CN1771080A - 色谱固定相的再生 - Google Patents

色谱固定相的再生 Download PDF

Info

Publication number
CN1771080A
CN1771080A CNA2004800092934A CN200480009293A CN1771080A CN 1771080 A CN1771080 A CN 1771080A CN A2004800092934 A CNA2004800092934 A CN A2004800092934A CN 200480009293 A CN200480009293 A CN 200480009293A CN 1771080 A CN1771080 A CN 1771080A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chromatographic stationary
polypeptide
chromatographic
water
actified solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2004800092934A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1771080B (zh
Inventor
P·拉森
O·舒
E·S·拉斯穆森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36118397&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1771080(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Priority claimed from PCT/DK2004/000234 external-priority patent/WO2004089504A1/en
Publication of CN1771080A publication Critical patent/CN1771080A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1771080B publication Critical patent/CN1771080B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B01D15/203—Equilibration or regeneration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/283—Porous sorbents based on silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B01J20/3425—Regenerating or reactivating of sorbents or filter aids comprising organic materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B01J20/345—Regenerating or reactivating using a particular desorbing compound or mixture
    • B01J20/3475—Regenerating or reactivating using a particular desorbing compound or mixture in the liquid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/34—Regenerating or reactivating
    • B01J20/3433—Regenerating or reactivating of sorbents or filter aids other than those covered by B01J20/3408 - B01J20/3425

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

再生色谱固定相的方法。

Description

色谱固定相的再生
发明领域
本发明涉及色谱纯化领域。更具体地说，本发明涉及再生色谱固定相的方法。
发明背景
多肽日益被用作治疗属于所有主要治疗范围内的疾病的药物。通过长期胰岛素服用治疗糖尿病已经实施了80年以上，而且多肽在生长障碍和癌方面的治疗应用也实践了很多年。大规模生产对治疗应用来说纯度足够高的多肽的经济方法对于另外的基于多肽的疗法达到大规模的商品化和对于现有疗法被更广泛地应用来说具有关键性的作用。
