CN1786175A - 一种表达重组人tPA的质粒及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达重组人tPA的质粒及构建方法。本发明提供的质粒pETrtPAm－1，CCTCC M205111，其上克隆了一种重组突变人tPA基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。质粒可转化受体菌，获得工程菌株，经过诱导可以高效表达重组突变tPA蛋白。产生的重组tPA分子，不同于现有其它的重组人tPA，具有分子量小、活性强、半衰期长、稳定性高的特点。

Description

一种表达重组人tPA的质粒及构建方法

                          技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种表达重组人tPA的质粒，该质粒转化工程菌株可以产生重组突变tPA蛋白，可以用于临床上治疗急性心肌梗塞、脑血栓、肺栓塞等疾病，在医学上具有重要的应用价值；同时本发明也涉及该质粒的构建方法。

                          背景技术

人tPA是人的组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，tPA)，是一种丝氨酸蛋白酶。它含527个氨基酸，分子量68KD，能把无活性的纤溶酶原激活成为纤溶酶而发挥溶血栓作用，已在临床上用于急性心肌梗塞、脑血栓中风、肺栓塞等溶栓治疗，是目前国际上优良的溶栓药物，具有溶栓快，安全性高，愈后致残率低，对人无抗原性等优点。

tPA主要由血管内皮细胞表达分泌，血浆中浓度很低，约为5ng/ml，半衰期约5分钟，因此从血浆或组织中直接提取tPA不可能用于生产，只能采用基因工程技术进行生产。1987年，美国率先批准第一个基因工程技术生产的重组tPA用于临床治疗急性心肌梗塞，商品名为阿克伐司(Activase)，该产品属于全长的原始tPA，属tPA第一代产品，显著缺点是半衰期短(3-6分钟)，活性低，对病人血浆中较高浓度的tPA抑制物PAI无抗性，因而使用剂量极大，每支针含tPA 150-200mg，每支针的价格也十分昂贵。

为了解决原始tPA存在的问题，在tPA结构与功能研究的基础上，研究人员进一步对tPA进行氨基酸缺失和替换变异研究。tPA在结构上可划分为F区(手指区结构域，4-49aa)、E区(生长因子功能域，50-86aa)、K1区(kringle1，87-175aa)、K2区(kringle 2，176-261aa)和P区(蛋白酶区，262-527aa)五个独立的功能结构域(结构域的命名和编号根据基因库Genbank登录号码GI137119或文献Pennica D.et al.Nature 301：214，1983)。t-PA的各个特定结构域与t-PA各种生物学活性之间的关系已阐明，F区和K2区均能特异性结合于纤维蛋白凝块，K1区与肝脏受体结合有关，P区上含丝氨酸蛋白酶，负责将纤维酶原切割成纤维酶，其上含有tPA活性抑制物PAI的结合位点(aa296-299)。tPA中任何一个区的缺失或变异不影响其它区域的结构和活性，这为tPA的重组、改造(称之为tPA突变体)提供了基础。美国、德国、日本、英国等国家都在研究通过重组和变异改善tPA的性能，并拥有各自的知识产权，如德国宝丽曼(Boehringer Mannheim)公司开发的瑞替普酶(Reteplase，rPA)、美国基因泰克(Genentech)公司开发的TNK酶(Tenecteplase)、美国布里斯托尔-迈尔斯普博(Bristol-MyersSpuibb)公司开发的nPA酶(Lanoteplase)、日本卫材(Eisai)筑波研究所开发的孟替普酶(Monteplase)等。瑞替普酶(Reteplase)是一种用大肠杆菌***表达生产的重组tPA产品，由K2P两个结构区组成，缺失F、E、K1三个区域，含355个氨基酸(Kohnert U，et al.Protein Engineering 5：93，1992，专利号：EP 0 382 174 A1)。其性质与天然tPA分子有了较大改变，稳定性得到提高，半衰期提高为15-18分钟，但是与纤维蛋白的亲和力有较大下降，它与纤维蛋白的结合为可逆结合，结合能力大大低于天然tPA，并且瑞替普酶结构中仍含有tPA活性抑制物PAI的结合位点，体外试验显示5U/ml的PAI-1就能使5ng/ml的瑞替普酶失活。其比活性为5×10⁵IU/mg，使用剂量20-40mg，制剂在2℃保存有效期2年，溶解后稳定性差，临床上要求在4小时内使用。TNK酶是一种用中国仓鼠细胞(CHO)生产的全长tPA，含527个氨基酸，在三个位置共6个氨基酸发生替换变异，即K1区的Thr103和Asn117分别被Asn和Glu取代，P区的Lys296-His-Arg-Arg299被4个Ala取代。和原始t-PA相比，TNK酶体外抗PAI的活性提高80倍，半衰期延长4倍，在体内活性只有原始tPA的82％，结合纤维蛋白能力保留87％(Keyt.B.A.et al.PNAS、USA、91：3670，1994)。临床上TNK酶使用剂量还是比较大，每针含量达50mg。孟替普酶是一种由田鼠肾细胞生产的全长tPA，含527个氨基酸，将E区的Cys84置换为Ser，其作用效果与t-PA相似，激活纤溶酶原的能力在纤维蛋白存在时比纤维蛋白没有时强14.9倍，但其与纤维蛋白结合率约为原始t-PA的1/3，使其对血栓部位特异性有所下降。以上三种tPA突变体均已上市，另外还有一种正待美国食品及药品管理局(FDA)批准的tPA突变体nPA酶(Lanoteplase)，缺失了F、E区，并修饰了K1区的糖基化位点，与原始t-PA相比，其半衰期延长37min，并改善了溶栓活性，但降低了对纤维蛋白的亲和力，而且引起的颅内出血率高于t-PA。

