CN101063099A

CN101063099A - 利用改良的肠杆菌科菌株制备l－氨基酸的方法

Info

Publication number: CN101063099A
Application number: CN200610153423.2A
Authority: CN
Inventors: N·杜施
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2006-04-29
Publication date: 2007-10-31
Also published as: US8883458B2; DE502006009084D1; ATE502102T1; US20110053227A1; US20060257979A1; DE102005020538A1; EP1719814B1; EP1719814A1

Abstract

本发明涉及通过发酵肠杆菌科的重组微生物来制备L－氨基酸的方法，其特征在于，a)在培养基或细胞中积累所期望的L－氨基酸的条件下，在培养基中培养生产所期望的L－氨基酸的微生物，所述微生物中增强尤其是过量表达编码基因产物的yjcG－ORF或核苷酸序列或等位基因，并且b)分离所期望的L－氨基酸，其中在合适时，发酵肉汤成分和/或生物量仍旧全部或部分(从≥0至100％)留在分离的产物中或者完全被去除。

Description

利用改良的肠杆菌科菌株制备L-氨基酸的方法

本发明涉及利用肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的重组微生物菌株制备L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的方法，其中，增强表达(尤其是过表达)命名为yjcG的开放阅读框(ORF)，还涉及所述的微生物。

现有技术

L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)用于人用药和制药工业中、食品工业中，特别是用于动物营养学中。

已知L-氨基酸可通过发酵肠杆菌科菌株，尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)来制备。因为其巨大的重要意义，人们不断努力以改良制备方法。方法上的改良可以考虑所涉及的措施，这些措施涉及，发酵技术如搅拌或供氧，或者营养培养基的组成，如发酵期间的糖浓度，或产品形式的加工，如通过离子交换色谱的方式进行，或微生物本身的内在表现性质。

诱变、选择和突变体选择的方法用于改良这些微生物的性能特点。由此产生了对代谢拮抗物(如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV))有抗性的株、或具有调节重要意义的代谢物的营养缺陷型，并产生诸如L-苏氨酸的L-氨基酸。

许多年来，通过扩增单个氨基酸生物合成基因并研究对产物的影响，重组DNA方法也已经用于改良产L-氨基酸的肠杆菌科菌株了。有关大肠杆菌和沙门氏菌细胞生物学和分子生物学的汇总的信息可在Neidhardt(编)：Escherichiacoli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，第二版，ASM Press，华盛顿特区，美国(1996)中找到。

发明目的

本发明的目的在于提供用于改良L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)发酵制备的新措施。

发明内容

本发明涉及肠杆菌科的重组微生物，其包含增强或过量表达的开放阅读框yjcG或编码其基因产物的核苷酸序列，yjcG编码被注释(annotated)为乙酸通透酶的多肽，所述微生物显示出形成并积累L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的改进的能力。

在每个例子中，将没有yjcG-ORF重组的微生物用作为对比的起点，它不含任何增强的yjcG-ORF，并对其用本发明的措施进行处理。

特别地，这些重组微生物包括肠杆菌科微生物，其中编码多肽的多核苷酸被增强，所述多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少90％、尤其至少95％、优选至少98％、至少99％、尤其优选99.8％并更尤其优选100％的同一性。

所述微生物包含增强或过量表达的选自以下组的多核苷酸：

a)具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的核苷酸序列及其互补核苷酸序列的多核苷酸；

b)具有在遗传密码子简并范围内相应于SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQID No.5的核苷酸序列的多核苷酸；

c)多核苷酸序列，其具有的序列在严紧条件下与序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5的互补序列杂交，严紧条件优选通过洗涤步骤来实现，所述洗涤步骤中温度范围为64℃至68℃，缓冲液盐浓度范围为2xSSC至0.1xSSC；

d)具有序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的多核苷酸，其包含功能中性的有义突变体，

所述多核苷酸优选编码乙酸通透酶。

本发明也涉及利用肠杆菌科的重组微生物发酵制备L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)的方法，所述重组微生物尤其是已经能生产L-氨基酸的，并在其中至少增强了具有名称为yjcG的开放阅读框(ORF)或编码其基因产物的核苷酸序列。

利用所述微生物进行优选方案。

如下文所述的L-氨基酸或氨基酸，指的是一种或更多种氨基酸，包括它们的盐，所述氨基酸选自L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。尤其优选L-苏氨酸。

在上下文中，术语“增强”表示在微生物中，一种或更多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度增加，所述酶或蛋白质由相应DNA编码，例如其中，基因的拷贝数或ORF的拷贝数增加了至少一个(1)拷贝，利用与基因可操作相连的强启动子、或编码相应具有高活性的酶或蛋白质的基因或等位基因或ORF，而且在合适时，这些措施可组合使用。

编码或能编码现有技术所不能确定任何功能的蛋白质和/或多肽或核糖核酸的核苷酸序列片断被命名为开放阅读框(ORF)。所讨论的核苷酸序列片段的功能明确后，该片断一般被称为基因。等位基因一般被认为是特定基因的可选形式。这些形式可通过核苷酸序列的不同而区分。

一般来说，由核苷酸序列，即ORF、基因或等位基因所编码的蛋白质或核糖核酸称为基因产物。

根据野生型蛋白质的或根据亲本株或微生物的蛋白质的活性或浓度，所述株或微生物没有针对相应酶或蛋白质重组，增强措施，尤其是过量表达，一般增加相应蛋白质的活性或浓度至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最大至1000％或2000％。非重组微生物或亲本株被认为是在其中实施本发明所述措施的微生物。

本发明涉及通过发酵肠杆菌科的重组微生物来制备L-氨基酸的方法，其特征在于，

a)在培养基或细胞中积累所期望的L-氨基酸的条件下，在培养基中培养产生所期望的L-氨基酸的微生物，在所述微生物中增强(尤其是过量表达)开放阅读框yjcG或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因，并且

b)分离所期望的L-氨基酸，其中在合适时，发酵肉汤成分和/或生物量仍旧全部或部分(从≥0至100％)留在分离的产物中或者完全被去除。

具有增强或过量表达的被称为yjcG的开放阅读框(ORF)的微生物，尤其是同样为本发明主题的一部分的重组微生物，能够从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、合适的淀粉和合适的纤维素或甘油和乙醇中产生L-氨基酸。该微生物是肠杆菌科的代表，并选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属(Serratia)。优选埃希氏杆菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏杆菌属的例子中，尤其指的是大肠杆菌菌种，而在涉及到沙雷氏菌属时，尤其指的是粘质沙雷氏杆菌菌种。

一般来说，用含所期望ORF、所期望基因、该ORF或基因的等位基因或其部分的载体，和/或强化ORF或基因表达的启动子，通过转化、转导或接合或者这些方法组合，来产生重组微生物。该启动子可以是由位于基因或ORF上游的内源调节序列通过增强突变而产生的启动子；或者，已将高效启动子与基因或ORF融合。

将要提及的埃希氏杆菌属(尤其是大肠杆菌菌种)菌株，尤其是适合作为产生L-苏氨酸的亲本株的例子为：

-大肠杆菌H4581(EP0301572)

-大肠杆菌KY10935(Bioscience Biotechnology and Biochemistry61(11)：1877-1882(1997))

-大肠杆菌VNII基因型MG442(US-A-4278,765)

-大肠杆菌WNII基因型M1(US-A-4,321,325)

-大肠杆菌VNII基因型472T23(US-A-5,631,157)

-大肠杆菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)

-大肠杆菌cat 13(WO 98/04715)

-大肠杆菌KCCM-10132(WO 00/09660)

将要提及的产L-苏氨酸的沙雷氏菌属(尤其是粘质沙雷氏杆菌菌种)菌株，适合作为亲本株的例子为：

-粘质沙雷氏杆菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology 38(6)：1045-1051(1979))

-粘质沙雷氏杆菌TLr156(Gene 57(2-3)：151-158(1987))

-粘质沙雷氏杆菌T-2000(Applied and Biochemistry and Biotechnology37(3)：255-265(1992))