从混合物纯化多肽是治疗用多肽的整个生产过程中常用数次的多步方法。反相高压液相色谱(RP-HPLC)是工业上高分离度地分离多肽的优选方法，而且证明了该方法对于大规模纯化很多多肽可通用。
由于治疗用的多肽需要高度纯化以免在对患者施用时引起不利事件，在生产工艺中应用几步色谱纯化步骤是很常见的。生产厂中色谱柱的固定相昂贵，所以将它们用于数次色谱循环。然而，色谱固定相的性能随时间而降低，即，通过柱的压力降抑制性地增大，而且分离系数受损。这归因于沉积物的逐渐积累。已有人建议通过包括碱性缓冲液(J.Chrom.461，1989，45-61)，例如pH7.4和高浓度的有机改性剂的再生方法来克服该问题。
Brange等(J.Pharm.Sci.86(1997)517-525)公开了将胰岛素纤丝溶于酸和溶于碱。
多年来，通过用碱性溶液再生色谱固定相来减轻该问题，例如0.1摩尔氢氧化钠(vide Liliedahl，“致力于肽的基于二氧化硅的HPLC纯化的十二年”，Tides 2000，2000年5月10日，Las Vegas，USA)。该再生方法可将用于纯化胰岛素的二氧化硅的使用寿命增大至100～600次循环。但是，二氧化硅物质暴露于苛性碱条件下时不稳定，特别是取代的二氧化硅物质可能不适合通过碱性溶液再生。纯化药物例如治疗用多肽的经济适用的方法必定包括不破坏色谱固定相的再生方法。
WO 00/61493中公开了再生多种来源的粒状物质(粘土、砂、二氧化硅等)的一般而复杂的方法。它是一种5步法，它包括：将所述物质与a)有机物质的提取剂，b)氧化剂接触，随后与c)酸溶液接触，d)将物料加热以及e)回收所述物质。该方法繁琐而不适合在色谱纯化工厂实施。
本领域需要再生色谱固定相的更有效方法以便延长这些昂贵的原料的使用寿命和防止通过色谱柱的压力降升高。尤其需要适合在生产厂就地再生色谱固定相的再生方法。
发明概述
本发明提供了再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约75％w/w的水的再生溶液接触。本发明另一方面提供了再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约1％w/w的水的再生溶液接触。
在本发明一个实施方案中，所述有机酸是甲酸。在本发明另一个实施方案中，所述有机酸是乙酸。在另一个实施方案中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，优选少于0.1％的水，更优选少于0.02％的水，而最优选少于0.001％的水。
本发明另一方面涉及再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸，一种有机溶剂和少于约1％w/w的水的再生溶液接触。
在本发明一个实施方案中，所述有机溶剂是乙醇。在本发明另一个实施方案中，所述有机溶剂是2-丙醇。在本发明又一个实施方案中，所述有机溶剂是乙腈。在本发明又一个实施方案中，所述有机溶剂选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
在本发明另一个实施方案中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，优选少于0.1％的水，更优选少于0.02％的水，而最优选少于0.001％的水。
本发明另一方面涉及已通过本发明的方法再生了的色谱固定相。
本发明另一方面涉及通过本发明的方法获得的多肽产品。
本发明又一方面涉及通过一种方法生产的多肽产品，所述方法包括利用所述方法再生色谱固定相。
本发明又一方面涉及自动色谱设备，它包括用于实施所述再生方法的管道和控制***。
本发明又一方面涉及通过使用已利用所述方法再生了的色谱固定相纯化多肽而制备的药物组合物。
附图简述
附图中进一步阐释了本发明，其中：
图1表示共焦原理。
图2表示Source 30Q与用Thioflavin T染色的胰岛素纤丝的2D图。
图3表示测定Source 30Q上的纤丝面积的原理。浅色区表示来自Source 30Q颗粒上的胰岛素纤丝的绿光。
图4A-B表示色谱纯化III的制备色谱图(图4A，上图，用甲酸再生之前，以及图4B(下图)，用甲酸再生以后)。
定义
下面是本说明书中应用的术语的详细定义。
如本文应用的术语“色谱固定相”表示可溶性相(soluble phase)从上面流过的固定相，即，色谱基体。通常将色谱固定相放在色谱柱内。色谱固定相的实例有取代的二氧化硅，例如C-4二氧化硅，C-12二氧化硅和C-18二氧化硅，以及聚合材料，例如聚苯乙烯、Source 30Q和Sepharose。色谱固定相的其它实例有膜、整块的材料和滤料。
如本文应用的术语“色谱洗脱剂”表示用于洗脱步骤的溶液，所述洗脱中，被纯化的多肽通常从色谱固定相被释放到洗脱剂中。在色谱法的常规方式中，一次完全的循环(cyclus)包括：