尽管各种tPA突变体在不同的方面改善tPA的性能，但第二代重组tPA仍存在着热稳定性差，特异性不高、使用剂量大以及生产成本高的问题。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种能表达重组tPA的质粒pETrtPAm-1。质粒转化工程菌株，可以高水平地表达重组tPA，产生的重组tPA分子不同于现有的其它重组人tPA(如rt-PA、TNK酶、瑞替普酶reteplase等)，具有分子量小、活性强、半衰期长、稳定性高的特点。

本发明的另一个目的在于提供一种构建表达重组tPA质粒的方法，方法简捷，具有可重复性。本发明提供的质粒pETrtPAm保存于大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α，DH5α/pETrtPAm-1已提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年10月09日，保藏编号为CCTCCM205111，分类命名：Escherichia coli DH5α/pETrtPAm-1。

质粒pETrtPAm-1上含有重组突变tPA基因，该重组基因去除了天然tPA基因的K1和K2两个结构区，只包含F、E、P结构区，全长1083bp(见SEQ IDNO.1)，共编码360个氨基酸，并在三个位置造成氨基酸替换，即R298E(AGG-GAG)、R299E(AGG-GAG)、S262G(TCC-GGT)(数字代表是原始tPA分子中的氨基酸位置)，其中后两个位点的突变造成tPA抑制物PAI-1的结合力下降。该重组变异tPA与目前已有专利的突变tPA均不同，如瑞替普酶(reteplase，rPA)是由K2P两个结构区组成，缺失F、E、K1三个区域，含355个氨基酸(KohnertU，et al.Protein Engineering 5：93，1992，专利号：EP 0 382 174 A1)；TNK酶(Tenecteplase)是全长tPA，含527个氨基酸，在三个位置共6个氨基酸发生替换变异，即K1区的Thr103和Asn117分别被Asn和Glu取代，P区的Lys296-His-Arg-Arg299被4个Ala取代；孟替普酶(Monteplase)是一种全长tPA，是将E区的Cys84置换为Ser；nPA酶(Lanoteplase)由K1、K2、P区组成，缺失了F、E区，并修饰了K1区的糖基化位点。

质粒中重组tPA基因下游紧接一个翻译终止码TGA。重组质粒的翻译起始区域含Kozak序列CCATGG，Kozak序列上游是核糖体结合序列和T7启动子序列，在T7转录酶存在时能高水平表达产生重组突变tPA蛋白。

