CN1774431A - 从天然原料分离和提纯紫杉醇的改进方法 - Google Patents

从天然原料分离和提纯紫杉醇的改进方法 Download PDF

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Abstract

公开了一种从含紫杉醇的紫杉烷天然来源提取和纯化紫杉醇的方法，包括步骤：a)用去离子或纯水洗涤含有紫杉醇的原料，该原料来自紫杉烷天然来源，所述的洗涤将可溶杂质从所述原料中除去；b)用有机溶剂萃取洗涤后的原料，得到含紫杉醇的湿原料；c)将所述的湿原料和盐接触，通过沉淀得到生物质，然后分离并干燥所述的生物质；d)通过将所述生物质溶于丙酮或丙酮－己烷混合物中从这样分离并干燥的生物质除去树脂和天然色素，然后向其中加入至少一种极性溶剂直至得到富含紫杉醇的油相；e)将前述步骤中得到的富含紫杉醇的油相在挥发性溶剂中用色谱法提纯至少一次，得到提纯的溶液，然后将通过色谱法得到的提纯溶液至少结晶一次。这种方法有利地减少了杂质和通过沉淀从生物质中得到紫杉醇及其类似物萃取物的体积，减少了提纯的步骤，增加了得到的紫杉醇的量；并且将生产成本降低到更经济的水平。

Description

从天然原料分离和提纯紫杉醇的改进方法
技术领域
本发明涉及一种从天然原料分离和提纯紫杉醇的改进方法。
背景技术
本申请人CHAICHEM PHARMACEUTICALS INTERNATIONAL的美国专利No.6,452,024及其相应的外国专利公开并要求保护以前的类型的方法，与该美国专利的前序中作为先有技术公开的所有以前的方法相比，其特别令人感兴趣。更准确地说，在该美国专利中公开的方法很有意义，是因为其可以：
-在萃取不同种的紫杉的树皮、针叶和/或树枝后更容易地得到生物质(biomass)；
-增加这样得到的并且必须要通过色谱法提纯的生物质的量；
-减少提纯的步骤；
-增加得到的紫杉醇的量；和
-将生产成本降低到更经济的水平。
在该美国专利No.6,452,024中公开的方法基本上包括下述步骤：
a)用有机溶剂从紫杉烷的天然来源萃取含有紫杉醇的原料；
b)将所述原料与碱性或酸性介质接触，沉淀得到生物质，分离并干燥所述的生物质；
c)通过将生物质溶于丙酮从分离和干燥的生物质中除去树脂和天然色素，然后向其中加入至少一种非极性溶剂(诸如己烷或庚烷)直至得到富含紫杉醇的油相。
d)将前述步骤收集的富含紫杉醇的油相与酸性介质接触(当步骤(b)用碱性介质进行时)或与碱性介质接触(当步骤(b)用酸性介质进行时)，以便通过沉淀得到沉淀物，分离沉淀物并将其干燥；和
e)将分离到的沉淀在挥发性溶剂中的溶液用色谱法提纯至少一次，然后将通过色谱法得到的提纯溶液结晶至少一次。
在上述美国专利中，还公开了步骤(e)优选包括：
e1)第一次色谱提纯，包括将在步骤(d)分离的沉淀溶于挥发性溶剂，制备这样得到的溶液与硅胶的混合物，将该混合物在含有硅胶的色谱柱中处理，回收富含紫杉醇的级分；
e2)第二次色谱提纯，包括将前一步骤回收的富含紫杉醇的级分蒸发至干直至得到残余物，然后将所述残余物溶于挥发性溶剂制备混合物，所述混合物用色谱法在与前述子步骤相同的条件下再提纯以便得到另一富含紫杉醇的级分；
e3)第一次结晶，包括将在前述子步骤得到的另一富含紫杉醇的级分蒸发至干直至得到残余物，将所述残余物溶于丙酮制成混合物，用非极性溶剂结晶含于所述混合物中的紫杉醇；
e4)第二次结晶，包括将前述子步骤得到的紫杉醇晶体溶于丙酮，然后在与前述子步骤相同的条件下重结晶所述紫杉醇；
e5)第三次色谱法提纯，包括将前述子步骤重结晶得到的晶体溶于挥发性溶剂得到溶液，制备所述溶液与硅胶的混合物，将所述混合物在含有硅胶的色谱柱中处理以便用洗脱溶剂得到再一种富含紫杉醇的级分；和
e6)第三次结晶，包括将前述子步骤得到的再一种富含紫杉醇的级分蒸发至干直至得到残余物，将所述残余物溶于醇、酮、或醇-酮混合物得到另一种混合物，用水结晶所述另一种混合物中所含的紫杉醇。
如前所述，上述美国专利No.6,452,024中公开的方法由于比现有方法更简单、有效且更经济而非常令人感兴趣。但是，该方法仍然需要许多通过色谱法和结晶纯化的分离步骤，当用紫杉烷天然来源的针叶和枝条进行萃取时，需要除去大量的溶剂可溶性杂质。这仍然导致了高生产成本，特别是因为在不同种紫杉中紫杉醇的含量低。另外，可被提纯的生物质的量是非常有限的，因为色谱柱的尺寸很小以及在提纯后得到的紫杉醇产量低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的方法，解决了上文提及的大部分问题。
更具体地，本发明的目的是提供一种改进的方法，其能够：
-在萃取不同种类的紫杉的树皮、针叶和/或枝条后得到含更多紫杉醇及其类似物的溶液；
-减少杂质，并减小通过沉淀从生物质中获得的紫杉醇及其类似物萃取液的体积；
-进一步增加必须通过色谱法提纯的生物质的量；
-进一步减少提纯步骤；
-进一步增加得到的紫杉醇的量；并且
-进一步将生产成本降低到更经济的水平。
根据本发明的从含紫杉醇的紫杉烷天然来源提取和纯化紫杉醇的改进方法包括下述基本步骤：
a)用去离子或纯水洗涤含有紫杉醇的原料，所述原料来自所述紫杉烷的天然来源，所述的洗涤能够将可溶性杂质从所述原料中除去；
b)用有机溶剂从所述洗涤后的原料中，萃取出含紫杉醇的湿原料；
c)将所述的湿原料和盐接触，通过沉淀得到生物质，然后分离并干燥所述的生物质；
d)通过将所述生物质溶于丙酮或丙酮-己烷混合物中从这样分离并干燥的生物质除去树脂和天然色素，然后向其中加入至少一种极性溶剂直至得到富含紫杉醇的油相；
e)将前述步骤中得到的富含紫杉醇的油相在挥发性溶剂中用色谱法提纯至少一次，得到提纯的溶液，然后将通过色谱法得到的提纯溶液至少结晶一次。
这样得到的结晶产物实际上是紫杉醇晶体的混合物，所述晶体被过滤并干燥后，其基本上由下述成分组成：
-约60％纯度高于99％的晶体，；
-约30％纯度高于98％(＜99％)的晶体，；和
-约10％纯度高于92％(＜98％)的晶体。
纯度小于99％的晶体可被分离，混合在一起，然后通过色谱提纯以便得到更多纯度高于99％的最终产物。
参考附图和所附的实施例，通过阅读下述非限制性的描述可更好地理解本发明与最接近先有技术的根本区别、其优点和其可简化实施的方式。
附图说明
图1a和1b是根据本发明方法的基本步骤和在最接近先有技术(即，美国专利No.6,452,024)中所公开方法的流程图的比较。
发明详述
如前所述，根据本发明的改进方法用于从原料中萃取和提纯紫杉醇，所述原料来自含有要被萃取的紫杉醇的紫杉烷的天然来源。
用于进行根据本发明方法的、用作起始原料的紫杉烷天然来源是紫杉属的。更具体地，其包括任何含紫杉醇及其衍生物的针叶树种。这类含紫杉醇的针叶树树种可以包括短叶紫杉、欧洲紫杉、加拿大紫杉、喜马拉雅紫杉、云南紫杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、东北紫杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
根据本发明的方法的优点是可使用含紫杉醇的紫杉烷天然来源的任何部分。优选使用所选择的一种或多种针叶树的树皮。或者，使用所选择的针叶树的枝条和针叶。
根据本发明方法的各个步骤的详细说明
步骤1-洗涤