产L-苏氨酸的肠杆菌科菌株优选其中具有一种或更多种选自以下组的基因或表型特征：α-氨基-β-羟戊酸抗性、硫代赖氨酸抗性、乙基硫氨酸抗性、α-甲基丝氨酸抗性、二氨基琥珀酸抗性、α-氮基丁酸抗性、疏螺旋体素抗性、环戊烷羧酸抗性、利福平抗性、诸如缬氨酸氧肟酸酯的缬氨酸类似物抗性、诸如6-二甲基氨基嘌呤的嘌呤类似物抗性，需要L-甲硫氨酸，可能部分和可补偿地需要L-异亮氨酸，需要内消旋二氨基庚二酸，有关含苏氨酸二肽的营养缺陷型，L-苏氨酸抗性，苏氨酸残液抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性、L-甲硫氨酸抗性、L-谷氨酸抗性、L-天冬氨酸抗性、L-亮氨酸抗性、L-苯丙氨酸抗性、L-丝氨酸抗性、L-半胱氨酸抗性、L-缬氨酸抗性、氟丙酮酸敏感性，苏氨酸脱氢酶缺陷，可能的利用蔗糖能力，增强苏氨酸操纵子，增强高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I，优选反馈抑制型，增强高丝氨酸激酶，增强苏氨酸合酶，增强天冬氨酸激酶，可能是反馈抑制型，增强天冬氨酸半醛脱氢酶，增强磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，可能是反馈抑制型，增强磷酸烯醇丙酮酸合酶，增强转氢酶，增强RhtB基因产物，增强RhtC基因产物，增强YfiK基因产物，增强丙酮酸羧化酶和减少乙酸形成。

已经发现，基因或开放阅读框(ORF)yjcG或其等位基因过量表达后，肠杆菌科微生物显示出形成并积累L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸的改良的能力。

大肠杆菌基因或开放阅读框(ORF)的核苷酸序列属于现有技术，能从由Blattner等(Science 277：1453-1462(1997))公开的大肠杆菌基因组序列中获得。已知，内源酶(甲硫氨酸氨肽酶)能裂解N-末端的氨基酸甲硫氨酸。

也已经公开了来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的核苷酸序列(登录号：NC_003197(区域4511508-4513157))和弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)的核苷酸序列(登录号：NC_004337(区域4293843-4295492))，其同样属于肠杆菌科。

大肠杆菌K12的yjcG-ORF如以下数据中的内容所述：

Gimenez等(Journal of Microbiology 185(21)：6448-55(2003))描述了大肠杆菌开放阅读框yjcG，其编码来自溶质的具有乙酸通透酶功能的蛋白质：钠同向输送体(SSS)家族，其基因名称为actP；该基因与acs共转录，其编码乙酰辅酶A合成酶；通透酶对于短链脂肪族单羧酸是高度特异的，除了乙酸，也能转运足够生长所需量的乙醇酸，以及诸如丙酸的小羧酸。

登录号：NC000913(区域4281276-4282925)

可选的基因名称：b4067，actP

核酸序列可从属于国家医学图书馆(Bethesda，MD，美国)的国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库、欧洲分子生物实验室(EMBL，Heidelberg，德国或剑桥，英国)的核酸序列数据库或日本DNA数据库(DDBJ，Mishima，日本)中获得。

为了更清楚，大肠杆菌yjcG-ORF的已知核苷酸序列被描述为SEQ ID No.1，鼠伤寒沙门氏菌或弗氏志贺氏菌yjcG-ORF的已知核苷酸序列分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.5。由这些阅读框编码的蛋白质被描述为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4和SBQ ID No.6。

文中所述的开放阅读框可根据本发明而使用。另外，可以用基因或开放阅读框的等位基因，其由遗传密码子的简并性产生或作为功能中性突变的共同序列。优选利用内源基因或内源开放阅读框。

“内源基因”或“内源核苷酸序列”被认为是存在于种群中的基因或开放阅读框或等位基因或核苷酸序列。

含功能中性突变的yjcG-ORF等位基因包括在它们编码的蛋白质中的造成至多60或至多50或至多40或至多30或至多20、优选至多10或至多5、更尤其优选至多3或至多2、或至少1个保守氨基酸替换的那些突变。

对于芳香族氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸互相替换时，所述替换为保守的。对于疏水氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸互相替换时，所述替换为保守的。对于极性氨基酸，谷氨酰胺和天冬酰胺互相替换时，所述替换为保守的。对于碱性氨基酸，精氨酸、赖氨酸和组氨酸互相替换时，所述替换为保守的。对于酸性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸互相替换时，所述替换为保守的。对于含羟基的氨基酸，丝氨酸和苏氨酸互相替换时，所述替换为保守的。

同样方式，也可以用编码所述蛋白质变体的核苷酸序列，所述变体额外包含延伸或截短至少一个(1)在N末端或C末端的氨基酸。该延伸或截短量不超过60、50、40、30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸残基。

合适的等位基因也包括编码其中***或缺失至少一个(1)氨基酸的蛋白质的那些等位基因。这些改变(被称为***缺失(indel))的最大数量可以影响到2、3、5、10、20个氨基酸，但决不超过30个氨基酸。

合适的等位基因进一步包括可通过杂交获得的那些等位基因，尤其是在严紧条件下利用SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5或其部分(尤其是编码区或其互补序列)来杂交。

普通技术人员可在以下文献中找到通过杂交鉴定DNA序列的说明：Boehringer Mannheim GmbH提供的手册“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”(Mannheim，德国，1993)和Liebl等(InternationalJournalof Systematic Bacteriology 41：255-260(1991)。杂交在严紧条件下进行，即形成的杂交物仅仅是探针与靶序列(即用探针处理的多核苷酸)有至少80％同一性的那些。已知，包括洗涤步骤的杂交的严紧性，由改变缓冲液组成、温度和盐浓度来影响和/或决定的。一般来讲，杂交反应在与洗涤步骤相比较低的严紧性下进行(Hybaid Hybridization Guide，Hybaid有限公司，Teddington，英国，1996)。

例如，相应于5xSSC缓冲液的缓冲液可在约50℃-68℃的温度下用于杂交反应。在这些条件下，探针也能同多核苷酸杂交，所述多核苷酸与探针序列具有少于70％的同一性。这些杂交物稳定性较差，在严紧条件下通过洗涤而去除。例如，通过将盐浓度降到2xSSC并在合适时降到0.5xSSC(The DIG System User’sGuide for Filter Hybridization，Boehringer Mannheim，Mannheim，德国，1995)，将温度调节到约50℃-68℃、约52℃-68℃、约54℃-68℃、约56℃-68℃、约58℃-68℃、约60℃-68℃、约62℃-68℃、约64℃-68℃、约66℃-68℃来实现。优选温度范围为约64℃-68℃或约66℃-68℃。合适时可以将盐浓度降到0.2xSSC或0.1xSSC。通过从50℃至68℃逐步增加杂交温度，每步约1-2℃，可以分离多核苷酸片断，例如与所用的探针序列或与如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少80％、或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的多核苷酸片段。其他杂交说明可通过商业途径以试剂盒(如，Roche Diagnostics GmbH的DIG Easy Hyb，Mannheim，德国，目录号1603558)的形式来获得。

例如为了达到增强效果，可以增加基因或开放阅读框或等位基因的表达，或增强蛋白质的催化性能。合适时可将两种措施组合使用。

例如为了达到过量表达，可以增加相应基因或开放阅读框的拷贝数，或可突变位于结构基因上游的启动子区和调节区或核糖体结合位点。整合在结构基因上游的表达盒以相同方式起作用。也可在用诱导型启动子发酵生产L-苏氨酸的过程中增加表达；另外，利用启动子用于表达基因，其允许不同时期的基因表达，这也是有益的。在基因表达的翻译调节水平上，可增加起始(核糖体与mRNA结合)频率或延伸率(延伸阶段)。通过延长mRNA生命期的措施同样能提高表达。另外，通过防止酶蛋白被降解也能增强酶活性。ORF、基因或基因构建体可存在于带有不同拷贝数的质粒中，或在染色体中整合并扩增。或者，有关基因的过量表达可通过改变培养基组成或培养方式来实现。