本发明涉及的重组突变tPA基因之序列，主要参照基因库Genbank登录号码GI 137119和文献(Pennica D.et al.Nature 301：214，1983)提供的tPA全基因序列和结构域编号进行。从脐带血管内皮细胞中提取总RNA，根据tPA基因cDNA的序列设计引物，用RT-PCR法扩增出全长cDNA序列，以之为出发序列构建重组突变人tPA基因。在获得重组突变tPA基因后，将之克隆到经过改造的表达质粒pET-His(pET-His质粒购自基因动力实验室有限公司)，获得重组质粒pETrtPAm-1。质粒pETrtPAm-1的构建流程如下：

1.tPA基因的FE片段和P片段的PCR扩增。

设计两对引物：

引物1：GAATTC GGATCCATGGGAAGATCTTACCAAGTGATC(下划线处是BamHI切割序列GGATCC，后接起始密码ATG，并含Kozak序列CCATGG，见斜粗体字母显示)

引物2：GTCGAC GGTACCCGTGGCCCTGGTATC(含KpnI切割序列GGTACC)

引物3：GTCGAC GGTACCTGCGGCCTGAGACAG(含KpnI切割序列GGTACC)

引物4：AGATCT AAGCTTCTCGAGTCACGGTCGCATGTTGTC(含HindIII切割序列AAGCTT)

用PCR方法分别扩增出tPA基因的FE片段(用引物1和2)和P片段(用引物3和4)。

2.获得重组tPA基因。

用限制性内切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用内切酶KpnI和HindIII切割P片段，用内切酶BamHI和HindIII切割pQE30质粒(购自QIAGEN公司)，用T4连接酶进行三片段连接，构建中间型重组质粒pQErtPA，上含重组tPA基因(rtPA基因)，由天然tPA基因的F、E、P结构区组成，不含K1和K2结构区，在起始密码处具有Kozak序列CCATGG)。

3.获得重组突变tPA基因(rtPAm-1基因)。

设计两条诱变引物：

引物5：CTCTCCGGGCGA CTCCTCGTGCTTGGCAAAGATGGC

引物6：GCCATCTTTGCCAAGCAC GAGGAGTCGCCCGGAGAG

采用PCR定点突变法在重组tPA基因上把原始tPA分子的R298、R299编码处都突变为E编码(密码由CTC变为GAG)，获得重组突变tPA基因，即rtPAm-1基因。

4.获得重组质粒pETrtPAm-1

首先对质粒pET-His进行改造，去除其上6His的编码区。根据pET-His质粒序列设计一对引物：

引物7：CGCTCCAGGGATCCGCAGAATTC(正向)

引物8：CATGAGCGGGATCCTTCTTAAAGTTAAAC(反向)

利用pET-His质粒DNA为模板，进行PCR扩增，然后用BamHI和HindIII切割扩增产物，获得经过改造的pET质粒片段，再将PCR产生的1.1kb的重组突变tPA基因(rtPAm-1基因)用内切酶BamHI和HindIII切割，用T4连接酶连接两片段，获得重组质粒pETrtPAm-1。

5.鉴定重组质粒pETrtPAm-1：用双酶切、PCR方法对重组质粒进行初步鉴定，再经过DNA测序进行最终确定。

测序证明重组突变人tPA基因序列完全符合预先设计。将获得的重组质粒pETrtPAm-1转化大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)(购自基因动力实验室有限公司)，在诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下可以高水平地产生rtPAm-1蛋白，蛋白分子量38kD，以包涵体的形式存在，表达量占总菌体蛋白的30％以上。利用10L发酵罐进行中试发酵生产，生产tPA的发酵表达水平可达到1100mg/L。rtPAm-1包涵体经过复性和纯化，用溶纤圈法检测，具有激活溶纤酶原溶纤活性的作用，活性达到5-6×10⁵IU/mg，达到或优于国际同类产品水平。动物试验表明rtPAm-1无毒性、无副作用，体内半衰期达20-30分钟。以上结果表明，本发明提供的质粒pETrtPAm-1表达重组突变tPA的能力强，产生的新型重组突变tPA分子与现有的tPA产品相比，具有分子量小、活性强、半衰期长、稳定性高的特点，在各项指标上达到或超过国际同类产品水平，具备生产应用价值。本发明之内容具有可重复性，普通技术人员按照本发明所提供的步骤，可以构建该质粒。

