在有浓度为至少30mg/ml的L-苏氨酸存在的最小琼脂上生长的菌株称作L-苏氨酸抗性的。它还公开了，rhtB基因的增强会实现对L-高丝氨酸的抗性，并提高苏氨酸生产。将能在有浓度为至少5mg/ml的L-高丝氨酸存在的最小琼脂上生长的菌株称作L-高丝氨酸抗性的。所述的专利申请公开了对10mg/ml L-高丝氨酸抗性的且对50mg/ml L-苏氨酸抗性的菌株。US 4,996,147公开了菌株H-4581，它是15g/l高丝氨酸抗性的。菌株H-4581可以在登记号FERM BP-1411下从国家高等工业科技研究所得到。

EP 1 016 710 A2公开了，开放读码框或基因yfiK或yeaS的增强会实现对L-苏氨酸和L-高丝氨酸的抗性。通过在在称作TG1的菌株中过表达YfiK基因产物，可以使关于L-高丝氨酸的最低抑制浓度从500ug/ml增加到1,000ug/ml，使关于L-苏氨酸的最低抑制浓度从30,000ug/ml增加到40,000ug/ml。通过YeaS基因产物的过表达，可以使关于L-高丝氨酸的最低抑制浓度从500ug/ml增加到1,000ug/ml，使关于L-苏氨酸的最低抑制浓度从30,000ug/ml增加到50,000ug/ml。另外在所述的专利申请中证实了，通过YfiK基因产物的过表达提高了苏氨酸生产。

根据这些技术说明，制备了可以在有≥(至少)5g/l、≥10、≥20g/l、≥30g/l、≥40g/l、≥50g/l、≥60g/l和≥70g/l L-苏氨酸存在下生长的(即L-苏氨酸抗性的)、且适用于在根据本发明的方法中制备L-苏氨酸的菌株。

具有至少下述特征的菌株特别适用于根据发明的方法：

a)苏氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，其任选地以过表达形式存在，和

b)选自下述的终止密码子：opal、ochre和amber，优选在rpoS基因中的amber和选自下述的t-RNA抑制基因：opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，优选amber抑制基因。

具有至少下述特征的菌株也特别适用于根据发明的方法：

a)苏氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I，其任选地以过表达形式存在，

b)在好氧培养条件下，不能分解苏氨酸，优选通过苏氨酸脱氢酶的弱化，

c)至少部分需要异亮氨酸，和

d)在有至少5g/l苏氨酸存在下生长。

具有至少下述特征的菌株非常特别适用于根据发明的方法：

b)选自下述的终止密码子：opal、ochre和amber，优选在rpoS基因中的amber，和选自下述的t-RNA抑制基因：opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，优选amber抑制基因，

c)在好氧培养条件下，不能分解苏氨酸，优选通过苏氨酸脱氢酶的弱化，

d)至少部分需要异亮氨酸，和

e)在有至少5g/l苏氨酸存在下生长。

而且，在根据本发明的方法中采用的细菌可以另外具有一种或多种下述的特征；

●由pckA基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEP羧基激酶)的弱化，如例如WO 02/29080中所述，

●由pgi基因编码的磷酸葡萄糖异构酶的弱化(Froman等Molecular and General Genetics 217(1)：126-31(1989))，

●由开放读码框ytfP编码的YtfP基因产物的弱化，如例如WO02/29080所述，

●由开放读码框yjfA编码的YjfA基因产物的弱化，如例如WO02/29080所述，

●由poxB基因编码的丙酮酸氧化酶的弱化，如例如WO 02/36797所述，

●由开放读码框yjgF编码的YjgF基因产物的弱化，如例如PCT/EP03/14271所述，Wasinger VC.和Humphery-Smith I.(FEMSMicrobiology Letters 169(2)：375-382(1998))，Volz K.(ProteinScience 8(11)：2428-2437(1999))和Parsons等(Biochemistry42(1)：80-89(2003))已经描述了大肠杆菌的yjgF orf。相关的核苷酸或氨基酸序列可以在登记号AE000495下从公开的数据库中得到。为了更清楚，它们如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

●由基因pntA和pntB编码的转氢酶的增强，如例如EP 0 733 712A1所述，

●由pps基因编码的磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强，如例如EP 0877 090 A1所述，

●由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，如例如EP 0723 011 A1所述，和

●由rseB基因编码的调节剂RseB的增强，如例如EP 1382685所述。Missiakas等(Molecular Microbiology 24(2)，355-371(1997))，De Las Penas等(Molecular Microbiology 24(2)：373-385(1997))和Collinet等(Journal of Biological Chemistry 275(43)：33898-33904(2000))已经描述了调节剂RseB。相关的核苷酸或氨基酸序列可以在登记号AE000343下从公开的数据库得到。

●由galP基因编码的半乳糖质子协同转运(＝半乳糖通透酶)的增强，如例如DE 10314618.0所述。Macpherson等(The Journal ofBiological Chemistry 258(7)：4390-4396(1983))和Venter等(TheBiochemical Journal363(Pt 2)：243-252(2002))已经描述了galP基因和它的功能。相关的核苷酸或氨基酸序列可以在登记号AE000377下从公开的数据库得到。

●能使用蔗糖作为碳源的能力。关于蔗糖利用的遗传决定子记载在现有技术中，例如FR-A-2559781，by Debabov(In：Proceedings ofthe IV International Symposium on Genetics of IndustrialMicroorganisms 1982.Kodansha Ltd，Tokyo，Japan，p 254-258)，Smith和Parsell(Journal of General Microbiology87，129-140(1975))和Livshits等(In：Conference on MetabolicBacterial Plasmides.Tartusk University Press，Tallin，Estonia(1982)，p 132-134和144-146)和US 5,705,371。通过接合对萘啶酸抗性的大肠杆菌K-12突变体中，转移了Smith和Parsell描述的关于菌株H155利用蔗糖的遗传决定子，并在2004年3月16日将对应的转化接合子保藏在Deutsche Sammlung fürMikroorganismen und Zellkulturen[德国微生物和细胞培养物中心](Braunschweig，Germany)，保藏号DSM 16293。关于蔗糖利用的遗传决定子也包含在菌株472T23中，它记载在US 5,631,157中，且可以在登记号ATCC 9801下从ATCC得到。Bockmann等(Molecular andGeneral Genetics 235，22-32(1992))已经描述了关于蔗糖利用的另一种遗传决定子，且在名称csc***下是已知的。

