CN1774267A - 与淀粉样物质结合的金属螯合剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的诊断、预防和治疗。本发明描述了表现出对淀粉样沉积物具有高亲合性的双官能治疗分子和对比成像剂、及其药学组合物。本发明还提供了使用成像技术以及这些双官能分子、对比成像剂、及其药学组合物用于检测淀粉样沉积物存在的方法；并且提供了用于预防或治疗淀粉样物质相关性状况诸如例如阿尔茨海默氏病的方法。

Description

与淀粉样物质结合的金属螯合剂

政府利益

本文所述工作得到National Institutes of Health/National Institute ofMental Health(国家卫生研究院/国家精神卫生研究院)的资助(资助号5K01 MH002001-02)。美国政府可在本发明中具有某些权利。

相关申请

本申请要求2003年1月22日提交的临时专利申请60/441,719的优先权，该申请被全文并入本文作为参考。

发明背景

淀粉样病变(amyloidosis)为一类疾病和病症，其特征在于被称为淀粉样物质的类蛋白物质(protein-like substance)在身体的一个和多个器官和组织中积聚。可***发生或局部发生的淀粉样物质积聚可损害正常的生命机能并引起器官衰竭。已经识别了至少15种淀粉样病变(每一种都与不同类型的淀粉样沉积物有关)。积聚后的蛋白质的性质以及聚集的位置决定症状，其可为从轻度到危急生命的程度。淀粉样沉积物为临床状况病理学的重要部分，如阿尔茨海默氏病、成人发病型糖尿病、慢性炎性疾病、透析相关性关节病、肿瘤、和家族性神经病。

在淀粉样病变中，通常可溶性功能蛋白质的异常折叠和聚合为不溶性的富含β折叠的(β-sheet-rich)四级结构引起聚集的蛋白质从细胞分泌出来并形成细胞外淀粉样沉积物(即小纤维、纤丝、蛋白斑、和缠结)。在可以经历这种转变的20种蛋白质中，一些优先地在脑中积聚，并且其与神经退行性疾病状况有关。这些蛋白质包括例如朊病毒蛋白，其与朊病毒疾病有关；和β淀粉样肽(Aβ)，其沉积在患有阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、路易体痴呆、淀粉样病变(荷兰型)遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆、和脑外伤患者的脑中有发现。

虽然淀粉样病变通常是罕见的病理生理学状况，但阿尔茨海默氏病(AD)在美国是最常见的痴呆形式。流行病学研究估计有40％到50％的人在他们接近90岁时患有AD(D.A.Evans等人，JAMA，1989，262：2551-2556；R.Katzman，Neurology，1993，43：13-20)。该疾病的第一个症状通常为记忆缺失，随后是语言、认知、和活动性损伤，并最终导致精神功能丧失，衰弱到使患者变得完全依赖他人照顾他们的日常生活。这种不可逆的退化最终导致死亡。除了其对个人和家庭的巨大影响之外，AD还造成了重大的公共卫生难题。根据the NationalInstitute on Aging(国家衰老研究院)，估计目前有4百万美国人患有该疾病，并且每年新诊断出约360,000例新病例(R.Brookmeyer等人，Am.J.Public.Health.，1998，88：1337-1342)。估计每年国家照顾AD患者的直接或间接费用有1000亿美元(R.L.Ernst等人，Arch.Neurol.，1997，54：687-693)，AD还对社会造成沉重的经济负荷。

在阿尔茨海默氏病患者中，β淀粉样肽的聚集导致在脑血管***中形成淀粉样沉积物和在新皮层中形成老年斑(C.L.Masters等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82：4245-4249)。因为没有侵入性活组织检查很难进行诊断，只能通过脑组织的死后验尸检查实现明确的诊断(G.McKhann等人，Neurology，1984，34：939-944；D.M.Mann，Mech.AgeingDev.，1985，31：213-255)，研究AD仍然是一项使人畏缩的工作，迄今为止，处置和治疗的进展还难以捉摸。FDA批准的多个作为“认知增强剂”的治疗剂(如Aricept_、Cognex_、Exelon_、和Mentane_)在一些AD患者中提供了轻微的缓解。然而，这些治疗剂不改变疾病的潜在进程，目前还没有对阿尔茨海默氏病在其发展的任何阶段提供治愈或有效的治疗。

一直以来，淀粉样物质积聚被认为在神经元细胞高死亡的区域浓度最高。这种关系得到了其中β淀粉样肽当以特定的β折叠构造聚集时产生高神经元毒性的事实的支持(J.Y.Koh等人，Brain Res.，1990，533：315-320；B.A.Yankner等人，Science，1990，250：279-282)。虽然越来越多的证据暗示淀粉样沉积物与AD患者中观察到的神经元功能障碍密切相关(J.W.Kelly，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95：930-932)，但仍不清楚毒性机理和引起Aβ沉积的神经化学事件的机理。

最近提出假说，认为过渡金属在阿尔茨海默氏病的发病机理中起到了决定性的作用(C.S.Atwood等人，Met.Ions Biol.Syst.，1999，36：309-364；A.I.Bush，Curr.Opin.Chem.Biol.，2000，4：184-191)。在小鼠和人中，已经表明随着自然老化在几个组织中包括脑中铁和铜水平增加(H.R.Massie等人，Ageing Dev.1979，10：93-99；B.Drayer等人，Am.J.Roentgenol.，1986，147：103-110；G.Bartzokis等人，Magn.Reson.Imaging，1997，15：29-35；L.Del Corso等人，Panminerva Med.，2000，42：273-277)。在AD患者的脑中也观察到了过渡金属失衡(J.R.Connor等人，J.Neurosci.Res.，1992，31：327-335；D.A.Loeffler等人，Brain Res.，1996，738：265-274；M.A.Deibel等人，J.Neurol.Sci.，1996，143：137-142；R.Cornett等人，Neurotox.，1998，19：339-345)，其中发现锌、铜、和铁的浓度在淀粉样蛋白斑内和周围变大(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，158：47-52)。此外，β淀粉样肽表现出高的对过渡金属离子的亲合性；并且Zn²⁺对Aβ的结合和Cu²⁺和Fe³⁺对Aβ的较小程度的结合显著地增加蛋白质聚集和形成淀粉样沉积物(A.I.Bush等人，Science，1994，265：1464-1467)。在金属螯合剂的存在下可使这两个过程(聚集和沉积)反转(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，272：26464-26470；C.S.Atwood等人，J.Biol.Chem.1998，273：12817-12826；R.A.Cherny等人，J.Biol.Chem.，1999，274：23223-23228)。

除了促进蛋白质聚集和淀粉样物质积聚之外，氧化还原活性过渡金属(即Cu²⁺和Fe³⁺)对Aβ的结合也导致活性氧物质的产生(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，274：37111-37116；X.Huang等人，Biochem.1999，38：7609-7616；L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74：270-279)，已知其对多种生物分子产生有害作用。生物金属介导的和淀粉样物质介导的活性氧物质的产生被认为至少部分地与AD患者脑中观察到的氧化应激有关(M.A.Pappolla等人，Am.J.Pathol.，1992，40：621-628；W.R.Markesbery，Free Radic.Biol.Med.，1997，23：134-147；P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，71：2034-2040；M.A.Smith等人，Antioxid.Redox Signal，2000，2：413-420；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，275：19439-19422)。

过渡金属离子可在阿尔茨海默氏病的一些病理效果中起作用这一发现为诊断方法和治疗处置的开发提供了新的途径。例如，在美国专利6,323,218中，金属螯合剂或金属复合化合物(如EDTA、4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、和青霉胺)被描述为是用于治疗与淀粉样病变有关的病理生理学状况的治疗剂。最近，氯碘羟喹，一种口服可生物利用的金属螯合剂，已经在阿尔茨海默氏病的Tg2576转基因小鼠模型中表现出显著抑制皮层淀粉样物质积聚(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30：665-676)。虽然这些研究结果令人充满希望，并且暗示金属螯合剂可能具有用于治疗与淀粉样物质积聚有关的状况的治疗价值，但可以证明许多非特异性金属螯合剂的潜在的副作用对于临床应用来说太大，因为它们可以扰乱其它需要金属的生物分子的正常的生理功能。

因此，仍然非常期望开发用于早期诊断、预防、和治疗通常是淀粉样病变、特别是阿尔茨海默氏病的有效的药物和方法。

发明概述

本发明涉及与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的诊断、预防、和治疗。具体地，本发明包括用于检测淀粉样沉积物的存在、和用于预防或治疗与淀粉样物质有关的状况的试剂和对策。在某些优选实施方案中，本发明可用于与脑中淀粉样蛋白和类淀粉样蛋白的聚集和积聚有关的病理生理学状况的诊断、预防、和治疗。

一方面，本发明提供充当金属螯合剂并表现出对淀粉样沉积物具有某种程度的吸引力的靶向治疗剂。更具体地，本发明提供包括与至少一个淀粉样物质结合部分结合的至少一个金属螯合部分的双官能分子。优选地，淀粉样物质结合部分表现出对Aβ淀粉样沉积物的高亲合性和特异性。在某些优选实施方案中，淀粉样物质结合部分可透过血脑屏障。例如，在某些这种实施方案中，淀粉样物质结合部分可以是苯并噻唑衍生物。在其它优选实施方案中，金属螯合部分与生物学相关的高亲合性过渡金属离子结合，所述过渡金属如锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)。例如，在这种实施方案中，金属螯合部分可为DTPA或α-硫辛酸衍生物。

本发明优选的双官能分子包括化合物XH1及其类似物，其化学结构示于图4中。其它优选的本发明的双官能分子包括化合物XH2及其类似物，其化学结构示于图6中。

另一方面，本发明提供表现出对淀粉样沉积物有某种程度的吸引力并且可通过成像技术检测到的靶向治疗剂。更具体地，本发明提供对比成像剂，其包括与至少一个淀粉样物质结合部分结合的至少一个成像部分。在某些优选实施方案中，淀粉样物质结合部分可透过血脑屏障。优选地，淀粉样物质结合部分表现出对Aβ淀粉样沉积物的高的亲合性和特异性。例如，优选的淀粉样物质结合部分可以是苯并噻唑衍生物。成像部分可以是本领域中已知的可被成像技术检测到的任何适当的实体。在某些优选实施方案中，成像部分包括与可检测金属实体复合的至少一个金属螯合部分。优选地，金属螯合部分与生理学可接受的金属实体复合。在优选实施方案中，金属实体是顺磁性金属离子，对比成像剂可通过磁共振成像(MRI)检测到。优选地，顺磁性金属离子为钆III(Gd³⁺)。在其它优选实施方案中，金属实体是放射性核素，对比显影剂可通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)检测到。优选地，放射性核素为锝99m(^99mTc)。

本发明还提供对比成像剂，其包括与至少一个淀粉样物质结合部分结合的至少一个金属螯合部分，所述淀粉样物质结合部分由可通过核磁共振(NMR)检测到的稳定的顺磁性同位素标记。在优选实施方案中，稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)；并且对比成像剂可通过磁共振光谱分析(MRS)检测到。

优选的本发明的对比成像剂是本文中所述的双官能分子的钆III(Gd³⁺)复合体。

另一方面，本发明提供药学组合物。本发明的药学组合物包括至少一种本发明的试剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。在这些药学组合物中，试剂的存在量足够满足其预定目的。更具体地，本发明提供药学组合物，其包括有效量的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐、和至少一种药学可接受的载体。本发明还提供药学组合物，其包括成像有效量的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐、和至少一种药学可接受的载体。在优选实施方案中，对比成像剂中的成像部分包括与钆III(Gd³⁺)或锝-99m(^99mTc)复合的至少一个金属螯合部分。在其它优选实施方案中，对比成像剂中的淀粉样物质结合部分由碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)标记。

在另一方面中，本发明提供在体外或体内降低或抑制淀粉样物质毒性的方法。在某些优选实施方案中，本发明可通过预防、减慢、或停止淀粉样物质积聚和/或通过促进、诱导、或帮助淀粉样沉积物溶解而降低或抑制淀粉样物质毒性。在其它优选实施方案中，本发明可通过减少、抑制、或干扰淀粉样物质介导的活性氧物质的产生而降低或抑制淀粉样物质的毒性。

更具体地，本发明提供了降低或抑制***中淀粉样物质毒性的方法，其包括使***与本发明的双官能分子或其药学组合物接触。该***可为已知能够产生和/或包含淀粉样沉积物的任何生物实体。例如***可为细胞、生物流体、生物组织或动物。该***可来源于活着的患者(如其可通过活组织检查得到)或死亡的患者(如其可通过尸体解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳动物。在优选实施方案中，细胞、生物流体、或生物组织来源于怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者。

本文还提供治疗患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者的方法，其包括对患者给予有效量的本发明的双官能分子或其药学组合物。在某些优选实施方案中，病理生理学状况与β淀粉样肽的积聚有关。

另一方面，本发明提供了用于检测***中或患者体内淀粉样沉积物存在的方法。在优选实施方案中，本发明的方法基于靶向对比成像剂和成像技术的使用。

更具体地，本发明提供了用于检测***中淀粉样沉积物存在的方法，其包括使***与成像有效量的对比成像剂或其药学组合物接触。优选接触在可使对比成像剂与***中存在的淀粉样沉积物相互作用、相互作用进而导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下进行。然后使用成像技术检测***中存在的与淀粉样沉积物结合的对比成像剂，并且产生***的至少一部分的一个或多个图像。在某些优选实施方案中，本发明的方法可用于鉴别用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂。本发明包括通过该方法鉴别的药物。

本发明还提供了用于检测患者体内淀粉样沉积物存在的方法。这些方法包括对患者给予成像有效量的靶向对比成像剂或其药学组合物。优选给药在可使对比成像剂与患者体内存在的淀粉样沉积物相互作用、相互作用进而导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下进行。在给药之后，使用成像技术检测患者体内存在的与淀粉样沉积物结合的对比成像剂，并且产生患者身体的至少一部分的一个或多个图像。

在某些优选实施方案中，通过使用对比成像剂进行本发明的检测***或患者体内淀粉样沉积物存在的方法，其中成像部分包括与顺磁性金属离子复合的至少一个金属螯合部分；通过磁共振成像(MRI)进行检测；产生MR图像。优选地，顺磁性金属离子是钆III(Gd³⁺)。在其它优选实施方案中，通过使用对比成像剂进行本发明的方法，其中成像部分包括与放射性核素复合的至少一个金属螯合部分；通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)进行检测；和产生SPECT图像。优选地，放射性核素是锝-99m(^99mTc)。在其它优选实施方案中，通过使用对比成像剂进行本发明的方法，其中淀粉样物质结合部分由稳定的顺磁性同位素标记；通过磁共振光谱分析(MRS)进行检测；和产生MR图像。优选地，稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)。

在某些实施方案中，本发明的方法用于定位患者体内的淀粉样沉积物。在其它实施方案中，本发明的方法用于诊断与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况。在其它实施方案中，上述方法用于跟踪与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的进展。在其它实施方案中，上述方法用于监测患者对与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的治疗的应答。

本文中所述的双官能治疗分子、靶向对比成像剂、药学组合物和方法也可用于诊断、预防或治疗受到淀粉样物质相关状况影响的不同于人的哺乳动物。例如，它们可用于人淀粉样病变的动物模型的情况中，以及动物朊病毒疾病中，如牛的牛海绵状脑病、绵羊的痒病；貂的传染性脑病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病。

通过以下详细说明可使本发明的其它方面、特征和优点变得显而易见。然而，应该理解，表明本发明的优选实施方案的详细说明和具体的实施例只是以示例的方式给出。

附图说明

图1表示在本领域中已经表现出高的对淀粉样蛋白的亲合性的刚果红(图1A)、柯胺-G(图1B)、(反，反)-1-溴-2，5-双-(3-羟基羰基-4-羟基)-苯乙烯基苯(图1C)、4′-碘-4′-脱氧多柔比星(图1D)、和硫代黄素T(图1E)的化学结构。

图2表示已知的金属鳌合剂4，7-二苯基-1，10-菲绕啉(图2A)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉(图2B)、去铁草酰胺(图2C、青霉胺(图2D)、EDTA(图2E)、EGTA(图2F)、DTPA(图2G)、TETA(图2H)、TPEN(图2I)、和α-硫辛酸(图2J)的化学结构。

图3表示本领域中已知的可与由成像技术检测到的金属实体复合的DOTA(图3A)、TTHA(图3B)、ECD(图3C)、EDTMP(图3D)、和HMPAO(图3E)的化学结构。

图4表示一类新的双官能分子的化学结构，该化学结构包括DTPA，DTPA担当金属螯合部分并以共价键结合于两个相同的淀粉样物质结合部分(硫代黄素衍生物)。该类化合物的母体分子(化合物XH1)和各种类似物分别出现在图4A和图4B中。

