CN1788723A - 含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液和水包油乳剂的组合物，还涉及其制备方法。所述制剂应用界面膜载药的原理，提高了油水中均难溶的药物去甲基斑蝥酸钠在乳剂中的载药量、降低其毒性并使其在体内能够靶向释药。它包括去甲基斑蝥酸钠、脂溶性介质、水、表面活性剂和等渗调节剂，其中所述脂溶性介质以制剂计用量为5％至30％，去甲基斑蝥酸钠以制剂计用量为0.01％至5％，表面活性剂以制剂计用量为0.5％至5％，等渗调节剂以制剂计用量为0.5％至5％，余量为水。其中，去甲基斑蝥酸钠在油水两相的界面膜中有一定的分布，其余部分去甲基斑蝥酸钠分布于水相及油相中。本制剂为一种抗肿瘤药物的制剂，经注射给药后在体内的特征主要表现为低毒性、肝靶向性。

Description

含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液(水包油乳剂)及制备方法。

背景技术

半个世纪以来，医学科学取得巨大的进展，人类籍化学、免疫、抗生素疗法三大防治手段，基本上控制了以往主要威胁人类健康的传染病，而诸如肿瘤、心脑血管疾病等非传染性疾病则逐渐成为人类健康的主要敌人，其中尤以肿瘤的危害为甚。多年来，人们虽然进行了很多的努力并取得较大的进展，但迄今为止肿瘤的危害仍未能被有效遏制。有数据表明，2002年国内因恶性肿瘤及癌症致死的人数占当年死亡人口总数的25.37％，肿瘤已成为危害人类健康的第一杀手。近两年来，肿瘤的发病呈上升趋势，发病年龄也从平均的55岁明显下移。可以预言，在今后的二、三十年内，癌症的发病率及死亡率将呈继续上升的趋势。因此，抗肿瘤药物的开发是许多药学工作者研究的重中之重。另外，由于多数抗肿瘤药物不良反应严重，在治疗过程中对患者的身心造成很大伤害，因此如何在提高药物疗效的同时，降低药物的刺激性及毒性、从而提高患者生存质量逐渐成为目前抗肿瘤药物研究新的方向与重点。

斑蝥(Mylabris)系鞘翅目芫菁科昆虫，药用已有两千余年历史。南宋时期已有明确记载斑蝥可以治疗癌症，70年代曾用于治疗原发性肝癌。斑蝥属剧毒药，如果滥用、超量应用、与酒蒜同用、生用(或泡制不当)、外用面积过大、蓄积、肝肾功能不全、冲服会引起中毒，中毒剂量为0.6g，致死剂量为1.5g；斑蝥素0.14μg能诱发皮肤起泡，10mg可产生严重中毒或致死，限制了其在临床上的应用。近年来，人们经过长期的研究和试验，合成了部分斑蝥素的衍生物或类似物，如去甲基斑蝥素、斑蝥酸钠和羟基斑蝥胺等抗癌药物来替代斑蝥素，实验表明，它们的药理作用相似，但毒性较斑蝥素小得多。1989年我国首先合成了抗癌新药去甲基斑蝥素(Norcantharidin)，它是将斑蝥素去除1，2位甲基而得。去甲基斑蝥酸钠为去甲斑蝥素直接水解制得的钠盐，仅在少数有机溶剂(如丙酮、乙酸乙酯)及热水中溶解，在冷水及油中的溶解度很低。