根据本发明的改进方法的第一步包括用去离子水或纯水洗涤来自紫杉烷天然来源的含紫杉醇及其类似物的原料。原料可以包括树皮、枝条、针叶等，将其用水完全浸没，在20-100℃之间的温度进行或不进行搅拌(优选在20-25℃)2至24小时(优选3小时)。之后将水排干。这能够将水溶性杂质从原料中除去。
步骤2-萃取
所述改进方法的第二个步骤包括用有机溶剂从第一步骤得到的洗涤后的原料萃取出含有紫杉醇及其类似物的湿原料。
在该萃取步骤中使用的有机溶剂优选选自醇、酮和其混合物。作为这类优选的溶剂，可提及的有甲醇、丙酮以及甲醇和丙酮的混合物。
在使用醇和酮的混合物的情况下，醇和酮优选以9∶1至1∶9之间的体积比存在。更优选混合物的体积比等于约1∶1。
还优选将这样得到的萃取液过滤除去沉淀，然后转移到双层壁罐中，在双层壁中间通入优选65-70℃的热水。从罐中蒸馏有机溶剂。通常，收集的溶剂量是起始体积的约70％。其余的含紫杉醇的溶液随后被排入另一个罐。该余液实际上是非浓缩的萃取液，因为其中含有残余水。
步骤3-生物质的分离
根据本发明的改进方法的第三个步骤包括从前述步骤得到的溶液分离生物质。
为了该目的，从前述步骤得到的非浓缩萃取液用甲醇和水稀释，然后盐析得到生物质沉淀。优选将氯化钠作为盐析萃取液所用的盐。但是，其它的盐可以用于相同的反应，如氯化铵、硫酸铵、乙酸钠或乙酸钾、氯化钾、磷酸钠或磷酸钾或柠檬酸钠或柠檬酸钾，所有这些盐是在水溶液中可溶的。
优选将氯化钠(或任何其它选择的盐)迅速地在剧烈搅拌下加入到非浓缩萃取液中。通过以每升溶液含有10-200克之间的浓度加入氯化钠，需要的生物质迅速形成。优选加入的氯化钠的浓度是每升非浓缩萃取溶液用50-100克，优选50-75克。
形成并已经沉淀出的生物质通过过滤或离心从溶液分离。这样分离的生物质是湿的，可将其立即送入下一步骤，或在空气或真空下干燥，优选通过通风或冷冻干燥。
步骤4-除去树脂和天然色素
根据本发明的改进方法的第四个步骤包括处理前述步骤分离到的生物质以便除去其中所含的树脂和天然色素。
这一步骤可根据在前述步骤中得到的生物质的种类进行，即，取决于其是干的还是湿的。
A-当在先的沉淀步骤得到的生物质是干燥的时，则通过向其中加入丙酮和己烷的混合物(优选体积比1/1)将其返回到溶液中，丙酮和己烷的混合物优选等同于沉淀前在步骤2中得到的非浓缩萃取液的体积的约1/25。
更优选通过先加入丙酮和己烷的混合物然后加入1.5体积的另外的纯己烷将干燥的生物质返回到溶液中。丙酮对己烷的最终比例是1体积丙酮对4体积己烷。在这种溶解后，将纯水加入到得到的溶液中形成富含紫杉醇的油相。基于每100体积所加入的丙酮，优选以2-10体积、更优选5-7体积的量加入水。
然后将这样得到的混合物送入滗析瓶。回收沉在瓶底的含紫杉醇及其它紫杉烷的油相。然后蒸发该油相，准备在硅胶上用色谱法提纯。
B-当在第三个步骤中离心后得到的生物质是湿的时(即，其没有进行干燥)，则将这种湿的生物质返回到丙酮和己烷混合物(优选A体积比1∶1)形成的溶液，而不加入任何水。丙酮的体积优选等于在沉淀前第二步骤得到的非浓缩萃取液体积的约1/20。
在这种溶解后，将至少一种非极性溶剂加入得到的溶液中形成富含紫杉醇的油相，以相同的方法将其从己烷分离。
用于该目的的一种或多种非极性溶剂优选选自与丙酮混溶的烃类，如戊烷、己烷或庚烷。当使用己烷时，通常所用己烷的体积是丙酮溶液体积的3-4倍。
在湿生物质含水太多的情况下，得到的富含紫杉醇的油相必须在将其涂敷在硅胶上之前进行处理除去残余水，将这样涂敷后的硅胶进行色谱法以便回收和提纯紫杉醇及其类似物。除去水可使在将涂敷的硅胶在加载到色谱柱上之前更迅速地干燥。
在富含紫杉醇的油相中的残余水可通过用与水不溶混的溶剂萃取除去。然后倾析混合物，将有机相与水分离。使用的不溶于水的溶剂优选选自卤代烃或醚。作为这类溶剂的实例可提及的有二氯甲烷、三氯甲烷和***。
将得到的萃取液回收，在真空下浓缩，并且就此准备在硅胶上用色谱法提纯。
步骤5-色谱法提纯
根据本发明的方法的第五个步骤和最后一个步骤是色谱提纯至少一次在前述步骤得到的富含紫杉醇的油相，然后将通过色谱法得到的提纯溶液结晶至少一次。
为此，将第四个步骤得到的浓缩的富含紫杉醇的油相进行至少一次色谱提纯，然后将通过色谱法得到的提纯溶液至少结晶一次。但是优选将第四个步骤得到的浓缩的富含紫杉醇的油相进行若干次色谱提纯和若干次结晶，色谱提纯的次数优选两次，结晶次数优选三次。
现将这些逐步提纯和结晶作为子步骤A至E进行描述。
A-第一次色谱提纯
在第一次色谱提纯步骤中，在本方法第四个步骤得到的富含紫杉醇的油相与硅胶混合，然后通风干燥。将涂敷了所述油相的硅胶装载到含有相同类型硅胶的色谱柱上。在柱中，提纯紫杉醇，所用洗脱混合物含有30-40％的丙酮和60-70％的己烷。优选洗脱混合物含约35％的丙酮和约65％的己烷。
使用的柱优选高142厘米，内径7.6厘米或15.2厘米，这取决于被提纯的紫杉醇的量。优选含4-6克紫杉醇的富含紫杉醇的油相在直径7.6厘米的柱中提纯。含20-24克紫杉醇的油相使用柱直径15.2厘米的柱。较小的柱(7.6厘米直径)含2.2-2.3公斤硅胶，较大的柱(15.2厘米直径)含8-9公斤硅胶。
柱的硅胶用由丙酮和己烷组成的洗脱混合物洗涤和平衡。级分的洗脱用相同的溶剂混合物进行，优选在7.6厘米直径柱中流速约100毫升/分钟，在15.2厘米直径柱中流速400毫升/分钟。在两种情况下，体积优选控制在0-30psi的压力下。
B-第一次结晶
B.1-在这一步骤，将在前述步骤通过色谱法得到的含紫杉醇的级分蒸发至干，然后返回丙酮形成溶液。调节丙酮的量从而使对于相应于紫杉醇HPLC分析峰最大值所述溶液在228nm的吸光度为1.0-1.5O.D.。然后通过在该丙酮溶液中加入3-4体积己烷结晶紫杉醇。
B.2-或者，将在前步骤通过色谱法得到的含紫杉醇的级分通过蒸发减少到初始体积的1/5或直至对于相应于紫杉醇HPLC分析峰最大值达到1.0-1.5O.D.。这样，紫杉醇留在丙酮-己烷(35-65％)溶剂混合物中。然后，通过在该溶液中加入2-3体积己烷结晶紫杉醇。
晶体迅速形成。混合物在室温或在2-8℃温度下放置过夜以完成结晶。
C-第二次结晶
在这一步骤，在前述步骤通过结晶得到的晶体通过过滤或离心分离，然后返回到丙酮中形成溶液，调节丙酮的体积从而使对于相应于紫杉醇HPLC分析的峰所述溶液的吸光度为1.0-1.5O.D.。
然后通过向丙酮溶液中加入每体积丙酮溶液3-4体积己烷重结晶该溶液所含的紫杉醇。
在这一步骤得到的晶体通过HPLC分析，紫杉醇纯度在85-95％之间。
通过过滤从上述两个结晶步骤分离晶体后，将己烷相与从第一次色谱法得到的级分混合，该级分相应的峰被确定为9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素(acetylbaccatin)III。在达到紫杉醇峰之前，该成分在若干级分中被洗脱。然后将混合物蒸发至干。这样获得的残余物通过加入甲醇转化为浅黄色9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III晶体。过滤分离晶体，然后返回到丙酮中形成溶液，加入4体积的己烷快速结晶。在这一步骤通过过滤得到的9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III晶体可用与上述公开的相同方法重结晶，HPLC分析表明纯度高于98％。
D-第二次色谱提纯
D.1在这一步骤中，过滤在前述步骤得到的紫杉醇晶体，然后返回到丙酮中形成溶液。过滤该紫杉醇溶液除去不溶于丙酮的颗粒。然后将这样得到的溶液与硅胶混和并通风干燥。