图5表示化合物XH1的化学表征结果。XH1的质谱和1H-NMR光谱分别表示在图5A和图5B中。

图6表示一类新的双官能分子的化学结构，该化学结构包括α-硫辛酸，α-硫辛酸担当金属螯合部分并以共价键结合于一个淀粉样物质结合部分(硫代黄素衍生物)。该类化合物的母体分子(化合物XH2)和各种类似物分别表示在图6A和图6B中。

图7表示化合物XH2的化学表征结果。XH2的质谱和1H-NMR光谱分别表示在图7A和图7中。

图8为表示双官能分子XH1、金属螯合化合物DTPA的存在对Aβ_1-40聚集的效果。通过在400nm测量混浊度评价聚集。

图9表示XH1对E17大鼠皮层原代神经元存活率的影响(图9A)和对人SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞的影响。在用XH1处理后48小时通过MTT试验和/或LDH释放试验评价细胞存活率。数据报告为平均细胞存活率(相对于未处理培养物的百分比％)±标准偏差。分别对每个浓度的XH1进行至少三次实验。

图10表示SDS-PAGE凝胶表现出增加XH1浓度对APP表达的影响(图10A)、和对用作对照的不同蛋白质(β-微管蛋白(图10A)、APLP1和APLP2(图10B))表达的影响。在用XH1处理SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞后48小时测量蛋白质合成。使用A8717作为APP的检测抗体。

图11表示在有或没有Aβ_1-40或HSA的存在下从使用对比成像剂(Gd-XH1或Gd-DTPA)培养的球形图测量的T1-加权MRI信号。在A1-5中，Gd-XH1的浓度为0mM(A1)到0.5mM(A5)。在B1-5中，Gd-DTPA的浓度为0mM(B1)到1mM(B5)。C道中所有的球形图都包含0.025mM的HSA，和浓度为0mM(C1)到0.25mM(C5)的Gd-XH1。D道中的球形图包含0.5mM的HSA，和浓度为0mM(D1)到0.025mM(D5)的Aβ_1-40。而E道中所有球形图都包含1mM的Gd-XH1，和浓度为0mM(E1)到0.025mM(E5)的Aβ_1-40。对比成像剂浓度增加产生更短的T1，从而产生更亮的信号。在这些实验中没有观察到信号饱和。

图12所示为表示球形图的MRI信号变量作为对比成像剂(Gd-XH1或Gd-DTPA)和蛋白质(HSA或Aβ_1-40)的函数的两个图。在图12A中，报告了两种对比成像剂Gd-XH1和Gd-DTPA的R1(即1/T1)的百分增长作为Aβ_1-40浓度的函数。在图12B中，报告了在有或没有HSA(0.025mM)存在下，不同浓度的Gd-XH1的R1。

图13为表示作为从包含Gd-DTPA(0.25mM)或Gd-XH1(0.25mM)和不同浓度的Aβ_1-42的球形图计算的R1(即1/T1)的MRI信号变化的图。

图14表示MRI信号，其在当AD小鼠和人脑组织提取物与Gd-XH1(0.025mM)混合时增强。

图15表示MRI成像。第一组图像(在图15A中)为表示解剖特性的大鼠脑的基线图像，第二组图像(在图15B中)表示在i.p.注射Gd-XH1之后约1小时测量的MRI信号的增加百分数。

定义

在整个说明书中，使用若干术语，其在下文中定义。

术语“淀粉样病变”和“淀粉样物质相关状况”在本文中可互换地使用。它们是指影响人或其它哺乳动物的任何病理生理学状况，其特征在于淀粉样物质在身体的任何器官或组织中的细胞外积聚。淀粉样病变与多种医学病症有关，但也可作为原发性疾病发生。

如本文中使用的，术语“淀粉样物质”是指淀粉样蛋白的聚集(如聚合)形式，所述积聚产生细胞外的淀粉样沉积物。无论淀粉样蛋白的组成性质如何，所有的淀粉样物质共有某些性质：它们形成对刚果红具有高亲合性的不溶性β-褶状折叠结构，其偏振光产生双折射，给出特征X射线衍射图形，并且对蛋白酶不敏感。

如本文中使用的，术语“淀粉样沉积物”是指由细胞外的淀粉样物质积聚产生的任何不溶性的四级结构。淀粉样沉积物可为小纤维、纤丝、蛋白斑、或缠结的形式。

术语“淀粉样蛋白”和“淀粉样蛋白肽”在本文中可可互换地使用。它们是指单体(即未聚集)形式的淀粉样蛋白氨基酸序列。淀粉样蛋白(和类淀粉样蛋白)的例子包括但不限于淀粉样蛋白免疫球蛋白轻链(AL，涉及浆细胞恶液质，并在例如骨髓性白血病即骨髓癌患者中有发现)；血清淀粉样蛋白相关蛋白质(AA或SAP，涉及慢性炎性状况，如类风湿性关节炎和骨髓炎)；β淀粉样肽(Aβ，其涉及神经退行性病症如阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、路易体痴呆、具有淀粉样物质的(荷兰型)遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆；和有可能在患有脑外伤的个体的脑中积聚)；改变型甲状腺素运载蛋白(ATTR，涉及家族性淀粉样病变)；小岛淀粉样物质多肽(islet amyloid-polypeptide，IAPP或Amylin，其在患有II型糖尿病的患者的胰腺中积聚)；和朊病毒蛋白(PrP，其涉及朊病毒疾病)。

术语“β淀粉样肽”、“Aβ肽”、和“Aβ”在本文可互换地使用。它们在本领域还已知为β-蛋白、β-A4和A4。Aβ为小的、可溶性的、4.3kDa、39-43个氨基酸长度的肽，其序列以前被公开过(参见C.Hilbich等人，J.Mol.Biol.，1992，228：460-473)。在本发明中，术语β淀粉样肽包括Aβ_1-43、以及Aβ_1-42、Aβ_1-41、Aβ_1-40和Aβ_1-39。术语“Aβ淀粉样物质”是指聚集状态的β淀粉样肽。在例如阿尔茨海默氏病患者的脑中、唐氏综合症的成人患者的脑中发现Aβ淀粉样沉积物，并且在患有脑外伤的个人中偶有发现。

术语“结合亲合性”和“亲合性”在本文中可互换地使用，是指分子实体之间的吸引力水平。亲合性可定量地表示为离解常数(K_d)、或其倒数，即缔合常数(K_a)。在本发明的情况中，考虑两种类型的亲合性：(1)淀粉样物质结合部分对淀粉样沉积物的亲合性、和(2)金属螯合部分对过渡金属离子或其它金属实体的亲合性。

术语“淀粉样物质结合部分”是指表现出对淀粉样沉积物具有高亲合性和特异性的任何实体。当淀粉样物质结合部分为分子的一部分时。其将自身的性质赋予分子，使分子变为“靶向的”(即其特异性地和有效地与淀粉样沉积物相互作用并结合)。淀粉样物质和淀粉样物质结合部分的结合可为共价的或非共价的(如疏水性相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用、氢键合等等)。最常见的结合为非共价形式。

在本文中用于化学部分、试剂、化合物、或分子的术语“金属螯合”和“螯合”是指实体的特征为存在参与与过渡金属离子或其它金属实体形成复合体(包含超过一个配价键)的两个或多个极性基团的能力。金属螯合剂在本领域中已知。金属螯合剂的例子包括但不限于2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、乙二胺四乙酸、4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、去铁草酰胺、和氯碘羟喹。

在本发明的情况中，术语“双官能分子”是指包括与至少一个淀粉样物质结合部分连接的至少一个金属螯合部分并且因此表现出双重选择性的分子。更具体地，本发明的双官能分子(1)以高的亲合性与过渡金属离子结合、并且(2)对淀粉样沉积物表现出高的亲合性和特异性。金属螯合部分和淀粉样物质结合部分可通过共价或非共价键连接。优选地，连接为共价连接。

如本文中使用的，术语“过渡金属离子”是指本领域中已知作为过渡金属的元素的离子形式。更具体地，在本发明的情况中，考虑三种生物学相关的过渡金属离子，即：“锌II”、“铜II”、和“铁III”，除非另作说明，其分别指Zn²⁺、Cu²⁺、和Fe³⁺。

如本文中使用的，术语“对比成像剂”是指可用于使用成像技术检测特定的生物元素的任何实体。本发明的对比成像剂是包括与至少一个淀粉样物质结合部分连接的至少一个成像部分的靶向分子。在本发明的优选实施方案中，对比成像剂的成像部分包括至少一个与金属实体复合的金属螯合剂。本发明的其它对比成像剂包括与至少一个淀粉样物质结合部分结合的至少一个金属螯合部分，所述淀粉样物质结合部分由可通过NMR检测到的稳定的顺磁性同位素标记。本发明的对比成像剂可用于检测体外、体内、和回体(ex vivo)***以及存活患者体内的淀粉样沉积物。

如本文中使用的，术语“金属实体”是指可通过成像技术如磁共振成像(MRI)检测到的顺磁性金属离子、或可通过成像技术如单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射层析成像(PET)检测到的放射性核素。

如本文中使用的，术语“顺磁性金属离子”是指可复合于金属螯合剂并可通过MRI检测到的生理学可耐受的实体。优选地，顺磁性金属离子选自钆III(Gd³⁺)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)、和镱III(Yb³⁺)。

如本文中使用的，术语“放射性核素”是指可复合于金属螯合剂并用于放射性药物技术中的金属元素的放射性同位素。优选的放射性核素为锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、钇-91(⁹¹Y)、铟-111(¹¹¹In)、铼-186(¹⁸⁶Re)和铊-201(²⁰¹Tl)。

如本文中使用的，术语“稳定的顺磁性同位素”是指可通过核磁共振光谱法(MRS)检测到的顺磁性核。用于本发明的优选的稳定顺磁性同位素是碳-13(¹³C)和氟-19(¹⁹F)。

在本发明的情况中，术语“氧化还原活性过渡金属离子”是指可通过参与一系列涉及淀粉样物质和/或淀粉样沉积物和氧(O₂)的反应被还原、并从而形成活性氧物质的过渡金属离子(例如Cu²⁺和Fe³⁺，可分别被还原为Cu⁺和Fe²⁺)。不能经历这种反应的锌II(Zn²⁺)，被称为“氧化还原非活性过渡金属离子”。

如本文中使用的，术语“活性氧物质”是指衍生自氧并通常具有生物***毒性或容易参加毒性副产物生成反应的分子。活性氧物质包括超氧化物自由基阴离子(O₂·^-)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H₂O₂)、和单线态氧(¹O₂，¹Δ_g)。

术语“淀粉样物质介导的”，当用于活性氧物质的产生时，是指涉及单体或聚合形式的淀粉样蛋白、氧化还原活性过渡金属离子、和氧并形成活性氧物质的一系列过程。

“氧化应激”在本文中是描述***直接或间接由淀粉样物质介导的活性氧物质的产生引起的损伤状态的通用术语。当***的抗氧化防卫机制不再能抑制产生的活性氧物质的有害作用时发生氧化应激。氧化应激首先可影响特定的生物分子(如蛋白质、脂质、和核酸)，最终诱导可以产生细胞突变、细胞死亡、和组织破坏的大量细胞损坏。

在本发明的情况中，术语“淀粉样物质毒性”是指当以β-折叠构造聚集时淀粉样蛋白具有毒性的能力、和/或淀粉样蛋白和/或淀粉样沉积物产生对多种生物分子具有有害作用并可最终诱导氧化应激的活性氧物质的能力。

术语“预防”在本文中是表征目的在于延迟或预防与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况发病的方法。术语“治疗”在本文中是表征目的在于(1)延迟或预防与淀粉样病变有关的状况的发病；或(2)减慢或终止状况症状的进展、恶化、或退化；或(3)改善状况症状；或(4)治愈该状况的方法。治疗可在疾病发病之前进行，作为预防处置或预防性措施。其也可在疾病开始之后进行，用于治疗作用。

术语“个体”或“患者”在本文中可互换地使用。它们是指可能受到与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况影响但可能患有或未患有这种疾病的人或其它哺乳动物。

如本文中使用的，术语“***”是指本领域中已知能够产生和/或包含淀粉样沉积物的生物实体。在本发明的情况中，考虑了体外、体内、和回体***；并且***可为细胞、生物流体、生物组织、或动物。***可来源于例如活着的患者(如其可通过活组织检查得到)、或得自死亡的患者(如其可通过尸体解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳动物。

如本文中使用的，术语“生物流体”是指由患者产生并得自患者的流体。生物流体的例子包括但不限于脑脊髓液(CSF)、血清、尿液、和血浆。在本发明中，生物流体包括通过例如超滤作用或色谱分离法纯化分离的这种流体的全部级分或任何级分。

如本文中使用的，术语“生物组织”是指得自患者的组织。生物组织可为体内的任何器官或***的全部或其一部分(如脑、胰腺、心脏、肾、胃肠道、甲状腺、神经***、皮肤等)。

如本文中使用的，术语“有效量”是指足够满足其预定目的(如所述目的可为：减慢或预防与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的发病；减慢或终止该状况症状的进展、恶化、或退化；引起状况症状改善；或治愈该状况。上述目的还可为：预防、减慢、或终止***或患者体内淀粉样物质积聚；促进、诱导、或帮助溶解***或患者体内存在的淀粉样沉积物；或减少、抑制或干扰淀粉样物质介导的活性氧物质的产生)的任何量的本发明的双官能分子、或其药学组合物。

如本文中使用的，术语“成像有效量”是指足够允许使用成像技术检测***或患者体内存在的淀粉样沉积物的任何量的本发明的对比成像剂或其药学组合物。

如本文中使用的，“药学组合物”定义为包括至少一种本发明的试剂(双官能治疗分子或靶向对比成像剂)或其生理学可耐受的盐、和至少一种药学可接受的载体。

术语“生理学可耐受的盐”是指分别保留游离碱或游离酸的生物活性和性质的任何酸加成盐或碱加成盐，并且其不是生物学不合需要的或其它方面不合需要的。酸加成盐是与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)；和有机酸(如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等等)形成的盐。碱加成盐是与无机碱形成的盐(如钠、钾、锂、铵、钙、镁、锌、铝盐等)和与有机碱形成的盐(如伯、仲、叔胺、包括天然存在的取代胺的取代胺、环胺和碱离子交换树脂的盐，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、三甲胺、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等)形成的。

如本文中使用的，术语“药学可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并在其给药浓度下不对宿主产生过多毒性的载体介质。该术语包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂、吸收延迟剂等等。这种介质和试剂在药学活性物质中的使用在本领域中是公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，第十八版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。

另外的定义在整个详细说明中提供。

某些优选实施方案的详细描述

本发明涉及与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的诊断、预防、和治疗。具体地，本发明包括用于检测淀粉样沉积物的存在和用于预防或治疗淀粉样物质相关状况的试剂和对策。在某些优选实施方案中，本发明可用于脑中与淀粉样蛋白和类淀粉样蛋白的聚集和积聚有关的病理生理学状况的诊断、预防、和治疗。

I.双官能治疗分子

本发明的一个方面涉及一类新的靶向治疗剂。

对正常衰老个体和阿尔茨海默患者脑中生物金属作用的研究为开发更有效的治疗设定了新的方向。使用金属螯合分子调节过渡金属离子的水平已经在体外表现出能够溶解淀粉样沉积物和预防氧化性损伤。还发现金属螯合剂显著地降低转基因小鼠脑中的淀粉样蛋白负荷(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30：665-676)。这些结果非常有希望并显示了这种方法用于治疗淀粉样物质相关状况的潜力。然而，大多数已知的金属螯合剂为非特异性的并且可干扰其它需要金属的生物分子的正常生理功能，从而产生对于临床应用来说太大的副作用。

本发明包括对靶向金属螯合剂的以下鉴别：能够防止金属离子干扰淀粉样蛋白和淀粉样沉积物而不干扰其它重要生物分子的作用；应该表现出较少的不希望的副作用；并且比目前使用的、试验的、或建议作为用于治疗淀粉样物质相关的病理生理学状况的治疗剂的大多数非特异性金属螯合剂更有效。因此，本发明提供治疗剂，其设计为用于(1)对淀粉样物质有某种程度的吸引力、和(2)作为金属鳌合剂。更具体地，本发明提供双官能分子，其包括与至少一个淀粉样物质结合部分结合的至少一个金属螯合部分。

淀粉样物质结合部分

淀粉样物质结合部分是对淀粉样沉积物具有某种程度的吸引力并且可以在当其被包含在双官能分子中时起到靶向作用的实体。在优选实施方案中，淀粉样物质结合部分表现出对淀粉样沉积物高的亲合性和特异性，即它们特异性地和/或有效地与淀粉样物质相互作用、结合、或对淀粉样物质标记。优选地，淀粉样物质结合部分是在体外和体内条件下保留其结合性质的稳定的无毒性实体。在某些优选实施方案中，淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样物质具有高的亲合性和特异性。更具体地，当使用合成的Aβ肽或阿尔茨海默氏病脑组织(如实施例部分中所述)测定时，这些淀粉样蛋白结合实体以0.1nM到10μM的离解常数(K_d)与Aβ结合。在其它优选实施方案中，淀粉样物质结合部分能够透过血脑屏障。这种性质对于当双官能分子用作用于治疗以脑中聚集的淀粉样蛋白和类淀粉样物质积聚为特征的神经退行性病症的治疗剂时特别重要。