与斑蝥素相比，去甲基斑蝥酸钠的泌尿***刺激作用大大降低，同时具有较斑蝥素更为显著的升高白细胞作用。体外实验表明去甲基斑蝥酸钠对肝癌、食道癌、喉癌、官颈癌等细胞株的形态或增殖有破坏或抑制作用。对肝癌患者可见生存期延长，AFP下降，瘤体及肿大的肝脏回缩、质地***，能减轻肝区疼痛及腹水；对食管癌、胃癌、贲门癌患者可见癌灶稳定或缩小，疼痛及梗阻缓解，进食改善。在病理标本中，可见上述癌变发生不同的退变或坏死，同时可见癌巢淋巴细胞浸润等。动物体内实验显示，去甲基斑蝥酸钠对小鼠艾氏腹水癌、S180肝癌实体型有一定抑制作用，可提高腹水肝癌H22、癌细胞线粒体的呼吸控制律与溶酶体酶活性，干扰癌细胞***，抑制DNA合成，使癌细胞骨架(微丝、微管)破坏，影响其超微结构，导致线粒体、微绒毛及质膜损伤。本品对正常细胞影响较小，能拮抗骨髓抑制，升高白细胞。本品为细胞周期特异性药物，阻断于M周期，并影响其周期运行速度。临床上主要应用于肝癌、食道癌、胃癌、贲门癌等术前用药或联合化疗，可用于白细胞降低及乙型肝炎。去甲基斑蝥酸钠片小鼠灌胃研究显示，本品吸收后较快分布于各组织，在动物的肝、肾、胃、肠、心、肺、唾液腺、甲状腺及瘤体中具有较高的药物浓度，给药后15min在肝脏、癌组织达高峰浓度，6小时候浓度显著下降，24h后大部分经肾***完毕，在体内较少积蓄。本品给动物静注后，可较快分布于各组织，在肝、肾、肺、胃、肠、心、唾液腺、甲状腺、癌组织中均有较高的药物浓度。药物主要通过泌尿******，静注后，尿中药物浓度0.5～1小时达高峰，24小时大部分自尿中排出。

目前，去甲基斑蝥酸钠主要以片剂和去甲基斑蝥酸钠注射剂应用于临床。去甲基斑蝥酸钠虽然明显减轻了斑蝥素的毒性，但并未完全消除。动物实验研究结果显示，给药剂量增大到一定程度时，肾脏和肝脏组织出现病理变化。使用剂量的严格限制也严重阻碍了药物疗效的发挥。临床使用时部分患者在静脉给药每日超过20mg或口服每日超过30mg时即出现不良反应，口服不良反应主要表现为恶心、呕吐、头晕等症状。由于注射液为碱性溶液，其pH值约为8，远大于血液pH值(7.35～7.45)，因此对血管壁刺激较大，易引起化学性静脉炎；且由于药物本身具有较强刺激性，亦可引起血管痉挛，血液减少，相对局部斑蝥酸钠浓度增大，加重静脉炎，且若输液速度大于血液流速，则静脉炎的发生率明显增高。主要不良反应表现为易引起静脉炎症，静脉部红、肿、热、痛，沿静脉走行长条状发红，如有渗出则红肿成块状，活动受限，经热敷理疗处理好转治愈。因此在临床用于外周浅静脉输液时，发生浅静脉炎的比例相当高，有的病人拒绝用该药治疗，影响药物在临床上正常实用。

因此鉴于上述特性，为使去甲基斑蝥酸钠更好地发挥临床疗效，研究和开发新剂型，以新剂型的高效、低毒的优势充分发挥去甲基斑蝥酸钠抗肿瘤活性并降低毒副作用，这无疑将对进一步促进和推广去甲基斑蝥素在临床中的应用具有重要意义。目前，有关于去甲基斑蝥素的新剂型报道非常有限，仅有微囊、白蛋白微球及偶联靶向性材料等。

脂肪乳剂作为肠外能量的重要补给方式应用于临床已近半个世纪。1920～1930年间，日本学者曾用蓖麻油为原料、卵磷脂为乳化剂，首先人工合成脂肪乳剂试用于动物；美国50年代推出了以棉花籽油为基础的Lipomul应用于病人但均因严重毒性而未能推广。1964年，美国停止生产和应用脂肪乳剂。但在欧洲，以Wretling为代表的一批学者不懈地研究和应用以大豆油为基础、以卵黄磷脂为乳化剂、以甘油为等张剂的脂肪乳剂Introlipid。1962年，Introlipid在瑞典被正式批准用于临床。1967年，由Hallberg等发表的文章“脂肪乳剂应用于完全静脉营养”全面总结了Introlipid的实验和临床研究，证明它应用于临床是安全、可靠的，并提出了Introlipid临床应用的准则。此文与1968年Dudrick等发表的“长期完全肠外营养下获生长、发育和正氮平衡”一文，被公认为是对肠外营养发展为常规临床应用有重大影响的两篇经典著作。此后20多年，Introlipid在世界各地得到了广泛应用，德、法、日、美等发达国家相继发展了本国的脂肪乳剂。1976年，美国有关当局又批准了脂肪乳剂可在临床常规应用。目前，全世界至少已有20余种脂肪乳剂面市。我国亦于80年代末与瑞典Kabi公司合资，大量生产Introlipid供临床应用。1973年，Solassol等首先介绍了三合一(All-in-one，AIO)溶液的概念，证明脂肪乳剂和所有其它营养液可混合于一个瓶内或袋内，在一定条件和时间内可保持稳定和营养支持效果。此后推广了AIO输液塑料袋，这一简单但又有重大意义的改进大大简化了肠外营养液的配制和输注，为脂肪乳剂的临床广泛应用拓宽了道路。到目前为止，通常的脂肪乳剂是指以脂肪酸甘油酯作为分散相，以蛋黄卵磷脂为乳化剂的水包油型(oil in water，o/w)亚微乳剂。由于脂肪乳剂乳滴的组成及粒径与口服脂肪类食物后在血液内存在的乳糜微粒十分类似，因此通常认为脂肪乳剂的乳滴在人体内的行为同乳糜微粒亦相似。随着对脂肪乳剂的深入研究，其在制药领域也正发挥着越来越重要的作用。