过量表达的方法在现有技术中已有详尽的描述，例如Makrides等(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))。用载体将拷贝数增加至少一个(1)拷贝。所用载体可以是诸如US5538873中所述的质粒。所用载体也可以是诸如EP0332448中所述的噬菌体Mu或噬菌体lambda(λ)的噬菌体。也可通过在染色体其他位点中整合额外的拷贝来增加拷贝数，例如整合在噬菌体λ的att位点(Yu和Court，Gene 223，77-81(1998))。US5939307报告了可以通过例如在染色体苏氨酸操纵子的上游整合表达盒或启动子来增加表达，如tac启动子、trp启动子、lpp启动子、或噬菌体λ的P_L启动子或P_R启动子。以相同方式，也可以使用噬菌体T7启动子、变速箱启动子或nar启动子。这些表达盒或启动子也可如EP0593792所述，用于过量表达质粒结合基因。依次使用lacI^Q等位基因使控制质粒结合基因的表达成为可能(Glascock和Weickert，Gene223，221-231(1998))。进一步，通过一个或更多核苷酸的替换、通过***和/或缺失来修饰它们的序列可增加启动子的活性。不同时期的基因的表达可如Walker等(Journal of Bacteriology 181：1269-80(1999))所述的，通过用依赖于生长阶段的fis启动子来实现。延伸率受密码子利用率的影响；利用亲本菌株中常见的tRNA密码子来增强基因表达。

普通技术人员可尤其参考Chang和Cohen(Journal of Bacteriology 134：1141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene 13：347-353(1981))、Amann和Brosius(Gene 40：183-190(1985))、de Broer等(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 80：21-25(1983))、LaVallie等(BIO/TECHNOLOGY 11：187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosa等(Plasmid 26：222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80：161-169(1989))、Hamilton等(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58：191-195(1998))和已知的遗传学和分子生物学教科书来找到有关的一般性说明。

可用的能够在肠杆菌科中复制的质粒载体，如pACYC184衍生的克隆载体(Bartolomé等；Gene 102：75-78(1991))、pTrc99A(Amann等；Gene 69：301-315(1988))或pSC101衍生物(Vocke和Bastia；Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 80(21)：6557-6561(1983))。在根据本发明的方法中，可利用质粒载体转化的株，所述质粒载体至少带有yjcG-ORF或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因。

术语“转化”被理解为指宿主(微生物)摄取分离的核酸。

也可用序列交换(Hamilton等；Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))、接合或转导来转移突变，其影响给定基因或开放阅读框在不同株中表达。

更详细的遗传学和分子生物学概念解释可以在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到，如Birge的教科书(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，Springer Verlag，纽约(美国)，2000)或Berg、Tymoczko和Stryer的教科书(Biochemistry，第5版，Freeman and Company，纽约(美国)，2002)或Sambrook等的手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(3卷本)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(美国)，2001)。

进一步，当使用肠杆菌科菌株生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸时，除了增强开放阅读框yjcG之外，增强已知苏氨酸生物合成途径的一种或更多种酶、或添补代谢(anaplerotic metabolism)的酶、或用于产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶、或糖酵解酶、或PTS酶、或硫代谢酶也是有益的。一般优选使用内源基因。

因此，例如，可同时增强(尤其过量表达)一个或更多选自以下组的基因

·thrABC操纵子的至少一个基因，其编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶(US-A-4278765)，

·编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒状杆菌pyc基因(WO 99/18228)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and General Genetics231(2)：332-336(1992)；WO 97/08333)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)，

·pntA和pntB基因，其编码转氢酶的亚基(European Journal ofBiochemistry 158：647-653(1986)；WO 95/11985)，

·rhtC基因，其编码苏氨酸抗性介导蛋白(EP-A-1013765)，

·编码苏氨酸的输出载体蛋白的谷氨酸棒状杆菌thrE基因(WO 01/92545)，

·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 11：5257-5266(1983)；Gene 23：199-209(1983)；DE19907347)，

·ptsHIcrr操纵子ptsH基因，其编码PTS磷酸转移酶***的磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶(WO 03/004674)，

·ptsHIcrr操纵子ptsI基因，其编码PTS磷酸转移酶***的酶I(WO03/004674)，

·ptsHIcrr操纵子crr基因，其编码PTS磷酸转移酶***的葡萄糖特异性IIA成分(WO 03/004674)，

·ptsG基因，其编码葡萄糖特异性IIBC成分(WO 03/004670)，

·编码半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，

·cysB基因，其编码cys调节子的调节蛋白(WO 03/006666)，

·cysJIH操纵子的cysJ基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶黄素蛋白(WO03/006666)，

·cysJIH操纵子的cysI基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶血红素蛋白(WO03/006666)，

·编码腺苷酰硫酸还原酶的cysJIH操纵子的cysH基因(WO 03/006666)，

·sucABCD操纵子的sucA基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基(WO03/008614)，

·sucABCD操纵子的sucB基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酰转琥珀酸酶E2亚基(WO 03/008614)，

·sucABCD操纵子的sucC基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基(WO03/008615)，

·sucABCD操纵子的sucD基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基(WO03/008615)，

·大肠杆菌开放阅读框(ORF)yibD(国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国，DE102004005836.9)的登录号AE000439)的基因产物，和

·基因acs，其编码乙酰辅酶A合成酶(Journal of Bacteriology 177(10)：2878-86(1995))。

进一步，为了产生L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)，除增强开放阅读框yjcG之外，衰减，尤其是消除或减少一个或更多选自以下组的基因的表达可能是有益的：

·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 169：4716-4721(1987))，

·编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives inMicrobiology 149：36-42(1987))，

·大肠杆菌yjfA开放阅读框(ORF)(国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)的登录号AAC77180)的基因产物(WO 02/29080)，

·大肠杆菌ytfP开放阅读框(ORF)(国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)的登录号AAC77179)的基因产物(WO 02/29080)，

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，

·dgsA基因(WO 02/081721)，又名mlc基因，其编码磷酸转移酶***的DgsA调节蛋白，

·fruR基因(WO 02/081698)，又名cra基因，其编码果糖抑制蛋白，

·rpoS基因(WO 01/05939)，又名katF基因，其编码Sigma³⁸因子，和

·编码天冬氨酸铵裂解酶的aspA基因(WO 03/008603)。

在本文中，术语“衰减”表示在微生物中，减少或消除一种或更多种酶或蛋白质的细胞内活性或浓度，所述酶或蛋白质由相应DNA编码，例如通过，比在没有重组相应酶或蛋白质的亲本株或微生物中更弱的启动子，或编码相应具有较低活性的酶或蛋白质的基因或等位基因，或失活相应酶或蛋白质、或开放阅读框或基因，而且在合适时，这些措施可组合使用。

一般，衰减措施将相应蛋白的活性或浓度降低至野生型蛋白质的活性或浓度或没有重组的相应酶或蛋白质的亲本株或微生物的蛋白质活性或浓度的0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。不是重组体的亲本株或微生物理解为对其实施本发明所述措施的微生物。

例如为了达到衰减目的，可减少或消除基因或开放阅读框的表达、或酶蛋白的催化性质。在合适时，这两个措施可组合使用。

可通过以合适的方式进行培养，通过基因改变(突变)基因表达的信号结构或通过反义RNA技术，来减少基因表达。例如，基因表达的信号结构是抑制子基因、活化子基因、操纵子基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。普通技术人员能参考诸如Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58：191-195(1998))、Carrier和Keasling(BiotechnologyProgress 15：58-64(1999))、Franch和Gerdes(Current Opinion inMicrobiology 3：159-164(2000)和遗传学和分子生物学的已知教科书，如Knippers的教科书(“Molekulare Genetik[Molecular Genetics]”，第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1995)或Winnacker的(“Gene und Klone[Genes and Clones]”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)，来找到这方面的信息。

