CN1807574A - 一种冬虫夏草的培养方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了冬虫夏草的培养方法及其专用培养基。其配方包括：复合氮源10.0－50.0克，土豆200克，单糖或双糖0－20.0克，复合维生素源0－5.0克，植物油0－3.0克，蛋白胨0－5.0克，用水定容至1000mL。该培养方法为：在起始pH值为4.8－7.2下，按5－20％的接种量将冬虫夏草菌种接种于权利要求1所述的冬虫夏草专用培养基中，然后在12－21℃，转速100－150rpm，自然光照或24小时黑暗条件下进行振荡培养，得到冬虫夏草菌丝体。利用该培养基及本发明的培养方法对发酵生产冬虫夏草菌丝体具有生长速度快、周期短、产率高、工艺简单、成本低等优点，适于冬虫夏草的工业化发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及冬虫夏草的培养方法及其专用培养基。
背景技术
冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]为子囊菌门(Ascomycota)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]的成员，寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫上，侵蚀虫体，使其死亡并形成菌核(外表为昆虫幼虫的皮壳)，次年春夏产生子座构成了药用复合体。冬虫夏草是我国医药宝库中的一味珍贵的中药药材，与人参、鹿茸齐名。我国冬虫夏草的药用历史悠久，于1963年被《中华人民共和国药典》正式收录。
现代药理学研究证实冬虫夏草具有免疫调节功能，可祛痰平喘，并对肝肾损伤具有保护作用，在抗肿瘤、治疗肾功能衰竭等方面具有较好的应用前景。但是，冬虫夏草为青藏高原特有的物种，仅分布于海拔3000-5000米之间的高山草甸和高山灌木丛中，其天然产量非常有限，长期的过度采挖和生态环境的破坏，已使这种珍贵药材的分布范围和发生数量出现明显的萎缩趋势。现代研究证实冬虫夏草人工培养菌丝体也具有和天然冬虫夏草相似的药理作用，因此通过冬虫夏草菌种发酵生产菌丝体以代替天然的冬虫夏草，已成为缓解人类需求对自然资源造成的压力和满足市场需要的重要途径。
冬虫夏草所处的生态环境特殊，年平均气温仅1.5℃左右，使其生长温度低，生长速度缓慢。在工业发酵上由于温度低、生长慢，往往造成生产产率低、消耗大、成本高的问题。
国内有不少单位进行了冬虫夏草的人工培养研究，有的虽已进入工业化生产阶段，但经研究证实：很多称为“冬虫夏草菌丝体”的发酵产品在分子水平与天然冬虫夏草没有联系，其培养基和培养条件不能应用于真正的冬虫夏草菌种；而用冬虫夏草菌种进行发酵生产，仍存在发酵周期长、产率低、成本高的问题，其培养基和培养条件亟待优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种冬虫夏草的专用培养基。
本发明所提供的冬虫夏草的专用培养基，其配方包括：复合氮源10.0-50.0克，土豆200克，单糖或双糖0-20.0克，复合维生素源0-5.0克，植物油0-3.0克，蛋白胨0-5.0克，用水定容至1000mL；所述单糖或双糖可为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或乳糖；所述复合氮源可为麦麸、奶粉、豆粕或玉米粉；所述复合维生素源可为酵母提取物；所述植物油可为大豆油。
所述冬虫夏草培养基的配方优选为：复合氮源10.0-50.0克，土豆200克，蔗糖0-20.0克，蛋白胨0-5.0克，酵母提取物1.0-3.0克，大豆油0-3.0克，用水定容至1000mL。
所述冬虫夏草培养基的配方尤其优选为：复合氮源20.0-50.0克，土豆200克，蔗糖10.0-20.0克，蛋白胨2.0-5.0克，酵母提取物1.0-2.0克，大豆油2.0-3.0克，用水定容至1000mL。
所述冬虫夏草的专用固体培养基是在上述液体培养基中再添加质量百分含量为1.5-2.0％的琼脂。
上述冬虫夏草的专用培养基可按常规方法配制，如先将上述质量配比的复合氮源和土豆煮汁，离心后，取上清液放入容器，再加入其它成分，加热溶解，使各种成分混合均匀，灭菌即可。
本发明的第二个目的是提供一种冬虫夏草的培养方法。
本发明所提供的冬虫夏草的培养方法，是在起始pH值为4.8-7.2下，按5-20％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，然后在12-21℃，转速100-150rpm，自然光照或24小时黑暗条件下进行振荡培养，得到冬虫夏草菌丝体；所述装瓶量为烧瓶容积的1/5-3/5。
所述起始pH值优选为5.0-6.5；所述接种量优选为10-20％；所述培养温度优选为15-20℃；接种了冬虫夏草菌种的冬虫夏草专用培养基的装瓶量为容器容积的1/5-3/5。
所述起始pH值尤其优选为5.5-6.5；所述培养条件尤其优选为在15-18℃，转速100rpm，24小时黑暗下进行振荡培养；所述装瓶量优选为容器容积的1/5-2/5，尤其优选为1/5。
上述培养方法中的容器优选为烧瓶；培养25-30天即可达到培养终点。
本发明提供了一种冬虫夏草的培养方法及其专用培养基。该培养基的原料简单、易得，而且可根据不同地方的实际情况选用不同的原材料，因而成本低廉。利用该培养基及本发明的培养方法对发酵生产冬虫夏草菌丝体具有生长速度快、周期短、产率高、工艺简单、成本低等优点，适于冬虫夏草的工业化发酵生产。用本发明方法培养所得的冬虫夏草菌丝体可更大地满足市场对冬虫夏草的需求，缓解了市场需求对自然资源的压力。基于上述优点，本发明可产生较好的社会及经济效益，市场前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：奶粉50.0克，蔗糖20.0克，蛋白胨5.0克，酵母提取物1.0克，大豆油3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
一、培养基的配制
土豆的处理：土豆去皮，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，加水补足至1000毫升。
取1000毫升土豆汁，按上述培养基配方加入奶粉、蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、大豆油，溶解，最后用水定容至1000毫升。
二、冬虫夏草菌丝体的生产
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达25.5g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例2、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：玉米粉50.0克，蔗糖20.0克，酵母提取物3.0克，大豆油3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