●由开放读码框yedA编码的YedA基因产物的增强，如例如WO03/044191所述，

●在有至少0.1-0.5mM或至少0.5-1mM疏螺旋体素存在下生长(疏螺旋体素抗性)，如US 5,939,307所述。疏螺旋体素-抗性的菌株kat-13可以在登记号NRRL B-21593下从NRRL得到。

●在有至少2-2.5g/l或至少2.5-3g/l二氨基琥珀酸存在下生长(二氨基琥珀酸抗性)，如WO 00/09661所述。二氨基琥珀酸-抗性的菌株DSM 9806可以在登记号KCCM-10133下从KCCM得到。

●在有至少30-40mM或至少40-50mM α-甲基丝氨酸存在下生长(α-甲基丝氨酸抗性)，如WO 00/09661所述。α-甲基丝氨酸-抗性的菌株DSM 9806可以在登记号KCCM-10133下从KCCM得到。

●在有不超过30mM或不超过40mM或不超过50mM氟代丙酮酸存在下生长(氟代丙酮酸敏感性)，如WO 00/09661所述。氟代丙酮酸-敏感的菌株DSM 9806可以在登记号KCCM-10133下从KCCM得到。

●在有至少210mM或至少240mM或至少270mM或至少300mML-谷氨酸存在下生长(谷氨酸抗性)，如WO 00/09660所述。谷氨酸-抗性的菌株DSM 9807可以在登记号KCCM-10132下从KCCM得到。

●至少部分需要甲硫氨酸。至少部分需要甲硫氨酸的菌株是，例如，菌株H-4257，它记载在US 5,017,483中，且可以在登记号FERMBP-984下从国家高等工业科技研究所得到。通过添加至少25，50或100mg/l L-甲硫氨酸，可以满足该需要。

●至少部分需要间二甲基庚二酸。至少部分需要间二甲基庚二酸的菌株是，例如，菌株H-4257，它记载在US 5,017,483中，且可以在登记号FERM BP-984下从国家高等工业科技研究所得到。通过添加至少25、50或100mg/l间二甲基庚二酸，可以满足该需要。

●在至少100mg/l利福平(利福平抗性)存在下生长，如US4,996,147所述。利福平-抗性的菌株H-4581可以在登记号FERMBP-1411下从国家高等工业科技研究所得到。

●在至少15g/l L-赖氨酸(赖氨酸抗性)存在下生长，如US4,996,147所述。L-赖氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登记号FERMBP-1411下从国家高等工业科技研究所得到。

●在至少15g/l甲硫氨酸(甲硫氨酸抗性)存在下生长，如所述US 4,996,147。甲硫氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登记号FERMBP-1411下从国家高等工业科技研究所得到。

●在至少15g/l L-天冬氨酸(天冬氨酸抗性)存在下生长，如US4,996,147所述，天冬氨酸-抗性的菌株H-4581可以在登记号FERMBP-1411下从国家高等工业科技研究所得到。

●由pyc基因编码的丙酮酸羧化酶的增强。合适的pyc基因或等位基因是，例如，来自谷氨酸棒杆菌(WO 99/18228、WO 00/39305和WO 02/31158)、埃特里根瘤菌(US 6,455,284)或枯草杆菌(EP 1092776)的那些。如果适当，也可以使用来自内源地含有丙酮酸羧化酶的其它微生物的pyc基因，例如，Methanobacterium thermoautotrophicum或荧光假单胞菌。

如果使用含有蔗糖的营养培养基，给菌株装配了关于蔗糖利用的遗传决定子。

术语“增强”在这方面描述了微生物中的一种或多种由对应DNA编码的酶或蛋白的胞内活性或浓度的提高，例如通过使用有效启动子或能编码对应的具有高活性的酶或蛋白的基因或等位基因，并任选地组合这些方法，使开放读码框、基因或等位基因或开放读码框、多种基因或等位基因的拷贝数增加至少一个(1)拷贝。

对于增强方法以及弱化方法，通常优选地使用内源基因、等位基因或开放读码框。″内源基因″或″内源核苷酸序列″应当理解为指存在于种属群体中的基因或开放读码框或等位基因或核苷酸序列。

如果使用质粒来提高拷贝数，如果适当，通过一种或多种选自下述的遗传基因座来稳定它们：Rasmussen等(Molecular and GeneralGenetics 209(1)，122-128(1987))、Gerdes 等(MolecularMicrobiology 4(11)，1807-1818(1990))和Thistedt和Gerdes(Journal of Molecular Biology 223(1)，41-54(1992))所述的质粒R1的parB基因座，Loh等(Gene 66(2)，259-268(1988))所述的F质粒的flm基因座，Miller等(Gene 24(2-3)，309-315(1983)所述的质粒pSC101的par基因座，Leung等(DNA 4(5)，351-355(1985)所述的质粒Co1E1的cer基因座，Sobecky等(Journal ofBacteriology 178(7)，2086-2093(1996))和Roberts和Helinsky(Journal of Bacteriology 174(24)，8119-8132(1992))所述的质粒RK2的par基因座，Eberl等(Molecular Microbiology 12(1)，131-141(1994))所述的质粒RP4的par基因座，和Gerdes和Molin(Journal of Molecular Biology 190(3)，269-279(1986))、Dam和Gerdes(Journal of Molecular Biology 236(5)1289-1298(1994))和Jensen等(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 95(15)，8550-8555(1998)所述的质粒R1的parA基因座。

通过增强措施、特别是过表达，通常会使对应的蛋白或酶的活性或浓度提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％、至多高达1,000％或2,000％，基于野生型蛋白的活性或浓度，或原始微生物中的蛋白的活性或浓度。