导致酶蛋白的催化性质改变或减少的突变在现有技术中是已知的。所述的例子有Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))、Yano等(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 95：5511-5515(1998))和Wente和Schachmann(Journal of Biological Chemistry 266：20833-20839(1991))的文章。综述可以在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Hagemann的(“Allgemeine Genetik[General Genetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

需要关注的突变是转换、颠换、***和缺失至少一个(1)碱基对或核苷酸。根据突变引起的氨基酸替换对酶活性的影响，针对错义突变或无义突变制作参照。错义突变造成用不同的氨基酸，尤其用非保守的氨基酸替换蛋白质中的给定的氨基酸。由此损害蛋白质的功能性能或活性，并将其值减少至从0至75％、0至50％、0至25％、0至10％、或0至5％。无义突变造成在基因编码区中的终止密码子，并因此使翻译未成熟就终止。在基因中***和缺失至少一个碱基对造成阅读框偏移突变，其反过来导致掺入不正确的氨基酸或翻译在未成熟前终止。如果终止密码子在编码区中作为突变的共同序列而形成，此后也会导致翻译在未成熟前终止。缺失至少一个(1)或更多密码子也通常会导致酶活性的完全丧失

产生这些突变的方法属于现有技术，可从遗传学和分子生物学的已知教科书中获得，例如Knippers的教科书(“Molekulare Genetik[MolecularGenetics]”，第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1995)或Winnacker的(“Gene und Klone[Genes and Clones]”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的(“Allgemeine Genetik[GeneralGenetics]”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

基因中合适的突变可通过基因或等位基因交换来整合进合适的菌株中。通常的方法如Hamilton等(Jorurnal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))所描述的利用条件复制pSC101衍生的pMAK705的基因交换的方法。也可用现有技术中所述的其它方法，如Martinez-Morales等的方法(Journal ofBacteriology 181：7143-7148(1999))或Boyd等的方法(Journal ofBacteriology 182：842-847(2000))。

通过接合或转导同样可以将有关基因中的突变、或影响有关基因或开放阅读框的突变转移进不同的菌株。

进一步，为了产生L-氨基酸(尤其是L-苏氨酸)，除了增强开放阅读框yjcG之外，消除不希望的副反应也是有益的(Nakayama：“Breeding of Amino AcidProducing Microorganisms”，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编)，Academic Press，伦敦，英国，1982)。

分离的细菌的性能或利用这些细菌的发酵方法的性能，在选自下组的一个或更多有关参数方面得到改良，这些参数选自产物浓度(单位体积的产物)、产物产量(单位消耗的碳源所产生的产物)和产物形成(单位体积和时间所形成的产物)，或其他的方法参数及其组合，基于非重组微生物或亲本株或利用该微生物或亲本株发酵的方法，所述改良至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。

根据本发明制备的微生物可以分批方法、以分批投料方法、以重复分批投料方法或以连续方法来培养(DE102004028859.3或US5763230)。已知的培养方法的综述见于Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction tobioprocess technology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactorsand peripheral installations](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994)。

所用的培养基需以合适的方式符合给定株的要求。美国细菌学学会手册“Manual of Methods for General Bacteriology”(华盛顿特区，美国，1981)包含了培养各种微生物的培养基的叙述。

糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和合适的纤维素、油和脂肪(如豆油、向日葵油、花生油和椰子脂肪)、脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(如甘油和乙醇)、和有机酸(如乙酸)，可用作为碳源。这些物质可单独或作为混合物来使用。例如，如EP1225230所述，葡萄糖和果糖的混合物可以为约1∶1的比率。

含氮的有机化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、黄豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可用作为氮源。氮源可单独或作为混合物来使用。

磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应的含钠盐，可用作为磷源。另外，培养基必须包含金属盐，如生长所需的硫酸镁或硫酸铁。最后，必需的生长启动物质，如氨基酸和维生素，可使之添加到上述物质中。合适的前体也可加入培养基中。所述成分可以一次性混合物的或在培养期间合适投料的形式加入培养基中。

发酵一般在5.5至9.0的pH中进行，尤其是在6.0至8.0。碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨气或氨水、或酸性化合物，如磷酸或硫酸，以合适的方式用于控制培养基的pH。防沫剂，如脂肪酸聚乙二醇醚，可用于控制泡沫。合适选择的作用物质，如抗生素，可添加到培养基中以保持质粒的稳定性。氧或含氧气体混合物，如空气，通入培养物以保持需氧条件。培养温度通常为25℃至45℃，优选30℃至40℃。微生物的活动造成在培养肉汤中积累L-氨基酸。持续培养直至形成最大量的L-氨基酸或L-苏氨酸。该目的通常在10至160小时内达到。

可以从已取出的培养肉汤中分离、收集或浓缩L-氨基酸，然后在合适时纯化。离子交换色谱和结晶是纯化L-氨基酸的典型方法。这些方法形成高度纯化的L-氨基酸。

从培养肉汤(发酵肉汤)制备产物也是可能的，肉汤经过去除处理，完全(100％)或几乎完全地，即多于或大于(＞)90％)，除去了存在于培养肉汤中细菌生物量，而将发酵肉汤中很大程度上，即30％-100％，优选大于等于(≥)50％、≥70％或≥90％或全部(100％))的剩余组分留在产物中。

分离方法，如离心、过滤、倾析或絮凝或其组合，用于去除或分离掉生物量。

然后用已知方法，如用旋转蒸发器、薄层蒸发器或降层蒸发器，通过反渗透或通过纳米过滤，或这些方法的组合，来浓缩或聚集剩下的肉汤。

然后处理该浓缩的肉汤，优选利用冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾制粒、或利用其他方法处理成能流动的、粉碎的粉末。然后利用合适的压缩或制粒方法顺序将该能流动的、粉碎的粉末转化成粗粒化的、易流动的、能储存的并最大程度无尘的产物。接着去除总量超过90％的水，以使产物中的水分少于10％、少于5％或少于3％。

如Spackman等(Ahalytical Chemistry 30：1190-1206(1958))所述的，通过阴离子交换色谱并接着用茚三酮衍生化来分析L-氨基酸，或如Lindroth等(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))所述的，通过反相HPLC来进行。

根据本发明的方法可用于发酵制备L-氨基酸，如L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸，尤其是L-苏氨酸。

下面通过实施例来更详尽地解释本发明。

用于大肠杆菌的基本(M9)和完全(LB)培养基如J.H.Miller(A shortcourse in bacterial genetics(1992)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述。从大肠杆菌分离质粒DNA以及用Klenow磷酸酶和碱性磷酸酶限制性酶切、连接和处理的所有技术，如Sambrook等(Molecular Cloning-A LaboratoryManual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述采进行。除非另有说明，大肠杆菌如Chung等((Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 86：2172-2175(1989))所述来转化。

制备菌株和转化株时的孵育温度为37℃。

实施例1

构建表达质粒pMW218yjcG

利用聚合酶链式反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增E.coli K12 yjcG-ORF。根据E.coli K12 MG1655中yjcG基因的核苷酸序列(登录号NC000913(区域4281276-4282925)，Blattner等，(Science 277：1453-1474(1997))合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，德国)。修饰引物序列以形成限制酶识别位点。对于yjcG-1引物，选择HindIII识别序列，对于yjcG-2引物，选择SacI识别位点，这些序列在以下所示核苷酸序列中用下划线表示：

yjcG-1：

5’-GATC AAGCTTATCCGGCCTACATTCG-3’(SEQ ID No.7)

yjcG-2：

5’-GATCTA GAGCTCGATTAATGCGCGCGGCCTT-3’(SEQ ID No.8)

根据生产商的说明书，用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德国)分离用于PCR的E.coli K12 MG1655染色体DNA。在标准PCR条件下(Innis等(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress)，利用Vent DNA聚合酶(New England Biolaps GmbH，Frankfurt，德国)和特异引物扩增出约2084bp大小的DNA片断(SEQ ID No.9)。