将涂敷了紫杉醇的硅胶装载到含有相同类型硅胶的色谱柱上。然后用基于洗脱混合物的有机溶剂第二次重提纯紫杉醇。优选洗脱混合物包括30-40％的丙酮和70-60％的己烷。
更优选步骤C得到的晶体用丙酮溶解，与硅胶混合，然后干燥。将被紫杉醇浸渍的硅胶加载到色谱柱上(优选142厘米长、7.6厘米或15.2厘米内径，取决于被提纯的紫杉醇的量)。7.6cm直径的柱可含2.2至2.3公斤的硅胶，15.2厘米直径的柱可含8公斤的硅胶。在柱中的硅胶用丙酮和己烷(优选35∶65％每体积)组成的溶液洗涤和平衡。级分的洗脱用相同的溶剂混合物进行，优选在7.6厘米直径的柱中流速约100毫升/分钟，或者在15.2厘米直径的柱中流速400毫升/分钟。两种柱都在0-30psi的压力操作。
D.2或者，过滤在前述步骤C得到的紫杉醇晶体，然后返回到二氯甲烷中形成溶液。过滤该紫杉醇溶液除去不溶于二氯甲烷的颗粒。
然后将这样得到的溶液与硅胶混和并通风干燥。将涂敷了紫杉醇的硅胶装载到含有相同类型硅胶的色谱柱上。然后用基于洗脱混合物的有机溶剂第二次重提纯紫杉醇。优选洗脱混合物包括95-98％的二氯甲烷和2-5％的异丙醇。更优选步骤C得到的晶体用二氯甲烷溶解，与硅胶混合，然后干燥。将被紫杉醇浸渍的硅胶加载到色谱柱上(优选142厘米长、7.6厘米或15.2厘米内径，取决于被提纯的紫杉醇的量)。7.6厘米直径的柱可含2.2至2.3公斤的硅胶，15.2厘米直径的柱可含8公斤的硅胶。在柱中的硅胶用二氯甲烷和异丙醇(优选97.5∶2.5％每体积)组成的溶剂洗涤和平衡。级分的洗脱用相同的溶剂混合物进行，优选在7.6厘米直径的柱中流速约100毫升/分钟，在15.2厘米直径的柱中流速400毫升/分钟。
E-第三次结晶
在这一步骤中，在步骤D通过色谱法回收的富含紫杉醇的级分根据它们的纯度合并，优选根据98-99％和90-98％的纯度合并。然后将其蒸发至干，然后溶于丙酮、醇(乙醇)、乙酸乙酯或***中形成溶液。
调节加入的丙酮的体积使得相对于根据HPLC分析紫杉醇相应的峰溶液的吸光度为1.0-1.5O.D.。当使用上述的其它溶剂时，即，醇(乙醇)、乙酸乙酯或***，紫杉醇浓度更加重要，通常是紫杉醇丙酮溶液浓度的5倍以上。
然后将紫杉醇进行第三次重结晶，优选如下：
1.通过在丙酮溶液中加入每体积丙酮3-4体积的己烷。
2.通过在醇溶液或乙酸乙酯溶液中加入每体积醇或乙酸乙酯至少3体积的己烷。
3.通过在***溶液中加入每体积***至少2体积的己烷。
在上文公开的最后提纯和重结晶步骤中，在紫杉醇溶液中加入己烷可在室温进行。这会减慢晶体的形成，但是在2-4℃或在室温过夜后将会结晶完全。过滤晶体，在真空下干燥，以便得到细小的分离的粉末。然后将所述晶体溶于醇(甲醇或乙醇)或丙酮，之后加入水中形成悬浮液，在约-60℃的温度在66-72小时期间冷冻干燥。
然后将得到的紫杉烷级分用HPLC色谱(Waters system)分析，使用自动取样器(Waters 717 plus)、光二极管矩阵检测器(Waters 996)、多溶剂输送***(Waters 600E)和C18 Nova-Pak柱、60、4μm(3.9×150毫米)。
级分的分析可通过注入5ul进行。以流速1毫升/分钟采用乙腈-水-甲醇的溶剂梯度(开始为25∶50∶30体积比，最终为35∶35∶30体积比)洗脱所述的柱。
在228nm测定化合物的峰，样品的分析时间约36分钟。紫杉醇峰的保留时间约18.9±0.2分钟，而9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III峰为6.5±0.2分钟。
优选在色谱提纯步骤用于溶解残余物的挥发性溶剂选自丙酮、C1-C3轻醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或这些溶剂的混合物。
在该步骤E的结束，在己烷中结晶紫杉醇后和在过滤并干燥后，得到紫杉醇晶体的混合物。该紫杉醇晶体混合物的组成是：
-60％纯度高于99％的晶体，
-30％纯度高于98％低于99％的晶体，和
-10％纯度高于92％低于98％的晶体。
本发明和申请人的美国专利No.6,452,024公开和要求保护的方法之间的根本区别
如前所述，附图1a和1b是美国专利No.6,452,024中公开和要求保护的方法的基本步骤与本发明方法比较的流程图：
1.如这些流程图中所示，在根据本发明的方法中，含待萃取的紫杉醇的原料优选由干燥的针叶和枝条构成，将其在用诸如甲醇或丙酮的有机溶剂萃取之前用纯水洗涤。在这种洗涤之后得到的水含一些水溶性的被丢弃的成分。然后将湿的针叶和枝条用甲醇或丙酮或两者的混合物“覆盖”，随后在20℃进行一段时间的萃取，例如16个小时。然后将萃取液通过一个筒式过滤器，注入一个双层壁的罐，通过循环夹套中加热的水蒸馏溶剂。如前所述，含一些残余水的萃取液被称作“非浓缩的萃取液”。
相反，在美国专利No.6,452,024中，是用甲醇和二氯甲烷的溶剂混合物直接进行干燥的针叶和枝条的萃取。在蒸馏之后得到浓缩的萃取液非常粘滞(visquous)并且含有大量的树脂和天然色素。该萃取液可被称作“浓缩的萃取液”。
2.在根据本发明的方法中，将氯化钠加入到非浓缩的萃取液，形成的生物质立即沉淀出来。该生物质通过离心分离。
在美国专利No.6,452,024中，先前在甲醇中稀释的浓缩萃取液在碱性或酸性介质中沉淀得到生物质。形成的沉淀非常细小和轻，在分离前通过加入氯化钠盐析。
3.然后，在根据本发明的方法以及在美国专利No.6,452,024公开的方法中，生物质溶于丙酮，将给定量的(优选4体积)的非极性溶剂(如己烷)加入到丙酮溶液形成富含紫杉醇的油相。
但是在根据本发明的方法中，这样得到的富含紫杉醇的油相易于在色谱柱中用硅胶在低压力下提纯。相反，在美国专利No.6,452,024公开的方法中，得到的富含紫杉醇的油相必须在酸性或碱性介质中进行第二次沉淀。在通过添加氯化钠盐析后，通过离心分离沉淀。将得到的沉淀干燥，然后溶于丙酮。只有在那时丙酮溶液易于在色谱柱中用硅胶在低压力下提纯。
4.在根据本发明方法的第一次色谱提纯中，富含紫杉醇的油相与硅胶混合，然后通风干燥。然后将被生物质覆盖的硅胶加载在色谱柱上。紫杉醇用丙酮和己烷的洗脱混合物提纯。将通过色谱法得到的含紫杉醇的级分收集在一起，然后结晶。通过过滤或离心得到的晶体溶于丙酮，然后第二次重结晶。通过过滤或离心分离晶体，易于第二次再提纯和最后用硅胶在低压的色谱柱提纯。
在美国专利No.6,452,024公开的方法的第一次色谱提纯步骤中，富含紫杉醇的油相与硅胶混合，通风干燥。然后将被生物质覆盖的硅胶加载在色谱柱上。紫杉醇用丙酮和己烷的洗脱混合物提纯。将通过色谱法得到的含紫杉醇的级分收集在一起，然后通过第二次色谱用在前步骤所用的条件再提纯。通过第二次色谱得到的含紫杉醇的级分收集在一起然后结晶。将通过过滤或离心得到的晶体溶于丙酮，然后第二次重结晶。通过过滤或离心分离晶体，易于第三次再提纯和最后用硅胶在低压下进行色谱柱提纯。
因此，在美国专利No.6,452,024公开的方法中，要进行的色谱的次数更多(是3次而不是2次)。
5.当然，在两种情况下，在本发明中来自第二和最后色谱柱的含紫杉醇的级分或在美国专利No.6,452,024中来自第三和最后一个色谱柱的那些级分被集中在一起，然后结晶，形成最终产物。
因此，现在可以更好地理解与美国专利No.6,452,024的方法相比本发明的主要优点是，根据本发明的方法从起始的针叶萃取步骤到生物质的获得包括了更少的制备步骤，以及更少的提纯步骤：以两次色谱法代替了美国专利No.6,452,024的三次色谱。