                        附图说明

图1质粒pETrtPAm-1构建示意图

1.重组tPA基因(rtPA基因)的获得。

设计两对引物，引物1和引物2用于扩增FE片段，引物3和4用于扩增P片段。以tPAcDNA为模板，通过PCR方法获得tPA基因的FE区、P区片段，两片段经过限制性内切酶切割，和酶切的pQE30质粒进行三片段连接，获得重组质粒pQErtPA，上含重组tPA基因，由原始tPA基因的F、E、P区组成。

2.重组突变rtPAm-1基因(rtPAm-1基因)的获得。

采用PCR定点突变法。设计两条诱变引物引物5和引物6，以pQErtPA为模板，分别用引物1和5、引物4和6进行PCR扩增。然后再将两种PCR产物混合，进行第二次PCR，两个片段可以互为模板——引物进行延伸，产生1.1Kb的重组突变tPA基因(rtPAm-1基因)。圆点显示设计的突变位点的位置。

3.对表达质粒pET-His进行改造，去除其上6His的编码区。

根据pET-His粒序列设计一对引物：引物7和引物8，以pET-His质粒DNA为模板，进行PCR扩增。然后用BamHI和HindIII切割扩增产物，得到没有6His编码区的pET质粒片段。

4.质粒pETrtPAm-1的获得。

将PCR产生的1.1kb的重组突变tPA基因(rtPAm-1基因)用内切酶BamHI和HindIII切割，用T4连接酶连接改造的pET质粒片段，获得重组质粒pETrtPAm-1。

图2质粒pETrtPAm-1的酶切鉴定和PCR鉴定(0.7％琼脂糖凝胶电泳)

1.经过改造的pET质粒。去除了6His编码区，其大小2.6kb。

2.DNA分子量标识(Marker)

3、4.pETrtPAm-1质粒经KpnI和HindIII双酶切产生的片段。其中0.8kb的带是rtPAm-1基因中的P片段，而2.9kb的带则是tPA的FE片段加上pET质粒片段。

5、6.以pETrtPAm-1为模板的PCR产物。1.1kb的扩增带是rtPAm-1基因片段。

图3.大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1诱导表达产生rtPAm-1蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)

1.经过LB、2YT液体培养基培养，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导前的大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1的菌体蛋白，没有出现rtPAm-1蛋白。

2.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导6h，超声波破碎大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1细胞，离心得到的上清中的蛋白。没有rtPAm-1蛋白。

3.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导6h，超声波破碎大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1细胞，离心得到的沉淀中的蛋白。出现rtPAm-1蛋白，箭头处显示rtPAm-1蛋白。rtPAm-1蛋白占到总细胞蛋白的30％以上，其大小约为38kD。

4.将诱导获得的rtPAm-1包涵体变性溶解于8M尿素，用pH8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)过夜透析复性，再利用分子筛层析柱G50-Sephadex进行纯化的rtPAm-1蛋白。经过上述处理，rtPAm-1蛋白的纯度达到95％以上。

5.蛋白质分子量标识(Marker)