为了实现增强，例如可以提高基因的表达或酶或蛋白的催化或功能性质。可以任选地组合这2种方法。

因而，例如，可以使对应基因的拷贝数增加至少一个(1)，或者可以诱变位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点。整合在结构基因上游的表达盒可以以相同的方式发挥作用。通过可诱导的启动子，还可以增强在发酵生产L-苏氨酸的过程中的表达。通过延长m-RNA的寿命的方法，可以类似地提高表达。另外，通过预防酶蛋白的降解，也能提高酶活性。基因或基因构建体可以以不同的拷贝数存在于质粒中，或者可以整合进染色体中并扩增。或者，通过改变培养基的组成和培养方法，也可以实现目标基因的过表达。

术语“弱化”在这方面描述了微生物中的一种或多种由对应DNA编码的酶或蛋白的胞内活性或浓度的减少或消除，例如通过使用弱启动子，或能编码对应的具有低活性的酶或蛋白、或能使对应的酶或蛋白或基因失活的基因或等位基因，并任选地组合这些方法。

通过弱化方法，通常会使对应的蛋白或酶的活性或浓度减少到野生型蛋白的活性或浓度或原始微生物中的蛋白的活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％或0-1％或0-0.1％。

为了实现弱化，例如，可以减少或消除基因或开放读码框的表达或酶或蛋白的催化或功能性质。可以任选地组合这2种方法。

通过合适的培养，通过基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)，或通过反义-RNA技术，可以减少基因表达。基因表达的信号结构是，例如，阻遏物基因、活化剂基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。专家可以发现这方面的信息，尤其是，例如，在Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering58：191-195(1998))中，在Carrier und Keasling(BiotechnologyProgress 15：58-64(1999))中，在Franch和Gerdes(Current Opinionin Microbiology 3：159-164(2000))中，和在已知的遗传学和分子生物学教材中，例如，Knippers(″Molekulare Genetik [MolecularGenetics]″，第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或Winnacker(″Gene und Klone[Genes and Clones]″，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教材。

会导致酶蛋白的催化性质变化或减少的突变是现有技术已知的。可以提及的实例是Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry272：8611-8617(1997)，Yano等(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 95：5511-5515(1998))、Wente和Schachmann(Journal of BiologicalChemistry 266：20833-20839(1991))的著作。在已知的遗传学和分子生物学教材中，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik [GeneralGenetics]″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)，可以发现总结性的描述。

可行的突变是至少一个(1)碱基对或核苷酸的转换、颠换、***和缺失。根据突变造成的氨基酸交换对酶活性的影响，指“错义突变”或“无义突变”。错义突变会导致蛋白中的特定氨基酸替换为另一种，这意味着，尤其是，非保守的氨基酸交换。通过这种方法，可以削弱蛋白的功能能力或活性，并减少至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％、0-5％、0-1％或0-0.1％的值。无义突变会在基因的编码区产生终止密码子，并因此在翻译中产生过早的中断。至少一个碱基对在基因中的***或缺失会导致移码突变，这会导致整合进不正确的氨基酸或过早中断翻译。如果突变造成在编码区形成终止密码子，这也会导致翻译的过早终止。至少一个(1)或多个密码子的缺失，典型地也会导致酶活性或功能的完全丧失。

适用于根据本发明的方法的菌株是，尤其是，US 5,175,107所述的菌株BKIIM B-3996，WO 00/09660所述的菌株KCCM-10132，和WO98/04715所述的菌株kat-13的需要异亮氨酸的突变体。如果适当，可以用所述方法使菌株适应根据本发明的方法，特别是通过将终止密码子整合进rpoS基因中，例如位于与RpoS蛋白的氨基酸序列的位点33相对应的位点处的amber密码子，并同时整合对应的t-RNA抑制基因，例如supE。

通过确定能分泌L-苏氨酸的大肠杆菌菌株中的rpoS基因的核苷酸序列，也可以鉴别出适用于根据本发明的方法的菌株。为此目的，克隆了rpoS基因，或用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，并确定核苷酸序列。如果rpoS基因含有终止密码子，在第2个步骤中检查它是否也含有对应的t-RNA抑制基因。如果适当，为以该方式鉴定出的菌株提供上述的性质，例如，thrA等位基因的过表达，在好氧培养条件下发生的苏氨酸分解的弱化，会实现至少部分需要异亮氨酸或在有至少5g/l苏氨酸存在下生长的导入ilvA基因的突变，或提供一种或多种上述的其它性质。

通过转化、转导或接合，可以将所述性质或特征转移进理想菌株中。

在转化方法中，将分离的遗传物质(典型地DNA)***受体菌株中。在肠杆菌科细菌(例如大肠杆菌)的情况下，将用于该目的的DNA体外地整合进质粒或噬菌体DNA中，然后将其转移进受体菌株中。对应的方法和操作规程是现有技术充分已知的，且详细记载在，例如，J.Sambrook的手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)中。

使用有条件的复制质粒，通过基因或等位基因交换的方法，可以将确定的突变转移进合适的菌株中。在确定的突变的情况下，已知了至少染色体中的位点，优选核碱基中的变化的准确位点和变化的性质(取代，即转换或颠换，***或缺失)。如果适当，使用普通方法，开始时对对应的DNA进行测序。实现基因或等位基因交换的普通方法是Hamilton等(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))所述的那些，其中使用了pSC101衍生pMAK705，它能热敏感地复制。使用该方法，可以将等位基因从质粒转移进染色体中。以相同的方式，可以将染色体等位基因转移到质粒中。可以类似地使用现有技术中公开的其它方法，例如，Martinez-Morales等(Journal of Bacteriology181：7143-7148(1999))的方法，Boyd等(Journal of Bacteriology182：842-847(2000))的方法或WO 01/77345中公开的方法。