a)用平衡缓冲液平衡而使柱呈准备好进行循环的状态，
b)包含产品的样品的应用，
c)任选的洗涤步骤，其中，洗涤带有结合的产品的色谱固定相，
d)洗脱，此时产品对色谱固定相的亲合力减小了，所以产品随色谱柱洗出液离开色谱柱，以及
e)任选的再生，此时试图用再生溶液除去色谱固定相的残留杂质。
如本文应用的术语“平衡缓冲液”表示用于平衡步骤的溶液，所述平衡步骤中使色谱柱作好色谱循环的准备。
如本文应用的术语“再生溶液”表示用于再生色谱固定相的溶液。再生的目的是在几次色谱循环期间保持令人满意的色谱分离性能。通常，关键的性能相关的参数是通过色谱柱的压力降和分离系数。一个再生步骤可能包括，将色谱固定相与一种再生溶液或与一种以上的再生溶液接触。在后一种情况下，术语“再生溶液”包括各再生溶液中的每一种以及由它们得到的混合物。
如本文应用的术语“混合物”表示含有至少两种组分的物质组合物。色谱柱洗出液是一种混合物，它含有洗脱剂中的化学品以及已从色谱柱脱离的产品。混合物的另一个实例是化学品在溶剂中的溶液，例如盐水。混合物的又一个实例是水与水混溶性有机溶剂。混合物的又一个实例是多肽在溶剂例如水或有机溶剂中的溶液或悬浮液。
如本文应用的术语“分离多肽”表示使多肽呈比分离它之前(即，原料中)更高浓度或更高纯度的状态。例如，一个分离多肽的实例是使多肽从溶液中沉淀或结晶，再从母液分离该沉淀物或晶体。
如本文应用的术语“有机溶剂”表示这种溶剂，即，它含有至少一个碳原子而且它在0℃～50℃的温度范围内呈流态。有机溶剂的非限制性实例有低级醇，例如甲醇和乙醇，多元醇，乙腈，己烷和丙酮。
如本文应用的术语“水混溶性有机溶剂”表示这种有机溶剂，即，它在20℃的水中的溶解度至少是1g/L。水混溶性有机溶剂的非限制性的实例有甲醇、1-丙醇、2-丙醇、乙腈和己二醇。
如本文应用的术语“有机酸”表示这种有机化合物，即，它具有至少一个官能团，它的离解常数pKa小于5.0。有机酸的实例有甲酸、乙酸、柠檬酸等。
如本文应用的术语“低级醇”表示C1-6-醇，其特征在于，它具有1～6个碳原子和一个羟基部分。低级醇中的碳骨架可能是直的或分枝的。低级醇的非限制性实例有乙醇、正丙醇、异丙醇和叔丁醇。
如本文应用的术语“多元醇”表示具有至少两个羟基部分的醇。多元醇的非限制性实例有己二醇(4-甲基-2，4-戊二醇)和新戊醇(2，2-二甲基-1，3-丙二醇)。
如本文应用的术语“赋形剂”表示加到药物组合物中而使组合物稳定和保存组合物的化合物。典型的赋形剂有缓冲剂、防腐剂和张度调节剂。
如本文应用的术语“药物组合物”表示这种产品，即，它含有活性化合物或其盐以及药物赋形剂例如缓冲剂、防腐剂和张度调节剂，所述药物组合物适用于治疗疾病或障碍。所以药物组合物在本领域也称为药物制剂。
如本文应用的术语“缓冲剂”表示这种化合物，即，它被用于溶液中以减小溶液的pH随时间变化的倾向，否则由于化学反应会发生pH变化。缓冲剂包括化学品例如磷酸钠、TRIS、甘氨酸和柠檬酸钠。
如本文应用的术语“张度调节剂”表示药物组合物中的化合物，它的作用是调节药物组合物的渗透压而使渗透压接近于人血浆的渗透压。张度调节剂包括NaCl、甘油、D-甘露糖醇等。
如本文应用的术语“药物上可接受的”表示适合正常药物应用，即，不在患者中引起不利事件。
如本文应用的术语“人胰岛素”表示其结构和性质是人们熟知的人激素。人胰岛素具有两条由半胱氨酸残基之间的二硫键连接的多肽链，即，A链和B链。A链是21个氨基酸的肽，而B链则是30个氨基酸的肽，这两条链通过三个二硫键连接：第一个在A链的位置6和11上的半胱氨酸之间，第二个在A链位置7上的半胱氨酸和B链位置7上的半胱氨酸之间，而第三个在A链位置20上的半胱氨酸和B链位置19上的半胱氨酸之间。
如本文应用的术语“多肽”表示由至少十个通过肽键连接的组成性氨基酸构成的化合物。所述组成性氨基酸可选自遗传密码编码的氨基酸组，而且它们可能是不被遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不被遗传密码编码的天然氨基酸例如有羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成生产的氨基酸，即，由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)，Tle(叔丁基甘氨酸)和β-丙氨酸。
如本文应用的术语“治疗用多肽”表示被认为具有作为治疗剂的潜在用途的多肽。治疗用多肽通常被高度纯化了，而且它们作为法规许可方法的部分经历了临床研究。治疗用多肽的实例有：人胰岛素、血小板生成素、***和人生长激素。
如本文应用的术语“多肽产品”表示含有多肽的组合物。多肽产品的实例有结晶多肽、沉淀多肽和多肽的溶液。