图4.用溶纤圈法检测rtPAm-1蛋白的激活纤溶酶原溶纤活性作用

1.阴性对照：生理氯化钠溶液，点样2μl。没有出现溶纤圈。

2.标准对照：标准样人tPA样品，点样10单位(10IU)。出现溶纤圈。

3.实验组：经过复性和纯化的rtPAm-1蛋白，点样5μl。出现溶纤圈。

结果表明本发明之质粒pETrtPAm-1表达的rtPAm-1蛋白具有激活纤溶酶原溶纤活性的作用。

                        具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第二版，1992年，科学出版社)中所述的实验方法。

实施例1.质粒pETrtPAm-1的构建和鉴定

图1显示了重组突变tPA基因的构建原理和过程。天然的成熟的人tPA含527个氨基酸，由5个独立的结构区组成(F、E、K1、K2和P)，P区含tPA的抑制物PAI结合区和酶活性区，K2含PAI作用区和纤维蛋白结合区，K1与肝清除tPA有关，F区(指型结构区)与蛋白质相互作用有关，在K1K2缺失时，F区仍可以和纤维蛋白、纤溶酶原互相作用。本发明所设计的重组突变rtPAm-1基因，是考虑到增加tPA的稳定性、延长半衰期和增加对抑制物PAI的抗性。在设计基因重建和变异时，分两步进行，首先建构出含F、E、P的重组tPA基因(缺失K1和K2)，然后再在PAI作用位点引入氨基酸编码的替换突变，获得如SEQ ID NO.1所示的基因序列，最后将此基因连接到表达质粒中，构建成质粒pETrtPAm-1。具体实施方式如下：

1.tPA基因FE片段和P片段的PCR扩增

首先合成两对引物，用于两个片段的扩增

引物1：GAATTC GGATCCATGGGAAGATCTTACCAAGTGATC(下划线处是BamHI切割序列GGATCC，后接起始密码ATG，并含Kozak序列CCATGG)

引物2：GTCGAC GGTACCCGTGGCCCTGGTATC(含KpnI切割序列GGTACC)

引物3：GTCGAC GGTACCTGCGGCCTGAGACAG(含KpnI切割序列GGTACC)

引物4：AGATCT AAGCTTCTCGAGTCACGGTCGCATGTTGTC(含HindIII切割序列AAGCTT)

用tPA cDNA为扩增模板，一组反应管中加入引物1和引物2，用于扩增FE片段，另一组加引物3和4，用于扩增P片段，两组PCR反应条件相同：94℃5min，之后94℃1min，55℃1min，72℃1min共33个循环，最后72℃10min，PCR扩增产物经酚抽提，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。

2.重组质粒pQErtPA的构建

用内切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用KpnI和HindIII切割P片段，用BamH I和KpnI切割载体质粒pQE30，利用T4连接酶进行三片段连接，获得pQErtPA重组质粒，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在氨苄青霉素(Amp)-LB平板上筛选获取阳性菌落。

3.在重组tPA基因上把原始tPA分子的R298、R299编码处都突变为E编码

采用PCR定点突变法进行突变。首先合成两条诱变引物(下划线处代表突变处)：

引物5：CTCTCCGGGCGA CTCCTCGTGCTTGGCAAAGATGGC

引物6：GCCATCTTTGCCAAGCAC GAGGAGTCGCCCGGAGAG

以pQErtPA质粒为模板，分别用引物1和5，引物4和6进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃5min，之后94℃1min，52℃1min，72℃1min共33个循环，最后72℃10min。PCR扩增产物经酚抽提，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。然后将回收的两种PCR产物混合，进行第二次PCR，PCR反应条件为：94℃10min，之后94℃1min，53℃1min，72℃1min共33个循环，最后72℃10min。两个片段可以互为模板——引物进行延伸，产生1.1Kb的重组突变tPA基因，即rtPAm-1基因。

4.对表达质粒pET-His进行改造

表达质粒pET-His购自基因动力实验室有限公司。原始的pET-His质粒可表达出连续6个组氨酸以便于蛋白质纯化，但不符合生物制品制药要求，而提纯后再切割融合肽段则会增加工序和大幅提高生产成本。因此这一步骤的主要目的是除去pET-His质粒上6个组氨酸的编码区。图1所示，根据pET-His质粒的6His编码区左右两侧的序列各设计一条引物：

引物7：CGCTCCAGGGATCCGCAGAATTC  (正向)

引物8：CATGAGCGGGATCCTTCTTAAAGTTAAAC(反向)

利用上述引物，以pET-His质粒为模板进行PCR，PCR反应条件为：94℃10min，之后94℃1min，53℃1min，72℃3min共33个循环，最后72℃10min。PCR可得到一条线性DNA扩增产物，一端含酶切位点BamH I，另一端含酶切位点BamHI和HindIII(图1)。