该方法可以用于，尤其是，将rpoS等位基因(其含有，例如，终止密码子)、抑制基因基因(例如，supE)、弱化的tdh等位基因(其含有，例如，缺失)、弱化的ilvA等位基因、thrA等位基因(其能编码″反馈″抗性的天冬氨酸激酶I一高丝氨酸脱氢酶I变体)、rhtA23突变、弱化的pck等位基因、弱化的ytfP ORF的等位基因、弱化的yjfA ORF、弱化的poxB等位基因或弱化的yjgF ORF***菌株中。

在转导方法中，使用噬菌体将遗传特征从供体菌株转移进受体菌株中。该方法属于现有技术，且记载在教材中，例如，E.A.Birge(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，SpringerVerlag，New York，USA，2000)。

在大肠杆菌的情况下，噬菌体P1典型地用于普通转导(Lennox，Virology 1，190-206(1955))。F.C.Neidhard(Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology，第2版，ASM Press，Washington，DC，USA，1996)的教材中的M.Masters的文章″Generalized Transduction″总结了普通转导的方法。实践规程包含在例如J.H.Miller(A Short Course In Bacterial Genetics.ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and RelatedBacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA，1992)的教材或P.Gerhardt″Manual of Methods for GeneralBacteriology″(American Society for Microbiology，Washington，DC，USA，1981)的教材中。

通过转导，可以将能赋予抗性的或其它显性的遗传性质，例如，抗生素抗性(例如卡那霉素抗性、氯霉素抗性、利福平抗性或疏螺旋体素抗性)，对抗代谢物的抗性(例如α-氨基-β-羟基戊酸抗性，α-甲基-丝氨酸抗性或二氨基琥珀酸抗性)，对代谢物的抗性(例如苏氨酸抗性、高丝氨酸抗性、谷氨酸抗性、甲硫氨酸抗性、赖氨酸抗性或天冬氨酸抗性)或利用蔗糖的能力，转移进合适的受体菌株中。

转导方法也适用于将所谓的非选择性的遗传性质，例如，营养缺陷型或需要氨基酸(例如需要异亮氨酸，需要甲硫氨酸或需要间二甲基庚二酸)，需要维生素或对抗代谢物的敏感性(例如氟代丙酮酸敏感性)，***受体菌株中。为此目的，使用在染色体上含有间隔约1分钟的转座子Tn10或Tn10kan的大肠杆菌菌株。在术语″Singer收集″或″Singer/Gross收集″(Singer等，Microbiological Reviews53，1-24，1989)下，这些菌株是已知的。这些菌株一般可以从YaleUniversity的大肠杆菌品种中心(New Haven，CT，USA)得到。在F.C.Neidhard(Escherichia coli and Salmonella Cellular andMolecular Biology，第2版，ASM Press，Washington，DC，USA，1996)的教材中的M.K.B.Berlyn等″Linkage Map of Escherichia coliK-12，Edition 9″文章中，可以发现其它信息。以类似的方式，可以将不是直接选择性的遗传性质(例如氟代丙酮酸敏感性，抑制基因突变)和不知其突变位点的那些，转入不同的菌株中。在，尤其是，在J.Scaife等(Genetics of Bacteria，Academic Press，London，UK，1985)的教材中，在上述的M.Masters的文章中，在上述的J.H.Miller的手册中，可以发现在该背景下的说明。使用Bochner等(Journal ofBacteriology 143，926-933(1980))所述的方法，可以再任选地去除用转座子Tn10***的四环素抗性基因。

在接合方法中，通过细胞-细胞接触，使遗传物质从供体转移进受体中。F因子(F：生育力)的接合转移，使用Hfr菌株(Hfr：高频重组)和携带F′因子的菌株(F′：F prime)的接合基因转移，属于常规的遗传学方法。在，尤其是，在F.C.Neidhard(Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology，第2版，ASM Press，Washington，DC，USA，1996)的标准著作中，可以发现总结性的描述。

实践规程记载在例如，J.H.Miller(A Short Course InBacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA，1992)的手册中，或P.Gerhardt″Manual of Methods for General Bacteriology″(American Societyfor Microbiology，Washington，DC，USA，1981)的手册中。F、F′和Hfr菌株一般可以从Yale University的大肠杆菌品种中心(NewHaven，CT，USA)得到。

接合方法已经用于，例如，将Thèze和Saint-Girons(Journal ofBacteriology 118，990-998(1974))所述的突变thrC1010转移进菌株MG442(Debabov，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79，113-136(2003)中。具有利用蔗糖能力的接合质粒记载在现有技术中，例如Schmi d等(Journal of Bacteriology151，68-76(1982))或Smith和Parsell(Journal of GeneralMicrobiology 87，129-140(1975))和Livshits等(In：Conference onMetabolic Bacterial Plasmids.Tartusk University Press，Tallin，Estonia(1982)，p 132-134und 144-146)。因而，Debabov报道(In：Proceedings of the IVth International Symposium on Genetics ofIndustrial Microorganisms 1982.Kodansha Ltd，Tokyo，Japan，p254-258)，通过接合，构建了已经导入了利用蔗糖能力的能生产苏氨酸的菌株。

序列表

<110>Degussa AG

<120>制备L-苏氨酸的方法

<130>030217BT

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(990)

<223>rpoS基因

<400>1

atg agt cag aat acg ctg aaa gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa 48

Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu

1 5 10 15

ttt gat gag aac gga gtt gag gtt ttt gac gaa aag gcc tta gta gaa 96

Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu

20 25 30

cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag 144

Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln

35 40 45

gga gcc aca cag cgt gtg ttg gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag 192

Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu

50 55 60

att ggt tat tca cca ctg tta acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg 240

Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala

65 70 75 80

cgt cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag 288

Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu

85 90 95

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Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg

100 105 110

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Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile

115 120 125

cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc ttc tca aca 432

Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr

130 135 140

tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg att atg aac 480

Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn

145 150 155 160

caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag gag ctg aac 528

Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn

165 170 175

gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg gac cat gaa 576

Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu

180 185 190

cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca gtt gat gac 624

Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp

195 200 205

gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc tcg gta gac acc 672

Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr

210 215 220

ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc ctg gcc gat 720

Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp

225 230 235 240

gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac gat atg aag 768

Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys

245 250 255

cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa cag cgt gaa 816

Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu

260 265 270

gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg gca aca ctg 864

Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu

275 280 285

gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt gtt cgc cag 912

Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln

290 295 300

att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg caa acg cag 960

Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln

305 310 315 320

ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 993

Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu

325 330

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu

1 5 10 15

Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu

20 25 30

Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln

35 40 45

Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu

50 55 60

Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu

85 90 95

Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg

100 105 110

Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile

115 120 125

Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr

130 135 140

Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn

145 150 155 160

Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn

165 170 175

Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu

180 185 190

Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp

195 200 205

Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr

210 215 220

Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp

225 230 235 240

Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys

245 250 255

Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu

260 265 270

Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu

275 280 285

Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln

290 295 300

Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln

305 310 315 320

Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu

325 330

<210>3

<211>993

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>等位基因

<222>(1)..(990)

<223>rpoS等位基因

<220>

<221>misc_feature

<222>(97)..(99)

<223>amber密码子

<400>3

atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac 60

ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaatagg aacccagtga taacgatttg 120

gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt 180

taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg 240

cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt 300

ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc 360

gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc 420

cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac 480

caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga 540

accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag 600

caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc 660

tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720

gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780

aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840

ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900

cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960

gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993

<210>4

<211>75

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>tRNA

<222>(1)..(75)

<223>supE等位基因

<400>4

tggggtatcg ccaagcggta aggcaccgga ttctaattcc ggcattccga ggttcgaatc 60

ctcgtacccc agcca 75

<210>5

<211>1545

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1542)

<223>ilvA基因

<400>5

atg gct gac tcg caa ccc ctg tcc ggt gct ccg gaa ggt gcc gaa tat 48

Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr

1 5 10 15

tta aga gca gtg ctg cgc gcg ccg gtt tac gag gcg gcg cag gtt acg 96

Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr

20 25 30

ccg cta caa aaa atg gaa aaa ctg tcg tcg cgt ctt gat aac gtc att 144

Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile

35 40 45

ctg gtg aag cgc gaa gat cgc cag cca gtg cac agc ttt aag ctg cgc 192

Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg

50 55 60

ggc gca tac gcc atg atg gcg ggc ctg acg gaa gaa cag aaa gcg cac 240

Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His

65 70 75 80

ggc gtg atc act gct tct gcg ggt aac cac gcg cag ggc gtc gcg ttt 288

Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe

85 90 95

tct tct gcg cgg tta ggc gtg aag gcc ctg atc gtt atg cca acc gcc 336

Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala

100 105 110

acc gcc gac atc aaa gtc gac gcg gtg cgc ggc ttc ggc ggc gaa gtg 384

Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val

115 120 125

ctg ctc cac ggc gcg aac ttt gat gaa gcg aaa gcc aaa gcg atc gaa 432

Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu

130 135 140

ctg tca cag cag cag ggg ttc acc tgg gtg ccg ccg ttc gac cat ccg 480

Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro

145 150 155 160

atg gtg att gcc ggg caa ggc acg ctg gcg ctg gaa ctg ctc cag cag 528

Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln

165 170 175

gac gcc cat ctc gac cgc gta ttt gtg cca gtc ggc ggc ggc ggt ctg 576

Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu

180 185 190

gct gct ggc gtg gcg gtg ctg atc aaa caa ctg atg ccg caa atc aaa 624

Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys

195 200 205

gtg atc gcc gta gaa gcg gaa gac tcc gcc tgc ctg aaa gca gcg ctg 672

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210 215 220

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Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu

225 230 235 240

ggc gta gcg gta aaa cgc atc ggt gac gaa acc ttc cgt tta tgc cag 768

Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln

245 250 255

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Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala

260 265 270

gcg atg aag gat tta ttc gaa gat gtg cgc gcg gtg gcg gaa ccc tct 864

Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser

275 280 285

ggc gcg ctg gcg ctg gcg gga atg aaa aaa tat atc gcc ctg cac aac 912

Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn

290 295 300

att cgc ggc gaa cgg ctg gcg cat att ctt tcc ggt gcc aac gtg aac 960

Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn

305 310 315 320

ttc cac ggc ctg cgc tac gtc tca gaa cgc tgc gaa ctg ggc gaa cag 1008

Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln

325 330 335

cgt gaa gcg ttg ttg gcg gtg acc att ccg gaa gaa aaa ggc agc ttc 1056

Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe

340 345 350

ctc aaa ttc tgc caa ctg ctt ggc ggg cgt tcg gtc acc gag ttc aac 1104

Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn

355 360 365

tac cgt ttt gcc gat gcc aaa aac gcc tgc atc ttt gtc ggt gtg cgc 1152

Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg

370 375 380

ctg agc cgc ggc ctc gaa gag cgc aaa gaa att ttg cag atg ctc aac 1200

Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn

385 390 395 400

gac ggc ggc tac agc gtg gtt gat ctc tcc gac gac gaa atg gcg aag 1248

Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys

405 410 415

cta cac gtg cgc tat atg gtc ggc gga cgt cca tcg cat ccg ttg cag 1296

Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln

420 425 430

gaa cgc ctc tac agc ttc gaa ttc ccg gaa tca ccg ggc gcg ctg ctg 1344

Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu

435 440 445

cgc ttc ctc aac acg ctg ggt acg tac tgg aac att tct ttg ttc cac 1392

Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His

450 455 460

tat cgc agc cat ggc acc gac tac ggg cgc gta ctg gcg gcg ttc gaa 1440

Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu

465 470 475 480

ctt ggc gac cat gaa ccg gat ttc gaa acc cgg ctg aat gag ctg ggc 1488

Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly

485 490 495

tac gat tgc cac gac gaa acc aat aac ccg gcg ttc agg ttc ttt ttg 1536

Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu

500 505 510

gcg ggt tag 1545

Ala Gly

<210>6

<211>514

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>6

Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr

1 5 10 15

Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr

20 25 30

Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile

35 40 45

Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg

50 55 60

Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His

65 70 75 80

Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe

85 90 95

Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala

100 105 110

Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val

115 120 125

Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu

130 135 140

Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro

145 150 155 160

Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln

165 170 175

Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu

180 185 190

Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys

195 200 205

Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu

210 215 220

Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu

225 230 235 240

Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln

245 250 255

Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala

260 265 270

Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser

275 280 285

Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn

290 295 300

Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn

305 310 315 320

Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln

325 330 335

Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe

340 345 350

Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn

355 360 365

Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg

370 375 380

Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn

385 390 395 400

Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys

405 410 415

Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln

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Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His