根据本发明的方法还使用了更少的溶剂，并且为了得到相同量的最终产物需要使用的原料更少。因此，根据本发明的改进方法的生产费用不仅比用于提纯紫杉醇的常用和传统方法低得多而且比美国专利No.6,452,024低得多。
具体实施方式
给出以下实施例仅用于具体说明，不应认为是对本发明范围的限制。
                      实施例1
洗涤
将100公斤的干燥和磨碎的加拿大紫杉的针叶和枝条装入棉布袋。将该袋放入不锈钢罐中，所述罐内加入400升的蒸馏水。在室温下将棉布袋完全浸没在水中3小时，排出含水可溶性杂质的溶液。
在实践中，该洗涤过程可重复一次或两次，湿的针叶通过棉布袋保留在罐中。
萃取
将250升的甲醇加入盛有湿的针叶和枝条的罐中。在室温萃取16小时。将萃取液泵送通过过滤器进入第二双层壁罐。借助在双壁罐中循环的80℃的热水蒸馏甲醇。回收的甲醇输入盛针叶的罐用于漂洗，纯甲醇的体积达到400升结束。然后将漂洗的甲醇泵送并蒸馏直至回收约75％的甲醇体积。在此后被称为“非浓缩的萃取液”的约100-120升残余溶液被输入另一个罐中，并保存至萃取液温度降至室温。
通过盐析沉淀生物质
非浓缩的萃取液用10升甲醇(与非浓缩萃取液的体积相比约10％的甲醇)澄清。在搅拌下迅速添加氯化钠，沉淀分离生物质。氯化钠的浓度是每升萃取液溶液约50克。沉淀立即形成，混合物不搅拌放置过夜。然后排出上层清液，重的沉淀物不用过滤或离心就可容易地回收。
如果有必要，通过添加氯化钠得到的生物质可通过过滤或在20℃以4200rpm速度离心30分钟迅速回收(J6 MC Beckman离心机，4.2 JSrotor)。应当理解，连续作业的离心机优选可用于处理大量的沉淀物。
用二氯甲烷或***萃取含10-去乙酰基浆果赤霉素III和浆果赤霉素III的上层液。通过蒸发浓缩有机相，可萃取处理这些紫杉烷的类似物。
除去树脂和色素
1.空气干燥得到的沉淀物。或者，可将其真空干燥或冷冻干燥(冷冻干燥器-FTS System)。沉淀物重约1.3公斤-1.5公斤。该沉淀物溶解在6升丙酮-己烷混合物(1∶1)，然后在0-2℃在30分钟期间过滤(或在4200rpm离心)，以便除去其中所含的不溶性颗粒。然后，将丙酮-己烷溶液转移到烧杯内，与1.5体积的纯己烷(9升)通过逐步加入1/2体积的己烷分别搅拌数分钟混合，加入5％-20％的纯水，优选5％至10％，形成油相。根据所用丙酮的体积计算水量。混合物然后送入分液瓶，分配约30分钟。在瓶底部回收紫杉醇富集相，在脱色(percolorization)前将得到的溶液蒸发浓缩至起始体积的1/10。该制品易于吸附在硅胶上用于色谱法提纯步骤。
2.在离心但不干燥后，将这样得到的沉淀物溶于3升丙酮，然后在0-2℃在30分钟期间过滤(或在4200rpm离心)除去其中所含的不溶性颗粒。然后，将丙酮溶液转移到烧杯中与4体积的己烷(12升)通过逐步加入1体积己烷分别搅拌数分钟混合。迅速形成油相。混合物然后送入分液瓶，分配约30分钟。在瓶底部回收紫杉醇富集相。这种溶液含一些残余水，因此通过加入1体积二氯甲烷萃取。
从该混合物分离出水，在除去树脂和色素或蒸发至干之前，将含紫杉醇的较低的二氯甲烷相浓缩至所得丙酮溶液的起始体积的1/5。就后者来说，干的残渣溶于0.5升丙酮。
                      实施例2
在低压下在硅胶上第一次色谱提纯
在实施例1中除去树脂和色素之后得到的含紫杉醇及其类似物的丙酮溶液与500克硅胶(230-400目)混合。被萃取液浸渍的硅胶通风干燥(或在真空下干燥)。干燥后的总重约900-950克，将该材料的一半装载到含2.2公斤硅胶(230-400目)的柱(142×7.6厘米内径)上。用丙酮和己烷(35∶65％，体积/体积)的混合物洗涤和平衡硅胶。用相同的溶剂，使用Dynamax溶剂输送***进行洗脱。在0-30psi的压力洗脱的流速大约100毫升/分钟。溶剂混合物的体积为约40升，分批收集各级分，每批1升。HPLC分析表明有9至10个级分(从第26或第27至第35或第36)含约0.2毫克/毫升至0.7毫克/毫升的紫杉醇，它们的纯度变化为10％-58％。含更多紫杉醇的级分具有更高的纯度。每个级分的紫杉醇量通过与紫杉醇标准样品的面积相比来确定。
值得注意的是，从一次提纯到另一次提纯，含紫杉醇的级分可能相对于其它级分有所偏差。
杂质量最高的级分被丢弃。通常，含紫杉醇小于0.3毫克/毫升的第一个级分被淘汰。
                      实施例3
在低压下在硅胶上第一次色谱提纯
在实施例1中除去树脂和色素之后得到的含紫杉醇及其类似物的丙酮溶液与500g硅胶(230-400目)混合。被萃取液浸渍的硅胶通风干燥(或在真空下干燥)。干燥后的总重约920克，将该材料的一半装载到含2.2公斤硅胶(230-400目)的柱(142×7.6厘米内径)上。用丙酮和己烷(40∶60％，体积/体积)的混合物洗涤和平衡硅胶。用相同的溶剂，使用Dynamax溶剂输送***进行洗脱。在0-30psi的压力洗脱的流速大约100毫升/分钟。溶剂混合物的体积大约30升，分批收集各级分，每批1升。HPLC分析表明有7至8个级分(从第16或第17至第23或第24个级分)含约0.1毫克/毫升至0.7毫克/毫升的紫杉醇，它们的纯度变化为8-45％。含更多紫杉醇的级分具有更高的纯度。每个级分的紫杉醇量通过与紫杉醇标准样品的面积相比来确定。
再次，值得注意的是，从一次提纯到另一次提纯，含紫杉醇的级分可能相对于其它级分有所偏差。
杂质量最高的级分被丢弃。通常，含紫杉醇小于0.3毫克/毫升的第一个级分被淘汰。
                      实施例4
第一次结晶
在实施例2和3中的第一次色谱法提纯后，将紫杉醇浓度高于0.3毫克/毫升的级分合并，然后蒸发至干。残余物溶于丙酮，调节丙酮的体积使得HPLC的紫杉醇最大峰值在1.0至1.5O.D.。然后将4体积的己烷加入丙酮溶液，在接下来的1小时期间开始结晶。混合物保持在2-8℃或在室温下过夜至完全结晶。
第二次结晶
然后，得到的晶体过滤(或离心)，随后溶于丙酮。调节丙酮的体积使得通过HPLC紫杉醇峰的最大值O.D.在1.0至1.5范围内。然后以相对于丙酮溶液4体积的比例加入己烷。在接下来的1小时中形成晶体。混合物保持在2-8℃或在室温过夜至完全结晶。过滤或离心晶体，在空气或真空下干燥。HPLC分析表明紫杉醇含量约85％或更高。9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III的直接分离和第一次结晶
在实施例2中通过第一次色谱提纯得到的含9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III(级分第20至第25)或在实施例3中的级分第13至第15与从第一和第二次结晶步骤得到的含9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III的己烷/丙酮溶液(母液)合并在一起，然后蒸发至干。通过加入甲醇形成结晶，然后过滤或离心回收。得到的晶体溶于丙酮，用3体积己烷结晶。产物确定为9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III，纯度＞95％。