根据生产商的说明书，将扩增的yjcG与载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero TOPOTA克隆试剂盒，Invitrogen，Groningen，荷兰)连接，并转化入E.coli TOP10株。在含50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选出含质粒的细胞。分离出质粒DNA之后，用PvuI和HindIII/SacI酶来酶切载体，酶切片断在0.8％琼脂糖凝胶上检验，然后将其命名为pCRBluntyjcG。

然后用HindIII和SacI酶来酶切载体pCRBluntyjcG，在0.8％琼脂糖凝胶上分离yjcG片断；然后从凝胶中分离(QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAGEN，Hilden，德国)并与低拷贝载体pMW218(Nippon Gene，Toyama，日本)连接，所述载体用HindIII和SacI酶来消化。用连接混合物转化E.coli DH5α株(Grant等；Proceedings of the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)，并在含50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选出含质粒的细胞。

质粒DNA分离后，通过用EcoRI/SalI酶进行对照酶切来确证克隆是否成功。

质粒被命名为pMW218yjcG(图1)。

实施例2

利用MG442/pMW218yjcG株制备L-苏氨酸

产L-苏氨酸的E.coli MG442株在US-A-4278765的专利说明书中有描述，并保藏于俄国国家工业微生物保藏中心(VKPM，莫斯科，俄国)，保藏号为CMIMB-1628。

用实施例1所述的表达质粒pMW218yjcG以及载体pMW218转化MG442株，在含50μg卡那霉素/ml的LB琼脂上选出含质粒的细胞。由此产生MG442/pMW218yjcG和MG442/pMW218株。然后在基本培养基上进一步繁殖选出的单个克隆，所述培养基具有以下组成：3.5g Na₂HPO₄*2H₂O/l，1.5g KH₂PO₄/l，1g NH₄Cl/l，0.1g MgSO₄*7H₂O/l，2g葡萄糖/l，20g琼脂/l，50mg卡那霉素/l。在100ml锥形烧瓶中的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种以下组成的10ml预培养基：2g酵母提取物/l，10g(NH₄)₂SO₄/l，1g KH₂PO₄/l，0.5gMgSO₄*7H₂O/l，15g CaCO₃/l，20g葡萄糖/l，50mg卡那霉素/l，并在KühnerAGESR培养箱(Birsfelden，瑞士)在37℃以180rpm培养16小时。在每种情况下，将250μl该预培养物接种进10ml生产培养基(25g(NH₄)₂SO₄/l，2g KH₂PO₄/l，1g MgSO₄*7H₂O/l，0.03g FeSO₄*7H₂O/l，0.018g MnSO₄*1H₂O/l，30g CaCO₃/l，20g葡萄糖/l，50mg卡那霉素/l)中，并在37℃培养48小时。培养后，利用Dr.LangeLP2W光度计(Düsseldorf，德国)在660nm波长处测定培养悬浮液的光密度(OD)。

然后通过离子交换色谱和涉及茚三酮检测的柱后反应，使用Eppendorf-BioTronik氨基酸分析仪(汉堡，德国)来确定培养上清液中得到的L-苏氨酸的浓度，所述培养上清液已通过过滤灭菌。

实验结果如表1所示。

表1

株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l
株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l	MG442/pMW218	6.4	2.15
MG442/pMW218yjcG	5.5	2.5	MG442/pMW218	6.4	2.15

附图简述：

图1：含yjcG基因的质粒MW218yjcG的图谱

长度说明应视为约数。所用的缩写和名称有以下意义：

·kan：编码卡那霉素抗性的基因

·yjcG：yjcG基因的编码区

·lacZ′：编码β-半乳糖苷酶的α-肽的基因片断

限制酶的缩写有以下意义：

·EcoRI：来自大肠杆菌(Escherichia coli)的限制性内切酶

·HindIII：来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的限制性内切酶

·SacI：来自不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)的限制性内切酶

·SalI：来自白色链霉菌(Streptonyces albus)的限制性内切酶

序列表

<110>Degussa AG

<120>利用改良的肠杆菌科菌株制备L-氨基酸的方法

<130>050061BT

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1650

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1650)

<223>yjcG编码区

<400>1

atg aaa aga gtt ctg acg gcg ctt gcc gcc aca ctc cct ttc gca gct 48

Met Lys Arg Val Leu Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Pro Phe Ala Ala

1 5 10 15

aac gcc gcg gat gct att agc ggg gcc gta gag cgc cag cca acg aac 96

Asn Ala Ala Asp Ala Ile Ser Gly Ala Val Glu Arg Gln Pro Thr Asn

20 25 30

tgg cag gcg att att atg ttc ctg att ttc gtc gtg ttt acg ctc ggc 144

Trp Gln Ala Ile Ile Met Phe Leu Ile Phe Val Val Phe Thr Leu Gly

35 40 45

att acc tac tgg gca tca aaa cgc gta cgt tct cgt agc gac tac tac 192

Ile Thr Tyr Trp Ala Ser Lys Arg Val Arg Ser Arg Ser Asp Tyr Tyr

50 55 60

acc gca ggc ggc aat atc act ggc ttc cag aac ggg ctg gcg att gcc 240

Thr Ala Gly Gly Asn Ile Thr Gly Phe Gln Asn Gly Leu Ala Ile Ala

65 70 75 80

ggg gac tat atg tcc gcc gcc tca ttc ttg ggg atc tcc gcg ctg gtg 288

Gly Asp Tyr Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gly Ile Ser Ala Leu Val

85 90 95

ttt acc tcc ggc tat gac ggc tta att tac tcg ctg ggc ttc ctg gtg 336

Phe Thr Ser Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Ser Leu Gly Phe Leu Val

100 105 110

ggc tgg ccg atc att ttg ttc ctg att gcc gaa cgt ctg cgt aac ctg 384

Gly Trp Pro Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Glu Arg Leu Arg Asn Leu

115 120 125

ggg cgc tac acc ttt gcc gat gtg gcc tct tac cgt ctg aaa caa ggg 432

Gly Arg Tyr Thr Phe Ala Asp Val Ala Ser Tyr Arg Leu Lys Gln Gly

130 135 140

ccg att cgt att ctt tcg gcc tgt ggt tct ctg gtg gtg gtg gcg ctt 480

Pro Ile Arg Ile Leu Ser Ala Cys Gly Ser Leu Val Val Val Ala Leu

145 150 155 160

tac ctt atc gcc cag atg gtg ggc gca ggt aaa ctg atc gag ctg ctg 528

Tyr Leu Ile Ala Gln Met Val Gly Ala Gly Lys Leu Ile Glu Leu Leu

165 170 175

ttt ggc ctt aac tat cac att gcg gtg gtg ctg gtc ggc gtg ctg atg 576

Phe Gly Leu Asn Tyr His Ile Ala Val Val Leu Val Gly Val Leu Met

180 185 190

atg atg tac gtc ctg ttc ggc ggc atg ctg gcg acc acc tgg gtg caa 624

Met Met Tyr Val Leu Phe Gly Gly Met Leu Ala Thr Thr Trp Val Gln

195 200 205

att atc aaa gcc gtg ctg ttg ctg ttc ggt gcc agc ttt atg gcc ttt 672

Ile Ile Lys Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ser Phe Met Ala Phe

210 215 220

atg gtg atg aaa cac gtc ggc ttt agc ttc aac aat ctg ttc agt gaa 720

Met Val Met Lys His Val Gly Phe Ser Phe Asn Asn Leu Phe Ser Glu

225 230 235 240

gcg atg gcg gta cac ccg aaa ggt gtc gac atc atg aag ccg ggc ggg 768

Ala Met Ala Val His Pro Lys Gly Val Asp Ile Met Lys Pro Gly Gly

245 250 255

ctg gtg aaa gat ccg atc tcc gcg ctc tct ctg ggt ctg gga ctg atg 816

Leu Val Lys Asp Pro Ile Ser Ala Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu Met