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Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu

465 470 475 480

Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly

485 490 495

Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu

500 505 510

Ala Gly

<210>7

<211>1545

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1542)

<223>ilvA等位基因

<220>

<221>突变

<222>(856)..(856)

<223>

<400>7

atg gct gac tcg caa ccc ctg tcc ggt gct ccg gaa ggt gcc gaa tat 48

Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr

1 5 10 15

tta aga gca gtg ctg cgc gcg ccg gtt tac gag gcg gcg cag gtt acg 96

Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr

20 25 30

ccg cta caa aaa atg gaa aaa ctg tcg tcg cgt ctt gat aac gtc att 144

Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile

35 40 45

ctg gtg aag cgc gaa gat cgc cag cca gtg cac agc ttt aag ctg cgc 192

Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg

50 55 60

ggc gca tac gcc atg atg gcg ggc ctg acg gaa gaa cag aaa gcg cac 240

Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His

65 70 75 80

ggc gtg atc act gct tct gcg ggt aac cac gcg cag ggc gtc gcg ttt 288

Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe

85 90 95

tct tct gcg cgg tta ggc gtg aag gcc ctg atc gtt atg cca acc gcc 336

Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala

100 105 110

acc gcc gac atc aaa gtc gac gcg gtg cgc ggc ttc ggc ggc gaa gtg 384

Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val

115 120 125

ctg ctc cac ggc gcg aac ttt gat gaa gcg aaa gcc aaa gcg atc gaa 432

Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu

130 135 140

ctg tca cag cag cag ggg ttc acc tgg gtg ccg ccg ttc gac cat ccg 480

Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro

145 150 155 160

atg gtg att gcc ggg caa ggc acg ctg gcg ctg gaa ctg ctc cag cag 528

Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln

165 170 175

gac gcc cat ctc gac cgc gta ttt gtg cca gtc ggc ggc ggc ggt ctg 576

Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu

180 185 190

gct gct ggc gtg gcg gtg ctg atc aaa caa ctg atg ccg caa atc aaa 624

Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys

195 200 205

gtg atc gcc gta gaa gcg gaa gac tcc gcc tgc ctg aaa gca gcg ctg 672

Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu

210 215 220

gat gcg ggt cat ccg gtt gat ctg ccg cgc gta ggg cta ttt gct gaa 720

Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu

225 230 235 240

ggc gta gcg gta aaa cgc atc ggt gac gaa acc ttc cgt tta tgc cag 768

Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln

245 250 255

gag tat ctc gac gac atc atc acc gtc gat agc gat gcg atc tgt gcg 816

Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala

260 265 270

gcg atg aag gat tta ttc gaa gat gtg cgc gcg gtg gcg aaa ccc tct 864

Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Lys Pro Ser

275 280 285

ggc gcg ctg gcg ctg gcg gga atg aaa aaa tat atc gcc ctg cac aac 912

Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn

290 295 300

att cgc ggc gaa cgg ctg gcg cat att ctt tcc ggt gcc aac gtg aac 960

Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn

305 310 315 320

ttc cac ggc ctg cgc tac gtc tca gaa cgc tgc gaa ctg ggc gaa cag 1008

Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln

325 330 335

cgt gaa gcg ttg ttg gcg gtg acc att ccg gaa gaa aaa ggc agc ttc 1056

Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe

340 345 350

ctc aaa ttc tgc caa ctg ctt ggc ggg cgt tcg gtc acc gag ttc aac 1104

Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn

355 360 365

tac cgt ttt gcc gat gcc aaa aac gcc tgc atc ttt gtc ggt gtg cgc 1152

Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg

370 375 380

ctg agc cgc ggc ctc gaa gag cgc aaa gaa att ttg cag atg ctc aac 1200

Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn

385 390 395 400

gac ggc ggc tac agc gtg gtt gat ctc tcc gac gac gaa atg gcg aag 1248

Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys

405 410 415

cta cac gtg cgc tat atg gtc ggc gga cgt cca tcg cat ccg ttg cag 1296

Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln

420 425 430

gaa cgc ctc tac agc ttc gaa ttc ccg gaa tca ccg ggc gcg ctg ctg 1344

Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu

435 440 445

cgc ttc ctc aac acg ctg ggt acg tac tgg aac att tct ttg ttc cac 1392

Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His

450 455 460

tat cgc agc cat ggc acc gac tac ggg cgc gta ctg gcg gcg ttc gaa 1440

Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu

465 470 475 480

ctt ggc gac cat gaa ccg gat ttc gaa acc cgg ctg aat gag ctg ggc 1488

Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly

485 490 495

tac gat tgc cac gac gaa acc aat aac ccg gcg ttc agg ttc ttt ttg 1536

Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu

500 505 510

gcg ggt tag 1545

Ala Gly

<210>8

<211>514

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>8

Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr

1 5 10 15

Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr

20 25 30

Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile

35 40 45

Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg

50 55 60

Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His

65 70 75 80

Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe

85 90 95

Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala

100 105 110

Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val

115 120 125

Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu

130 135 140

Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro

145 150 155 160

Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln

165 170 175

Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu

180 185 190

Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys

195 200 205

Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu

210 215 220

Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu

225 230 235 240

Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln

245 250 255

Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala

260 265 270

Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Lys Pro Ser

275 280 285

Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn

290 295 300

Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn

305 310 315 320

Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln

325 330 335

Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe

340 345 350

Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn

355 360 365

Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg

370 375 380

Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn

385 390 395 400

Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys

405 410 415

Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln

420 425 430

Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His

450 455 460

Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu

465 470 475 480

Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly

485 490 495

Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu

500 505 510

Ala Gly

<210>9

<211>1548

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>DNA

<222>(1)..(1548)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(527)..(952)