9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III的第二次结晶
这样得到的9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III晶体溶于丙酮，然后将1体积己烷加入所述丙酮溶液。缓慢搅拌混合物，再加入2体积己烷。将溶液缓慢结晶。过滤或离心回收白色晶体，通风干燥或在真空下干燥。该晶体的HPLC分析表明9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III含量等于或大于98％。
                       实施例5
在低压下在硅胶上第二次色谱提纯
实施例4中第二次结晶后得到的紫杉醇晶体溶于75至100毫升丙酮，然后过滤除去不溶性颗粒，随后被吸附在75至100克硅胶上。被紫杉醇涂敷的硅胶通风干燥或在真空下干燥。干燥的硅胶加载在含2.2公斤的硅胶(230-400目)的柱(142×7.6厘米内径)的顶部。用丙酮和己烷(35∶65体积/体积)的混合物洗涤和平衡硅胶。在0-30psi的压力和约100毫升/分钟的流速，用相同的溶剂，使用Dynamax溶剂输送***进行洗脱。溶剂混合物的体积约40升，分批收集各级分，每批1升。HPLC分析表明有9至10个级分(从第26或第27至第34或第35个级分)含约0.2毫克/毫升至0.6毫克/毫升的紫杉醇，它们的纯度变化为85％到99％。将纯度高于98％的含紫杉醇的级分合并在一起用于第三次和最后一次结晶。
再次指出，从一个提纯步骤到另一个提纯步骤，含紫杉醇的级分可能相对于其它级分有所偏差。
                       实施例6
在低压下在硅胶上第二次色谱提纯
实施例4中第二次结晶后得到的紫杉醇晶体溶于75至100毫升二氯甲烷，然后过滤除去不溶性颗粒，随后与75至100克硅胶接触。被紫杉醇涂敷的硅胶通风干燥或在真空下干燥。将干燥的硅胶加载在含2.2公斤的硅胶(230-400目)的柱(142×7.6厘米内径)的顶部。用二氯甲烷和异丙醇(97.5∶2.5体积/体积)的混合物洗涤和平衡硅胶。在0-30psi的压力和约100毫升/分钟的流速，用相同的溶剂，使用Dynamax溶剂输送***进行洗脱。溶剂混合物的体积大约50升，分批收集各级分，每批1升。HPLC分析表明有20个级分(从第28至第48个级分)含约0.1毫克/毫升至0.3毫克/毫升的紫杉醇，它们的纯度变化为98％到＞99％。将纯度高于98％的含紫杉醇的级分合并在一起用于第三次和最后一次结晶。
第三次结晶
在实施例5或实施例6第二次色谱提纯后，合并然后将紫杉醇纯度高于98％的级分蒸发至干。残余物溶于丙酮，调节丙酮的体积使得HPLC分析的紫杉醇最大峰值在1.0至1.5O.D.。然后将4体积的己烷加入丙酮溶液，在接下来的1小时期间开始结晶。混合物保持在2-8℃或在室温下过夜至完全结晶。过滤或离心回收白色晶体，通风干燥或在真空下干燥。通过HPLC分析的晶体纯度如下：
-实施例5得到的为99.20至99.50％；和
-实施例6得到的为99.50至99.90％。
如上文所公开的，第二次色谱提纯后从含紫杉醇级分获得的残余物可以溶于乙醇、乙酸乙酯或***。那些溶剂的体积比先前所用的丙酮小5倍，这意味着紫杉醇浓度高5倍(10毫克/毫升)。
在实践中：
-将1至2体积己烷随后加入到醚溶液；或者
-将3至4体积己烷随后加入到乙醇或乙酸乙酯溶液，在接着的1小时期间开始结晶。
混合物保持在2-8℃或在室温下过夜至完全结晶。那些晶体的纯度与用丙酮结晶时的非常相似。
保存纯度不及98％的晶体，用上述第二次提纯所述的相同条件一起通过色谱重提纯。这次再提纯又得到这些晶体总量的约75％，纯度大于99％。
将所述的晶体溶于最小体积的乙醇或甲醇或丙酮，然后返回到含有纯水的小瓶里。溶剂的体积是纯水体积的约10-15％。在72小时内将紫杉醇冻干，温度从-60℃到+20℃以每分钟0.02℃变化，压力为100毫托。

Claims (22)

1.用于从含有待提取的紫杉醇的紫杉烷的天然来源提取和纯化紫杉醇的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用去离子或纯水洗涤含有紫杉醇的原料，所述原料来自所述紫杉烷的天然来源，所述的洗涤将可溶性杂质从所述原料中除去；
b)用有机溶剂从所述被洗涤原料中萃取出含紫杉醇的湿原料；
c)将所述的湿原料和盐接触，通过沉淀得到生物质，然后分离并干燥所述的生物质；
d)通过将所述生物质溶于丙酮或丙酮-己烷混合物中从这样分离并干燥的生物质除去树脂和天然色素，然后向其中加入至少一种极性溶剂直至得到富含紫杉醇的油相；
e)将前述步骤中得到的富含紫杉醇的油相在挥发性溶剂中用色谱法提纯至少一次，得到提纯的溶液，然后将通过色谱法得到的提纯溶液至少结晶一次。
2.根据权利要求1的方法，其中含紫杉醇的紫杉烷的天然来源包括选自下述的针叶树：短叶紫杉、欧洲紫杉、加拿大紫杉、喜马拉雅紫杉、云南紫杉、Taxus densiformis、Taxus hicksii、Taxus wardii、东北紫杉、Taxus capitata或Taxus brownii。
3.根据权利要求1或2的方法，其中：在步骤(a)中，所述原料选自所述针叶树的树皮、树枝和针叶或其混合物。
4.根据权利要求1至3的方法，其中：在步骤(b)中，所述有机溶剂选自醇或酮以及醇和酮的混合物。
5.根据权利要求4的方法，其中：在步骤(b)中，所述有机溶剂是甲醇、丙酮或以9∶1到1∶9的体积比存在的甲醇和丙酮的混合物。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中：在步骤(c)中，用于通过沉淀得到生物质的盐选自氯化钠、氯化铵、硫酸铵、乙酸钠、乙酸钾和其混合物。
7.根据权利要求6的方法，其中：在步骤(c)中，所述盐是氯化钠；以每升步骤(b)萃取得到的湿原料10-100克的浓度使用。
8.根据权利要求6或7的方法，其中：在步骤(c)中，将沉淀的生物质用过滤或离心法分离，然后用空气直接干燥或冷冻干燥。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其中：在步骤(d)中，将在步骤(c)中得到的干燥生物质通过加入丙酮然后加入水被溶解，加入的水的比例是以每100体积加入的丙酮计用2-10体积水，并且其中，在所述的步骤(d)中，所述至少一种非极性溶剂选自己烷和戊烷。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中步骤e)包括下述子步骤：
e.1)制备在步骤(d)中得到的富含紫杉醇的油相和硅胶的混合物，用洗脱溶剂在含硅胶的色谱柱中处理所述的混合物，得到第一紫杉醇富集级分；
e.2)将第一紫杉醇富集级分蒸发至干直至得到残留物，将所述残留物溶于丙酮制备混合物，用非极性溶剂结晶混合物中所含的紫杉醇，或蒸发第一紫杉醇富集级分直至达到一个可接受的紫杉醇浓度，然后用非极性溶剂结晶混合物中所含的紫杉醇；
e.3)在丙酮中溶解子步骤(e.2)得到的紫杉醇晶体，然后用非极性溶剂重结晶紫杉醇；
e.4)将子步骤(e.3)得到的晶体溶于挥发性溶剂得到溶液，制备所述溶液与硅胶的混合物，然后在含硅胶的色谱柱中用洗脱溶剂处理所述的混合物，得到带有洗脱溶剂的第二紫杉醇富集级分；和
e.5)将子步骤(e.4)得到的第二紫杉醇富集级分蒸发至干直至得到残留物，将残留物溶于丙酮、醇、醚、乙酸乙酯或其混合物，然后用非极性溶剂结晶紫杉醇。