260 265 270

ttt ggt acg gcg ggc ttg ccg cac att ctg atg cgc ttc ttt aca gtc 864

Phe Gly Thr Ala Gly Leu Pro His Ile Leu Met Arg Phe Phe Thr Val

275 280 285

agc gat gcc cgc gaa gca cgt aag agc gtg ttc tac gcc acc ggg ttt 912

Ser Asp Ala Arg Glu Ala Arg Lys Ser Val Phe Tyr Ala Thr Gly Phe

290 295 300

atg ggc tac ttc tat att ctg acc ttt att atc ggc ttc ggc gcg atc 960

Met Gly Tyr Phe Tyr Ile Leu Thr Phe Ile Ile Gly Phe Gly Ala Ile

305 310 315 320

atg ctg gtt ggt gcg aat ccg gaa tat aaa gac gcg gcg ggc cat ctg 1008

Met Leu Val Gly Ala Asn Pro Glu Tyr Lys Asp Ala Ala Gly His Leu

325 330 335

att ggt ggt aac aac atg gcg gcc gtt cac ctg gcg aat gca gtg ggc 1056

Ile Gly Gly Asn Asn Met Ala Ala Val His Leu Ala Asn Ala Val Gly

340 345 350

ggc aac ctg ttc ctc ggt ttt att tca gcg gtt gct ttc gcc act atc 1104

Gly Asn Leu Phe Leu Gly Phe Ile Ser Ala Val Ala Phe Ala Thr Ile

355 360 365

ctc gcg gtg gtt gcg ggt ctg acg ctg gcg ggc gca tcc gcg gtt tcg 1152

Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ser Ala Val Ser

370 375 380

cat gac ttg tac gct aac gtc ttc aaa aaa ggc gcg acc gaa cgt gaa 1200

His Asp Leu Tyr Ala Asn Val Phe Lys Lys Gly Ala Thr Glu Arg Glu

385 390 395 400

gag ctg cgg gta tca aaa atc acc gta ctg atc ctc ggc gtg att gcg 1248

Glu Leu Arg Val Ser Lys Ile Thr Val Leu Ile Leu Gly Val Ile Ala

405 410 415

att atc ctc ggc gtg ctg ttt gag aat cag aac atc gcc ttt atg gtg 1296

Ile Ile Leu Gly Val Leu Phe Glu Asn Gln Asn Ile Ala Phe Met Val

420 425 430

ggg ctg gcg ttt gcc atc gcg gcg agc tgt aac ttc ccg atc att ctg 1344

Gly Leu Ala Phe Ala Ile Ala Ala Ser Cys Asn Phe Pro Ile Ile Leu

435 440 445

ctt tct atg tac tgg tcg aaa ctg acc acg cgt ggc gcg atg atg ggt 1392

Leu Ser Met Tyr Trp Ser Lys Leu Thr Thr Arg Gly Ala Met Met Gly

450 455 460

ggc tgg ctg ggg ctg att acc gca gta gta ctg atg atc ctc ggc ccg 1440

Gly Trp Leu Gly Leu Ile Thr Ala Val Val Leu Met Ile Leu Gly Pro

465 470 475 480

acg att tgg gta cag atc ctt ggt cac gaa aaa gcc atc ttc ccg tat 1488

Thr Ile Trp Val Gln Ile Leu Gly His Glu Lys Ala Ile Phe Pro Tyr

485 490 495

gaa tac ccg gcg ctg ttc tct atc acc gtg gca ttc ctc ggc atc tgg 1536

Glu Tyr Pro Ala Leu Phe Ser Ile Thr Val Ala Phe Leu Gly Ile Trp

500 505 510

ttc ttc tcg gca acc gat aac tca gcg gaa ggc gcg cgt gag cgt gaa 1584

Phe Phe Ser Ala Thr Asp Asn Ser Ala Glu Gly Ala Arg Glu Arg Glu

515 520 525

ctg ttc cgc gcg cag ttt atc cgc tcc cag acc ggc ttt ggc gtt gag 1632

Leu Phe Arg Ala Gln Phe Ile Arg Ser Gln Thr Gly Phe Gly Val Glu

530 535 540

caa ggc cgc gcg cat taa 1650

Gln Gly Arg Ala His

545

<210>2

<211>549

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Lys Arg Val Leu Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Pro Phe Ala Ala

1 5 10 15

Asn Ala Ala Asp Ala Ile Ser Gly Ala Val Glu Arg Gln Pro Thr Asn

20 25 30

Trp Gln Ala Ile Ile Met Phe Leu Ile Phe Val Val Phe Thr Leu Gly

35 40 45

Ile Thr Tyr Trp Ala Ser Lys Arg Val Arg Ser Arg Ser Asp Tyr Tyr

50 55 60

Thr Ala Gly Gly Asn Ile Thr Gly Phe Gln Asn Gly Leu Ala Ile Ala

65 70 75 80

Gly Asp Tyr Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gly Ile Ser Ala Leu Val

85 90 95

Phe Thr Ser Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Ser Leu Gly Phe Leu Val

100 105 110

Gly Trp Pro Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Glu Arg Leu Arg Asn Leu

115 120 125

Gly Arg Tyr Thr Phe Ala Asp Val Ala Ser Tyr Arg Leu Lys Gln Gly

130 135 140

Pro Ile Arg Ile Leu Ser Ala Cys Gly Ser Leu Val Val Val Ala Leu

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Ala Gln Met Val Gly Ala Gly Lys Leu Ile Glu Leu Leu

165 170 175

Phe Gly Leu Asn Tyr His Ile Ala Val Val Leu Val Gly Val Leu Met

180 185 190

Met Met Tyr Val Leu Phe Gly Gly Met Leu Ala Thr Thr Trp Val Gln

195 200 205

Ile Ile Lys Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ser Phe Met Ala Phe

210 215 220

Met Val Met Lys His Val Gly Phe Ser Phe Asn Asn Leu Phe Ser Glu

225 230 235 240

Ala Met Ala Val His Pro Lys Gly Val Asp Ile Met Lys Pro Gly Gly

245 250 255

Leu Val Lys Asp Pro Ile Ser Ala Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu Met

260 265 270

Phe Gly Thr Ala Gly Leu Pro His Ile Leu Met Arg Phe Phe Thr Val

275 280 285

Ser Asp Ala Arg Glu Ala Arg Lys Ser Val Phe Tyr Ala Thr Gly Phe

290 295 300

Met Gly Tyr Phe Tyr Ile Leu Thr Phe Ile Ile Gly Phe Gly Ala Ile

305 310 315 320

Met Leu Val Gly Ala Asn Pro Glu Tyr Lys Asp Ala Ala Gly His Leu

325 330 335

Ile Gly Gly Asn Asn Met Ala Ala Val His Leu Ala Asn Ala Val Gly

340 345 350

Gly Asn Leu Phe Leu Gly Phe Ile Ser Ala Val Ala Phe Ala Thr Ile

355 360 365

Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ser Ala Val Ser

370 375 380

His Asp Leu Tyr Ala Asn Val Phe Lys Lys Gly Ala Thr Glu Arg Glu

385 390 395 400

Glu Leu Arg Val Ser Lys Ile Thr Val Leu Ile Leu Gly Val Ile Ala

405 410 415

Ile Ile Leu Gly Val Leu Phe Glu Asn Gln Asn Ile Ala Phe Met Val

420 425 430

Gly Leu Ala Phe Ala Ile Ala Ala Ser Cys Asn Phe Pro Ile Ile Leu

435 440 445

Leu Ser Met Tyr Trp Ser Lys Leu Thr Thr Arg Gly Ala Met Met Gly

450 455 460

Gly Trp Leu Gly Leu Ile Thr Ala Val Val Leu Met Ile Leu Gly Pro

465 470 475 480

Thr Ile Trp Val Gln Ile Leu Gly His Glu Lys Ala Ile Phe Pro Tyr

485 490 495

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Gly Trp Pro Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Glu Arg Leu Arg Asn Leu