淀粉样物质结合部分与淀粉样沉积物之间的相互作用可为共价的或非共价的。最经常是，淀粉样物质结合部分与淀粉样沉积物之间的相互作用为非共价的(见下文)。非共价相互作用的例子包括但不限于疏水性相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用、和氢键。不管相互作用的性质如何，淀粉样沉积物与本发明双官能分子内的淀粉样物质结合部分之间的结合应该为选择性的、特异性的、并且足够强以使得金属螯合部分发挥其作用(即预防、抑制、或反转过渡金属离子与淀粉样蛋白和/或淀粉样沉积物之间的相互作用)。

用于本发明中的适当的淀粉样物质结合部分包括满足要求上列条件的任何淀粉样蛋白结合实体。实际上，淀粉样沉积物的生物标志物的开发作为研究目标已经多年了(W.E.Klunk，Neurobiol.Aging，1998，19：145-147)，并且现有多个这种化合物。刚果红(其化学结构在图1A中示出)用于体外对淀粉样沉积物染色已经有数十年了(M.Tubis等人，J.Am.Pharm.Assoc.，1960，49：422-425；M.Tubis等人，Nukl.Med.，1962，3：25-38)。

已经提出了几种模型用于说明刚果红对以β折叠构造聚集的淀粉样蛋白的特异性亲合性(W.E.Klung等人，J.Histochem.Cytochem.，1989，37：1273-1281；W.E.Klunk等人，Neurol.Aging，1994，15：691-698；D.B.Carter和K.-C.Chou，Neurol.Aging，1998，19：37-40)。在所有提出的模型中，认为刚果红的阴离子型磺酸盐基团和淀粉样蛋白肽上的碱性氨基酸如精氨酸和赖氨酸之间的化学计量的和饱和的静电相互作用在优先结合中起到重要作用。在一些提出的模型中，还假设所述相互作用中涉及刚果红的联苯部分与淀粉样蛋白肽的苯丙氨酸部分之间的芳香族相互作用。

基于这些模型，推断特异性结合于淀粉样沉积物的分子倾向于是长的、共轭***，该***具有在每个末端带负电荷的基团的多个苯环。使用这些标准，已经设计、合成(N.A.Dezutter等人，Eur.J.Nucl.Med.，1999，26：1392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97：7609-7614))涉及刚果红的双偶氮联苯胺(bisdiazobenzidine)化合物(参见例如美国专利4,933,156、5,008,099、和5,039,511)；柯胺-G(图1B)及衍生物(参见例如美国专利6,114,175、6,133,259、和6,168,776)；(反，反)-1-溴-2，5-双(3-羟基羰基-4-羟基)-苯乙烯基苯(BSB)(图1C)和多种类似物，并放射性标记和评价其在体外和体内作为潜在的淀粉样沉积物的探针(W.E.Klunk等人，Neurobiol.Aging，1994，15：691-698，W.Zhen等人，J.Med.Chem.，1999，42：2805-2815：N.A.Dezutter等人，J.Nucl.Med.，1999，26：1392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：7609-7614)。发现所有的这些分子都对Aβ表现出高的亲合性和特异性并因此适用于本发明中。然而，在这些生物标志物的一些上的高极性官能团的存在显示出限制其进入大脑，只有没有极性官能团的衍生物表现出高的大脑摄入。本发明的双官能分子的设计将受其预定目的的限定，并且根据淀粉样物质结合部分的已知的、观察到的或期望的性质(例如，它们的血脑屏障透过性)选择淀粉样物质结合部分。

当选择淀粉样物质结合部分设计双官能治疗分子时，还应该将毒性作为一个因素考虑。例如，本领域中已知偶氮染料可能是致癌的(D.L.Morgan等人，Environ.Health Perspec.，1994，102：63-78)。偶氮染料的潜在致癌性被认为是由于其被大肠菌大量代谢降解为游离的(毒性的)母体胺产生的(C.E.Cerniglia等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1982，107：1224-1229；C.E.Cerniglia等人，Carcinogen.，1982，3：1255-1260)。为了避免毒性的问题，期望避免偶氮染料如刚果红、柯胺-G及其衍生物作为淀粉样物质结合部分、或选择给药途径以使双官能治疗分子避开大肠菌。

还评价了较小分子与淀粉样沉积物特异性结合的能力。这些包括但不限于anthracycline，即4′-碘代-4′-脱氧多柔比星(图1D)，已经发现其强烈地结合于多种不同类型的淀粉样蛋白和淀粉样沉积物(G.Merlini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92：2959-2963)；噻唑染料如樱草素、硫代黄素S、和硫代黄素T(其化学结构在图1E中)。已知这些噻唑染料使组织切片中的淀粉样物质染色并在体外有效地结合于合成的Aβ(G.Kelenyi，Histochem.Cytochem.，1967，15：172-180；J.Burns等人，J.Pathol.Bacteriol.，1967，94：337-344；R.Guntern等人，Experientia，1992，48：8-10；H.LeVine，Meth.Enzymol.，1999，309：274-284)。有趣地是，最近表明，从硫代黄素T的杂环除去甲基，这样去掉了正电荷，产生与Aβ具有高亲合性以及在啮齿类中具有良好的脑摄入的一系列亲脂性染料(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，69：1471-1484；Z.P.Zhuang等人，J.Med.Chem.，2001，44：1905-1914)。

在某些优选实施方案中，淀粉样物质结合部分是已经报导表现出对淀粉样沉积物具有高亲合性和能够跨越血脑屏障的小分子的衍生物(D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97：7609-7614)。实施例1和实施例9描述了两类新的包括这种淀粉样蛋白结合小分子中的至少一个的双官能分子的合成。

优选地，淀粉样物质结合部分包含可用于(或容易地化学转化成可用的不同官能团)使淀粉样物质结合部分共价连接于金属螯合部分的至少一个官能团。适当的官能团包括但不限于胺(优选伯胺)、硫醇、羧基等等。

金属螯合部分

金属螯合部分是可以以高亲合性与过渡金属离子结合的实体。优选地，可通过金属螯合部分复合的过渡金属离子为生物金属(即它们是生物学相关的过渡金属离子)。最优选地，金属螯合部分以高亲合性与在淀粉样沉积物内和周围发现的高浓度的过渡金属离子结合。在某些优选实施方案中，金属螯合部分以高亲合性与选自锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)中的至少一种过渡金属离子结合。优选地，金属螯合部分是在体外和体内条件下保留其结合性质的稳定的无毒性实体。

在淀粉样蛋白相关临床状况病理学的至少两个方面涉及到过渡金属离子的实验证据越来越多。研究表明(1)过渡金属与淀粉样蛋白之间的相互作用可通过加速淀粉样蛋白肽聚集和积聚成为毒性的β折叠构造而增强淀粉样物质毒性，和(2)氧化还原活性过渡金属离子可以通过有利于产生活性氧物质而增加淀粉样物质的毒性。

具体地，已经表明β淀粉样肽具有选择性的高亲合性和低亲合性的Cu²⁺和Zn²⁺结合部位(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.，1994，269：12152-12158)，并且Aβ与Cu²⁺、Zn²⁺、和Fe³⁺的相互作用已经显示了促进肽的聚集和积聚(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.1994，265：1464-1467)。在申请人的实验室中，金属螯合剂在死亡后尸检的人脑样品中反转合成Aβ肽的聚集、溶解淀粉样物质(C.S Atwood等人，J.Biol.Chem.，1998，273：12817-12826；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，272：26464-26470；R.A.Cherny等人，J.Biol.chem.1999，274：23223-23228)和诱导对用于阿尔茨海默氏病的Tg2576转基因小鼠模型脑中淀粉样物质负荷的显著抑制(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30：665-676)导致了金属螯合剂和金属复合分子作为用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂的提议(参见美国专利6,323,218)。

通过干扰过渡金属离子与淀粉样蛋白和/或淀粉样沉积物之间的相互作用，金属螯合剂可影响淀粉样物质毒性。根据本发明的这个方面，适当的金属螯合部分是可以通过预防、减慢、或终止淀粉样蛋白的聚集和积聚、和/或通过促进、诱导、或帮助淀粉样沉积物溶解而降低或抑制淀粉样物质毒性的实体。这可以在当金属螯合部分以高亲合性结合于至少一个选自锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)的过渡金属离子时实现。

有确凿的证据表明，引起细胞损伤的氧化应激对于在阿尔茨海墨氏病中观察到的神经退行性疾病是至关重要的(R.N.Martins等人，J.Neurochem.，1986，46：1042-1045)。在AD患者脑中持续观察到蛋白质以及核DNA和线粒体DNA的氧化增加(P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，71：2034-2040；W.R.Markesbery，Free Radic.Biol.Med.，1997，23：134-147；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，275：19439-19442)。此外，β淀粉样肽已经显示能够增强神经来源的细胞以及无细胞培养基中活性氧物质的产生(C.Behl等人，Cell，1994，77：817-827；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，274：37111-37116；X.Huang等人，Biochem.，1999，38：7609-7616)。当Aβ结合Cu²⁺和/或Fe³⁺时观察到发生大规模的氧化还原化学反应，以催化的方式使两种金属的氧化态降低并从O₂产生H₂O₂(X.Huang等人，Biochem.，1999，38：7609-7616)。因为在受AD-影响的脑中的淀粉样沉积物中发现铜(400μM)、锌(1mM)和铁(1mM)水平升高(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，158：47-52；M.A.Smith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：9866-9868)，在阿尔茨海默氏病中观察到的氧化应激被认为与通过Aβ的金属结合形式产生活性氧物质有关。这一假设得到了从AD脑分离的老年斑和神经元纤维缠结能够产生活性氧物质、并且发现铜和铁的存在是反应发生所必需的(L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74：270-279)的观察结果的支持。

氧化还原活性金属如Cu²⁺和Fe³⁺可以参与导致活性氧物质产生的反应(W.R.Markesbery，Free Rad.Biol.Med.，1997，23：134-147)。这种反应的一个系列如下所示。β淀粉样肽以及Aβ淀粉样物质具有还原Cu²⁺(或Fe³⁺)的能力并同时从分子氧的表观还原生成超氧化物自由基阴离子(O₂·^-)而形成过氧化氢(H₂O₂)。随后发生类似Fenton的反应，该反应产生羟基自由基。

(a)

如： ，或

(b)

(c)

如： 或

除了上述的活性氧物质之外，可以形成其它自由基，并且其它自由基也促进淀粉样病变的病理。这些包括但不限于淀粉样蛋白肽和淀粉样沉积物的自由基形式，和氧化氮阴离子，氧化氮阴离子可通过例如超氧化物自由基阴离子与一氧化氮的反应产生。

根据本发明的这一方面，适当的金属螯合部分是可以通过减少、抑制、或干扰生物金属介导的和淀粉样物质介导的活性氧物质的产生而降低或抑制淀粉样物质毒性的实体，所述活性氧物质包括超氧化物自由基阴离子(O₂·^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(¹O₂)。这可以在当双官能分子中的金属螯合部分以高亲合性结合于氧化还原活性过渡金属离子中的至少一种时实现，所述氧化还原活性过渡金属离子选自铜II(Cu²⁺)和铁III(Fe³⁺)。

用于本发明中的适当的金属螯合部分可以是已知以高亲合性与过渡金属离子结合的多种金属螯合剂和金属复合分子中的任何一种。其包括但不限于芳香族胺如红菲绕啉(4，7-二苯基-1，10-菲绕啉，其结构在图2A中)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉(图2B)、和TPEN(四(2-吡啶甲基)乙二胺，图2I)；和脂肪族胺如去铁草酰胺(图2C)、青霉胺(2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸，图2D)、EDTA(乙二胺四乙酸，图2E)、EGTA(O，O′-双(2-氨乙基)乙二醇-N，N′，N″，N_-四乙酸，图2F)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸，图2G)、和TETA(三亚乙基四胺，图2H)；及其官能衍生物、同系物和类似物。

α-硫辛酸衍生物构成了可用于本发明实践中的金属螯合剂的另一个种类。除了表现出金属螯合性质之外，α-硫辛酸衍生物还具有强大的抗氧化活性(综述，参见例如H.Moini等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.，2002，182：84-90；或G.Biewenga等人，Gen.Pharmac.，1997，29：315-331)。α-硫辛酸的抗氧化作用已经在神经元和非神经元组织中表现出来(M.A.Lynch，Nutr.Neurosci.，2001，4：419-438)。体外、动物、和初步的对人的研究结果表明硫辛酸可在多种神经退行性病症中有效(L.Packer等人，Free Radic.Biol.Med.，1997，22：359-378)。具体地，α-硫辛酸已经被证明在AD患者死后尸检的人脑中有效降低神经元淀粉样物质负荷(J.Fonte等人，J.Alzheimer Dis.，2001，3：209-219)，和反转老年小鼠中的记忆损伤和脑氧化应激(S.A.Farr等人，J.Neurochem.，2003，83：1173-1183)。

预计α-硫辛酸衍生物(与其它金属螯合剂相比)表现出的另外的性质(如抗氧化)可以扩大双官能分子的作用范围，因为α-硫辛酸可以通过不同机制发挥其抗氧化作用，包括螯合金属离子、清除活性氧物质(ROS)或其它自由基、再生内原性抗氧化剂(如维生素C、维生素E和谷胱甘肽)、和/或修复氧化性损伤。

本发明的双官能分子的精确设计将受其预定目的影响并且根据金属螯合部分的已知的、观察到的或期望的性质选择金属螯合部分。用于干扰淀粉样蛋白聚集和促进淀粉样沉积物溶解的优选的金属螯合部分包括DTPA、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、青霉胺，及其衍生物、同系物和类似物，或其任何的组合。用于干扰生物金属介导的和淀粉样物质介导的活性氧物质产生的优选的金属螯合部分包括2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、α-硫辛酸，及其衍生物、同系物和类似物，或其任何的组合。

已经开发了包括与两个相同的淀粉样物质结合部分(苯并噻唑衍生物)共价结合的DTPA作为金属螯合部分的第一类新的双官能分子，其合成、性质和应用在实施例部分中描述(参见实施例1、4到6)。包括与一个淀粉样物质结合部分(选自与第一类中使用的那些相同的苯并噻唑衍生物)共价结合的α-硫辛酸作为金属螯合部分的第二类双官能分子的合成在实施例9中描述。

优选地，金属螯合部分含有至少一个可用于使金属螯合部分共价连接于淀粉样物质结合部分的官能团(或可以容易地化学转化为可使用的不同官能团)。适当的官能团包括但不限于胺(优选伯胺)、硫醇、羧基等等。

双官能分子的合成

可通过本领域中已知的任何合成方法制备本发明的双官能分子，唯一的必要条件是：在反应之后，淀粉样物质结合部分和金属螯合部分分别保持其结合和螯合性质。淀粉样物质结合部分可以以多种方式与金属螯合部分结合。优选地，淀粉样物质结合部分共价连接于金属螯合部分。本领域技术人员可以理解，淀粉样物质结合部分和金属螯合部分可直接彼此连接或通过连接基团彼此连接。

在某些优选实施方案中，金属螯合部分和淀粉样物质结合部分直接地彼此共价连接。直接的共价结合可以通过酰胺键、酯键、碳-碳键、二硫键、氨基甲酸酯键、醚键、硫醚键、脲键、胺键、或碳酸酯键进行。可通过利用淀粉样物质结合部分和金属螯合部分上的官能团实现共价结合。可用于将两个部分连接在一起的适当的官能团包括但不限于胺(优选伯胺)、酸酐、羟基、羧基、和硫醇。例如如实施例1中所述，可通过淀粉样物质结合部分上的伯胺和金属螯合部分上的酸酐官能团之间的反应形成酰胺键。也可通过使用活性剂如碳二亚胺使一个部分中的伯胺与另一个部分上的羧基结合。有多种活性剂在本领域中已知并适合于用于本发明中。

在其它优选实施方案中，金属螯合部分和淀粉样物质结合部分可通过连接基团彼此间接地共价连接。这可以通过使用本领域中公知的多种稳定的双功能试剂完成，包括同官能的和杂官能的连接基团(参见例如Pierce Catalog and Handbook，1994)。使用双官能连接基团与使用活性剂的不同之处在于双官能连接基团在反应之后在本发明的双官能分子中得到连接部分，而活性剂使反应中的两个部分之间得到直接连接。双官能连接基团的主要作用是允许两个否则为化学惰性的部分之间反应。然而，还可以选择变成反应产物的一部分的双官能连接基团，使其赋予双官能分子某种程度的构型灵活性(如双官能连接基团包括含几个原子的直链烷基链，例如含有2到10个碳原子的直链烷基链)。