5.重组表达质粒pETrtPAm-1的构建：

上一步PCR得到的线性DNA扩增产物用BamHI和HindIII切割，并用0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳进行回收，将第3步中PCR得到的rtPAm-1基因用BamHI和HindIII双酶切后并回收。用T4连接酶连接两片段，得到重组质粒pETrtPAm-1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落，经过鉴定(见下一步骤)，命名为DH5α/rtPAm-1。

6.质粒pETrtPAm-1的鉴定：

碱裂解法(参照萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第二版，1992年，科学出版社)从阳性菌落DH5α/rtPAm-1培养物中提取质粒pETrtPAm-1，用KpnI和HindIII双酶切，0.7％琼脂糖凝胶电泳检查，结果产生0.8Kb和2.9Kb两条带(图2)，与预期大小相符，其中0.8kb的带代表rtPAm-1基因中的P片段，而2.9kb的带则是FE片段加上pET质粒片段。进一步用PCR进行鉴定，以重组质粒为模板，用引物1和引物4进行PCR，可以得到大小为1.1kb的扩增带(图2)，与预期大小相符。

质粒上rtPAm-1基因的测序由英俊(invitrogen)生物技术有限公司进行。测序引物是利用pET-His质粒上的T7RNA聚合酶序列通用引物，测序结果表明获得的rtPAm-1基因序列与预期设计完全一致，rtPAm-1基因全长1083nt(包括终止密码TGA)，编码360个氨基酸的蛋白。将产生的质粒命名为pETrPAm。

实施例2质粒pETrtPAm-1在大肠杆菌中诱导表达rtPAm-1蛋白

1.质粒pETrtPAm-1的提取

将大肠杆菌菌株DH5α/rtPAm-1接种到LB液体培养基，37℃过夜培养，采用碱裂解法提取质粒(参照萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第二版，1992年，科学出版社)。

2.质粒pETrtPAm-1转化大肠杆菌BL21(DE3)

用冷CaCl2法制备BL21(DE3)感受态细胞，将pETrtPAm-1质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落。获得的菌株命名为BL21/rtPAm-1(参照萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第二版，1992年，科学出版社)。

3.从上一步骤的氨苄青霉素(Amp)-LB平板中挑选单菌落，接种到5ml含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃培养14小时，然后按1∶40转种到2YT培养基中，37℃培养2～3h，加入诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，37℃诱导6h。离心收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mMTris，0.5M NaCl，pH8.0)，超声波破碎菌体，离心收集沉淀，用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质表达情况。

图3显示，经过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后，大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1高效表达出rtPAm-1蛋白。表达的蛋白分子量约为38kD，与预期大小相符。表达蛋白呈包涵体形式，在细胞破碎后，全部出现在沉淀中，表达量占到细胞总蛋白的30％以上。

实施例3大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1在10升发酵罐中的生产水平

1.斜面种子培养。在氨苄青霉素(Amp)-LB平板中挑选BL21/rtPAm-1单菌落接种到LB斜面固体培养基，含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，37℃培养16小时。

2.摇瓶种子培养：2YT液体培养基，含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，每瓶100ml培养基，接种一环斜面种子，37℃振荡培养12-14小时。

3.发酵培养，所用培养基为发酵培养基：蛋白胨20g/L，酵母抽提物8g/L，NaCl2g/L，MgSO₄0.2g/L，泡敌20μl/L，纯净水配制，培养基体积10升。消毒前调节pH值至7.0。蒸汽消毒，缸压0.1mpa(120℃)20分钟。

发酵培养的控制条件和参数：

培养基体积10升，pH6.8-7.0；

接种量5％-10％；

搅拌机转速40Hz；

温度控制范围35-37℃；

罐压0.05-0.07Mpa；

通气量3-5升/min(1∶0.3-1∶0.5)

按上述条件和参数，培养至菌量6-8克/升、pH值上升到7.2、DO下降至20％以下时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，35-37℃继续培养，诱导蛋白质表达6-8小时。发酵全程为10-12小时。

发酵可得到重组tPA的包涵体。用10升全自动发酵罐连续发酵生产10批次，菌体产量(离心沉淀湿重)稳定在8.0-10.0g/L，tPA晶体(纯化后，湿重)稳定在900-1200mg/L，平均产量达到1100mg/L。tPA晶体经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查，tPA蛋白含量约为90％。