培养基的配制：玉米粉煮沸半小时，加入土豆再煮沸半小时，然后用纱布过滤，按上述配方加入蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、大豆油，最后用水定容至1000毫升。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达23.8g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例3、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：豆粕50.0克，葡萄糖20.0克，蛋白胨5.0克，大豆油3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达21.5g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例4、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：麦麸50.0克，葡萄糖20.0克，蛋白胨5.0克，大豆油3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达18.0g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例5、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：奶粉10.0克，蔗糖20.0克，蛋白胨5.0克，酵母提取物1.0克，大豆油3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例1相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达17.7g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例6、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：麦麸50.0克，蛋白胨5.0克，酵母提取物5.0克，大豆油1.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达14.6g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例7、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：麦麸50.0克，蔗糖20.0克，蛋白胨5.0克，酵母提取物3.0克，大豆油3克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，自然光照条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达13.2g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例8、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：麦麸50.0克，蔗糖20.0克，蛋白胨5.0克，酵母提取物3.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为4.8下，按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达15.6g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
实施例9、冬虫夏草菌丝体的生产
冬虫夏草专用培养基：麦麸50.0克，土豆200克，用水定容至1000毫升。
对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，用水定容至1000毫升。
用与实施例2相同的方法配制培养基。
从天然冬虫夏草上分离菌种，纯化，进行分子生物学鉴定，确定其为真正的冬虫夏草菌种菌株。将其在起始pH值为6.0下，按15％的接种量将冬虫夏草菌种接种于上述冬虫夏草专用培养基中，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在18℃，转速100rpm，24小时黑暗条件下进行振荡培养25-30d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率达8.5g/L。同时按10％的接种量将冬虫夏草菌种接种于对照培养基中，在起始pH值为6.0下，装瓶，装瓶量为烧瓶容积的1/5，然后在15℃，转速150rpm，自然光照条件下进行振荡培养40d，得到冬虫夏草菌丝体，菌丝体产率为6.9g/L。
将所得的冬虫夏草菌丝体提取DNA，对其ITS(核糖体转录间隔区)进行PCR扩增并测序，采用冬虫夏草专用分子数据库进行比较分析，分析结果表明本方法培养得到的菌丝体为冬虫夏草菌丝体。
Claims (10)
1、冬虫夏草的专用培养基，其配方包括：复合氮源10.0-50.0克，土豆200克，单糖或双糖0-20.0克，复合维生素源0-5.0克，植物油0-3.0克，蛋白胨0-5.0克，用水定容至1000mL；所述单糖或双糖为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖或乳糖；所述复合氮源为麦麸、奶粉、豆粕或玉米粉；所述复合维生素源为酵母提取物；所述植物油为大豆油。
2、根据权利要求1所述的冬虫夏草的专用培养基，其特征在于：其配方包括：复合氮源10.0-50.0克，蔗糖0-20.0克，蛋白胨0-5.0克，酵母提取物1.0-3.0克，大豆油0-3.0克，土豆200克，用水定容至1000mL。
3、根据权利要求2所述的冬虫夏草的专用培养基，其特征在于：其配方包括：复合氮源20.0-50.0克，蔗糖10.0-20.0克，蛋白胨2.0-5.0克，酵母提取物1.0-2.0克，大豆油2.0-3.0克，土豆200克，用水定容至1000mL。
4、根据权利要求1或2或3所述的冬虫夏草的专用培养基，其特征在于：所述冬虫夏草的专用固体培养基是在液体培养基中再添加质量百分含量为1.5-2.0％的琼脂。
5、一种冬虫夏草的培养方法，是在起始pH值为4.8-7.2下，按5-20％的接种量将冬虫夏草菌种接种于权利要求1所述的冬虫夏草专用培养基中，然后在12-21℃，转速100-150rpm，自然光照或24小时黑暗条件下进行振荡培养，得到冬虫夏草菌丝体。
6、根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：所述起始pH值为5.0-6.5；所述接种量为10-20％；所述培养温度为15-20℃；接种了冬虫夏草菌种的冬虫夏草专用培养基的装瓶量为容器容积的1/5-3/5。
7、根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：所述起始pH值为5.5-6.5；所述培养条件为在15-18℃，转速100rpm，24小时黑暗下进行振荡培养；所述装瓶量为容器容积的1/5-2/5。
8、根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于：所述装瓶量为容器容积的1/5。
9、根据权利要求6或7或8所述的培养方法，其特征在于：所述容器为烧瓶。
10、根据权利要求6或7或8所述的培养方法，其特征在于：所述振荡培养时间为25-30天。
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