在本发明的情况中可以使用多种本领域中已知的适当的同官能的和杂官能的连接基团。优选的连接基团包括但不限于烷基和芳基，包括具有如氨基、酸酐、羟基、羧基、羰基等活性化学官能度的直链和支链烷基、取代烷基和芳基、杂烷基和杂芳基。

本领域技术人员可以容易地理解，本发明的双官能分子可以包括通过多种不同的方式彼此连接的多种淀粉样物质结合部分的和多种金属螯合部分。本发明的双官能分子内的淀粉样物质结合部分可以完全相同或不同。类似地，本发明的双官能分子内的金属螯合部分可完全相同或不同。双官能治疗分子的精确设计将受其预定目的和其使用的具体情况中期望的性质的影响。

II.靶向对比成像剂

本发明的另一个方面涉及一类新的靶向对比成像剂。

以上已经提及，目前淀粉样病变的诊断包括活组织检查或组织样品的组织病理学。淀粉样物质的存在典型地通过在使用刚果红染色之后在正交偏振光下检测的苹果绿双折射测定。然而，受影响器官的活组织检查不排除并发症，并且不能令人满意地显示淀粉样沉积物的程度或分布(C.Friman和T.Pettersson，Curr.Opin.Rheumatol.，1996，8：6-71)。在阿尔茨海默氏病的情况中，淀粉样沉积物只能在死后评价。这构成了对疾病进行研究和开发更有效的治疗方法的主要障碍。

用于诊断淀粉样病变的理想探针应为对淀粉样物质具有高的亲合性和特异性；表现出低的毒性；并允许检测、定位、和定量患者体内存在的淀粉样沉积物。对于与脑中淀粉样蛋白(或类淀粉样蛋白)的聚集和积聚有关的阿尔茨海默氏病和其它神经退行性病症的诊断，理想的探针还应该可透过血脑屏障，并且允许非侵入性检测、定位、和定量活着的患者脑中的淀粉样沉积物。

本发明涉及满足一些上列标准的靶向、可检试验剂。因此，本发明提供了靶向对比成像剂，其设计为用于(1)对淀粉样物质具有某种程度的吸引力、和(2)可通过成像技术检测到。更具体地，本发明提供了包括与至少一个淀粉样物质结合部分连接的至少一个成像部分的对比成像剂。

淀粉样物质结合部分

本发明的对比成像剂中的淀粉样物质结合部分起到与在上述双官能治疗分子中的作用相同的作用；它们是对淀粉样物质表现出某种程度的吸引力的靶向实体，即，它们特异性地和/或有效地与淀粉样沉积物相互作用、结合、或对其标记。因此用于设计和开发对比成像剂的适当的淀粉样物质结合部分与以上列举的用于双官能治疗分子中的那些淀粉样物质结合部分相同。

在某些优选的实施方案中，本发明的对比成像剂中的淀粉样物质结合部分表现出对淀粉样沉积物的高的亲合性和特异性。在其它优选实施方案中，淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样物质具有高的亲合性和特异性。在其它优选实施方案中，淀粉样物质结合部分能够跨越血脑屏障，如上所述，这在当对比成像剂预定用作在脑中定位淀粉样沉积物的体内生物标志物时是一个重要的性质。

上述的某些偶氮染料的潜在致癌性在淀粉样蛋白成像研究中意义不大，因为在任何时候只有非常微量的、微不足道量的高特异性淀粉样物质结合部分接触大肠菌。

成像部分

在本发明的情况中，成像部分是可通过成像技术如磁共振成像(MRI)、磁共振光谱分析(MRS)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射层析成像(PET)检测到的实体。优选地，成像部分是在体外和体内条件下保持其性质的稳定的无毒性实体。

MRI成像部分：在某些优选实施方案中，本发明的对比成像剂设计为可通过磁共振成像检测到。

MRI已经发展为诊断临床医学和生物医学研究中最强大的非侵入性技术(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，99：2293-2352；W.Khun，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29：1-19；M.M.Huber等人，Bioconjug.Chem.，1998，9：242-249；R.A.Moats等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36：726-728；X.Yu等人，Mag.Res.Med.，2000，44：867-872)。MRI是用于化学、物理学和分子结构生物学中最著名的分析方法-核磁共振(NMR)-的应用。MRI可以在相对短的时间跨度内产生三维结构信息，并广泛用作非侵入性诊断工具以识别可能有害的生理学异常、观察血液流动、或测定心血管***的一般状态(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，99：2293-2352)。

MRI的优点(优于其它高质量成像方法)在于不依靠可能有害的电离辐射(A.R.Johnson等人，Inorg.Chem.，2000，39：2652-2660)。在MRI中，通过检测水浓度中的局部变化、和NMR信号与水质子(¹H)的T₁(自旋点阵)和T₂(自旋-自旋)张弛时间提供生物样品或患者身体的对比成像。通常可通过使用对比成像剂改善MRI的清晰度。由于其顺磁性性质，这些成像剂通过利用其不成对电子促进自旋移而缩短T₁和T₂张弛时间。这使得浓度依赖性对比度增加并因此增强了不同解剖结构之间的差异。

因为实体的顺磁磁化率(由此其能够缩短水分子附近的质子核的T₁和T₂张弛时间的能力)随不成对电子数的增加而增加(F.A.Cotton等人，“Basic Inorganic Chemistry”，John Wiley&Sons，New York，1995，第68页)，用于MRI的理想的顺磁性金属离子原则上应具有尽可能多的不成对电子。然而，这种顺磁性金属离子与水分子的复合体为高毒性的，因此不能用于体内成像(W.Kuhn，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29：1-19)。通过将顺磁性金属离子复合于配体或金属螯合部分并只留下一个配位点对水分子开放，认为已经有力地降低了毒性。因此，大多数的MRI对比成像剂典型地包括螯合形式的顺磁性金属离子。

因此，在本发明的某些实施方案中，优选将MRI对比成像剂设计为使得成像部分包括与顺磁性金属离子复合的至少一个金属螯合部分。

用于本发明的适当的顺磁性金属离子包括已知为生理学可接受的、在MRI中是良好的对比增强剂、并容易地结合到金属螯合部分中的任何顺磁性金属离子。优选地，顺磁性金属离子选择钆III(Gd3+)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)、和镱III(Yb³⁺)。更优选地，顺磁性金属离子为钆III(Gd³⁺)。钆为FDA批准用于MRI的对比剂，其在异常组织中积聚，使这些异常区域在MRI上变得非常明亮(得到增强)。已知钆在身体不同区域特别是在脑中正常组织和异常组织之间提供大的对比度。

用于本发明的适当的金属螯合部分包括在本领域中已知与可由MRI检测到的顺磁性金属离子复合的任何实体。优选地，金属螯合部分是稳定的、无毒性实体，其以高亲合性结合顺磁性金属离子，留下一个配位点对水分子开放，并且一旦复合，这种高的亲合性使得顺磁性金属离子不能被水置换。

已经使用多种这种金属螯合部分用于Gd³⁺的复合。这些包括DTPA(图2G)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA，其化学结构在图3A中)；及其衍生物(参见例如美国专利4,885,363、5,087,440、5,155,215、5,188,816、5,219,553、5,262,532、和5,358,704、和D.Meyer等人的Invest.Radiol.，1990，25：S53-55)。然而，这些配体的钆复合体在生理条件下是盐，并且对非顺磁性阳离子抗衡离子的需要增加了溶液的重量克分子渗透压浓度。已经使用DTPA-双(酰胺)衍生物制备了保持高水溶性和松弛性(relaxativity)的中性的钆复合体(美国专利4,687,659)。

复合顺磁性金属离子的其它金属螯合部分包括非环形的实体，如氨基多羧酸及其磷含氧酸类似物(如三亚乙基四胺六乙酸或TTHA，其化学结构在图3B中；和二磷酸二吡哆醛，DPDP在图3C中)；和大环的实体(如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″-三乙酸或DO3A，其化学结构在图3D中)。金属螯合部分也可是美国专利5,410,043、5,277,895、和6,150,376、或F.H.Arnold的Biotechnol.，1991，9：151-156中所述的任何实体。

在实施例2中描述了通过在本发明的治疗双官能分子中嵌入Gd³⁺开发的一类新的MRI对比成像剂的合成。本发明的MRI成像剂的性质和应用分别在实施例7和8中报导。

MRS成像部分：在某些实施方案中，本发明的对比成像剂设计为用于磁共振光谱分析(MRS)中。更具体地，本发明还提供了对比成像剂，其包括与至少一个由稳定的顺磁性同位素标记的淀粉样物质结合部分连接的至少一个金属螯合部分。优选的稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)和氟-19(¹⁹F)。

放射性成像部分：在其它优选实施方案中，本发明的对比成像剂设计为用于可通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)或正电子发射层析成像(PET)检测到。

SPECT和PET为已经用于检测肿瘤、动脉瘤(血管壁中的浅色斑)、不规则的或不充分的到各种组织的血液流动、血细胞病症、和器官如甲状腺功能不足和肺机能不足的核医学成像技术。两种技术都获得被引入生物样品或患者身体中的放射性核素的浓度的信息。PET通过检测短寿命的放射性物质射出的辐射产生图像，所述短寿命的放射性物质通过用中子轰击非放射性化学品以造成放射性同位素而形成。PET检测其中放射性物质与组织中的电子碰撞射出正电子的位置处放出的γ射线。PET分析产生在感兴趣部位的身体的一系列薄片图像(如脑、胸、肝)。这些薄片图像可装配成体现被检组织的三维图像。然而，只有少数的PET中心，因为它们必须位于产生用于该技术的短寿命放射性同位素所需的粒子加速器装置附近。SPECT类似于PET，但是用于SPECT的放射性物质(如^99mTC、¹²³I、¹³³Xe)具有比用于PET的那些更长的衰变时间，并且其发射的不是双γ射线而是单γ射线。虽然SPECT图像表现出比PET图像更差的灵敏度和较少的细节，但SPECT技术表比PET具有几个优点：其不需要位于粒子加速器附近，并且比PET便宜得多。

因此，在某些优选实施方案中，本发明的对比成像剂设计为可通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)检测到。优选地，对比成像剂中的成像部分包括至少一个复合于可通过SPECT检测到的金属实体的金属螯合部分。

用于本发明的适当的金属实体是本领域中已知为生理学可接受的、可通过SPECT检测到的、并且容易被结合到金属螯合部分中的放射性核素。优选地，放射性核素选自锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、钇-91(⁹¹Y)、铟-111(¹¹¹In)、铼-186(¹⁸⁶Re)、和铊-201(²⁰¹Tl)。最优选地，放射性核素为锝-99m(^99mTc)。在目前进行的常规核医学过程中，超过85％使用基于^99mTc的方法。

用于本发明的适当的金属螯合部分包括已知复合于可通过SPECT检测到的短寿命放射性核素的任何实体。优选地，金属螯合部分是以高亲合性结合可由SPECT检测到的放射性核素的稳定的、无毒性实体。

复合放射性核素如^99mTc的金属螯合部分在本领域中是公知的(参见例如“Technetium and Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine”，M.Nicolini等人，编著，1995，SGEditoriali：Padova，Italy)。适当的金属螯合部分包括例如N₂S₂和N₃S螯合剂(A.R.Fritzberg等人，J.Nucl.Med.，1982，23：592-598，其可以分别通过两个氮原子和两个硫原子、或通过三个氮原子和一个硫原子复合于放射性核素。半胱氨酸乙酯二聚物(ECD，其化学结构在图3C中)为本领域中公知的N₂S₂螯合剂。N₂S₂和N₃S螯合剂在例如美国专利4,444,690、4,670,545、4,673,562、4,897,255、4,965,392、4,980,147、4,988,496、5,021,556和5,075,099中描述。

其它适当的金属螯合部分可选自多磷酸盐(如亚乙基二氨基四亚甲基四亚磷酸，EDTMP，其化学结构在图3D中)；氨基羧酸(如EDTA、N-(2-羟基)乙二胺-三乙酸、次氮基三乙酸、N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸、亚乙基双(羟基苯基甘氨酸)和二亚乙基三胺五乙酸；1，3-二酮(如乙酰丙酮、三氟乙酰丙酮、和噻吩甲酰三氟丙酮)；羟基羧酸(如酒石酸、柠檬酸、葡糖酸、和5-磺酰基水杨酸；多胺(如乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、和三氨乙基胺)；氨基醇(如三乙醇胺、和N-(2-羟乙基)乙二胺)；芳香族杂环碱(如2，2′-二咪唑、甲基吡啶胺、二甲基吡啶胺和1，10-菲咯啉)；酚(如水杨醛、二磺酰基邻苯二酚、和变色酸)；氨基酚(如8-羟基喹啉和肟磺酸(oximesulfonic acid))；肟(如六甲基亚丙基胺肟，HMPAO，在图3E中)；席夫碱(如二水杨醛-1，2-亚丙基二亚胺)；四吡咯(如四苯基卟吩和酞菁)；硫化合物(如甲苯二硫醇、内消旋-2，3-二巯基丁二酸、二巯基丙醇、巯基乙酸、乙基黄原酸钾、二乙基二硫代氨基甲酸钠、双硫腙、二硫代磷酸二乙酯、和硫脲)；合成的大环化合物(如二苯并[18]冠醚-6)，或两种或多种上述试剂的组合。

优选的金属螯合部分选自多羧酸如EDTA、DTPA、DOTA、DO3A；及其衍生物、同系物、和类似物；或其组合。

其它适当的金属螯合部分在美国专利5,559,214和WO 95/26754、WO 94/09056、WO 94/29333、WO 94/08624、WO 94/08629、WO94/13327、和WO 94/12216中描述。

优选地，金属螯合部分含有至少一个可用于(或容易地化学转化成可用的不同官能团)使金属螯合部分共价连接于淀粉样物质结合部分的官能团。适当的官能团包括但不限于胺(优选伯胺)、硫醇、羧基等等。

对比成像剂的合成

上述制备本发明的双官能分子分的方法可用于合成对比成像剂。

可通过本领域中已知的任何方法制备包括至少一个与金属实体复合的金属螯合部分的成像部分。可在金属螯合部分和淀粉样物质结合部分之间形成直接或间接的共价结合之前、过程中、或之后进行复合。优选地，使用本发明的双官能分子作为初始物质进行复合(参见实施例2和3)。当金属实体是短寿命放射性核素时，优选复合在使用对比成像剂之前不久进行。

适当的复合方法包括例如将金属实体直接结合到金属螯合部分中和金属转移作用。当可能时，优选直接结合。在该方法中，通常将金属螯合部分的水溶液与金属盐接触或混合。反应混合物的pH可为约4到约11。优选地，pH为5到9。更优选地，反应在pH为6到8下进行。直接结合的方法在本领域中是公知的，并且已经描述了不同的过程(参见例如WO 87/06229)。当需要在结合之前将金属实体还原为不同的氧化状态时使用金属转移作用。金属转移作用的方法在本领域是公知的。实施例3说明了这种反应，其中通过使用SnCl₂将金属离子还原为Tc(V)将^99mTc结合到双官能分子中。

本领域技术人员可以理解，对比成像剂可包括通过多种不同方式彼此连接的多个淀粉样物质结合部分和多个成像部分。对比成像剂内的淀粉样物质结合部分可完全相同或不同。类似地，对比成像剂内的成像部分可完全相同或不同。对比成像剂的设计将受其预定目的和在其所用的具体情况中所需的性质影响。

III.双官能治疗分子的应用

本发明的另一方面涉及用于降低或抑制淀粉样物质毒性的***。因此，本发明提供了用于降低或抑制淀粉样蛋白(和类淀粉样蛋白)当以β-折叠构型聚集时对其环境产生的毒性能力的试剂和对策。本发明还提供了用于降低或抑制淀粉样物质介导的对多种生物分子具有有害影响并可以诱导氧化应激的活性氧物质产生的试剂和对策。

更具体地，本发明提供了起到金属螯合剂作用的靶向试剂和使用它们用于降低或抑制体外、体内和回体***以及活着的患者中的淀粉样物质毒性的方法。本文提供的方法包括使用本发明的双官能分子，其通过有效地螯合过渡金属离子并表现出对淀粉样沉积物的高的亲合性和特异性而显示出双重选择性。

在某些优选实施方案中，本发明使得可通过预防、减慢、或终止淀粉样物质在***或患者中积聚，和/或通过促进、诱导、或帮助已经存在于***或患者中的淀粉样沉积物溶解而降低淀粉样物质毒性。这可以在当双官能分子中的金属螯合部分以高亲合性结合于至少一种过渡金属离子时实现，所述过渡金属离子选自锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)。

在其它优选实施方案中，本发明使得可通过减少、抑制、或干扰淀粉样物质介导的活性氧物质的产生而降低或抑制淀粉样物质毒性。这可以在当双官能分子中的金属螯合部分以高亲合性结合于至少一个选自铜II(Cu²⁺)和铁III(Fe³⁺)的氧化还原活性过渡金属离子时实现。

本领域技术人员可以理解，涉及使用具有金属螯合部分(其结合高亲合性的Cu²⁺和/或Fe³⁺)的双官能分子的方法可降低或抑制由聚集的淀粉样蛋白产生的毒性和由活性氧物质生成(因为Cu²⁺和Fe³⁺是可以促进淀粉样蛋白聚集的过渡金属离子和可以在活性氧物质生成过程中涉及到的氧化还原活性生物金属)所引起的毒性。

更具体地，本发明提供了降低或抑制***中淀粉样物质毒性的方法，其包括使***与有效量的本发明的双官能分子或其药物组合物接触。

接触可以体外、体内、或回体方式进行。例如，可通过培养进行接触。

***可为任何已知能够产生和/或含有淀粉样沉积物的任何生物实体。例如，***可为细胞、生物流体、生物组织、或动物。当***为细胞、生物流体或生物组织时，其可来源于活着的患者(如其可以通过活组织检查得到)或死亡的患者(如，其可以通过尸体解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳动物。在优选实施方案中，细胞、生物流体、或生物组织来源于怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者。在其它优选实施方案中，细胞、生物流体、或生物组织来源于怀疑患有与β淀粉样肽的积聚有关的病理生理学状况的患者。在这种具体情况中，优选双官能分子中的淀粉样物质结合部分表现出对Aβ淀粉样物质的高的亲合性和特异性。

本发明还提供了用于预防或治疗患者中与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的方法。本文所述的方法可用于(1)延迟或预防疾病的发作；或(2)减慢或终止疾病的进展、加重、或恶化；或(3)反转或改善疾病的症状和症候；或(4)治愈疾病。该治疗可在疾病发作之前给予，用于预防或预防性作用；或在疾病开始之后给予，用于治疗作用。

更具体地，本发明提供了治疗患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者的方法，其包括对患者给予有效量的本发明的双官能分子或其药学组合物。

双官能分子或其药学组合物的给药可通过本领域中已知的任何方法进行，例如通过口服和肠胃外给药，包括静脉内给药、肌内和皮下注射给药、和透皮给药和肠给药。

影响患者的病理生理学状况可与任何淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白的积聚有关，所述蛋白例如淀粉样蛋白免疫球蛋白轻链(AL)；血清淀粉样蛋白相关蛋白质(AA或SAP)；β淀粉样肽(Aβ)；改变型运甲状腺素蛋白(ATTR)；小岛淀粉样物质多肽(IAPP或Amylin)；朊病毒蛋白质(PrP)等等。聚集的淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白的积聚可在身体的任何器官或组织中发生并在心、脑、胃肠***、肝、脾、肾、胰腺、肺、关节、肌肉等中形成小纤维、纤丝、蛋白斑、和/或缠结。

病理生理学状况可以是已知与淀粉样病变有关的任何疾病和病症。这些疾病和病症包括但不限于II型糖尿病、进行性核上麻痹、某种类型的内分泌***癌症如甲状腺骨髓癌、家族性淀粉样病变(Finnish型)、家族性淀粉样蛋白多发性神经病(Portuguese型)、家族性淀粉样蛋白多发性神经病(Iowa型)、家族性淀粉样蛋白心肌病(Danish型)、有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样蛋白肾病(Muckle-Wells′综合症)、遗传性非神经性***性淀粉样变(Ostertag型)、遗传性肾淀粉样病变、与淀粉样蛋白有关的骨髓癌或macroglobulinernia相关的原发症、***性老年性淀粉样病变、何杰金氏病、郎格罕氏岛、孤立型心房淀粉样蛋白(isolated atrial amyloid)、和家族性地中海热。

在某些优选实施方案中，本发明的方法涉及对优选在脑中与聚集和积聚的淀粉样蛋白和类淀粉样蛋白有关的病理生理学状况的预防和治疗。这些病理生理学状况包括例如朊病毒疾病，其可以影响人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合症、FatalFamilial Insomnia、和库鲁病)以及其它哺乳动物(如牛的牛海绵状脑病、羊的痒病、貂的可传染的脑病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病)；有时在患有脑外伤的个体的脑中观察到的淀粉样病变；和神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、路易体痴呆、具有淀粉样病变(荷兰型和冰岛型)的遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆、和影响成年唐氏综合症患者的阿尔茨海默氏病形式。在这些情况中，选择本发明的双官能分子中的淀粉样物质结合部分，以使其能够跨越血脑屏障。

IV.检测方法

另一方面，本发明可进行与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的诊断。具体地，本发明可进行神经退行性疾病的非侵入性诊断的特征在于淀粉样物质在患者脑中的聚集和积聚。因此，本发明提供了检测淀粉样沉积物存在的试剂和对策。更具体地，本发明提供了可通过成像技术检测到的靶向试剂和可在体外、体内、和回体***以及活着的患者中检测、定位和定量淀粉样沉积物的方法。本文提供的方法基于本发明的对比成像剂的使用，该对比成像剂包括与至少一个可通过成像技术检测到的成像部分连接的至少一个对淀粉样沉积物有高亲合性和特异性的淀粉样物质结合部分。或，本文提供的方法可涉及本发明的对比成像剂的使用，所述对比成像剂包括至少一个与至少一个由稳定的顺磁性同位素标记的淀粉样物质结合部分连接的金属螯合部分。

更具体地，本发明提供了用于检测***中存在淀粉样沉积物的方法，其包括使***与成像有效量的本发明的对比成像剂或其药学组合物接触的步骤。优选在可使对比成像剂与***中存在的淀粉样沉积物相互作用、使得相互作用导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下进行接触。然后使用成像技术检测与***中存在的淀粉样沉积物相结合的对比成像剂，产生***的至少一部分的一个或多个图像。

接触可以通过本领域中已知的任何适当的方法进行。例如，可以通过培养进行接触。

***可以是已知能够产生和/或含有淀粉样沉积物的任何生物实体，例如，***可为细胞、生物流体、生物组织、或动物。当***是细胞、生物流体、或生物组织时，其可来源于活着的患者(如，其可通过活组织检查得到)或死亡的患者(如，其可通过尸体解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳动物。

在优选实施方案中，细胞、生物流体或生物组织来源于怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者。例如，细胞、生物流体或生物组织可来源于怀疑患有与β淀粉样肽的积聚有关的病理生理学状况的患者。在这种具体情况中，根据对Aβ淀粉样物质的高亲合性和特异性选择对比成像剂中的淀粉样物质结合部分。在其它优选实施方案中，细胞、生物流体、或生物组织与用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂接触(体外或回体)。

在本发明的一个方面中，上述方法用于识别潜在治疗剂。例如，可在使细胞、生物流体或生物组织与用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂接触之前或之后形成细胞、生物流体或生物组织的至少一部分的图像。对“之前”和“之后”的图像的比较可测定试剂对***中存在的淀粉样沉积物的作用。本发明还包括通过这种方法鉴别的治疗剂。

本发明还提供了用于检测患者体内存在的淀粉样沉积物的方法。该方法包括对患者给予成像有效量的本发明的靶向对比成像剂或其药学组合物。优选给药在可使对比成像剂(1)达到患者身体可能含有淀粉样沉积物的区域和(2)与任何淀粉样沉积物相互作用以使相互作用导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下进行。在给予对比成像剂之后并且在逝去的足够时间内用于发生相互作用(例如在30分钟到48小时之后)，使用成像技术检测存在于患者中的结合于淀粉样沉积物的对比成像剂，并且形成患者身体的至少一部分的一个或多个图像。

在一个实施方案中，该方法用于定位患者中的淀粉样沉积物。通过比较从怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者得到的结果与对得自临床上健康个体的图像，可以测定淀粉样沉积物的存在和分布并且确诊淀粉样病变。例如，该方法可用于定位患者脑中的淀粉样蛋白斑。在这种情况中，选择对比成像剂中的淀粉样物质结合部分，使其能够跨越血脑屏障。具体地。该方法可用于检测和定位怀疑患有阿尔茨海默氏病的患者脑中的淀粉样蛋白斑。在这种情况中，对比成像剂中的淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样物质具有高的亲合性和特异性并且可透过血脑屏障。对于脑成像，测量结合的对比成像剂的量并与结合于患者小脑的对比成像剂的量相比(作为比值)。然后将该比值与年龄相当的临床健康的患者脑中的同一比值比较。

对比成像剂或其药学组合物的给药可以通过本领域中已知的任何适当的方法进行，例如通过口服和肠胃外的方法给药，包括静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、皮内给药和腔内给药、和肠方法。

在优选实施方案中，本文提供的用于检测***或患者中的淀粉样沉积物存在的方法通过使用本发明的对比成像剂进行，其中使金属螯合部分复合于上述的顺磁性金属离子。然后通过磁共振成像(MRI)和产生MR图像进行淀粉样沉积物的检测。优选地，顺磁性金属离子为钆III(Gd³⁺)。

在其它优选实施方案中，检测方法通过使用本发明的对比成像剂进行，其中使金属螯合部分复合于上述放射性核素。然后通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)和产生SPECT图像进行淀粉样沉积物的检测。优选地，放射性核素为锝-99m(^99mTc)。

在其它优选实施方案中，检测方法通过使用本发明的对比成像剂进行，其中用上述的稳定的顺磁性同位素标记淀粉样物质结合部分。然后通过磁共振光谱分析(MRS)和产生MR图像进行淀粉样沉积物的检测。优选地，稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)。

提供用于检测在患者或***中淀粉样沉积物存在的本发明的方法可用于诊断与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况。可通过对患者身体的部分或全身进行检查和成像、或通过对得自患者的生物***(如一个或多个生物流体或生物组织样品)进行检查和成像实现诊断。这种方法或其它方法、或两种方法的组合可根据怀疑影响患者的临床状况的性质进行选择。得自患者的结果与得自临床健康个体研究的数据的比较将决定和证实诊断。

这些方法也可用于跟踪与淀粉样病变有关的病理生理学状况的进展。例如，这可以通过在一段时间内重复该方法以建立患者中淀粉样沉积物的存在、定位、分布、和定量的时间曲线而实现。

这些方法也可用于监测患者对与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的治疗的应答。例如，在对患者进行治疗之前或之后，产生包含淀粉样沉积物的身体的一部分的图像(或来源于患者并包含淀粉样沉积物的细胞、生物流体、或生物组织的一部分的图像)。“之前”和“之后”的成像的比较用于测定治疗对淀粉样沉积物的效果并从而监测患者对具体治疗的应答。

可通过本文的方法诊断或跟踪其进展的病理生理学状况可以与上述列举的任何淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白的积聚有关。聚集的淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白可以在身体的任何器官或组织中积聚并形成小纤维、纤丝、蛋白斑、和/或缠结。可通过本文提供的方法为器官如心、脑、胃肠***、肝、脾、肾、胰腺、肺、关节、肌肉等进行检查和成像。

可通过本文中提供的本发明的方法诊断或跟踪其进展的病理生理学状况可以是已知与淀粉样病变有关的任何疾病和病症。例如，本发明的方法可用于诊断的状况如II型糖尿病、进行性核上麻痹、某种类型的内分泌***癌症如甲状腺骨髓癌、家族性淀粉样病变(Finnish型)、家族性淀粉样蛋白多发性神经病(Portuguese型)、家族性淀粉样蛋白多发性神经病(Iowa型)、家族性淀粉样蛋白心肌病(Danish型)、有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样蛋白肾病(Muckle-Wells′综合症)、遗传性非神经性***性淀粉样变(Ostertag型)、遗传性肾淀粉样病变、与淀粉样蛋白有关的骨髓癌或macroglobulinernia相关的原发症、***性老年性淀粉样病变、何杰金氏病、郎格罕氏岛、孤立心房淀粉样蛋白、和家族性地中海热。

在某些优选实施方案中，本发明的方法涉及与特别在脑中聚集和积聚的淀粉样蛋白和类淀粉样蛋白有关的病理生理学状况的诊断。这些病理生理学状况包括例如朊病毒疾病，其可以影响人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合症、Fatal FamilialInsomnia、和库鲁病)以及其它哺乳动物(如牛的牛海绵状脑病、羊的痒病、貂的可传染的脑病、和黑尾鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病)；有时在患有脑外伤的个体脑中观察到的淀粉样病变；和神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、路易体痴呆、具有淀粉样病变(荷兰型和冰岛型)的遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆、和影响成年唐氏综合症患者的阿尔茨海默氏病形式。在这些情况中，选择本发明的双官能分子中的淀粉样物质结合部分，以使其能够跨越血脑屏障。

制剂、剂量和给药

双官能治疗分子

本文描述的双官能治疗分子可本身直接给药或以药学组合物的形式给药。因此，本发明提供包括有效量的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐、和至少一种药学可接受的载体的药学组合物。具体的制剂取决于选择的给药途径。双官能治疗分子或其药学组合物可通过本领域中已知的任何适当的方法给药。适当的途径的例子包括口服和肠胃外给药，包括静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、和皮下注射、经皮给药和肠给药、等等。

可通过将本发明的双官能分子与一种或多种药学可接受的载体或稀释剂合并得到用于口服用药学组合物。这种载体的应用可使本发明的双官能分子配制成例如片剂、胶囊剂、丸剂、糖衣剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、淤浆剂(slurries)、和悬浮剂。用于口服用药学可接受的载体和稀释剂是本领域已知的(参见例如Remington′s PharmaceuticalSciences，1990)，期望包括任何和所有的溶剂、分散介质、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等等。这种药学组合物应包含至少1重量％的活性化合物。可改变组合物的百分比，其可方便地为每单位约5重量％到约80重量％。可用于治疗应用的组合物中的活性化合物的量是将获得适当剂量的量。本发明的优选组合物制备为包含约0.5μg到2000mg活性化合物的口服剂量单元形式。

口服制剂可选择性地包含其它常规的、无毒的组分，如填料和粘合剂(例如，糖，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、和山梨糖醇；和纤维素制剂如淀粉、凝胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和聚乙烯吡咯烷酮)；赋形剂(例如磷酸二钙)；崩解剂(如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、藻酸、和海藻酸钠)；润滑剂(如硬脂酸镁)；和调味剂(如胡椒薄荷、冬青油、和樱桃香料)。当制剂形成胶囊时，其可包含除上述之外的液体或半液体介质(如脂肪油、液体石蜡、和液体聚乙二醇)。可存在多种其它物质作为包衣或用于改变剂量单元的外形。例如，片剂、丸剂、或胶囊剂可由虫胶、糖、或两者一起包衣。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料、和香料如樱桃或橙口味的香料。用于制备口服用药学组合物的任何物质都应是药学纯的并在使用量下是基本上无毒的。

也可将本发明的双官能分子配制为用于注射的肠胃外给药(如通过弹丸注射或连续输注)，并且作为单位剂型存在(如在安瓿中或多剂量容器中存在)。用于注射的剂量单元形式对于容易给药和剂量的均匀性特别有利。本文中使用的术语“剂量单元形式”是指适合作为待治疗患者使用的单一剂量的物理离散形式单元。每个单元包含计划产生期望的治疗效果的预定量的活性物质。剂量单元形式直接取决于活性化合物和期望的治疗效果的特征。例如，单位剂型包含0.5μg到约2000mg的主要活性化合物。或可以给药200ng/kg体重到超过10mg/kg体重的量。所述量可以是单个活性化合物的量或合并的活性化合物的总量。

肠胃外组合物可为活性双官能分子的悬浮液、乳液、或水性和非水溶液，并且可选择性地包含其它助剂，如助悬剂、稳定剂、和/或分散剂。亲脂性的溶剂或媒介物(如脂肪油、合成脂肪酸酯、和脂质体)可用于制备悬浮液和乳液。可通过加入另外的物质如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、和右旋糖酐增加水性肠胃外制剂的粘度。

或者，可将本发明的双官能分子配制为可控制释放活性成分。控制释放组合物在本领域中是已知的(参见例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，1990)，并且其可以是微胶囊、栓剂、或depot剂型。可通过将活性分子结合或截留在聚合物材料(诸如例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯基吡咯烷酮、水凝胶、聚乳酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羟甲基纤维素、和羧甲基纤维素)的粒子中、或胶质的药物递送***(诸如例如脂质体、微球、微或大乳液、纳米粒子、和纳米胶囊)中得到这些药学组合物。Depot制剂可通过植入或经皮递送、肌肉注射、或通过使用经皮贴膏给药(参见例如美国专利4,708,716和5,372,579中所述的装置)。

本发明的双官能治疗分子或其药学组合物可单独给药或与本发明的其它试剂组合、和/或与其它治疗剂组合，其性质部分地取决于要治疗的疾病状况。例如，在阿尔茨海默氏病的情况中，本发明的双官能分子可与FDA批准的治疗剂如多奈哌齐(Aricept_)、他克林(Cognex_)、rivastigmine(Exelone_)、和velnacrine(Mentane_)组合给药，所述治疗剂是起到认知增强剂作用并且已知为一些AD患者提供轻微缓解的乙酰胆碱酯酶抑制剂。确定适合于治疗具体病症的化合物的组合的能力在从业医生的能力范围内。

可治疗性地给予本发明的双官能分子或其药学组合物以治疗与淀粉样物质积聚有关的多种病理生理学状况，(即在疾病发病之后)或事先预防这些病理生理学状况。

本发明的双官能分子或其药学组合物的给药应剂量应是递送对于其预定目的有效的剂量。给药途径、制剂和剂量取决于患者的年龄、性别、体重和健康状况；要治疗的具体的病理生理学状况(***的或局部的、原发性或继发性淀粉样病变)；疾病程度；双官能治疗分子的效力、生物利用度、体内半衰期和副作用的严重程度。这些因素可在治疗过程中容易地测定。选择性地或另外地，给药剂量可以由使用用于治疗的具体状况的动物模型研究测定，和/或从已知表现出类似药理学活性的化合物的动物或人的数据决定。对于每种治疗需要的总剂量可通过多次剂量或单次剂量给药。基于这些或其它方法调节剂量以实现最大效力是本领域已知的，并且在从业医生的能力范围内。

患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的适当的患者可通过实验室试验和病史鉴别。具体地，可通过本文所述的涉及应用靶向对比成像剂和成像技术的本发明的方法测定淀粉样沉积物的存在、定位、分布、和定量。

靶向对比成像剂

本发明还提供包括靶向对比成像剂的药学组合物。更具体地，本发明的药学组合物包括成像有效量的至少一种上述对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。在某些优选的药学组合物中，对比成像剂的成像部分包括至少一个与顺磁性金属离子或放射性核素复合的金属螯合部分。优选地，顺磁性金属离子为钆III(Gd³⁺)；放射性核素为锝-99m(^99mTc)。在其它优选实施方案中，对比成像剂中的淀粉样物质结合部分被稳定的顺磁性同位素标记。优选地，稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)。

可通过本领域中已知的任何适当方法进行对比成像剂或其药学组合物的给药，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences中所述的那些。根据怀疑影响患者的淀粉样病变的具体类型和待检身***置，可将对比成像剂局部地或***地给药，口服递送(作为固体、溶液、或悬浮液)或通过注射(例如静脉内、动脉内、鞘内(即通过脊髓液)、皮内、或腔内)递送。

对于口服，可在上述双官能治疗分子的情况中所述配制本发明的对比成像剂。

对于注射给药，可将对比成像剂的药学组合物配制为无菌水溶液或非水溶液、或作为用于临时制备无菌的可注射溶液的无菌粉末。这种药学组合物在生产和储存条件下应是稳定的，并且必须在避免微生物如细菌和真菌的污染作用下保存。

药学可接受的载体是溶剂或分散介质，如水溶液(如Hank′s溶液、醇/水溶液、或盐水溶液)、和非水载体(如丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有机酯如油酸乙酯)。可注射的药学组合物也可包含肠胃外介质(如氯化钠和Ringer′s葡萄糖)、和/或静脉内介质(如流体和营养补充剂)；以及其它常规的、药学可接受的、无毒的赋形剂和添加剂，包括盐、缓冲剂、和防腐剂如抗菌药和抗真菌药(如parabens、氯代丁醇、酚、山梨酸、thirmerosal等等)。可通过加入可以延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和凝胶)引起可注射组合物的吸收延长。不同组分的pH和浓度可由本领域技术人员容易地测定。

无菌的可注射溶液通过将活性化合物引入到具有上列多种其它组分的需要量的适当溶剂中，然后通过例如过滤或辐照灭菌制备。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法为真空干燥和冻干技术。

通常，可检测到的对比成像剂的剂量根据以下考虑因素的改变而改变，如患者的年龄、性别、和体重，以及怀疑影响患者的具体病理生理学状况、疾病程度和待检身体区域。还要考虑的因素如禁忌症、伴随治疗和其它变量，以调整待给药的可检测对比成像剂的剂量。然而，这可以通过从业医生容易地实现。

通常，本发明的药学组合物的适当的日剂量相当于足够检测患者体内存在的所有淀粉样沉积物的对比成像剂的最低量。为了使该剂量最小化，优选给药为静脉内、肌内、腹膜内、或皮下，并且优选邻近待检部位。例如，静脉内给药适合于尿路成像、脊柱内给药更适合于脑和中枢神经***的成像；而未进食患者的口服适合于胃肠道成像。

优选本发明的放射性对比成像剂以0.1到约10m居里/kg体重每天的范围给药。优选本发明的顺磁性对比成像剂以每天0.02到1.3毫摩尔/kg体重的范围给药。

实施例

以下实施例描述完成和实践本发明的某些优选方式。然而，应该理解，这些实施例只是用于说明性的目的，并不限制本发明的范围。

实施例1：一类与淀粉样物质结合的金属螯合剂的合成

已经设计了一类新的双官能分子并正在开发。新的双官能分子包括直接共价连接于两个相同的淀粉样物质结合部分的一个金属螯合部分。该类所有的双官能分子共有的金属螯合部分是本领域中公知的金属螯合剂二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。如图4A所示，该类的母体分子的淀粉样物质结合部分为硫代黄素衍生物，其属于经报导为在啮齿动物中可透过血脑屏障并表现出对Aβ淀粉样物质具有高亲合性(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，69：1471-1484)的硫代黄素类似物类。

该类的其它成员为其中苯并噻唑部分的芳环被一个或多个官能团取代的母体双官能分子的类似物，所述官能团包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰氧基(sulfonoxyl)、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺酰基、和4-，5-或6-羟基(参见图4B)。

用于以下报告的合成中的所有试剂和溶剂得自AldrichChemical(St.Louis，MO)、Acros Organics(Pittsburg，PA)、或LancasterSynthesis Inc.(Windham，NH)，为可能得到的最高纯度级别，其不经纯化直接使用。

在本文中描述了该类母体双官能分子(化合物XH1)的合成。如以下图解所示，XH1的制备涉及在金属螯合部分与淀粉样物质结合部分之间形成酰胺键。该反应根据以前发表的合成方法而改编的方法进行(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，69：1471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，39：3375-3384‘和M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，29：1488-1491)。

步骤(a)的合成得到硫代黄素类似物，2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(化合物III)，其通过4-硝基苯甲酰氯(化合物II)和2-氨基苯硫酚(化合物I)之间直接偶联的产物的还原制备。在步骤(b)的合成中，DTPA-双(酸酐)(化合物IV)与过量的硫代黄素类似物反应形成所需的化合物XH1。

更具体地，在室温下搅拌无水苯(200mL)中的化合物I(10g，80mmol)和化合物II(15g，80mmol)16小时。然后用乙酸乙酯萃取，蒸发溶剂并通过急骤层析纯化残余物(己烷∶乙酸乙酯85∶15，v∶v)，得到15g(73％)的2-(4′-硝基苯基)-苯并噻唑，为浅黄色固体。然后在氮气下将乙醇中该中间体(10g，40mmol)和氯化锡(II)二水合物(20g，90mmol)的混合物回流4小时。通过蒸发除去乙醇，并将残余物溶解于乙酸乙酯(200mL)中。用1M NaOH(3×200mL)和水(3×200mL)洗得到的溶液。蒸发溶剂，得到10g(97％)的2-(4′-氨基苯基)-苯并噻唑。

然后在30分钟内将DTPA-双(酸酐)(2.5g，7.0mmol)分批加入到冰冷却的化合物III(8.85g，7.8mmol)的乙醇溶液中。加入水(150mL)之后，再在环境温度下搅拌得到的反应混合物12小时。通过减压浓缩反应混合物并加入水(500mL)，得到的溶液用HCl调节到pH 2.5，以诱导形成晶体。在收集之后，晶体从乙醇重结晶，得到纯的XH1(收率：71％)。

通过LC/MS和¹H-NMR表征得到的母体双官能分子。使用在250MHz下操作的Bruker AVANT仪器记录质子-NMR光谱。化学位移单位为ppm，使用DMSO作为参考。通过M-Scan Inc.(West Chester，PA)通过FAB-MS进行反相LC/MS分析。在Symmetry^TM C18，3.5μM，2.1×50mm的柱(Waters Corporation，Milord，MA)上进行LC-MS色谱法，流速为1mL/min，以10分钟、梯度为15-85％乙腈/水，并且具有0.1％恒定浓度的甲酸。XH1的质谱和¹H-NMR光谱在图5中。

上述合成路线可用于和适合于制备该类的其它双官能分子。

实施例2：一类MRI对比成像剂的合成

可从实施例1中描述的双官能分子制备可通过磁共振成像(MRI)检测到的对比成像剂。如在以下母体化合物的情况中所示，MRI对比成像剂Gd-XH1的合成涉及将钆III(Gd³⁺)嵌入到XH1中。该反应根据以前报导的方法进行(M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，29：1488-1491)。

更具体地，将水(30mL)中的XH1(12.1g，25.0mmol)和氧化钆Gd₂O₃(4.53g，12.4mmol)的混合物回流5小时。通过用1M NaOH调节溶液的pH到6.5，定量形成钆复合体的无色晶体。

实施例3：一类SPECT对比成像剂的合成

类似地，可从实施例1中描述的双官能分子制备可通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)检测到的对比成像剂。在以下所示母体双官能分子的情况中，通过使用美国专利4,434,151中所述的在pH 6.5条件下的亚锡还原方法嵌入锝-99m进行反应。反应定量地得到锝复合体，即化合物^99mTc-XH1。

更具体地，将XH1(8.25g，0.17mmol)溶解于1.0mL的乙醇和pH为5.5的1.0M乙酸钠中，并向反应混合物中加入^99mTcO₄ ^-(5-50mCi)在盐水中的1.0mL发生剂洗提液。通过使每毫升乙醇溶解2.0mgSnCl₂·H₂O得到的0.2mL的亚锡溶液的加入产生锝复合体、15-30分钟之后，可通过电泳测定标记效率。

实施例4：用于试验双官能分子生物活性的无细胞试验

在下文中，描述可用于检测本发明的双官能分子的生物活性的多种无细胞试验。更具体地，第一系列的试验用于评价感兴趣的双官能分子降低、抑制、或干扰氧化还原活性过渡金属离子与β淀粉样肽结合从而导致Aβ聚集的能力。第二系列的试验用于评价感兴趣的双官能分子抑制淀粉样物质介导的氧化还原活性过渡金属离子的还原的能力。第三系列的试验用于评价本发明的双官能分子对金属介导的和淀粉样物质介导的活性氧物质的产生的抑制作用，活性氧物质如H₂O₂、O₂·^-、和·OH。本节中描述的最后的试验用于评价双官能分子溶解金属诱导的Aβ聚集物的能力。

对金属-β淀粉样肽结合的抑制

已知氧化还原活性过渡金属离子与淀粉样蛋白的结合(1)促进蛋白质的聚集和积聚、(2)还原过渡金属离子、和(3)产生活性氧物质如过氧化氢(H₂O₂)、超氧化物自由基阴离子(O₂·^-)和羟基自由基(·OH)。在本发明的双官能分子的存在下，这三个过程的效率应至少被降低，最好被完全抑制。以下的无细胞试验可通过评价它们对这三种次发过程的作用来评价本发明的双官能分子对氧化还原活性过渡金属离子与淀粉样蛋白β肽结合的效果。

(a)Aβ肽的合成

通过固相Fmoc化学在W.M.Keck Foundation BiotechnologyResource Laboratory(Yale University，New Haven，CT)；Glabe Laboratory(University of California，Irvine，CA)；或Multhaup Laboratory(Universityof Heidelberg，Germany)合成人Aβ肽(Aβ_1-40和Aβ_1-42)，或直接购自U.S.Peptide，Inc.(Rancho Cucamonga，CA)；或Aldrich-Sigma(St.Louis，MO)。合成物通过反相HPLC纯化、氨基酸排序、和质谱学证实。将合成的Aβ肽溶解于三氟乙醇(30％的Milli-Q水(MilliporeCorporation，Milord，MA)溶液)或20mM HEPES(pH 8.5)中，为0.5-1.0g/mL的浓度，在10,000xg下离心20分钟，并将上层清液(Aβ备用液)用于实验当天的随后分析。

通过214nm的紫外光谱学或通过Micro BCA蛋白质分析(Pierce，Rockford，IL)测定Aβ备用液的浓度。通过向140μL的蒸馏水加入10μL的Aβ备用液(或牛血清清蛋白(BSA)标准液)、然后向96孔板中加入等量的Micro BCA Protein Assay Reagent(150μL)并测量562nm的吸光度进行Micro BCA分析。使用BSA标准曲线测定Aβ的浓度。在使用之前，所有的缓冲液和金属离子(如氯化物盐)的备用液通过0.22μm过滤器(Gelan Sciences，Ann Arbor，MI)过滤，以除去任何粒状物质。

可使用两种不同的方法研究XH1对Zn²⁺诱导的Aβ聚集的反转性：浊度和免疫过滤。

(b)通过浊度测量的对金属诱导的聚集的抑制

如前所述(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，272：26464-26470)进行浊度测定。在有或没有25μM化合物XH1(母体双官能分子)的存在下将Aβ_1-40(10μM)与Zn²⁺(25μM)在67mM磷酸盐缓冲液、150mM NaCI(pH7.4)中共同培养1小时，并以1分钟为间隔进行浊度测定。随后，将20μL等分试样量的10mM待测双官能分子或10mMZn²⁺加入到混合物中，在2分钟之后，以1分钟间隔再取得4个读数。在最终加入双官能分子并读取浊度之后，再在读取最后一个读数之前将混合物培养30分钟。为了对照，使用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)代替化合物XH1进行同样的实验(DTPA是公知的金属螯合剂也是包含在XH1中的金属螯合部分)。

图8中所示的这些试验的结果表明，DTPA和本发明的母体双官能分子都显著地降低溶液中Zn²⁺诱导的Aβ_1-40的聚集，观察到DTPA有最强的效果。

(c)通过免疫过滤测量的对金属诱导的Aβ聚集的抑制

在用于评价本发明的双官能分子对金属诱导的Aβ聚集的效果的第二种方法中，将生理学浓度的Aβ(8nM)加入到包含150mM NaCI、20mM HEPES(pH7.4)、100nM BSA、并具有ZnCl₂(0、0.1、0.2、0.5和2M)的混合物中，并在有或没有待测双官能分子(1-5μM)的存在下培养(30分钟，37℃)，然后将反应混合物(200μL)置于96孔Easy-TiterELISA***(Pierce，Rockford，IL)中并通过0.22μm醋酸纤维素过滤器(MSI，Westboro，MA)过滤。将聚集的粒子固定在膜上(0.1％戊二醛，15分钟)，充分洗涤，然后用抗-Aβ单克隆抗体6E10(Senetek，MarylandLeights，MI)探测。洗涤印迹并在ECL化学发光试剂(AmershamBiosciences Corp.，Piscataway，NJ)的存在下暴露于膜。然后通过从免疫印迹的ECL膜的透光度定量分析免疫反应性。

对淀粉样物质介导的氧化还原活性过渡金属离子的还原的抑制

可根据对已有方案(J.W.Landers等人，Amer.Clin.Path.，1958，29：590-592)的改进使用96孔微量滴定板(Corning Costar，Acton，MA)进行金属还原试验。在有或没有本发明的待测待测双官能分子(200μM)的存在下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH为7.4，中将Aβ肽(10μM)或维生素C(100μM)、金属离子(10μM，Fe(NO₃)3或Cu(NO₃)₂))和被还原的金属离子指示剂(红菲绕啉二磺酸，BP，用于Fe²⁺，200μM，Aldrich-Sigma，或浴铜灵二磺酸，BC，用于Cu⁺，200μM，Aldrich-Sigma)在37℃共同培养1小时。通过将购自the National Institute of Standardsand Technology(NIST)的金属离子的含水备用液直接在缓冲液中稀释制备金属离子溶液。然后使用96孔板阅读器(SPECTRAmax 250，Molecular Devices，CA)分别在536nm(Fe²⁺-BP复合体)和483nm(Cu⁺-BC复合体)下测量吸光度。还测量了对照样品的吸光度，以评价光散射作用并测定在这些波长下的背景缓冲液信号。通过在有各自的指示剂和双官能分子存在的肽和金属产生的吸光度中减去这些对照吸光度得到536nm或483nm的净吸光度(ΔA)。

根据式[Fe²⁺]或[Cu⁺]＝(ΔAx10⁶)/(εxι)，其中ι为仪器的说明书手册中所述的300μL容积孔的测量后的相同垂直长度(Fe²⁺为0.856cm，Cu⁺为1.049cm)，ε是已知的复合体的摩尔吸光度，即Fe²⁺-BP为7124M^-1cm^-1，Cu⁺-BC为2762M^-1cm^-1。

对金属介导的和淀粉样物质介导的活性氧物质产生的抑制

H₂O₂试验：可根据从现有方案(J.C.Han等人，Anal.Biochem.，1996，234：107-109；和J.C.Han等人，Biochem.，1994，220：5-10)改编的方法在UV透明的96孔微量滴定板(Molecular Devices，CA)中进行H₂O₂分析。在有或没有本发明的待测双官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS缓冲液(300mL，pH 7.4)中将Aβ肽(Aβ_1-40或Aβ_1-42；10μM)或维生素C(10μM)、Fe³⁺或Cu²⁺(1μM)，和H₂O₂截留剂(三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，Pierce，50μM)在37℃共同培养1小时。在相同条件下，用过氧化氢酶(Aldrich-Sigma，100U/mL)代替肽，用作表示没有H₂O₂的对照信号。在培养之后，通过5，5-二硫-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Aldrich-Sigma)检测未反应的TCEP，其产生2摩尔的显色产物2-(硝基-5-硫代苯甲酸)(NTB)。该反应如下：

然后残留的TCEP与DTNB反应：

根据下式定量H₂O₂的产生量：H₂O₂(μM)＝(ΔA^*×10⁶)/(2×ι×ε)，其中ΔA^*为在412nm下的样品和只有过氧化氢酶对照之间的绝对吸光度差；ι＝0.875cm，为得自板阅读器制造商的说明书的相等垂直长度；ε为NTB的摩尔吸光度(在412nm下为14，150M^-1cm^-1)。TCEP为强还原剂，其可以主动与包含二硫键的多肽反应。然而，该反应不能在Aβ上发生，因为Aβ没有这种化学键。

用于O₂·^-检测的试验：可以通过在有或没有本发明的待测双官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS(pH 7.4)中在37℃培养一小时之后测量(使用96孔板阅读器)Aβ肽(Aβ_1-42或Aβ_1-40，10M，300μL每孔)的吸光度来评价O₂·^-的产生。相应的空白为单独的PBS的信号。在该试验中没有得到通过肽产生的信号的绝对基线，因为酪氨酸的吸收峰(Aβ的残基10)接近O₂·^-的吸收峰值(254nm)。然而，通过与过氧化物歧化酶(100U/mL)的共同培养引起的吸光度的降低帮助确定大部分吸光度信号是由于O₂·^-的存在。

用于检测·OH的硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)试验：在根据已有方案(J.M.Gutteridge等人，Biochim.Biophys.Acta，1983，759：38-41)改造的96孔微量滴定板中进行与Fe³⁺或Cu²⁺的培养混合物的硫代巴比妥酸活性物质(TBARS)试验。在有或没有本发明的待测双官能分子的存在下将β淀粉样肽(Aβ_1-42或Aβ_1-40；10μM)或维生素C(100μM)与Fe³⁺或Cu²⁺(1μM)和脱氧核糖(7.5mM，Aldrich-Sigma)在PBS(pH7.4)中培养。在培养(37℃，1小时)之后，加入冰醋酸和2-硫代巴比妥酸(1％，w/v的0.05M NaOH中，Aldrich-Sigma)并加热(100℃，10分钟)。将最终的混合物置于冰上1-3分钟，然后在532nm下测量吸光度。通过减去由除了维生素C或Aβ肽之外的相同化学组分构成的对照样品的吸光度得到每个样品的净吸光度改变。

对金属诱导的Aβ聚集物的再溶解作用

为了评价本发明的双官能分子再溶解金属诱导的Aβ聚集物的能力，首先通过加入ZnCl₂(25μM)或CuCl₂(5μM)诱导Aβ(Aβ_1-40或Aβ_1-42；10ng/孔，在PBS中)聚集。然后通过过滤将聚集物转移到0.22μm尼龙膜上。然后用单独的PBS或包含2μM的本发明的待测双官能分子的PBS或包含2μM的氯碘羟喹作为对照洗涤聚集物(200μL/孔)。将膜固定，用抗Aβ单克隆抗体6E10探测，并且通过暴露ECL-膜显影。通过ECL膜的光密度分析测定相对信号强度，根据已知量的肽进行校正。各个值表示为在用单独的PBS洗涤后保留在过滤器上的Aβ信号的百分比。

实施例5：检测双官能分子的基于细胞的试验

双官能分子的神经毒性

(a)E17大鼠皮层原代神经元

使用原代神经元培养物检测母体双官能分子XH1的神经毒性。如G.J.Brewer和C.W.Cotman(在Brain Res.，1989，494：65-74)中所述，E17大鼠皮层原代神经元得自妊娠之后17天的无病原体的雌性Sprague-Dawley大鼠(购自Taconic Farms，MA)。使用的方案允许在精确定义的培养条件下以低密度长期培养神经元。该方案提供最大为90％的神经元培养物。最好使少数的胶质细胞与大鼠皮层原代神经元共同培养，因为这些细胞有助于神经元的存活。阿糖胞苷(1μM)用于控制培养物制备中胶质细胞的增长。使用神经元特异性的烯醇酶(和/或星形神经胶质特异性的S100β)免疫组织化学有规律地检查神经元群。

使E17大鼠皮层原代神经元在95％O₂、5％CO₂、85％湿度条件下，在37℃下，在具有B-27添加剂(Life Technologies，Inc.)、20μM L-谷氨酸盐、100单位/mL青霉素、0.1g/mL链霉素、和2mM L-谷氨酰胺的不含血清的Neurobasal^TM介质中生长4天。在第5天(处理日)，将介质替换为不含血清的Neurobasal^TM加上L-谷氨酰胺，没有B-27添加剂。然后在XH1(0、1或10μM)的存在下培养细胞并在用XH1处理后48小时分析细胞存活率。使用购自Roche(Nutley，NJ)的试剂盒进行LDH释放试验和MTT试验，以分别评价坏死细胞的死亡并测定细胞代谢活动。

这些分析的结果在图9A中报告，是使用三组实验得到的数据的平均值。结果表明，XH1在E17大鼠皮层原代神经元中的低的大分子浓度没有诱导任何显著的细胞死亡。

(b)人SH-SYSY成神经细胞瘤细胞

还在人SH-SYSY成神经细胞瘤细胞上试验了XH1的神经毒性。SH-SYSY细胞系通常用于研究神经生成、分化、和肿瘤形成(D.Vu等人，Brain Res.Mol.Brain Res.，2003，115：93-103)。SH-SYSY细胞得自American Type Culture Collection并在补充有10％胎牛血清(Gibco-BRL)和抗生素的Dulbecco氏改进伊格尔培养基中生长。

在XH1(0、1、5或10μM)的存在下培养(95％O₂，5％CO₂，85％湿度，37℃)人SH-SYSY成神经细胞瘤细胞并在处理48小时后使用上述LDH释放试验评价细胞的存活率。在图9B中报导的这些实验的结果表明，XH1在人SH-SYSY成神经细胞瘤细胞的低的大分子的浓度没有引起任何显著的细胞死亡。

双官能分子对金属介导的APP蛋白表达的效果

若干事实暗示在淀粉样蛋白前体(APP)的水平增加与阿尔茨海默氏病发展之间有直接联系。APP已经与AD有关，因为其通过蛋白酶剪切处理进入β-肽中，β-肽积聚成为淀粉样蛋白斑，并且因为APP基因突变可以引起AD的早期发病。然而，即使在家族性AD突变的存在下，发现在转基因小鼠中APP的过度表达是引起淀粉样纤丝沉积和阿尔茨海默状病理的发展的足够Aβ肽所必需的。现在有若干报告支持翻译的调节机制对控制APP合成和可能的Aβ肽分泌物在生物学相关的状况中的重要作用(van Leeuwen等人，Science，1998，279：242-247)。

可以通过进行不同的实验评价XH1及其类似物降低或抑制APP合成和随后发生的Aβ产生的能力。

(a)APP蛋白合成的测定

在SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞中，通过SDS-PAGE测量XH1抑制APP合成的能力。对照蛋白质(β-微管蛋白和/或两种淀粉样蛋白前体状蛋白APLP1和APLP2)用于保证本发明的双官能分子的靶向抑制特异性。

SDS-PAGE：收获SH-SYSY人成神经细胞瘤细胞并用冷的PBS洗三次，然后混合有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的M-PER^TM哺乳动物蛋白萃取试剂(Pierce)进行细胞溶解。将细胞溶解产物在冷藏室中以13,000rpm涡流15分钟，并且BCA分析上层清液的总蛋白浓度。在具有相等的蛋白质负荷(15μg/孔)的预制的NuPAGE^TM 4-12％Bis-TrisGel(Invitrogen)上进行蛋白质印迹。其在200V进行45分钟并在75mA/凝胶转运95分钟。根据制造商的说明书通过原代和二代抗体探测印迹并最后以15分钟间隔洗涤2-3小时。然后使用化学发光的试剂盒(Pierce)使印迹显影。

这些实验的结果在图10中报告。如图10中所示，XH1浓度增加使APP合成减少，而在同样的条件下，对β-微管蛋白表达无作用。类似地，如图10B所示，XH1的存在(最大为10μM的浓度)不影响APLP1或APLP2合成。这些数据证明XH1的靶向抑制特异性。

成神经细胞瘤细胞的代谢标记：可以在每次处理之前将细胞以相同数目平皿接种到8微量滴定孔(96孔皿中每孔1×10⁵细胞)之后测定原代成神经细胞瘤中的胞内APP蛋白合成。在XH1、DPTA的存在下处理细胞48小时，或未处理。计数随机孔中的细胞，以保证在每个实验开始时每个孔都存在1×10⁵细胞。在不含甲硫氨酸的介质中预培养成神经细胞瘤细胞15分钟并在不含甲硫氨酸的介质(RPMI1640，GIBCO)中用300μCi/mL[³⁵S]-甲硫氨酸脉冲标记30分钟。在用25mLSTEN缓冲液和无菌玻璃棒(STEN缓冲液是0.2％NP-40、2mM EDTA，50mM Tris，pH7.6)使成神经细胞瘤细胞溶解之前在冷的PBS(4℃)中洗涤每个微量滴定板两次。向细胞溶解缓冲液中加入20mM PMSF、5mg/mL亮肽素以防止蛋白质水解。将每个孔的缓冲液合并为300uL的总体积。使用对抗APP的羧基末端产生的抗血清(对抗APP-695的676-695氨基酸残基产生的C-8抗体的1∶500稀释物)使每种合并的溶解液的一半免疫沉积。每种溶解液的残余部分用人铁蛋白抗血清(1∶500稀释物，Boehringer)免疫沉积。

在所有的标记实验中，通过将抗体标记的抗原复合体结合于A蛋sepharose^TM小珠收集免疫沉积的蛋白质。将免疫沉积的样品施用于10-20％的Tris-Tricine凝胶(Novex)并且根据生产商的说明书使样品在Tris-Tricine缓冲液中电泳。用25％甲醇、7％(v/v)甲醇使凝胶固定1小时，用荧光试剂(Amplify，Amersham)处理30分钟，干燥，并在-80℃暴露于X-omat Kodak胶片下过夜。

(b)APP mRNA水平的测定

为了比较，通过实时RT-PCR测量APP的mRNA水平评价XH1影响APP生成的能力。

(c)胞内和分泌的Aβ_1-40和Aβ_1-42浓度的测定

使用市售的用于Aβ_40/42水平的ELISA试剂盒(BioSourceInternational)测定在用XH1处理SH-SYSY细胞后的胞内和分泌的Aβ_1-40和Aβ_1-42浓度。

(d)筛选分析

APP的mRNA编码的5′-非翻译区(5′-UTR)被证明包含铁应答元素(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，47：45518-45528)，即，通过调节铁蛋白翻译和转铁蛋白受体mRNA稳定性控制细胞铁动态平衡的RNA茎环。已经表明铁含量调节星形胶质细胞的APP mRNA翻译(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，1999，274：6421-6431)，而已经发现胞内的铁含量调节成神经细胞瘤细胞中的APP合成(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，47：45518-45528)。此外，报导铁螯合剂如desferrioxiame的存在诱导对由APP 5′-UTR引起的翻译的下调，观察到通过铁内流而使其反转。

J.T.Rogers和同事开发了基于转染的分析，以通过与用于APP的mRNA编码的5′-UTR的相互作用抑制APP表达的能力筛选可能的药物。他们使用这种分析筛选不同类别的药物，包括已知的受体配体相互作用的阻断剂、细菌抗生素、脂类代谢中涉及的药物、和金属螯合剂。

与Dr.Rogers合作，类似于较早报告的试验用于检测XH1及其类似物通过与mRNA 5′-UTR的相互作用降低APP表达和随后发生的Aβ产生的能力。

构造制备：如J.T.Rogers等人，J.Mol.Neurosci.，2002，19：77-82中所述，通过将APP基因的5′-UTR序列分别与下游报道基因(荧光素酶和绿色荧光蛋白质，GFP)熔合制成pSV2(APP)荧光素酶和pSV2(APP)GFP构造。

转染：用10μg的pGL-3、pGAL和pGALA构造的DNA转染人SH-SYSY成神经细胞瘤细胞，并用5μg的表达绿色荧光蛋白质(GFP)的构造的DNA共同转染。从SV40促进剂表达荧光素酶和GFP报道基因。根据生产商的说明书(Invitrogen)，转染在LipofectAMINE-2000的存在下进行。典型地，在烧瓶(100mm²)中生长的成神经细胞瘤细胞用于每种处理。将各个烧瓶转染(12h)，随后相同地转移到96孔板中用于每种处理中接触XH1(或其它待测双官能分子)和作为对照的去铁草酰胺48小时。

在处理48小时之后，通过显微镜检查每个孔确定细胞的存活率。通过使用自动Wallac 1420 multilabel计数器在480/509nm波长(GFP)下读取96孔板的每个孔中GFP的相对表达来证实细胞生的存活率。在得到GFP读数之后，将每个96孔板中的细胞在50μL的报道溶解缓冲液(Promega，Madison，WI)进行细胞溶解，随后使用Wallac 1420计数器进行荧光素酶分析。

为了排除本发明的双官能分子表现出对总翻译的非特异性下调作用的可能性，还需要在报道分子(即，APP、CAT、荧光素酶、和GFP)前面使用表达APP 5′UTR序列的反义版本的构造。这些构造的转染将保证筛选的化合物以高选择性靶向于APP-mRNA的正确的二级结构。特异性的黄金标准(gold standard)将用于检查当APP基因表达、合成、和Aβ水平被抑制时是否APLP1和APLP2合成和5′-UTR驱动的基因表达仍然是未改变的。

实施例6：Aβ淀粉样物质通过本发明双官能分子的回体溶解

下述试验可用于评价本发明的双官能分子从人脑组织提取Aβ沉积物的能力。

样品制备：得到贮存在-80℃下的死后组织以及随附的组织病理学和临床数据，一半样品得自阿尔茨海默氏病患者，另一半得自年龄相当的健康患者。根据Consortium to Establish a Register for Alzheimer′sDisease(CERAD)标准(S.S.Mirra等人，Neurology，1997，49：S14-16)评价阿尔茨海默氏病，特别注意神经炎斑和神经元纤维缠结的存在。

得自死后脑组织的Aβ淀粉样物质提取物：使用DIAX 900匀浆器(Heidolph&Co，Kelheim，Germany)以全速将在3mL冰冷的PBS(pH7.4)中的额皮层的相同区域(0.5g)匀化三个30秒周期，每个动作之间静止30秒，PBS包含除了EDTA之外的蛋白酶抑制剂混合物(BioRad，Hercules，CA)，或在0.1到2mM的本发明的双官能分子或用作对照的氯碘羟喹的存在下。为了得到PBS-可提取级分，将匀浆以100,000xg离心30分钟(Beckman J180，Beckman instruments，Fullerton，CA)并收集上层清液，分成1-mL等分试样量并在冰上贮存或立即在-70℃冻结。使用1∶5的冰冷的10％三氯乙酸使1-mL上层清液样品中的蛋白质沉积，并通过在10,000xg离心20分钟形成小球。通过在包含8％SDS、10％巯基乙醇、和8M尿素的Tris-Tricine SDS-样品缓冲液中煮沸10分钟将小球准备用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过在1mL PBS中匀化并在如上样品缓冲液中煮沸得到皮层样品中的总Aβ。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹：通过将样品装载到10孔、10-20％梯度凝胶(Novex，San Diego，CA)随后Western转移到0.2-mm硝化纤维素膜(BioRad，Hercules，CA)上进行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用单克隆抗体WO2(其检测5到8表位处的Aβ_1-40和Aβ_1-42)、G210(其对在羧基残基40封端的Aβ物质有特异性)或G211(其对在残基42处封端的Aβ物质有特异性)(N.Ida等人，J.Biol.Chem.，1996，271：22908-22914))与辣根过氧化酶结合兔抗小鼠IgG(Dako，Denmark)结合并使用化学发光(ECL，Amersham BiosciencesCorp.，Piscataway，NJ)显现来检测Aβ肽。每个凝胶包括两个或多个泳道，泳道含有起内部参考标准作用的已知量的合成Aβ。

Aβ印迹扫描和透射密度测定分析：使用配有透明适配器(TecoInformation Systems，Taiwan)的Relisys扫描器扫描印迹图像，并且使用用于PC(Scion Corporation，Frederick，MD)的改进的Image 1.6软件(NIH，Bethesda，MD)进行密度测定，使用步进扩散表进行校正。为了定量测量脑提取物中的Aβ，使用合成Aβ作为内部参考标准产生标准曲线，并将得到的值内插。

实施例7：本发明的MRI对比成像剂的性质

得自球形图的MRI信号

将不同的溶液混合物(在PBS中包含对比成像剂、Gd-XH1或Gd-DTPA，有或没有Aβ_1-40、Aβ_1-42、或HSA，pH7.4)注射到4.5-mL空心圆球体(由聚丙烯制成)中并经受3-T磁扫描器(Simens)。使用旋转-回声扫描方式并使用12TR值(TE＝5ms)测量每个溶液的T1信号，R1＝1/T1，R1(obs)＝R1(0)+R1(Gd-XH1-Aβ_1-40或Aβ_1-42)。

报告在图11中的这些实验结果表示了Gd-XH1对纵向(T1)磁弛豫速率的影响。当Gd-XH1浓度增加时，T1减小并且信号变得更亮。对于Gd-DTPA(用作对照的小的亲水性分子)与HSA或Aβ的组合没有观察到效果。

这些实验的结果还在图12和图13中报告。它们表明Gd-XH1特异性地与Aβ_1-40肽相互作用，而只与HSA有轻微的相互作用(图12)。另外，如图13所示，当与富有β折叠的Aβ_1-42结合时，Gd-XH1的驰豫速率比与表现出较少β折叠含量的天然Aβ_1-40结合时有增加。

AD小鼠和人脑组织提取物的MRI信号

通过使用与蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)混合的T-PER组织蛋白提取试剂将组织溶解制备AD小鼠(PS1(M146V)xAPPTg2576)和人脑组织提取物。然后将包含0.25mM Gd-XH1和10μg/mL(总蛋白)提取物的不同的溶液混合物注入到4.5-mL空心圆球体中并进行与上述同样的实验方案。

这些实验的结果报告在图14中。它们表明，当与Gd-XH1混合时，AD小鼠和人脑组织提取物中的MRI信号增强。

实施例8：在AD动物模型中的Aβ淀粉样沉积物的MRI检测

本文描述了检测阿尔茨海默氏病的动物模型中淀粉样沉积物存在的方法。该方法基于Gd-XH1的使用。如上所述，Gd-XH1特异性地与Aβ_1-40和Aβ_1-42相互作用。此外，发现当AD小鼠和人脑组织提取物与Gd-XH1混合时，提取物的MRI信号增强。

用于该系列实验的动物模型为转基因Tg2576小鼠株，其过度表达具有家族性AD基因突变的人淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，并表现出AD的神经病理学特征，如记忆缺失和在脑的特定区域形成年龄相关性淀粉样沉积物。使用小的9.4T MRI***(400MHz，MagnexScientific，Kidlington，UK)在MGH/MIT/HMS Athinoula A.MartinosCenter for Functional and Structural Biomedical Imaging(Department ofRadiology，Massachusetts General Hospital，Boston，MA)进行成像。

为了评价Gd-XH1的体内毒性，为PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠(约6个月大，每组5只小鼠)每天腹腔内注射每千克体重为30mg剂量的Gd-XH1，进行4周。对照包括注射相同剂量的Gd-DTPA和无治疗。没有观察到Gd-XH1的急性毒性。

进行第一系列的试验实验以评价Gd-XH1的MRI对比成像能力。将Gd-XH1与甲基纤维素混合并制备为悬浮液。为一只雄性Sprague-Dawley大鼠(8个月大)腹腔内注射每千克体重为10mg的单一剂量的这种悬浮液。注射一小时后，使用4.7T MRI仪器(GE)以序列扫描方式为动物成像。记录解剖学的和S/N比率制的MRI图像。得到的一些图像在图15中表示。在i.p.注射一小时之后，观察到信噪比有8％的增加。T1加权信号强度的增加好象是普遍的，表明Gd-XH1可以渗透BBB和骨骼肌。

使用APP转基因小鼠代替大鼠进行另外的实验。更具体地，为每组5到10只APP转基因Tg2576小鼠腹腔内注射每千克体重为0.1mmol单一剂量的本发明的MRI对比成像剂如Gd-XH1在DMSO和PBS(60∶40；v∶v)的混合物中溶液。为了比较，另一组5到10只PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠腹腔内注射每千克体重为0.1mmol单一剂量的对照用对比成像剂在PBS中的溶液。对照成像剂为使其包括与本发明的对比成像剂同样的复合于相同的顺磁性金属离子的同样的金属螯合部分，但是与本发明的对比成像剂的不同之处在于其不包括任何淀粉样物质结合部分。例如，在对比成像剂Gd-XH1的情况中，使用Gd-DTPA作为对照。在注射之后，通过MRI为两组动物成像。通过在处死动物之后的Aβ免疫染色评价和证实本发明的MRI对比成像剂对转基因小鼠中脑的Aβ淀粉样物质成像的增强的作用。

实施例9：一类包括α-硫辛酸部分的双官能分子的合成

已经设计并了正在开发第二类新的双官能分子。新的双官能分子包括直接共价连接于一个淀粉样物质结合部分的一个金属螯合部分。该类的所有双官能分子共有的金属螯合部分为α-硫辛酸，其还已知具有强大的抗氧化性质。如图6A所示，该类的母体分子的淀粉样物质结合部分是与第一双官能分子(实施例1)中所用的同样的苯并硫代黄素衍生物。

该类的其它成员为其中苯并噻唑部分的芳环被一个或多个官能团取代的母体双官能分子的类似物，所述官能团包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰氧基、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺酰基、和4-，5-或6-羟基(参见图6B)。

本文描述该类母体双官能分子(化合物XH2)的合成。XH2的制备涉及在金属螯合部分和淀粉样物质结合部分之间形成酰胺键。根据由以前发表的合成方法(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，69：1471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，39：3375-3384；h M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，29：1488-1491)改编的方法进行反应。

向在室温下搅拌的1mg硫辛酸(Aldrich Chemical)的二氯甲烷溶液加入二滴DMF。向该溶液中逐滴加入0.5mL草酰氯。反应表面显示产生少量气体。当起泡停止时，混合物用1.2mg的4-苯并噻唑-2-基苯胺和1mL的N，N-二异丙基乙胺在15mL二氯甲烷中的溶液处理。在室温下搅拌深绿色混合物一小时。用水洗混合物，硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到固体。将其与乙酸乙酯研磨并在真空下干燥，得到XH2(90％)，其结构通过¹H-NMR证实(参见图7)。

Claims (95)

1.双官能分子，其包括与至少一个淀粉样物质结合部分连接的至少一个金属螯合部分。

2.权利要求1的双官能分子，其中金属螯合部分以高亲合性与至少一种选自锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)的过渡金属离子结合。

3.权利要求1的双官能分子，其中金属螯合部分包括DTPA。

4.权利要求1的双官能分子，其中金属螯合部分包括α-硫辛酸衍生物。

5.权利要求1的双官能分子，其中淀粉样物质结合部分可透过血脑屏障。

6.权利要求1的双官能分子，其中淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

7.权利要求1的双官能分子，其中淀粉样物质结合部分包括苯并噻唑衍生物。

8.权利要求1的双官能分子，其中金属螯合部分以高亲合性与至少一种选自锌II(Zn²⁺)、铜II(Cu²⁺)、和铁III(Fe³⁺)的过渡金属离子结合，并且其中淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

9.权利要求8的双官能分子，其中金属螯合部分包括DTPA。

10.权利要求8的双官能分子，其中淀粉样物质结合部分包括苯并噻唑衍生物。

11.权利要求8的双官能分子，其中金属螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉样物质结合部分包括苯并噻唑衍生物。

12.具有以下化学结构的双官能分子：

13.具有以下化学结构的双官能分子：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

14.具有以下化学结构的双官能分子：

15.具有以下化学结构的双官能分子：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

16.对比成像剂，其包括与至少一个淀粉样物质结合部分连接的至少一个成像部分。

17.权利要求16的对比成像剂，其中淀粉样物质结合部分可透过血脑屏障。

18.权利要求16的对比成像剂，其中淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

19.权利要求16的对比成像剂，其中淀粉样物质结合部分包括苯并噻唑衍生物。

20.权利要求16的对比成像剂，其中成像部分包括至少一个与金属实体复合的金属螯合部分。

21.权利要求20的对比成像剂，其中金属螯合部分包括DTPA。

22.权利要求16的对比成像剂，其中成像部分包括至少一个与金属实体复合的金属螯合部分，并且其中淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

23.权利要求22的对比成像剂，其中金属螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉样物质结合部分包括苯并噻唑衍生物。

24.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是顺磁性金属离子。

25.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是选自钆III(Gd³⁺)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)、和镱III(Yb³⁺)的顺磁性金属离子。

26.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是钆III(Gd³⁺)。

27.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是放射性核素。

28.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是选自锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、钇-91(⁹⁰Y)、铟-111(¹¹¹In)、铼-186(¹⁸⁶Re)、和铊-201(²⁰¹Tl)的放射性核素。

29.权利要求20或22的对比成像剂，其中金属实体是锝-99m(^99mTc)。

30.对比成像剂，其中钆III(Gd³⁺)与具有以下化学结构的双官能分子复合：

31.对比成像剂，其中钆III(Gd³⁺)与具有以下化学结构的双官能分子复合：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

32.对比成像剂，其包括与至少一个由稳定的顺磁性同位素标记的淀粉样物质结合部分连接的至少一个金属螯合部分。

33.权利要求32的对比成像剂，其中稳定的顺磁性同位素是碳-13(¹³C)或氟-19(¹⁹F)。

34.药学组合物，其包括有效量的权利要求1的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

35.药学组合物，其包括有效量的权利要求8的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

36.药学组合物，其包括有效量的权利要求12的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

37.药学组合物，其包括有效量的权利要求13的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

38.药学组合物，其包括有效量的权利要求14的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

39.药学组合物，其包括有效量的权利要求15的至少一种双官能分子或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

40.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求16的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

41.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求20的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

42.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求25的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

43.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求28的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

44.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求30的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

45.药学组合物，其包括成像有效量的权利要求31的至少一种对比成像剂或其生理学可耐受的盐，和至少一种药学可接受的载体。

46.用于降低或抑制***中淀粉样物质毒性的方法，其包括使***与权利要求1的双官能分子或其药学组合物接触。

47.权利要求46的方法，其中所述方法预防、减慢或终止***中的淀粉样物质积聚；或促进、诱导、或帮助***中存在的淀粉样沉积物的溶解；或兼有上述两种作用。

48.权利要求46的方法，其中所述方法降低、抑制或干扰淀粉样物质介导的活性氧物质的产生。

49.权利要求46的方法，其中接触通过体外或回体培养进行，并且其中***选自细胞、生物流体、和生物组织。

50.权利要求49的方法，其中细胞、生物流体、或生物组织来源于怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者。

51.权利要求50的方法，其中病理生理学状况与β淀粉样肽的积聚有关，并且其中双官能分子中的淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

52.权利要求46的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

53.权利要求46的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

54.权利要求46的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

55.权利要求46的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

56.用于治疗患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者的方法，其包括对患者给药有效量的权利要求1的双官能分子或其药学组合物。

57.权利要求56的方法，其中所述方法预防、减慢或终止患者体内的淀粉样物质积聚；或促进、诱导、或帮助患者体内存在的淀粉样沉积物的溶解；或兼有上述两种作用

58.权利要求56的方法，其中所述方法降低、抑制或干扰淀粉样物质介导的活性氧物质的产生。

59.权利要求56的方法，其中给药通过选自口服给药和肠胃外给药的方法进行，包括静脉内、肌内、皮下注射、和经皮给药以及肠给药。

60.权利要求56的方法，其中病理生理学状况与β淀粉样肽的积聚有关，并且其中双官能分子中的淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性和特异性。

61.权利要求56的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

62.权利要求56的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

63.权利要求56的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

64.权利要求56的方法，其中双官能分子具有以下化学结构：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

65.权利要求56的方法，其中病理生理学状况选自阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、路易体痴呆、具有淀粉样病变的(荷兰型)遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆、和脑外伤。

66.权利要求56的方法，其中病理生理学状况是阿尔茨海默氏病。

67.检测***中淀粉样沉积物存在的方法，其包括步骤：

使***与成像有效量的权利要求20的对比成像剂或其药学组合物在可使对比成像剂与存在的任何淀粉样沉积物相互作用从而导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下接触；

使用成像技术检测***中存在的并与对比成像剂结合的任何淀粉样沉积物；和

产生***的至少一部分的一个或多个图像。

68.权利要求67的方法，其中***中存在的淀粉样沉积物通过β淀粉样肽的积聚形成，并且其中对比成像剂中的淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性。

69.权利要求67的方法，其中接触通过体外或回体培养进行，并且其中***选自细胞、生物流体、和生物组织。

70.权利要求69的方法，其中细胞、生物流体、或生物组织来源于怀疑患有与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的患者。

71.权利要求69的方法，其中细胞、生物流体、或生物组织来源于接受与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的治疗的患者。

72.权利要求69的方法，其中细胞、生物流体、或生物组织与用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂接触。

73.权利要求67的方法，其中所述方法用于鉴别用于治疗与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的潜在治疗剂。

74.权利要求67的方法，其中所述方法用于诊断与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况。

75.权利要求67的方法，其中所述方法用于跟踪与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的进展。

76.权利要求67的方法，其中所述方法用于监测患者对与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的治疗的应答。

77.检测患者体内淀粉样沉积物存在的方法，其包括步骤：

在可使对比成像剂与存在的任何淀粉样沉积物相互作用从而导致对比成像剂与淀粉样沉积物结合的条件下对患者给药成像有效量的权利要求20的对比成像剂或其药学组合物；

使用成像技术检测患者体内存在的并与对比成像剂结合的任何淀粉样沉积物；和

产生患者身体的至少一部分的一个或多个图像。

78.权利要求77的方法，其中给药通过选自口服给药和肠胃外给药的方法进行，包括静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、皮内给药、和腔内给药、以及肠给药。

79.权利要求77的方法，其中淀粉样沉积物通过β淀粉样肽的聚集和积聚形成，并且其中对比成像剂中的淀粉样物质结合部分对A β淀粉样沉积物具有高的亲合性或特异性。

80.权利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者体内的淀粉样沉积物。

81.权利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者脑中的淀粉样沉积物，并且其中对比成像剂中的淀粉样物质结合部分可透过血脑屏障。

82.权利要求77的方法，其中所述方法用于诊断与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况。

83.权利要求77的方法，其中所述方法用于跟踪与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的进展。

84.权利要求77的方法，其中所述方法用于监测患者对与淀粉样物质积聚有关的病理生理学状况的治疗的应答。

85.权利要求67或77的方法，其中对比成像剂中的成像部分包括至少一个与顺磁性金属离子复合的金属螯合部分；检测通过磁共振成像(MRI)进行；和产生MR图像。

86.权利要求85的方法，其中顺磁性金属离子选自钆III(Gd³⁺)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)、和镱III(Yb³⁺)。

87.权利要求85的方法，其中顺磁性金属离子是钆III(Gd³⁺)。

88.权利要求87的方法，其中钆III(Gd³⁺)与具有以下化学结构的双官能分子复合：

89.权利要求87的方法，其中钆III(Gd³⁺)与具有以下化学结构的双官能分子复合：

其中R选自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羟基、5-羟基、和6-羟基。

90.权利要求67或77的方法，其中对比成像剂中的成像部分包括至少一个与放射性核素复合的金属螯合部分；检测通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)进行；和产生SPECT图像。

91.权利要求90的方法，其中放射性核素选自锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、钇-91(⁹⁰Y)、铟-111(¹¹¹In)、铼-186(¹⁸⁶Re)、和铊-201(²⁰¹Tl)。

92.权利要求90的方法，其中放射性核素是锝-99m(^99mTc)。

93.权利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理学状况与β淀粉样肽的积聚有关，并且其中对比成像剂中的淀粉样物质结合部分对Aβ淀粉样沉积物具有高的亲合性。

94.权利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理学状况选自阿尔茨海默氏病、唐氏综合症、路易体痴呆、具有淀粉样病变的(荷兰型)遗传性脑出血、关岛帕金森痴呆、和脑外伤。

95.权利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理学状况是阿尔茨海默氏病。

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