<223>yjgF orf

<400>9

tcgcgatctg gtactgtaag gggaaataga gatgacacac gataataaat tgcaggttga 60

agctattaaa cgcggcacgg taattgacca tatccccgcc cagatcggtt ttaagctgtt 120

gagtctgttc aagctgaccg aaacggatca gcgcatcacc attggtctga acctgccttc 180

tggcgagatg ggccgcaaag atctgatcaa aatcgaaaat acctttttga gtgaagatca 240

agtagatcaa ctggcattgt atgcgccgca agccacggtt aaccgtatcg acaactatga 300

agtggtgggt aaatcgcgcc caagtctgcc ggagcgcatc gacaatgtgc tggtctgccc 360

gaacagcaac tgtatcagcc atgccgaacc ggtttcatcc agctttgccg tgcgaaaacg 420

cgccaatgat atcgcgctca aatgcaaata ctgtgaaaaa gagttttccc ataatgtggt 480

gctggccaat taattgcggt tggtaataaa agtctggctc cctata atg agc cag 535

Met Ser Gln

1

act ttt tac cgc tgt aat aaa gga gaa atc atg agc aaa act atc gcg 583

Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys Thr Ile Ala

5 10 15

acg gaa aat gca ccg gca gct atc ggt cct tac gta cag ggc gtt gat 631

Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln Gly Val Asp

20 25 30 35

ctg ggc aat atg atc atc acc tcc ggt cag atc ccg gta aat ccg aaa 679

Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val Asn Pro Lys

40 45 50

acg ggc gaa gta ccg gca gac gtc gct gca cag gca cgt cag tcg ctg 727

Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg Gln Ser Leu

55 60 65

gat aac gta aaa gcg atc gtc gaa gcc gct ggc ctg aaa gtg ggc gac 775

Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys Val Gly Asp

70 75 80

atc gtt aaa act acc gtg ttt gta aaa gat ctg aac gac ttc gca acc 823

Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp Phe Ala Thr

85 90 95

gta aac gcc act tac gaa gcc ttc ttc acc gaa cac aac gcc acc ttc 871

Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn Ala Thr Phe

100 105 110 115

ccg gca cgt tct tgc gtt gaa gtt gcc cgt ctg ccg aaa gac gtg aag 919

Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys Asp Val Lys

120 125 130

att gag atc gaa gcg atc gct gtt cgt cgc taa tcttgatgga aatccgggct 972

Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

135 140

atcatgcccg gattaagtct gatgacaaac gcaaaatcgc ctgatgcgct acgcttatca 1032

ggcctacgtg attcctgcaa tttattgaat ttgttggccg gataaggcat ttacgccgca 1092

tccggcatga acaaaactca ctttgtctac aatctgaatc ggggctatcg tgcccagttt 1152

attctttatt gccagccgta acgacggcta tagaaccctt tcaccaactg ggttaatgtc 1212

atataccctg ccagaatcgc aaccagccac gggaaatagc ttaacggcag cgcctgtaat 1272

tgcagataac tggccagcgg tgaaaacggc aatgcgatcc cgacaatcat cacgatcacg 1332

gtcatgatca ttaacggcca cgatgcacag ctctgaataa acggcacacg gcgggtgcgg 1392

atcatatgca caatcagcgt ttgcgacagt aagcccacca caaaccatcc cgactggaac 1452

agcgtttgcg tttccggcgt gttggcatgg aatacccacc acatcaggca aaacgtcaaa 1512

atatcgaaga tcgagctgat cggtccgaag aagatc 1548

<210>10

<211>141

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>10

Met Ser Gln Thr Phe Tyr Arg Cys Asn Lys Gly Glu Ile Met Ser Lys

1 5 10 15

Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Val Gln

20 25 30

Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln Ile Pro Val

35 40 45

Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala Gln Ala Arg

50 55 60

Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Leu Lys

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp Leu Asn Asp

85 90 95

Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr Glu His Asn

100 105 110

Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg Leu Pro Lys

115 120 125

Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg

130 135 140

Claims

1.使用能生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌制备L-苏氨酸的方法，其特征在于，

a)将细菌接种到至少第一种营养培养基中，并培养，

c)将步骤b)的连续培养过程中的碳源浓度调节到不超过30g/l。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的培养步骤(a)是通过分批方法完成的。

3.根据权利要求1的方法，其中所述的培养步骤(a)是通过补料分批方法完成的，采用了至少一种附加的营养培养基。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其中形成的L-苏氨酸是纯化的。

5.根据权利要求1、2或3的方法，其中在步骤(b)中，首先使从培养物中取出的生物量达到至少90％的程度，然后使取出的水达到至少90％的程度。

6.根据权利要求1或2的方法，其中所述的另一种或另外几种营养培养基是在开始分批方法＞0-20小时后补加。

7.根据权利要求1或3的方法，其中所述的另一种或另外几种营养培养基是在开始补料分批方法＞0-80小时后补加。

8.根据权利要求1的方法，其中所述的碳源是一种或多种选自下述的化合物：蔗糖、甜菜或蔗糖的糖蜜、果糖、葡萄糖、淀粉水解物、纤维素水解物、***糖、麦芽糖、木糖、醋酸、乙醇和甲醇。

9.根据权利要求1的方法，其中所述的氮源是一种或多种选自蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素的有机含氮物质或物质混合物，和/或一种或多种选自氨、含铵盐和硝酸盐的无机化合物。

10.根据权利要求9的方法，其中所述的含铵盐和硝酸盐是硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、硝酸钾和硝酸钾钠。

11.根据权利要求1的方法，其中所述的磷源是磷酸或其聚合物或植酸或其碱金属或碱土金属盐。

12.根据权利要求11的方法，其中所述的磷酸碱金属盐是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。