11.根据权利要求10的方法，其中：
在步骤(e.1)中，将步骤(d)得到的富含紫杉醇的油相与硅胶混合，然后在空气中干燥；回收硅胶并加载在也含有硅胶的色谱柱中；然后用洗脱混合物提纯紫杉醇，所述的洗脱混合物含有30％-40％的丙酮和60％-70％的己烷；和
在步骤(e.3)中，将步骤(e.2)得到的结晶通过过滤或离心分离，溶于丙酮中形成溶液，调节丙酮的体积从而使对于相应于HPLC分析的峰所述溶液的吸光度为1.0-1.5O.D.(光密度)，然后通过在该溶液中加入3-4体积己烷重结晶紫杉醇。
12.根据权利要求10或11的方法，其中：在步骤(e.2)中，将在步骤(e.1)中通过色谱法得到的含紫杉醇的富集级分收集在一起，蒸发至干，然后溶于丙酮形成溶液，调节丙酮的量从而使得对于相应于HPLC分析的峰所述溶液的吸光度为1.0至1.5O.D.(光密度)；然后通过在所述溶液中加入3-4体积己烷结晶紫杉醇。
13.根据权利要求10或11的方法，其中：在步骤(e.2)中：将在步骤(e.1)中通过色谱法获得的含紫杉醇的富集级分收集在一起并蒸发直至对于相应于HPLC分析的峰所述富集级分的吸光度达到1.0至1.5O.D.(光密度)；然后通过在所述富集的溶液中加入1.5-2体积的己烷结晶紫杉醇。
14.根据权利要求10至13任一项的方法，其中：在步骤(e.4)中，过滤或离心在步骤(e.3)中得到的晶体，然后溶于丙酮形成溶液；所述溶液然后与硅胶混合并在通风下干燥；被紫杉醇覆盖的硅胶被加载到也含有硅胶的色谱柱中；然后用有机溶剂基的洗脱混合物再提纯紫杉醇，所述洗脱混合物含有30％-40％的丙酮和60％-70％的己烷。
15.根据权利要求10至13任一项的方法，其中：在步骤(e.4)中，过滤或离心在步骤(e.3)中得到的晶体，然后溶于丙酮形成溶液；所述溶液然后与硅胶混合并在通风下干燥；被紫杉醇覆盖的硅胶被加载到也含有硅胶的色谱柱中；然后用有机溶剂基的洗脱混合物再提纯紫杉醇，所述的洗脱混合物含有95％-98％的二氯甲烷和2％-5％的异丙醇。
16.根据权利要求10至15任一项的方法，其中：在步骤(e.5)中，将在步骤(e.4)中通过色谱法得到的含紫杉醇的富集级分根据它们的纯度合并，蒸发至干，然后溶于丙酮形成溶液，调节丙酮的量从而使得对于相应于HPLC分析的峰所述溶液的吸光度为1.0至1.5O.D.(光密度)；然后通过在所述溶液中加入3-4体积己烷结晶紫杉醇。
17.根据权利要求10至15任一项的方法，其中：在步骤(e.5)中，将在步骤(e.4)中通过色谱法获得的含紫杉醇的富集级分收集在一起并蒸发直至对于相应于HPLC分析的峰所述富集级分的吸光度达到1.0至1.5O.D.(光密度)；然后通过在所述富集的溶液中加入1.5-2体积的己烷结晶紫杉醇。
18.根据权利要求10至15任一项的方法，其中：在步骤(e.5)中，将在步骤(e.4)中通过色谱法得到的含紫杉醇的富集级分根据它们的纯度合并，蒸发至干，然后溶于乙醇形成溶液，调节乙醇的量从而使所述溶液相应于HPLC分析达到约5-10mg/ml的紫杉醇浓度；然后通过在所述溶液中加入3-4体积己烷结晶紫杉醇。
19.根据权利要求10至15任一项的方法，其中：在步骤(e.5)中，将在步骤(e.4)中通过色谱法得到的含紫杉醇的富集级分根据它们的纯度合并，蒸发至干，然后溶于乙酸乙酯形成溶液，调节乙酸乙酯的量从而使所述溶液相应于HPLC分析达到约5-10mg/ml的紫杉醇浓度；然后通过在所述溶液中加入3-4体积己烷结晶紫杉醇。
20.根据权利要求10至15任一项的方法，其中：在步骤(e.5)中，将在步骤(e.4)中通过色谱法得到的含紫杉醇的富集级分根据它们的纯度合并，蒸发至干，然后溶于***形成溶液，调节***的量从而使所述溶液相应于HPLC分析达到约5-10毫克/毫升的紫杉醇浓度；然后通过在所述溶液中加入1-2体积己烷结晶紫杉醇。
21.根据权利要求10至20任一项的方法，其中：
在步骤(e.3)中，所述挥发性溶剂选自丙酮、C1-C3轻质醇、乙酸乙酯、***、二氯甲烷和其混合物。
22.根据权利要求10-21任一项的方法，包括附加步骤：从步骤(e.1)分离紫杉醇之前的洗脱级分中以及从步骤(e.2)和(e.3)结晶后得到的混合物中用甲醇萃取9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III的晶体；并且将这样萃取的结晶用丙酮-己烷的混合物重结晶。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031008A (zh) * 2014-06-30 2014-09-10 牛兆颖 一种紫杉醇粗提物的制备方法
CN108101869A (zh) * 2017-12-20 2018-06-01 上海金和生物制药有限公司 一种天然紫杉醇的提取方法
CN109384749A (zh) * 2018-12-26 2019-02-26 重庆市碚圣医药科技股份有限公司 一种紫杉醇的纯化方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR054215A1 (es) * 2006-01-20 2007-06-13 Eriochem Sa Una formulacion farmaceutica de un taxano, una composicion solida de un taxano liofilizado a partir de una solucion de acido acetico, un procedimiento para la preparacion de dicha composicion solida de un taxano, una composicion solubilizante de un taxano liofilizado, y un conjunto de elementos (kit
KR101455694B1 (ko) * 2012-09-18 2014-11-03 학교법인 선목학원 에틸아세테이트 및 아세토니트릴의 유기용매 혼합액을 이용한 액체-액체 추출법을 포함하는 약물 검출법
KR101381502B1 (ko) * 2012-09-28 2014-04-04 공주대학교 산학협력단 파클리탁셀의 정제방법
CN103877600B (zh) * 2014-03-27 2017-04-05 沈祖鸿 含有红豆杉提取物的喷雾剂及其制造方法和制造配方
CN110845451A (zh) * 2019-11-28 2020-02-28 云南皓瑞逸生物科技有限公司 一种从红豆杉中提取紫杉醇的方法
CN112521349B (zh) * 2020-11-11 2023-04-07 福建齐衡科技有限公司 一种紫杉醇的纯化方法

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2601676B1 (fr) 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation du taxol et du desacetyl-10 taxol
FR2629818B1 (fr) 1988-04-06 1990-11-16 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation du taxol