实施例4rtPAm-1蛋白质的复性和纯化

1.离心收集经过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌BL21/rtPAm-1菌体，悬浮于缓冲液A(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0)。

2.超声波破碎细胞，离心收集沉淀，蒸馏水洗涤3次后，溶解于8M尿素，在4℃条件下，用pH8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)过夜透析复性。

3.利用用分子筛层析柱G50-Sephadex(购自安玛西亚公司)进行纯化，柱子用10mMTris-Cl(pH7.5)平衡，上柱量为柱床体积20％，用10mMTris-Cl(pH7.5)，0.15-0.5M NaCl梯度洗脱，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)监视收集，tPA最先直接从柱中流出，后为分子量30KD以下的蛋白。

图3泳道4显示经过变性溶解、复性和纯化后的rtPAm-1蛋白，经过分子筛层析纯化后，rtPAm-1蛋白的纯度可达95％以上。

实施例5rtPAm-1蛋白的活性检测

采用溶圈法进行，步骤如下：

1.tPA标准品：购自***北京药品生物制品检定所，每瓶含tPA30000IU，用3ml生理氯化钠溶液溶解，使tPA浓度为10IU/μl。

2.人凝血酶：用生理氯化钠溶液配成100IU/ml，于-20℃保存。

3.纤溶酶原：购自北京药品生物制品检定所，用生理氯化钠溶液配成0.5mg/ml。

4.人纤维蛋白原：30mg/支，中国药品生物制品检定所制备标准试剂。实验前配置，配置前先在37℃水浴预热15min，生理氯化钠溶液也同时预热，然后每支加5ml生理氯化钠溶液，37℃水浴静置保温30min使其完全溶解，配置成6mg/ml溶液。

5.纤维蛋白平板制备：称取125mg琼脂糖，加入23ml生理氯化钠溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加入280ul纤维蛋白(0.5mg/ml)，加入14μl凝血酶(100IU/ml)，不停摇匀，混浊后倒平板，水平放置，室温凝固。

6.活性检测：用打孔器在纤维蛋白平板上打孔，直径2mm，将tPA样品和标准品点入孔中，37℃8小时，测量透明圈直径。根据标准tPA和rtPAm-1样品的透明圈直径大小，计算出样品活性。

结果见图4，经过变性、复性及纯化后的rtPAm-1能够激活纤溶酶原产生溶纤圈，经过与标准tPA的换算，活性达到5-6×10⁵IU/mg，达到国际同类产品的水平。

实施例6动物试验

1.rtPAm-1的体内半衰期

取家兔三只，按10万单位/公斤的剂量从耳静脉注射，注射结束后5分钟第一次采血样，加到有抗凝剂的小管中，离心1500转/分沉淀细胞，取5μl上清测tPA活性，以后每5分钟采一次血样测tPA活性，计算tPA活性下降50％的平均时间。经过测定rtPAm-1在家兔体内的半衰期20-30分钟。

2.异常毒性试验：

按尾静脉注射和腹腔注射两个试验组进行，按每公斤体重5万单位tPA剂量注射，每个样品注射20只，另用20只注射无菌生理盐水为对照租，连续观察7天。结果两个试验组的小鼠在7天内全部健存，无异常反应，体重增长，活动和进食正常。