脂肪乳剂的特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物，特别是抗癌药物、***物及抗炎药物的良好载体。常采用的方法是将药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，由于该结构亦类似于微球，因此脂质微球(LipidMicrosphere，LM)的名称也应运而生。一般认为脂质微球是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，平均粒径在200nm左右。

LM具有许多物理化学及生物学上的优点：

1.是脂溶性药物的良好载体。临床不少药物水溶性差，必须依靠有机溶剂才能发挥作用，而有机溶剂不仅本身有一定毒性，还可能干扰药物效果。

2.可有效增加药物的稳定性。含药脂质微球中，有相当一部分药物分布在油相或油水界面膜中，避免了直接与水接触。对于易水解或对pH变化敏感的药物，这种“隔离”起到了增加稳定性的作用。

3.LM中药物部分包裹于油相或界面膜中，避免了与体液的直至接触，因而降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。另外，药物在体内是由油相中缓慢释放，可避免药物在注射用时由于初期浓度过高而引起的不良反应。

4.粒径在200nm左右的小微粒能被机体的网状组织***的吞噬细胞所吞噬而滞留在网状组织***(如肝脏、肺等)中，具有靶向性，这种特点对于抗肿瘤药物提高药效、降低毒副作用尤为重要。

Takahashi等人的有关文献报道：用博莱霉素试制成LM，并用水剂作对照，以荷瘤大鼠作试验。进行静脉或肿瘤内给药，然后分别测定肿瘤大小和肿瘤中药物浓度，结果显示：LM组的肿瘤缩小50％以上，给药后10小时仍可检出药物；而水剂组的肿瘤无明显缩小，30分钟到1小时后已检测不出药物。以上说明药物的剂型不同，效果也不同，表明了LM具有选择性分布并缓慢释放的特点，对肝脏、淋巴组织***的疾病和癌症化疗都是一个较适宜的载体剂型。研究证明这种特点对于抗肿瘤药物提高药效、降低毒副作用尤为重要。

近几年来，以LM作为药物载体的靶向转移作用逐渐受到人们的重视。药物脂肪乳剂一经开发，便在临床上广泛应用，收到了良好的效益。日本的水岛裕研制的Lipo PGE1和Lipo PGI2等一系列载药脂肪乳剂产品的开发上市预示了此类制剂广阔的前景。尤其是已臻成熟的乳剂生产工艺和合成的或天然的表面活性剂的应用以及乳剂生产技术的提高，促进了具有商业价值、稳定外形的乳剂产品的发展(稳定期大约为2年)，为含药脂肪乳的开发生产创造了更好的条件。如依托米酯、异丙酚、棕榈酸***脂肪乳剂、氟比洛芬乙氧基α-乙酯脂质乳剂、***素E1脂质乳等。

理论上，要将难溶性药物溶解，有两个条件是必需的：1.有效的振摇或搅拌过程；2.未溶颗粒具有较大的比表面积。在我们的实验中，就是利用了这两个原则，我们实验的基础理论为：首先，在高速搅拌下将药物粉末加入乳剂中可得到一种超微的油滴与药物细小颗粒同时分散在水中的粗分散体系。第二步，对该分散体系进行一个高压匀化过程，高速的气流撞击形成一种超音速搅拌，使药物颗粒迅速溶解并以分子形式渗透到油水界面膜中。其中药物可以以两种形式加入，一种是超微的粉末，另一种是纳米级分散的混悬液。药物加入方法也有两种，即将药物直接加入到制备好的注射用乳剂中或将药物加入至初乳中再稀释。目前，这项技术目前已成功的应用于两性霉素B(Amphotericin B)，R.H.Müller等于2001年制备出了两性霉素B注射用膜载药纳米乳剂。