如本文应用的涉及母体多肽的术语“类似物”表示修饰的多肽，其中母体多肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代了和/或其中从母体多肽缺失了一个或多个氨基酸残基和/或其中从母体多肽缺失了一个或多个氨基酸残基和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加到了母体多肽。这种氨基酸残基的添加或缺失可在多肽的N端或多肽的C端或多肽内发生。一个类似物的实例是Arg34-GLP-1(7-37)，它是一种GLP-1(7-37)多肽，其中，位置34上的Lys被Arg替换了。其它实例有猪或牛胰岛素，两者都是人胰岛素的类似物。
如本文应用的涉及多肽的术语“前体”表示正被产生的多肽的修饰形式。多肽的前体通常是多肽的氨基酸延长的形式，或是多肽的截短的形式。这些前体的作用可以是增强细胞表达，包含纯化用亲和标记物，保护正被产生的多肽的某些活性基等。
如本文应用的涉及母体多肽的术语“衍生物”表示化学修饰的母体多肽或其类似物，其中，在母体多肽或其类似物中不存在至少一个取代基，即，被共价修饰了的母体多肽。典型的修饰有酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化(PEGylations)等。人胰岛素衍生物的实例有苏氨酸甲酯B30人胰岛素和NεB29-十四烷酰des(B30)人胰岛素。
如本文应用的术语“亲脂取代基”表示这种取代基，即，它含有4～40个碳原子并且在20℃水中的溶解度在约0.1mg/100ml水～约250mg/100ml水范围内，例如约0.3mg/100ml水～约75mg/100ml水范围内。例如，辛酸(C8)在20℃水中的溶解度是68mg/100ml，癸酸(C10)在20℃水中的溶解度是15mg/100ml，而十八酸(C18)在20℃水中的溶解度是0.3mg/100ml。
如本文应用的术语“管道和控制***”表示物质设备(管道和控制阀)与控制操作设备的管道和阀的软件。
发明描述
本发明涉及再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约75％w/w的水的再生溶液接触。
本发明还涉及再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约1％w/w的水的再生溶液接触。
本发明还涉及再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与具有至少25％w/w的有机酸浓度的再生溶液接触。
一些有机酸可用于所述方法的再生溶液中。一种优选的有机酸是甲酸。用于再生溶液的另一种有机酸是乙酸。另一种再生溶液含有两种有机酸，例如甲酸和乙酸。
所述再生溶液可进一步含有有机溶剂。优选地，有机溶剂也用于平衡缓冲液或色谱洗脱剂中。在本发明一个实施方案中，所述有机溶剂是乙醇。在另一个实施方案中，所述有机溶剂是2-丙醇。在又一个实施方案中，所述有机溶剂是乙腈。在又一个实施方案中，所述有机溶剂选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
在另一个实施方案中，所述有机酸是甲酸，而且所述有机溶剂是乙醇。在又一个实施方案中，所述有机酸是甲酸，而且所述有机溶剂是乙腈。在又一个实施方案中，所述有机酸是甲酸，而且所述有机溶剂是2-丙醇。在又一个实施方案中，所述有机酸是甲酸，而且所述有机溶剂是己二醇。在另一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，而且所述有机溶剂是乙醇。在又一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，而且所述有机溶剂是乙腈。在又一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，而且所述有机溶剂是2-丙醇。在又一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，而且所述有机溶剂是己二醇。
在另一个实施方案中，本发明涉及再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于0.5％的水、优选少于0.1％的水、更优选少于0.02％的水、而最优选少于0.001％的水的再生溶液接触。
所述色谱固定相与再生溶液优选在色谱柱内接触。这样，因与再生步骤相关的停车时间而损失的生产能力最小。所以，不用再次填充色谱柱就可进行再生色谱固定相的操作。在一个实施方案中，在所述再生过程中流化色谱固定相。在另一个实施方案中，在将所述色谱固定相与所述再生溶液接触之前用水混溶性有机溶剂替换色谱洗脱剂或平衡缓冲液。优选地，所述水混溶性有机溶剂也存在于色谱洗脱剂或平衡缓冲液内。优选地，所述水混溶性有机溶剂也存在于再生溶液内。