                     SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学武汉陆地生物工程有限公司

<120>一种表达重组人tPA的质粒及构建方法

<130>一种表达重组人tPA的质粒及构建方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1083

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

atgggaagat cttaccaagt gatctgcaga gatgaaaaaa cgcagatgat ataccagcaa     60

catcagtcat ggctgcgccc tgtgctcaga agcaaccggg tggaatattg ctggtgcaac    120

agtggcaggg cacagtgcca ctcagtgcct gtcaaaagtt gcagcgagcc aaggtgtttc    180

aacgggggca cctgccagca ggccctgtac ttctcagatt tcgtgtgcca gtgccccgaa    240

ggatttgctg ggaagtgctg tgaaatagat accagggcca cgggtacctg cggcctgaga    300

cagtacagcc agcctcagtt tcgcatcaaa ggagggctct tcgccgacat cgcctcccac    360

ccctggcagg ctgccatctt tgccaagcac gaggagtcgc ccggagagcg gttcctgtgc    420

gggggcatac tcatcagctc ctgctggatt ctctctgccg cccactgctt ccaggagagg    480

tttccgcccc accacctgac ggtgatcttg ggcagaacat accgggtggt ccctggcgag    540

gaggagcaga aatttgaagt cgaaaaatac attgtccata aggaattcga tgatgacact    600

tacgacaatg acattgcgct gctgcagctg aaatcggatt cgtcccgctg tgcccaggag    660

agcagcgtgg tccgcactgt gtgccttccc ccggcggacc tgcagctgcc ggactggacg    720

gagtgtgagc tctccggcta cggcaagcat gaggccttgt ctcctttcta ttcggagcgg    780

ctgaaggagg ctcatgtcag actgtaccca tccagccgct gcacatcaca acatttactt    840

aacagaacag tcaccgacaa catgctgtgt gctggagaca ctcggagcgg cgggccccag    900

gcaaacttgc acgacgcctg ccagggcgat tcgggaggcc ccctggtgtg tctgaacgat    960

ggccgcatga ctttggtggg catcatcagc tggggcctgg gctgtggaca gaaggatgtc   1020

ccgggtgtgt acaccaaggt taccaactac ctagactgga ttcgtgacaa catgcgaccg   1080

tga                                                                 1083

Claims (3)

1、一种表达重组人tPA的质粒，其特征在于质粒pETrtPAm-1，该质粒保存于大肠杆菌菌株DH5α，DH5α/pETrtPAm-1保藏编号为CCTCC M205111。

2.根据权利要求1所述的一种表达重组人tPA的质粒，其特征在于：质粒pETrtPAm-1含有一种重组突变人tPA基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.一种用于实现权利要求1所述质粒的构建方法，它包括下列步骤：

A.tPA基因的FE片段和P片段的PCR扩增：

设计两对引物：

引物1：GAATTCGGATCCATGGGAAGATCTTACCAAGTGATC；

引物2：GTCGACGGTACCCGTGGCCCTGGTATC；

引物3：GTCGACGGTACCTGCGGCCTGAGACAG；

引物4：AGATCTAAGCTTCTCGAGTCACGGTCGCATGTTGTC；

以人tPA cDNA为模板，用PCR方法，用引物1和2扩增出tPA基因的FE片段，用引物3和4扩增P片段；

B.获得重组tPA基因：

用限制性内切酶BamHI和KpnI切割FE片段，用内切酶KpnI和HindIII切割P片段，用内切酶BamHI和HindIII切割pQE30质粒，用T4连接酶进行三片段连接，构建重组质粒pQErtPAm-1，上含重组tPA基因，由天然tPA基因的F、E、P区组成，不含K1和K2区，在起始密码处具有Kozak序列CCATGG；

C.获得重组突变tPA基因：

设计一对诱变引物：

引物5：CTCTCCGGGCGACTCCTCGTGCTTGGCAAAGATGGC

引物6：GCCATCTTTGCCAAGCACGAGGAGTCGCCCGGAGAG

采用PCR定点突变法，在重组tPA基因上把原始tPA分子中的R298、R299编码处都突变为E编码，获得重组突变tPA基因，即rtPAm-1基因；

D.获得重组质粒pETrtPAm-1：

首先对质粒pET-His进行改造，去除其上6His的编码区，根据pET-His质粒序列设计一对引物：

引物7：CGCTCCAGGGATCCGCAGAATTC；

引物8：CATGAGCGGGATCCTTCTTAAAGTTAAAC；

利用pET-His质粒DNA为模板，进行PCR扩增，然后用BamHI和HindIII切割扩增产物，得到改造的pET质粒片段，再将PCR产生的1.1kb的重组突变tPA基因用内切酶BamHI和HindIII切割，用T4连接酶连接两片段，获得重组质粒pETrtPAm-1。

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