115 120 125

ggg cgc tac acc ttt gcc gat gtg gcc tct tac cgt ctg aaa caa ggg 852

Gly Arg Tyr Thr Phe Ala Asp Val Ala Ser Tyr Arg Leu Lys Gln Gly

130 135 140

ccg att cgt att ctt tcg gcc tgt ggt tct ctg gtg gtg gtg gcg ctt 900

Pro Ile Arg Ile Leu Ser Ala Cys Gly Ser Leu Val Val Val Ala Leu

145 150 155 160

tac ctt atc gcc cag atg gtg ggc gca ggt aaa ctg atc gag ctg ctg 948

Tyr Leu Ile Ala Gln Met Val Gly Ala Gly Lys Leu Ile Glu Leu Leu

165 170 175

ttt ggc ctt aac tat cac att gcg gtg gtg ctg gtc ggc gtg ctg atg 996

Phe Gly Leu Asn Tyr His Ile Ala Val Val Leu Val Gly Val Leu Met

180 185 190

atg atg tac gtc ctg ttc ggc ggc atg ctg gcg acc acc tgg gtg caa 1044

Met Met Tyr Val Leu Phe Gly Gly Met Leu Ala Thr Thr Trp Val Gln

195 200 205

att atc aaa gcc gtg ctg ttg ctg ttc ggt gcc agc ttt atg gcc ttt 1092

Ile Ile Lys Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ser Phe Met Ala Phe

210 215 220

atg gtg atg aaa cac gtc ggc ttt agc ttc aac aat ctg ttc agt gaa 1140

Met Val Met Lys His Val Gly Phe Ser Phe Asn Asn Leu Phe Ser Glu

225 230 235 240

gcg atg gcg gta cac ccg aaa ggt gtc gac atc atg aag ccg ggc ggg 1188

Ala Met Ala Val His Pro Lys Gly Val Asp Ile Met Lys Pro Gly Gly

245 250 255

ctg gtg aaa gat ccg atc tcc gcg ctc tct ctg ggt ctg gga ctg atg 1236

Leu Val Lys Asp Pro Ile Ser Ala Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu Met

260 265 270

ttt ggt acg gcg ggc ttg ccg cac att ctg atg cgc ttc ttt aca gtc 1284

Phe Gly Thr Ala Gly Leu Pro His Ile Leu Met Arg Phe Phe Thr Val

275 280 285

agc gat gcc cgc gaa gca cgt aag agc gtg ttc tac gcc acc ggg ttt 1332

Ser Asp Ala Arg Glu Ala Arg Lys Ser Val Phe Tyr Ala Thr Gly Phe

290 295 300

atg ggc tac ttc tat att ctg acc ttt att atc ggc ttc ggc gcg atc 1380

Met Gly Tyr Phe Tyr Ile Leu Thr Phe Ile Ile Gly Phe Gly Ala Ile

305 310 315 320

atg ctg gtt ggt gcg aat ccg gaa tat aaa gac gcg gcg ggc cat ctg 1428

Met Leu Val Gly Ala Asn Pro Glu Tyr Lys Asp Ala Ala Gly His Leu

325 330 335

att ggt ggt aac aac atg gcg gcc gtt cac ctg gcg aat gca gtg ggc 1476

Ile Gly Gly Asn Asn Met Ala Ala Val His Leu Ala Asn Ala Val Gly

340 345 350

ggc aac ctg ttc ctc ggt ttt att tca gcg gtt gct ttc gcc act atc 1524

Gly Asn Leu Phe Leu Gly Phe Ile Ser Ala Val Ala Phe Ala Thr Ile

355 360 365

ctc gcg gtg gtt gcg ggt ctg acg ctg gcg ggc gca tcc gcg gtt tcg 1572

Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ser Ala Val Ser

370 375 380

cat gac ttg tac gct aac gtc ttc aaa aaa ggc gcg acc gaa cgt gaa 1620

His Asp Leu Tyr Ala Asn Val Phe Lys Lys Gly Ala Thr Glu Arg Glu

385 390 395 400

gag ctg cgg gta tca aaa atc acc gta ctg atc ctc ggc gtg att gcg 1668

Glu Leu Arg Val Ser Lys Ile Thr Val Leu Ile Leu Gly Val Ile Ala

405 410 415

att atc ctc ggc gtg ctg ttt gag aat cag aac atc gcc ttt atg gtg 1716

Ile Ile Leu Gly Val Leu Phe Glu Asn Gln Asn Ile Ala Phe Met Val

420 425 430

ggg ctg gcg ttt gcc atc gcg gcg agc tgt aac ttc ccg atc att ctg 1764

Gly Leu Ala Phe Ala Ile Ala Ala Ser Cys Asn Phe Pro Ile Ile Leu

435 440 445

ctt tct atg tac tgg tcg aaa ctg acc acg cgt ggc gcg atg atg ggt 1812

Leu Ser Met Tyr Trp Ser Lys Leu Thr Thr Arg Gly Ala Met Met Gly

450 455 460

ggc tgg ctg ggg ctg att acc gca gta gta ctg atg atc ctc ggc ccg 1860

Gly Trp Leu Gly Leu Ile Thr Ala Val Val Leu Met Ile Leu Gly Pro

465 470 475 480

acg att tgg gta cag atc ctt ggt cac gaa aaa gcc atc ttc ccg tat 1908

Thr Ile Trp Val Gln Ile Leu Gly His Glu Lys Ala Ile Phe Pro Tyr

485 490 495

gaa tac ccg gcg ctg ttc tct atc acc gtg gca ttc ctc ggc atc tgg 1956

Glu Tyr Pro Ala Leu Phe Ser Ile Thr Val Ala Phe Leu Gly Ile Trp

500 505 510

ttc ttc tcg gca acc gat aac tca gcg gaa ggc gcg cgt gag cgt gaa 2004

Phe Phe Ser Ala Thr Asp Asn Ser Ala Glu Gly Ala Arg Glu Arg Glu

515 520 525

ctg ttc cgc gcg cag ttt atc cgc tcc cag acc ggc ttt ggc gtt gag 2052

Leu Phe Arg Ala Gln Phe Ile Arg Ser Gln Thr Gly Phe Gly Val Glu

530 535 540

caa ggc cgc gcg cat taatcgagct ctagatc 2084

Gln Gly Arg Ala His

545

<210>10

<211>549

<212>PRT

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>10

Met Lys Arg Val Leu Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Pro Phe Ala Ala

1 5 10 15

Asn Ala Ala Asp Ala Ile Ser Gly Ala Val Glu Arg Gln Pro Thr Asn

20 25 30

Trp Gln Ala Ile Ile Met Phe Leu Ile Phe Val Val Phe Thr Leu Gly

35 40 45

Ile Thr Tyr Trp Ala Ser Lys Arg Val Arg Ser Arg Ser Asp Tyr Tyr

50 55 60

Thr Ala Gly Gly Asn Ile Thr Gly Phe Gln Asn Gly Leu Ala Ile Ala

65 70 75 80

Gly Asp Tyr Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gly Ile Ser Ala Leu Val

85 90 95

Phe Thr Ser Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Ser Leu Gly Phe Leu Val

100 105 110

Gly Trp Pro Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Glu Arg Leu Arg Asn Leu

115 120 125

Gly Arg Tyr Thr Phe Ala Asp Val Ala Ser Tyr Arg Leu Lys Gln Gly

130 135 140

Pro Ile Arg Ile Leu Ser Ala Cys Gly Ser Leu Val Val Val Ala Leu

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Ala Gln Met Val Gly Ala Gly Lys Leu Ile Glu Leu Leu

165 170 175

Phe Gly Leu Asn Tyr His Ile Ala Val Val Leu Val Gly Val Leu Met

180 185 190

Met Met Tyr Val Leu Phe Gly Gly Met Leu Ala Thr Thr Trp Val Gln

195 200 205

Ile Ile Lys Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ser Phe Met Ala Phe