本发明制备的去甲基斑蝥素脂质微球注射液(水包油乳剂)，降低了去甲基斑蝥酸钠的血管刺激性，提高疗效并降低毒副作用，因而具有一定的创新性和较强的实用性。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液(水包油乳剂)及制备方法。

该注射液包含去甲基斑蝥酸钠，脂溶性介质，水和表面活性剂。其中去甲基斑蝥酸钠可以是去甲基斑蝥素，也可以是由去甲基斑蝥素在制剂制备过程中经过反应生成去甲基斑蝥酸钠。

脂溶性介质指示一大类生理可接受性物质，不管是矿物油，植物油，动物油，精油或合成油，或其混合物。因此，脂溶性介质用以指一个宽范围的具有十分不同化学性质的物质。在以类型或功能分类油时，如矿物油源自石油并包含脂肪或蜡基烃，芳香烃或混合的脂肪与芳香基烃。在矿物油类别中也包含石油衍生的油如精制石蜡油等。在植物油类别中，油主要来源于种子或坚果，并包含干性油如亚麻子和桐油；半干性油如红花油和大豆油；不干性油如蓖麻油、棉籽油和椰子油和可用作的皂料如棕榈油和椰子油。在动物油类别中，油通常来自作为牛羊脂，猪油和硬脂酸的脂肪。液状动物油包含鱼油，油酸，鲸蜡油等。它们通常含大量脂肪酸。包含一些植物油，如橄榄油，棉籽油，谷物油和花生油，也包含一些特殊的鱼油，它们由于富含维生素而被广泛的用作药物，如鳕鱼肝，鲨鱼肝油等。液状脂肪油如单、双、三甘油酯，或其混合物为优选的油。根据本发明，中等链长的三甘油酯也为有用的油。优选为长链脂肪酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯，及其混合物。

所用表面活性剂可为任何表面活性剂，通常为磷脂，吐温(Tween)，普朗尼克(poloxamer)，油酸钠，油酸，胆酸，去氧胆酸及其混合物。所述磷脂选自卵磷脂，豆磷脂，及其混合物。所述吐温选自吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，吐湿85，及其混合物。优选为卵磷脂，豆磷脂，油酸钠，油酸，吐温80，普朗尼克F68，及其混合物。

典型地，以制剂质量计本发明的配方组成为：

油相  5％～30％

去甲基斑蝥酸钠  0.01％～0.5％

表面活性剂  0.5％～5％

纯甘油  0.5％～5％

其余为注射用水

如果需要，组合物中也可以添加多种添加剂。如可能含有金属螯合剂。一般金属螯合剂为依地酸二钠(乙二胺四乙酸二钠盐)，依地酸钠钙(乙二胺四乙酸钙二钠盐)，及其混合物。金属螯合剂以制剂计用量为约0％至约1％。

本发明也涉及含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液和水包油乳剂的制备方法。包含以下步骤中的一种或几种：

1.将去甲基斑蝥酸钠超微颗粒混悬液或者是超微的粉末加入至不合去甲基斑蝥酸钠的空白乳剂经混合制得去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液。

2.将去甲基斑蝥酸钠超微颗粒混悬液或者是超微的粉末加入至含有部分去甲基斑蝥酸钠的乳剂中经混合制得去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液。

3.将去甲基斑蝥酸钠加入至含有表面活性剂的水溶性介质中，然后与油相混合，经过高速搅拌制备初乳。

4.该制剂的制备方法主要包括高速搅拌过程及高压均质过程。

5.制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

本发明涉及一种混合去甲基斑蝥酸钠到油中的方法，包含以下步骤：将去甲基斑蝥酸钠溶在所述油和所述去甲基斑蝥酸钠共溶剂的溶液中；并除去所述共溶剂已构成所述去甲基斑蝥酸钠的所述油溶液。通常所述共溶剂为短链醇。特别是甲醇，乙醇和异丙醇。这些共溶剂最终通过蒸发除去。