13.根据权利要求1的方法，其中一条或几条取料流的速度与补料流或补料流总量的80％-120％、90％-110％相对应。

14.根据权利要求1的方法，其中相对于补料流或补料流总量，同时或以时间交替的方式开始取出。

15.根据权利要求1的方法，其中所述的肠杆菌科细菌是大肠杆菌物种。

16.根据权利要求1的方法，其中所述的肠杆菌科细菌含有至少一个thrA基因或等位基因，其能编码苏氨酸-不敏感的天冬氨酸激酶I一高丝氨酸脱氢酶I。

17.根据权利要求1的方法，其中所述的肠杆菌科细菌含有选自下述的终止密码子：opal、ochre和amber，优选在rpoS基因中的amber，和选自下述的t-RNA抑制基因：opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，优选amber抑制基因。

18.根据权利要求1的方法，其中以相对应于小于30小时、小于25、小于20小时的平均停留时间的速度，补加补料流或补料流总量。

19.根据权利要求1的方法，其中调节补加的一种或几种营养培养基，使磷/碳比(P/C比)不超过4；不超过3；不超过2；不超过1.5；不超过1；不超过0.7；不超过0.5；不超过0.48；不超过0.46；不超过0.44；不超过0.42；不超过0.40；不超过0.38；不超过0.36；不超过0.34；不超过0.32；或不超过0.30。

20.根据权利要求1的方法，其中为取出的培养液提供氧气或含氧的气体，直到碳源的浓度降至小于2g/l、小于1g/l或小于0.5g/l。

21.根据权利要求17的方法，其中形成的L-苏氨酸是纯化的。

22.根据权利要求17的方法，其中在步骤(b)中，首先使从培养物中取出的生物量达到至少90％的程度，然后使取出的水达到至少90％的程度。

23.根据权利要求1、2或3的方法，其中将培养过程中的碳源浓度调节至不超过20、10或5g/l。

24.根据权利要求1、2或3的方法，其中将培养过程中的碳源浓度调节至不超过5或2g/l。

25.根据权利要求23或24的方法，其中将培养过程中的碳源浓度调节至不超过5g/l。

26.根据权利要求23或24的方法，其中将培养过程中的碳源浓度调节至不超过2g/l。

27.根据权利要求1、2或3的方法，其中在采用的碳源的基础上，形成的L-苏氨酸的产率是至少31％。

28.根据权利要求1、2或3的方法，其中在采用的碳源的基础上，形成的L-苏氨酸的产率是至少37％。

29.根据权利要求1、2或3的方法，其中在采用的碳源的基础上，形成的L-苏氨酸的产率是至少42％。

30.根据权利要求1、2或3的方法，其中以至少1.5-2.5g/l/h的空间/时间产量形成L-苏氨酸。

31.根据权利要求1、2或3的方法，其中以至少2.5至大于3.5g/l/h的空间/时间产量形成L-苏氨酸。

32.根据权利要求1、2或3的方法，其中以至少3.5-5.0g/l/h的空间/时间产量形成L-苏氨酸。

33.根据权利要求1的方法，其中在培养步骤(a)中使用补料分批方法，且其中以至少5.0至大于8.0g/l/h的空间/时间产量形成L-苏氨酸。

34.大肠杆菌K-12的能利用蔗糖的转化接合子，其作为DSM16293保藏在Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen[德国微生物和细胞培养物中心](Braunschweig，Germany)。

35.根据权利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株：

b)选自下述的终止密码子：opal、ochre和amber，优选在rpoS基因中的amber，和选自下述的t-RNA抑制基因：opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因。

36.根据权利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株：

b)在好氧培养条件下，不能分解苏氨酸，

c)至少部分需要异亮氨酸，和

d)在有至少5g/l苏氨酸存在下生长。

37.根据权利要求1、2或3的方法，其中使用具有至少下述特征的菌株：

b)选自下述的终止密码子：opal、ochre和amber，优选在rpoS基因中的amber，和选自下述的t-RNA抑制基因：opal抑制基因、ochre抑制基因和amber抑制基因，

d)至少部分需要异亮氨酸，和

e)在有至少5g/l苏氨酸存在下生长。

38.根据权利要求35、36或37的方法，其中使用的菌株另外含有一种或多种选自下述的特征：

38.1由pckA基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的弱化，

38.2由pgi基因编码的磷酸葡萄糖异构酶的弱化，

38.3由开放读码框ytfP编码的YtfP基因产物的弱化，

38.4由开放读码框yjfA编码的YjfA基因产物的弱化，

38.5由poxB基因编码的丙酮酸氧化酶的弱化，

38.6由开放读码框yjgF编码的YjgF基因产物的弱化，

38.7由基因pntA和pntB编码的转氢酶的增强，

38.8由pps基因编码的磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强，

38.9由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增强，

38.10由rseB基因编码的调节剂RseB的增强，

38.11由galP基因编码的半乳糖质子协同转运的增强，

38.12能使用蔗糖作为碳源的能力，

38.13由开放读码框yedA编码的YedA基因产物的增强，

38.14在有至少0.1-0.5mM或至少0.5-1mM疏螺旋体素存在下生长(疏螺旋体素抗性)，

38.15在有至少2-2.5g/l或至少2.5-3g/l二氨基琥珀酸存在下生长(二氨基琥珀酸抗性)，

38.16在有至少30-40mM或至少40-50mM α-甲基丝氨酸存在下生长(α-甲基丝氨酸抗性)，

38.17在有不超过30mM或不超过40mM或不超过50mM氟代丙酮酸存在下生长(氟代丙酮酸敏感性)，

38.18在有至少210mM或至少240mM或至少270mM或至少300mML-谷氨酸存在下生长(谷氨酸抗性)，

38.19至少部分需要甲硫氨酸，

38.20至少部分需要间二甲基庚二酸，

38.21在至少100mg/l利福平(利福平抗性)存在下生长，

38.22在至少15g/l L-赖氨酸(赖氨酸抗性)存在下生长，

38.23在至少15g/l甲硫氨酸(甲硫氨酸抗性)存在下生长，

38.24在至少15g/l L-天冬氨酸(天冬氨酸抗性)存在下生长，和

38.25由pyc基因编码的丙酮酸羧化酶的增强。