US5019504A (en) 1989-03-23 1991-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture
US5175315A (en) 1989-05-31 1992-12-29 Florida State University Method for preparation of taxol using β-lactam
MY110249A (en) 1989-05-31 1998-03-31 Univ Florida State Method for preparation of taxol using beta lactam
US5015744A (en) 1989-11-14 1991-05-14 Florida State University Method for preparation of taxol using an oxazinone
US5136060A (en) 1989-11-14 1992-08-04 Florida State University Method for preparation of taxol using an oxazinone
US5475120A (en) 1990-11-02 1995-12-12 University Of Florida Method for the isolation and purification of taxol and its natural analogues
US5380916A (en) 1990-11-02 1995-01-10 University Of Florida Method for the isolation and purification of taxane derivatives
US5312740A (en) 1991-02-12 1994-05-17 Nippon Steel Corporation Process for producing taxol by cell culture of taxus species
JP3222466B2 (ja) 1991-04-19 2001-10-29 ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシシッピー タクサン類を単離するための方法および組成物
CA2072400C (en) 1991-07-05 2003-08-19 Jayaprakash B. Nair Supercritical extraction of taxanes
IT1258838B (it) 1992-01-31 1996-02-29 Indena Spa Processo per l'estrazione di tassolo e derivati da cultivar del genere taxus
US5451392A (en) 1992-03-03 1995-09-19 The Research And Development Institute At Montana State University Production of taxol
US5445809A (en) 1992-03-03 1995-08-29 Research And Development Institute At Montana State University Production of taxol from the yew tree
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
CA2092849C (en) 1992-04-07 2003-11-18 Paul M. Cino Callus cell induction and the preparation of taxanes
US5322779A (en) 1992-04-16 1994-06-21 The Research And Development Institute, Inc. At Montana State University Taxol production by taxomyces andreanae
EP0639186B1 (en) 1992-04-17 1999-06-23 Abbott Laboratories Taxol derivatives
GB9213077D0 (en) 1992-06-19 1992-08-05 Erba Carlo Spa Polymerbound taxol derivatives
US5470866A (en) 1992-08-18 1995-11-28 Virginia Polytechnic Institute And State University Method for the conversion of cephalomannine to taxol and for the preparation of n-acyl analogs of taxol
US5684169A (en) 1992-11-27 1997-11-04 Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. Cyclodextrin inclusion complex of taxol, and method for its production and its use
US5380751A (en) 1992-12-04 1995-01-10 Bristol-Myers Squibb Company 6,7-modified paclitaxels
CA2126698A1 (en) * 1992-12-07 1994-06-23 Muraleedharan G. Nair Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from taxus spp.
US5279949A (en) * 1992-12-07 1994-01-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from Taxus spp
CA2155304C (en) 1993-02-05 2010-07-20 Charles Swindell Syntheses of paclitaxel, analogs and intermediates with variable a-ring side chains
US5703247A (en) 1993-03-11 1997-12-30 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. 2-Debenzoyl-2-acyl taxol derivatives and methods for making same
US5440055A (en) 1993-03-12 1995-08-08 Aphios Corporation Method and apparatus for extracting taxol from source materials
US5516676A (en) 1993-06-15 1996-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Preparation of C-13 hydroxyl-bearing taxanes using nocardioides or a hydrolase isolated therefrom
US5405972A (en) 1993-07-20 1995-04-11 Florida State University Synthetic process for the preparation of taxol and other tricyclic and tetracyclic taxanes
EP1063300B1 (en) 1993-11-15 2003-09-03 Mitsui Chemicals, Inc. A method of producing a taxane-type diterpene and method of obtaining cultured cells which produce the taxane-type diterpene at a high rate
US5508447A (en) 1994-05-24 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Short synthetic route to taxol and taxol derivatives
US5616330A (en) 1994-07-19 1997-04-01 Hemagen/Pfc Stable oil-in-water emulsions incorporating a taxine (taxol) and method of making same
US5679807A (en) 1995-01-30 1997-10-21 Hauser, Inc. Preparation of taxol and docetaxel through primary amines
US5780653A (en) 1995-06-07 1998-07-14 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Nitrophenyl, 10-deacetylated substituted taxol derivatives as dual functional cytotoxic/radiosensitizers
US5675025A (en) 1995-06-07 1997-10-07 Napro Biotherapeutics, Inc. Paclitaxel synthesis from precursor compounds and methods of producing the same
FR2736355B1 (fr) * 1995-07-07 1997-11-07 Pf Medicament Procede d'extraction et d'isolement de la 10-desacetylbaccatine iii
US5760251A (en) 1995-08-11 1998-06-02 Sepracor, Inc. Taxol process and compounds
US5654448A (en) 1995-10-02 1997-08-05 Xechem International, Inc. Isolation and purification of paclitaxel from organic matter containing paclitaxel, cephalomannine and other related taxanes
US5756536A (en) 1995-11-03 1998-05-26 Purdue Research Foundation Microbial transformation of taxol and cephalomannine
US5767297A (en) 1997-02-05 1998-06-16 Ensuiko Sugar Refining Co., Ltd. Taxoid derivative and method of producing thereof
US5795909A (en) 1996-05-22 1998-08-18 Neuromedica, Inc. DHA-pharmaceutical agent conjugates of taxanes
US5773629A (en) 1996-06-14 1998-06-30 Industrial Technology Research Institute Synthesis of (4S, 5R) -2, 4-diphenyl-5-carboxy-oxazoline derivative as taxol side-chain precursor
US5750737A (en) 1996-09-25 1998-05-12 Sisti; Nicholas J. Method for paclitaxel synthesis
US5739359A (en) 1997-01-24 1998-04-14 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Methods for preparing 1-deoxy paclitaxels
US5969165A (en) 1999-01-07 1999-10-19 508037 (Nb) Inc. Isolation and purification of paclitaxel and other related taxanes by industrial preparative low pressure chromatography on a polymeric resin column
CA2299149C (fr) * 1999-06-22 2010-09-21 Chaichem Pharmaceuticals International Procede d'isolation et de purification du paclitaxel a partir de sources naturelles
US6452024B1 (en) * 2000-02-22 2002-09-17 Chaichem Pharmaceuticals International Process for extraction and purification of paclitaxel from natural sources

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031008A (zh) * 2014-06-30 2014-09-10 牛兆颖 一种紫杉醇粗提物的制备方法
CN104031008B (zh) * 2014-06-30 2015-12-09 牛兆颖 一种紫杉醇粗提物的制备方法
CN108101869A (zh) * 2017-12-20 2018-06-01 上海金和生物制药有限公司 一种天然紫杉醇的提取方法
CN109384749A (zh) * 2018-12-26 2019-02-26 重庆市碚圣医药科技股份有限公司 一种紫杉醇的纯化方法

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