本发明所述制剂应用界面膜载药的原理，提高了油水中均难溶的药物去甲基斑蝥酸钠在乳剂中的载药量、降低其毒性并使其在体内能够靶向释药。其中，去甲基斑蝥酸钠在油水两相的界面膜中有一定的分布(约20～80％)，其余部分去甲基斑蝥酸钠分布于水相及油相中。本制剂为一种抗肿瘤药物的制剂，经注射给药后在体内的特征主要表现为低毒性、肝靶向性。

附图说明：

图1为脂质微球结构示意图。

图2为去甲基斑蝥酸钠脂质微球稀释后粒度测定结果图。(其中， A-1表示制剂以氯化钠注射液(0.9％)稀释1-10倍后平均粒径，

A-2表示制剂以氯化钠注射液(0.9％)稀释20-100倍后平均粒径，

B-1表示制剂以葡萄糖注射液(5.4％)稀释1-10倍后平均粒径，B-1表示制剂以葡萄糖注射液(5.4％)稀释20-100倍后平均粒径，SD-A-1表示以氯化钠注射液(0.9％)稀释1-10倍后粒度分布值，

SD-A-2表示以氯化钠注射液(0.9％)稀释20-100倍后粒度分布值，SD-B-1表示以葡萄糖注射液(5.4％)稀释1-10倍后粒度分布值，SD-B-2表示以葡萄糖注射液(5.4％)稀释20-100倍后粒度分布值。)

图3为稀释样品ζ-电位测定结果图。

图4为稀释后样品水相中的分布图。

图5为NCTD血药浓度—时间曲线图。

(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图6为NCTD心脏中药物浓度—时间曲线图。(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图7为NCTD肝中药物浓度—时间曲线图。(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液， 表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图8为NCTD肾中药物浓度—时间曲线图。(其中，

表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液，

表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图9为给药0.5小时的大鼠体内各组织药物分布图。(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图10为给药6小时的大鼠体内各组织药物分布图。(其中，

表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图11为给药12小时的大鼠体内各组织药物分布图。(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

图12为给药24小时后大鼠体内各组织AUC值分布图。(其中， 表示去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液，■表示去甲基斑蝥酸钠普通注射液)

具体实施方式

实施例1

去甲基斑蝥酸钠原料的制备

去甲基斑蝥酸钠虽然有注射液，但是都是从去甲斑蝥素直接水解制得钠盐水溶液。其原料药没有生产和销售。而从去甲斑蝥素制备去甲斑蝥酸钠是一个最基本的有机反应，因此，我们参照文献报道，以去甲斑蝥素为原料，经过水解成盐，脱水，洗涤，干燥，制得去甲斑蝥酸钠。反应式如下：

一般合成方法如下：

氢氧化钠10-30g，加水100mL，溶解后放冷，边搅拌边加入去甲斑蝥素10-30g，待近全部溶解后，滤除少量不溶物。将溶液减压浓缩近干，得大量白色粉末状固体，加乙醇5-50mL，抽滤，得到白色晶体，用乙醇多次洗涤，每次洗后检查洗出液的pH值，待洗出液pH值为4-9时，抽滤，真空干燥，得白色结晶性粉末。

精制：将上述白色粉末5-50g，溶于5-50mL水中，用G3垂熔漏斗过滤，滤液加入100-1000mL乙醇，放置2-20小时后抽滤，真空干燥，得白色粉末状固体。

实施例2

去甲基斑蝥酸钠制剂的处方制备工艺

处方1：

注射用薏苡仁油 5-30g

去甲基斑蝥酸钠  0.01g-5g

卵磷脂  0.5-5g

甘油  0-5g

注射用水加至100ml

制备方法1：

(1)将处方量的卵磷脂、甘油及去甲基斑蝥酸钠与预热至40-100℃的适量注射用水进行混合，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至各成份均匀分散；(2)于上述分散液中加入处方量的预热至40-100℃的油相，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至油相均匀分散；(3)取上述初乳加入预热至40-100℃的注射用水至全量，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5微米以下；(4)取去甲基斑蝥酸钠亚微乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方2：

注射用大豆油  5-30g

去甲基斑蝥酸钠  0.01g-5g

豆磷脂  0.5-5g

甘油  0-5g

Tween-80  0-1g

注射用水加至100ml

制备方法2：

(1)将处方量去甲基斑蝥酸钠分散于0％-5％的Tween-80溶液中，高速搅拌器搅拌数分钟，1-5次，然后用高压乳匀机匀化1-10次(50-100MP，20-100℃)即得，所制混悬液的去甲基斑蝥酸钠含量为纳米乳剂的10倍；(2)将处方量的卵磷脂、甘油与预热至40-100℃的适量注射用水进行混合，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至各成份均匀分散；(3)于上述分散液中加入处方量的预热至40-100℃的大豆油，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至油相均匀分散，加入20-100℃的注射用水至全量；(4)将去甲基斑蝥酸钠超微颗粒混悬液加入空白初乳中，高压均质1-10次，取样镜检，至油滴在0.5微米以下；(5)取去甲基斑蝥酸钠亚微乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方3：

注射用鸦胆子油  5-30g

去甲基斑蝥酸钠  0.01g-5g

卵磷脂  0.5-5g

甘油  0-5g

Tween-80  0-1g

注射用水加至100ml

制备方法3：

(1)～(3)步骤同制备方法2；(4)将空白初乳加入高压均质机中均质1-10次，取样镜检，至油滴在0.5微米以下；(5)将去甲基斑蝥酸钠超微颗粒混悬液加入空白乳剂中高速搅拌；(6)取去甲基斑蝥酸钠亚微乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中，灭菌。

处方4：

油相(大豆油/MCT)  5-30g

去甲基斑蝥酸钠  0.01-5g

卵磷脂  0.5-5g

甘油  0-5g

油酸钠  0-1g

EDTA   0-1g

注射用水加至  100mL

制备方法4：

(1)将注射用甘油、油酸钠、EDTA、F68分散于适量注射用水中，至磁力搅拌器中加热至40-100℃搅拌至全部溶解；(2)注射用卵磷脂、Tween-80、加入至由注射用MCT、注射用大豆油组成的混合油相中，加热至40-100℃下搅拌至卵磷脂完全溶解，加入去甲基斑蝥酸钠，进行高压均质。(3)将油相加入至水相中，置于高速组织捣碎机搅拌数分钟，1-5次。(4)调节pH值至4-9，注射用水稀释定容至处方量，转移至高压均质机均质3-10次。(5)装瓶，封罐氮气，置于高压旋转灭菌器中，灭菌。

除以上所列处方中组合物外，按以上方法另外制备5个制剂，它们的组成如下：

去甲基斑蝥酸钠，去甲基斑蝥素，及其混合物	0.2g
		大豆油、红花油、薏苡仁油、鸦胆子油、中链脂肪酸甘油酯	5-30g
卵磷脂、豆磷脂	0-5g
		油酸、油酸钠	0-1g
胆酸、去氧胆酸钠	0-1g

甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖	0-5g
		EDTA	0-1g
Pol oxamer F68	0-5g
		吐温80	0-1g

实施例3

去甲基斑蝥酸钠脂质微球稀释介质的筛选

本发明研究了不同稀释介质及稀释后不同时间对去甲基斑蝥酸钠脂质微球性质的影响，以筛选出较合适的临床用稀释介质，并确定稀释后可安全使用的时间。

实验方法：将去甲基斑蝥酸钠脂质微球样品分别以氯化钠注射液(0.9％)稀释1-10倍(代号A-1)及20-100倍(代号A-2)，以葡萄糖注射液(5.4％)稀释1-10倍(代号B-1)及20-100倍(代号B-2)，测定稀释30min，1h，2h，4h及8h后的粒径、ζ-电位及药物包裹率。稀释后样品的粒度测定的结果见附图2，稀释样品ζ-电位变化见附图3，样品稀释后药物分布随时间的变化见附图4，稀释后样品水相中的分布图见附图5，

由以上实验结果确定，去甲基斑蝥酸钠脂质微球在临床使用时以葡萄注射液稀释1-10倍时，在2h内使用是安全合理的。

实施例4

去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液刺激性试验

(1)血管刺激性实验

选用新西兰白兔6只，3只白兔于右耳耳缘静脉注射去甲基斑蝥酸钠注射液Qs，左耳注射相同剂量无菌的5％葡萄糖注射液作为对照；另3只白兔于右耳耳缘静脉注射去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液Qz，左耳注射相同剂量无菌的5％葡萄糖注射液作为对照。每日一次，连续三天，末次给药24小时后，处死白兔，肉眼观察注射部位的反应情况，并解剖兔耳血管及周围组织做石蜡切片，染色，光镜检查。

结果显示：去甲基斑蝥酸钠注射液两种剂型血管刺激性实验肉眼观察结果表明：Qz的血管刺激性弱于Qs；镜检报告表明：Qs组对新西兰白兔耳血管有一定程度的血管刺激性，Qz组对新西兰白兔耳血管未见明显刺激性。

(2)肌肉刺激性实验

选用新西兰白兔4只，每种剂型2只，分别在右侧股四头肌注射Qs和Qz注射液1ml，左侧股四头肌注射等量的无菌5％葡萄糖注射液作为对照，注射48小时后，处死白兔，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应情况，确定反应级数。

0级：无变化。

1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下。

2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上。

3级：重度充血，伴有肌肉变性。

4级：出现坏死，有褐色变性。

5级：出现广泛性坏死。

然后算出4块股四头肌反应级数总和，如果股四头肌反应级数的最高值和最低值之差大于2，则应另取2只健康白兔重新实验。得到结果后，若4块股四头肌反应级数总和小于10，则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。

结果表明：Qz的肌肉刺激性弱于Qs。

实施例5

溶血性实验

自新西兰白兔的颈总动脉取血20ml，置于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动，数分钟后，除去纤维蛋白，取出血液，加等量5％葡萄糖注射液，离心，除去上清液；沉淀的红细胞再加5％葡萄糖注射液清洗，离心。如此反复直至上清液透明，按红细胞的容量用5％葡萄糖注射液配成2％的混悬液。

取干净试管7支，分别编号，依次加入下表内各液，第6管不加供试液作为空白对照管，第7管用蒸馏水代替5％葡萄糖注射液，摇匀，置于37℃水浴中，分别于0.5小时、1小时、2小时、3小时观察是否有溶血现象发生。

结果表明：Qs、Qz都未见溶血现象发生，两种剂型的溶血性实验都合格。

实施例6

过敏性实验

取健康豚鼠8只，Qs、Qz两种剂型各4只，每只豚鼠腹腔注射相应供试液0.5ml，隔日一次，共三次。在首次注射后的第14、21天于每只豚鼠的后脚掌外侧静脉注入相应供试药液1ml(剂量折算同前)，进行攻击。每次静脉给药观察2小时，如出现抓鼻、竖毛、咳嗽、呼吸困难中的两种或两种以上者判为阳性；如有痉挛、大小便失禁、虚脱、休克、死亡现象之一者判为阳性。一切正常为阴性。

结果表明：Qs、Qz两种剂型都符合过敏性实验标准。

实施例7

大鼠血浆药代动力学研究给药方案

12只大鼠随机分成二组，每组6只，实验前禁食一夜。甲组为对照组，于右后股静脉注射去甲基斑蝥酸钠氯化钠注射液(2mg·mL^-1)，乙组为受试组，于右后股静脉注射去甲基斑蝥酸钠脂质微球，分别于10min，20min，30min，45min，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h眼眶取0.5mL血，置预先肝素化的尖底离心试管中，离心，精密吸取上层血浆200μL，加入20μL注射用水，按一定方法处理后，取20μL进样，以当日的标准曲线计算各时间点样品中去甲基斑蝥酸钠的浓度。

实验结果见附图6

隔室模型药物动力学参数

用3P97药物动力学程序处理去甲基斑蝥酸钠脂质微球和注射液的平均血药浓度数据。根据AIC和拟合度判断两者的模型归属，结果表明，去甲基斑蝥酸钠脂质微球和注射液的血药浓度数据均符合双隔室模型。

非隔室模型药物动力学参数

由血药浓度-时间实测数据描述体内过程，计算药物动力学参数。结果显示，主要药动学参数AUC_0-∞，AUMC_0-∞，AUC_0-t，AUMC_0-t，S₂，MRT，VRT无显著性差异。

实施例8

大鼠组织分布动力学研究

给药方案

60只大鼠随机分成二组，每组30只。甲组为对照组，于右后股静脉注射NCTD氯化钠注射液，乙组为受试组，于右后股静脉注射NCTD脂质微球，分别于0.5h，2h，6h，12h，24h(每点6只大鼠，甲、乙组各3只)断头处死动物，取出心，肝，脾，肺，肾，脑，用生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干，称取0.5g，加1mL生理盐水匀浆，小于0.5g的组织直接匀浆，离心，取上清液，按“组织样品处理与测定”项下处理后，取20μL进样，以当日的标准曲线计算各时间点样品中NCTD的浓度。

实验结果

实验动物静脉注射NCTD脂质微球和NCTD注射液后各时间点的药物浓度测定结果见表10～12，实验动物各时间点各组织药物浓度的平均值与时间的关系见附图6～12。

在本试验给药条件下，受试制剂与参比制剂给药后24h内大鼠脾、肺、脑的血药浓度无法测到，故未列出结果。

另外，给于受试制剂的大鼠组给药12h～24h后有两只动物死亡，且补加实验后仍死亡，故受试制剂组24h大鼠各组织分布数据仅得到一组。

由大鼠体内血浆药动学试验结果显示，去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液在大鼠体内并无明显缓释作用。组织分布动力学考察实验结果表明，去甲基斑蝥酸钠在肾脏、肝脏、心脏及血浆中的分布较多，而在肺、脾及脑中几乎无分布。改变剂型后，除肝脏中的总分布略有改变外，基本未改变药物体内其它组织的分布特征。

以去甲基斑蝥酸钠溶液剂为参比制剂，测定大鼠体内的组织分布动力学特征，结果表明：将去甲基斑蝥酸钠制备成脂质微球后静脉给药后，未改变药物在大鼠脾、肺、肾、脑、及血浆中的滞留时间及药物分布量，在肝组织中的分布略有增加。

Claims (10)

1、一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：它包括去甲基斑蝥酸钠、脂溶性介质、水、表面活性剂和等渗调节剂，其中所述脂溶性介质以制剂计用量为5％至约30％，去甲基斑蝥酸钠以制剂计用量为0.01％至5％，表面活性剂以制剂计用量为0.5％至5％，等渗调节剂以制剂计用量为0.5％至5％，余量为水。

2、根据权利要求1所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：制剂中还含有金属螯合剂；等渗调节剂甘油、山梨醇、甘露醇、葡萄糖，及其混合物；还含有氢氧化钠，盐酸，及其混合物，其中螯合剂以制剂计用量为0％至1％，等渗调节剂以制剂计用量为0.5％至5％。

3、根据权利要求1所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：所述注射液包括供静脉输液用的含去甲基斑蝥酸钠的水包油乳剂，构成脂质微球注射液的组合物与水包油乳剂的组合物相同。

4、根据权利要求1或3所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：所述注射液应用界面膜载药的原理，注射液中去甲基斑蝥酸钠在油水两相的界面膜中有分布约占20～80％，其余部分去甲基斑蝥酸钠分布于水相及油相中。

5、根据权利要求1或3所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：所述注射液中去甲基斑蝥酸钠可以是去甲基斑蝥素，也可以是由去甲基斑蝥素在制剂制备过程中经过反应生成去甲基斑蝥酸钠。

6、根据权利要求1所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：所述的脂溶性介质选自矿物油，植物油，动物油，精油和合成油，或其混合物，所述表面活性剂选自磷脂，吐温，普朗尼克，油酸钠，油酸，胆酸，去氧胆酸及其混合物。

7、根据权利要求1所述的一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：所述油选自红花油，大豆油，玉米油，中链脂肪酸甘油三酯，薏苡仁油，鸦胆子油，及其混合物；其中所述磷脂选自卵磷脂，豆磷脂，或者是二者混合物；所述吐温选自吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，吐温85，或者是以上不同规格的任意比例混合物。

8、一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液的制备方法，包含以下步骤：将去甲基斑蝥酸钠超微颗粒混悬液或者是超微的粉末加入至不含去甲基斑蝥酸钠的空白乳剂或者是含有部分去甲基斑蝥酸钠的乳剂中经混合制得去甲基斑蝥酸钠脂质微球注射液。

9、一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：包含以下工艺步骤：将去甲基斑蝥酸钠加入至含有表面活性剂的水溶性介质中，然后与油相混合，经过高速搅拌制备初乳后，进行高压均质过程，制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

10、一种含有去甲基斑蝥酸钠的脂质微球注射液，其特征在于：包含以下工艺步骤：将去甲基斑蝥酸钠与脂溶性介质混和后，再分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳后，进行高压均质过程，制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

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