210 215 220

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225 230 235 240

Ala Met Ala Val His Pro Lys Gly Val Asp Ile Met Lys Pro Gly Gly

245 250 255

Leu Val Lys Asp Pro Ile Ser Ala Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu Met

260 265 270

Phe Gly Thr Ala Gly Leu Pro His Ile Leu Met Arg Phe Phe Thr Val

275 280 285

Ser Asp Ala Arg Glu Ala Arg Lys Ser Val Phe Tyr Ala Thr Gly Phe

290 295 300

Met Gly Tyr Phe Tyr Ile Leu Thr Phe Ile Ile Gly Phe Gly Ala Ile

305 310 315 320

Met Leu Val Gly Ala Asn Pro Glu Tyr Lys Asp Ala Ala Gly His Leu

325 330 335

Ile Gly Gly Asn Asn Met Ala Ala Val His Leu Ala Asn Ala Val Gly

340 345 350

Gly Asn Leu Phe Leu Gly Phe Ile Ser Ala Val Ala Phe Ala Thr Ile

355 360 365

Leu Ala Val Val Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ser Ala Val Ser

370 375 380

His Asp Leu Tyr Ala Asn Val Phe Lys Lys Gly Ala Thr Glu Arg Glu

385 390 395 400

Glu Leu Arg Val Ser Lys Ile Thr Val Leu Ile Leu Gly Val Ile Ala

405 410 415

Ile Ile Leu Gly Val Leu Phe Glu Asn Gln Asn Ile Ala Phe Met Val

420 425 430

Gly Leu Ala Phe Ala Ile Ala Ala Ser Cys Asn Phe Pro Ile Ile Leu

435 440 445

Leu Ser Met Tyr Trp Ser Lys Leu Thr Thr Arg Gly Ala Met Met Gly

450 455 460

Gly Trp Leu Gly Leu Ile Thr Ala Val Val Leu Met Ile Leu Gly Pro

465 470 475 480

Thr Ile Trp Val Gln Ile Leu Gly His Glu Lys Ala Ile Phe Pro Tyr

485 490 495

Glu Tyr Pro Ala Leu Phe Ser Ile Thr Val Ala Phe Leu Gly Ile Trp

500 505 510

Phe Phe Ser Ala Thr Asp Asn Ser Ala Glu Gly Ala Arg Glu Arg Glu

515 520 525

Leu Phe Arg Ala Gln Phe Ile Arg Ser Gln Thr Gly Phe Gly Val Glu

530 535 540

Gln Gly Arg Ala His

545

Claims

1.重组微生物，其包含增强或过量表达的yjcG-ORF，所述yjcG-ORF的基因产物具有乙酸通透酶活性。

2.如权利要求1所述的微生物，其中对应于yjcG-ORF的被增强的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的氨基酸序列有至少90％同一性，该多肽具有乙酸通透酶活性。

3.如权利要求2所述的微生物，其特征在于其含有过量表达或增强的对应于yjcG-ORF的多核苷酸，所述多核苷酸选自以下组：

c)多核苷酸序列，其具有的序列在严紧条件下与序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5的互补序列杂交，严紧条件通过洗涤步骤来实现，所述洗涤步骤中温度范围为64℃至68℃，缓冲液盐浓度范围为2xSSC至0.1xSSC；

d)具有序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的多核苷酸，其包含功能中性的有义突变体。

4.如权利要求2所述的微生物，其特征在于，所述多肽具有与选自SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的一个序列有至少95％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求2所述的微生物，其特征在于，所述多肽具有与选自SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的一个序列的氨基酸序列有100％同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求1至5所述的微生物，其特征在于，其是用载体通过转化、转导或接合或这些方法的组合制备的，所述载体包含yjcG-ORF、该ORF的等位基因、或其部分、和/或启动子。

7.如权利要求1或6所述的微生物，其中yjcG-ORF或等位基因的拷贝数增加了至少1个。

8.如权利要求7所述的微生物，其中yjcG-ORF的拷贝数增加了至少1个是通过将ORF或等位基因整合进微生物的染色体来实现的。

9.如权利要求7所述的微生物，其中yjcG-ORF的拷贝数增加了至少1个是通过染色体外复制的载体来实现的。

10.如权利要求1至9所述的微生物，其特征在于，为了实现增强，

a)yjcG-ORF上游的突变启动子和调节区或核糖体结合位点，或

b)表达盒或启动子整合在yjcG-ORF上游。

11.如权利要求1至9所述的微生物，其特征在于，yjcG-ORF的表达是在增强ORF表达的启动子的控制之下。

12.如权利要求1至11所述的微生物，其特征在于，基于亲本株或没有针对yjcG-ORF重组的微生物的基因产物的活性或浓度，增强yjcG-ORF使yjcG基因产物(蛋白质)的浓度或活性增加至少10％。

13.如权利要求1至12所述的微生物，其特征在于，微生物选自埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、普罗威登斯菌属和沙雷氏菌属。

14.如权利要求13所述的微生物，其特征在于，所期望的L-氨基酸的生物合成途径的其他基因也存在于增强尤其是过量表达形式中。

15.如权利要求1至14所述的微生物，其特征在于，其产生L-苏氨酸。

16.通过发酵肠杆菌科的重组微生物来制备L-氨基酸的方法，其特征在于，

a)在培养基或细胞中积累所期望的L-氨基酸的条件下，在培养基中培养如权利要求1至15所述的产所期望的L-氨基酸的微生物，并且

b)分离所期望的L-氨基酸，发酵肉汤成分和/或生物量仍旧全部或部分(从≥0至100％)留在分离的产物中或者完全被去除。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，为了制备L-苏氨酸，发酵微生物，其中同时额外增强尤其是过量表达一个或更多选自以下组的基因：

a)thrABC操纵子的至少一个基因，其编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶，

b)编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒状杆菌pyc基因，

c)编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，

d)编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，

e)pntA和pntB基因，其编码吡啶转氢酶的亚基，

f)rhtC基因，其编码苏氨酸抗性介导蛋白，

g)编码苏氨酸的输出载体蛋白的谷氨酸棒状杆菌thrE基因，

h)编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因，

i)ptsH基因，其编码磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶，

j)ptsI基因，其编码磷酸转移酶***的酶I，

k)crr基因，其编码葡萄糖特异性IIA成分，

l)ptsG基因，其编码葡萄糖特异性IIBC成分，

m)编码半胱氨酸合酶A的cysK基因，

n)cysB基因，其编码cys调节子的调节蛋白，

o)cysJ基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶黄素蛋白，

p)cysI基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶血红素蛋白，

q)编码腺苷酰硫酸还原酶的cysH基因，

r)sucA基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基，

s)sucB基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酰转琥珀酸酶E2亚基，

t)sucC基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基，

u)sucD基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基，

v)大肠杆菌yibD开放阅读框(ORF)的基因产物，和

w)基因acs，其编码乙酰辅酶A合成酶。

18.如权利要求16至18所述的方法，其特征在于，利用微生物，在所述的微生物中，降低所希望的L-氨基酸形成的代谢途径至少部分被哀减。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，为了制备L-苏氨酸，发酵微生物，其中同时额外衰减，尤其是消除、或减少表达一个或更多选自以下组的基因：

a)编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，

b)编码苹果酸脱氢酶的mdh基因，

c)大肠杆菌yjfA开放阅读框(ORF)的基因产物，

d)大肠杆菌ytfP开放阅读框(ORF)的基因产物，

e)pckA基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，

f)编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

g)dgsA基因，其编码磷酸转移酶***的DgsA调节蛋白，

h)fruR基因，其编码果糖抑制蛋白，

i)rpoS基因，其编码Sigma³⁸因子，和

j)编码天冬氨酸铵裂解酶的aspA基因。

20.如权利要求16和18所述的方法，其特征在于，制备L-氨基酸，所述L-氨基酸选自L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。

21.如权利要求16和18所述的方法，其特征在于，制备L-氨基酸，所述L-氨基酸选自L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸。