CN101748161B - 一种厌氧发酵纯化丁二酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种新型厌氧发酵纯化丁二酸的工艺。该发明采用基于固液分离、超滤、脱色、酸化、结晶单元的分离工艺，引入硫酸铵的热裂解技术，实现酸、碱的循环利用，形成一个闭合的清洁生产流程，有效保证食品级和医药级丁二酸的产品质量。本发明不仅降低了发酵成本，提高了经济效益；且减少环境污染和改善生态环境，促进国民经济的可持续发展，具有广泛的社会效益。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种新型厌氧发酵纯化丁二酸的闭合工艺。
背景技术
丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。目前丁二酸大多数仍采用化学法合成，其原料依赖于化石资源。丁二酸发酵的工业潜能早在1980年就被认识到，随着化石资源日益枯竭和生物法制备丁二酸的技术进步，利用生物转化法大规模生产丁二酸引起越来越多的国家的重视。
丁二酸是生物炼制产品工程中最重要的碳四平台化合物。其作为许多重要的中间产物和专业化学制品，传统生产方法采用的是从丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，生产污染大，成本高，这严重抑制了丁二酸这一大宗化学品的发展潜力。生物法生产丁二酸的主要原料是葡萄糖及木糖等糖类物质，其来源广泛且价格低廉(玉米、废乳清、工业生产废料等)，开发高效的生物合成丁二酸的方法具有非常重要的意义，生产成本将有望从目前的12,000元/吨降至4,000元/吨以下，从而打开大宗化学品的市场，取代很多基于苯和石化中间产物的商品，减少在超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，市场总量将有望由目前的1.8万吨扩展至400万吨。利用生物法进行丁二酸的生产还具有一个重要特征——吸收并固定CO2用于菌株的代谢，最终生成丁二酸，这是丁二酸生产有别于传统有机酸生产的一个重要特质。每生产1kg丁二酸，将会有0.37kg的CO2被固定。生物合成丁二酸是绿色环保的生产工艺，如果将发酵生产丁二酸与另一大宗发酵产品乙醇的生产过程进行耦合，更可将发酵生产乙醇产生的CO2加以利用，减少温室气体的排放，并且在减少碳损失同时生产出丁二酸、乙醇与二乙基丁二酸三种产品。
丁二酸发酵液中含有大量菌体、不溶物颗粒、残留底物、蛋白质及色素物质等杂质，在对其进行提取纯化之前，需将发酵液中的不溶物颗粒及大分子杂质进行有效的分离。因此，针对微生物发酵法制备丁二酸体系开展下游技术的研究具有重要的实践意义。
目前公开专利及文献中涉及从微生物发酵液中提取制备丁二酸的方法主要有钙盐法、溶剂萃取法、铵盐法、电渗析法、离子交换法及膜分离法。美国专利US5034105、US5143834采用两级膜电渗析分离提纯丁二酸的方法，但该法电渗析膜损耗及电能消耗极高，且不能处理二价离子；美国专利US5168055采用钙盐中和法提取丁二酸，路线长、效率低下，产生大量硫酸钙废渣，酸碱消耗大，增加了成本和环境污染；中国专利CN200810195852.5、CN200810195851.0采用离子交换法处理并分离提取丁二酸，由于丁二酸发酵液中含有大量杂质离子，导致树脂污染加重，交换容量迅速下降，树脂处理频繁，存在再生困难、洗脱剂用量及排污量大等问题；中国专利ZL200610086003.7采用微滤、超滤膜分离提取丁二酸，但由于发酵液酸化时产生大量硫酸镁，可能会导致产品硫酸盐超标或提取收率下降。
美国专利申请US5958744公开了一种发酵生产和纯化丁二酸的工艺，其技术方案的流程图如附图1所示。其采用铵盐法提取丁二酸，通过补加氨水和硫酸调节酸碱，并实现氨水和硫酸的循环使用。但其结晶过程操作条件苛刻，需要高温裂解硫酸盐，步骤繁琐，难度大。总之，目前丁二酸的分离提取方法在简化工艺、提高产品质量及降低成本等方面仍有待改进。
发明内容
本发明的技术目的在于针对US5958744的技术方案的缺点进行改进，使得改进后的新的技术方案对色素、生物大分子等的分离更加合理和简便，进一步减少丁二酸发酵生产的下游工艺的操作成本。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案在于：
一种厌氧发酵纯化丁二酸的工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)在发酵罐中利用微生物在发酵培养基中厌氧发酵生产丁二酸；
(2)在发酵产酸的过程中添加碱性中和剂来维持发酵体系pH值为6.0～7.0；
(3)发酵结束后，将发酵液通过过滤装置实现固液分离，去除不溶物后的发酵液再进行超滤去除生物大分子；
(4)超滤液经脱色后进入多效蒸发器，待浓缩4～6倍；
(5)将浓缩后的物料在结晶器反应处理后，游离出丁二酸，并送至丁二酸结晶器中冷却结晶，经过滤器过滤，得到结晶状丁二酸产品，以及含少量丁二酸的母液；
(6)将母液进入下一个结晶器中并与甲醇混合后送至甲醇蒸发器中浓缩结晶出丁二酸晶体，并将其返回脱色罐，经脱色结晶后得到丁二酸产品，其余物料回收甲醇后送至热裂器裂解回收。
本发明的上述工艺，其中：
步骤(2)中所述的最佳pH值为6.8；
步骤(5)中所述的结晶器中的pH值应维持在2.0以下；最佳pH值为1.5～1.8；
步骤(1)中所述碱性中和剂为NH4OH时，步骤(5)时向结晶器中加入浓硫酸以得到游离丁二酸，步骤(6)中的热裂器将硫酸铵裂解生成氨水和硫酸氢铵，生成的硫酸氢铵或硫酸至少一部分用来与步骤(5)中额外的反应，氨水再补加到发酵罐中；
步骤(1)中所述碱性中和剂为NaOH时，步骤(5)时向结晶器中加入氨水并通入CO2气体，最后加入浓硫酸以得到游离丁二酸，步骤(6)中的热裂器将硫酸铵裂解生成氨水和硫酸氢铵，生成的硫酸氢铵至少一部分用来与步骤(5)中额外的反应，氨水再补加到发酵罐中，并回收NaHSO4；
步骤(1)中所述碱性中和剂为Mg(OH)2时，步骤(5)时向结晶器中加入氨水并通入HCl气体，得到游离丁二酸，并回收Mg(OH)2至发酵罐中，步骤(6)中的热裂器用于回收NH4Cl；
步骤(1)中所述碱性中和剂为MgCO3时，步骤(5)时向结晶器中加入氨水并通入HCl气体，得到游离丁二酸，并回收Mg(OH)2至发酵罐中，步骤(6)中的热裂器用于回收NH4Cl；
步骤(1)中所述碱性中和剂为Na2CO3时，步骤(5)时向结晶器中加入氨水并通入CO2气体，最后加入浓硫酸以得到游离丁二酸，并回收NaHCO3至发酵罐中，步骤(6)中的热裂器将硫酸铵裂解生成氨水和硫酸氢铵，生成的硫酸氢铵至少一部分用来与步骤(5)中额外的反应，氨水再补加到发酵罐中，并回收NaHSO4。
本发明的有益效果在于：
1、所述的闭合工艺，其中超滤去除的生物大分子包含蛋白质、多糖等，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；
2、同时，在多效蒸发之前增加了脱色单元，以保证丁二酸结晶产品的质量；脱色用来去除发酵液中的色素，以保证丁二酸结晶产品的质量；
3、再次，在甲醇沉淀硫酸铵、甲醇蒸发结晶得到的丁二酸晶体回到脱色罐中，再经脱色、蒸发结晶，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量，且本发明工艺路线只需加入一次酸、碱，降低了生产成本。
附图说明
图1为US5958744所公开的工艺路线；
图2为利用氨水调节发酵液pH时的工艺；
图3为利用NaOH调节发酵液pH时的工艺；
图4为利用Mg(OH)2调节发酵液pH时的工艺；
图5为利用MgCO3调节发酵液pH时的工艺；
图6为利用Na2CO3调节发酵液pH时的工艺。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
本发明所述的发酵生产丁二酸的方法可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的微生物菌种。本实施例所采用的产丁二酸的微生物菌种为：产琥珀酸放线杆菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113)，该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。
本发明所述的发酵培养基可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的发酵培养基。本实施例所采用的培养基为：每升体积培养基含葡萄糖(分开灭菌)50～100g，酵母粉15g，玉米浆15mL，无水乙酸钠1.36g，NaCl 1g，K2HPO4 3g，MgCl2 0.2g，CaCl2 0.2g。
本发明所述的发酵微生物菌种制备丁二酸的方法可以是现有技术中任意的厌氧发酵制备方法，而这些方法一般都包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤。本实施的制备步骤为：
(1)菌种活化：菌种活化的斜面培养基为pH 6.0～8.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的固体斜面培养基，斜面培养时将菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在厌氧培养箱中培养，培养箱含有N2、CO2和H2的混合气体，温度为30～40℃，活化培养24～48h，用于种子培养基接种和菌株保存；
(2)种子培养：向100mL血清瓶中加入种子培养基为20～80mL，通入含有N2和CO2混合气，115～121℃灭菌15～30min，冷却后接入斜面培养菌株，培养温度为30～40℃，摇床转速100～200r/min，培养时间为10～16h，用于发酵培养基接种；
(3)5L发酵罐发酵培养：5L发酵罐中发酵培养基体积为2～4L，接种量为3～7％(v/v)，温度为35～40℃，发酵罐通入含有N2和CO2混合气，以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在100～300rpm，发酵过程采用添加碱性中和剂控制pH在6.0～7.0，发酵时间为30～48h，分离提取丁二酸。
分析方法：
HPLC***高效液相色谱仪：WatersHPLC2010工作站；色谱柱Prevail organic acidcolumn 250mm×4.6mm；紫外检测波长215nm；流速1mL/min，进量20μL，流动相25mmol/L KH2PO4，pH 2.5；柱温：室温。重蒸水配制不同浓度的有机酸(丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))标准溶液，根据峰面积与有机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各有机酸含量。
本实施例的工艺步骤为，如图2所示：
在发酵罐中，按照上述发酵方法利用Actinobacillus succinogenes NJ113在上述发酵培养基中厌氧发酵生产丁二酸；在发酵产酸的过程中添加NH4OH来维持发酵体系在pH值6.0；发酵结束后，将发酵液通过过滤装置实现固液分离，去除不溶物后的发酵液再进行超滤去除蛋白质、多糖等生物大分子，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；超滤液经脱色以保证丁二酸结晶产品的质量，后再进入多效蒸发器，待浓缩4～6倍移至结晶器，加入浓硫酸酸化，游离出丁二酸并形成硫酸铵；将酸化液在丁二酸结晶器中冷却结晶，并维持pH在1.5，在此低pH下，丁二酸二铵与硫酸氢铵反应生成丁二酸和硫酸铵：
(NH4)2A+2NH4HSO4→H2A+2(NH4)2SO4
其中，A代表丁二酸根离子，即-(HOOC)(CH2)2(COOH)-
经过滤器过滤，得到结晶状丁二酸产品，以及含少量丁二酸和硫酸铵的母液；将母液进入下一个结晶器中并与甲醇混合，并将以晶体形式析出的硫酸铵过滤送至热裂器裂解，在200～300℃条件下裂解，形成的NH3、NH4HSO4或H2SO4回收，氨再回收用以控制发酵过程中的pH值，NH4HSO4或H2SO4可用以脱色液调酸；而甲醇结晶器中溶解有丁二酸的甲醇溶液送至甲醇蒸发器中浓缩结晶，所得晶体返回脱色罐，经脱色结晶后得到丁二酸产品，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量。
实施例2
本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，其整个工艺方法如图3所示：
利用NaOH调节发酵pH。
在厌氧反应器中利用微生物厌氧发酵生产丁二酸，发酵过程中，用NaOH调节发酵体系的pH，维持在7.0。发酵结束后的发酵液经过滤器滤出不溶物，再经超滤去除蛋白质、多糖等生物大分子，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；同时，在多效蒸发之前增加了脱色单元，以保证丁二酸结晶产品的质量；在结晶器中pH维持在1.8，在此低pH下，通入CO2，并补加氨水，则丁二酸二钠与氨水及碳酸钠反应生成丁二酸二铵和碳酸氢钠，最后加入浓硫酸以得到游离丁二酸。
Na2A+2NH3+2H2CO3→(NH4)2A+2NaHCO3
A代表丁二酸根离子，即-(HOOC)(CH2)2(COOH)-
反应生成的碳酸氢钠再用于发酵罐中调节pH。
在甲醇蒸发器中蒸发结晶得到的丁二酸晶体回到脱色罐中，再经脱色、蒸发结晶，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量。
硫酸盐主要包括硫酸铵、一些残留的硫酸氢铵和硫酸进入热裂器，在200～300℃条件下裂解，硫酸铵和硫酸钠裂解为硫酸氢铵和氨水，以及硫酸氢钠。
2(NH4)2SO4+Na2SO4→NH4HSO4+3NH3+2NaHSO4
反应生成的氨水再用于结晶器中，硫酸氢铵再回到丁二酸结晶器中重复使用。
实施例3
本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，其整个工艺方法如图4所示：
利用Mg(OH)2调节发酵pH。
以碳水化合物作为碳源，在厌氧反应器中利用微生物厌氧发酵生产丁二酸，发酵过程中，用Mg(OH)2调节发酵体系的pH，维持在6.8左右。发酵结束后的发酵液经过滤器滤出不溶物，再经超滤去除蛋白质、多糖等生物大分子，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；同时，在多效蒸发之前增加了脱色单元，以保证丁二酸结晶产品的质量；在结晶器中pH维持1.6，在此低pH下，补入HCl，再补加氨水，则丁二酸镁与HCl反应生成丁二酸和MgCl2，MgCl2再与氨水反应生成Mg(OH)2和NH4Cl。
MgA+2HCl→H2A+MgCl2
MgCl2+2NH4OH→2NH4Cl+Mg(OH)2
A代表丁二酸根离子，即-(HOOC)(CH2)2(COOH)-
反应生成的氢氧化镁再用于发酵罐中调节pH。
在甲醇蒸发器中蒸发结晶得到的丁二酸晶体回到脱色罐中，再经脱色、蒸发结晶，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量。
氯化铵则作为肥料使用。
实施例4
本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，其整个工艺方法如图5所示：
利用MgCO3调节发酵pH。
以碳水化合物作为碳源，在厌氧反应器中利用微生物厌氧发酵生产丁二酸，发酵过程中，用MgCO3调节发酵体系的pH，维持在7.0。发酵结束后的发酵液经过滤器滤出不溶物，再经超滤去除蛋白质、多糖等生物大分子，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；同时，在多效蒸发之前增加了脱色单元，以保证丁二酸结晶产品的质量；在结晶器中pH维持在1.7，在此低pH下，补入HCl，再补加氨水，则丁二酸镁与HCl反应生成丁二酸酸和MgCl2，MgCl2再与氨水反应生成Mg(OH)2和NH4Cl。
MgA+2HCl→H2A+MgCl2
MgCl2+2NH4OH→2NH4Cl+Mg(OH)2
A代表丁二酸根离子，即-(HOOC)(CH2)2(COOH)-
反应生成的氢氧化镁再用于发酵罐中调节pH。
在甲醇蒸发器中蒸发结晶得到的丁二酸晶体回到脱色罐中，再经脱色、蒸发结晶，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量。
氯化铵则作为肥料使用。
实施例5
本实施例采用与实施例1完全相同的发酵条件和方法，其整个工艺方法如图6所示：
利用Na2CO3调节发酵pH。
以碳水化合物作为碳源，在厌氧反应器中利用微生物厌氧发酵生产丁二酸，发酵过程中，用Na2CO3调节发酵体系的pH，维持在6.8。发酵结束后的发酵液经过滤器滤出不溶物，再经超滤去除蛋白质、多糖等生物大分子，以避免在后续浓缩结晶过程中的色素产生；同时，在多效蒸发之前增加了脱色单元，以保证丁二酸结晶产品的质量；在结晶器中pH维持在1.8，在此低pH下，通入CO2，并补加氨水，则丁二酸二钠与氨水及碳酸钠反应生成丁二酸二铵和碳酸氢钠。
Na2A+2NH3+2H2CO3→(NH4)2A+2NaHCO3
A代表丁二酸根离子，即-(HOOC)(CH2)2(COOH)-
反应生成的碳酸氢钠再用于发酵罐中调节pH。
在甲醇蒸发器中蒸发结晶得到的丁二酸晶体回到脱色罐中，再经脱色、蒸发结晶，以进一步减少产品中甲醇的残留，保证产品的质量。
硫酸盐主要包括硫酸铵、一些残留的硫酸氢铵和硫酸进入热裂器，在200～300℃条件下裂解，硫酸铵和硫酸钠裂解为硫酸氢铵和氨水，以及硫酸氢钠。
2(NH4)2SO4+Na2SO4→NH4HSO4+3NH3+2NaHSO4
反应生成的氨水再用于结晶器中，硫酸氢铵再回到丁二酸结晶器中重复使用。
Claims (4)
1.一种厌氧发酵纯化丁二酸的工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)在发酵罐中利用微生物在发酵培养基中厌氧发酵生产丁二酸；
(2)在发酵产酸的过程中添加碱性中和剂Mg(OH)2或者MgCO3来维持发酵体系pH值为6.0～7.0；
(3)发酵结束后，将发酵液通过过滤装置实现固液分离，去除不溶物后的发酵液再进行超滤去除生物大分子；
(4)超滤液经脱色后进入多效蒸发器，待浓缩4～6倍；
(5)向结晶器中加入氨水并通入HCl气体，将浓缩后的物料在结晶器反应处理后，游离出丁二酸，并送至丁二酸结晶器中冷却结晶，经过滤器过滤，得到结晶状丁二酸产品，以及含少量丁二酸的母液；并回收结晶器中的Mg(OH)2至发酵罐中；
(6)将母液进入下一个结晶器中并与甲醇混合后送至甲醇蒸发器中浓缩结晶出丁二酸晶体，并将其返回脱色罐，经脱色结晶后得到丁二酸产品，其余物料回收甲醇后送至热裂器裂解回收NH4Cl。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述的步骤(2)中所述的最佳pH值为6.8。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述的步骤(5)中所述的结晶器中的pH值应维持在2.0以下。
4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于所述的最佳pH值为1.5～1.8。
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