在又一个实施方案中，将所述色谱固定相与再生溶液在色谱柱外接触。该操作比在色谱柱内进行再生操作更麻烦，但是如果在色谱固定相颗粒之间截留了沉淀物质，该方法可能还是适用的。在后一种情况下，不用溶解所述物质即可从色谱固定相除去沉淀物质。
在一个实施方案中，所述色谱固定相是RP-HPLC基体。用于RP-HPLC的色谱固定相是机械上很刚性的物质，它们可能是二氧化硅或取代的二氧化硅，例如C4、C6、C8、C10、C12、C16、C18、C30或苯基二氧化硅，或者它可能是压力稳定的取代或未取代的聚合材料。所述色谱固定相，不管是基于二氧化硅的基体还是聚合材料，也可作为具有大孔和中孔的整体棒存在于色谱柱中。用作色谱固定相的适当二氧化硅材料是球形颗粒，它具有窄孔径分布而且粒径在3μm～100μm，例如5μm～100μm，例如8μm～30μm范围内，例如10μm，13μm，15μm，16μm，18μm和20μm。通常，应用的孔径在60～300，例如100，120，150，175，200或300。对于压力稳定的聚合材料来说，孔径可能从10或更高开始，例如50，100，400，600，1000或3000。在一个实施方案中，所述压力稳定的聚合材料是Source 30Q或XAD1180。用固定相填充色谱柱，在适当检验填充质量以后，用以结合方式使用的缓冲剂平衡色谱柱。生产规模色谱柱通常具有15～100cm的直径，而且这类体系可能具有动态轴向压缩。对于少量多肽的生产来说，生产柱可能具有例如15cm、20cm或25cm的直径。对于大量多肽的生产来说，生产柱可能具有例如40cm、60cm、80cm或更大的直径。
在本发明另一个实施方案中，被再生的色谱固定相是膜、整块材料、滤料等。
在再生色谱固定相的方法的一个实施方案中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触至少1秒，优选至少1分钟，更优选至少5分钟，例如1分钟～24小时，1分钟～5小时，1分钟～2小时，10分钟～60分钟。
在再生色谱固定相的方法的另一个实施方案中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触直到常规流速下通过色谱柱长度的压力降减小至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。
在再生色谱固定相的方法的另一个实施方案中，所述色谱固定相与所述再生溶液的接触是在约0℃～70℃，在5℃～50℃，例如10℃～40℃，例如15℃～30℃，或者18℃～25℃范围内的温度下进行的。
在再生色谱固定相的方法的另一个实施方案中，所述色谱固定相的使用寿命是至少500次色谱循环，优选至少700次色谱循环，更优选至少1000次色谱循环，最优选至少2000次色谱循环。
在再生色谱固定相的方法的另一个实施方案中，对于每次色谱循环都将所述方法应用于所述色谱固定相，每2次色谱循环至少应用一次，每5次色谱循环至少应用一次，每20次色谱循环至少应用一次，每50次色谱循环至少应用一次，或者每100次色谱循环至少应用一次。
在本发明另一个实施方案中，对色谱固定相进行再生操作的次数是至少25次，至少50次，至少100次，至少200次，至少400次或者至少1000次。
在再生色谱固定相的方法的另一个实施方案中，无论何时通过色谱柱长度的压力降超过阈值，就将所述方法应用于所述色谱固定相。
本发明另一方面是生产治疗用多肽或其前体的方法，所述方法包括至少一步色谱处理步骤，该步骤中，通过上述再生方法再生色谱固定相。在生产治疗用多肽或其前体的方法的一个实施方案中，所述治疗用多肽是含有亲脂取代基的衍生物。在生产治疗用多肽或其前体的方法的另一个实施方案中，所述治疗用多肽是含有连接到赖氨酸残基的ε-氨基上的亲脂取代基的衍生物。在生产治疗用多肽或其前体的方法的又一个实施方案中，所述治疗用多肽选自下组物质：胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、exendin-4、TFF肽、人胰岛素、其类似物及其衍生物。在又一个实施方案中，所述多肽选自下组物质：Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、exendin-4、Lys17Arg30-GLP-2(1-33)、Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰))GLP-2(1-33)和Gly2-GLP-2(1-33)。在又一个实施方案中，所述多肽是exendin-4。在又一个实施方案中，所述多肽是含有人血清白蛋白或其片断的融合多肽。在又一个实施方案中，所述多肽是GLP-1(7-37)或其类似物与人血清白蛋白片断或其类似物之间的融合多肽。在又一个实施方案中，所述多肽是exendin-4(1-39)或其类似物与人血清白蛋白片断或其类似物之间的融合多肽。在又一个实施方案中，所述多肽是含有免疫球蛋白的Fc部分或其片断的融合多肽。在又一个实施方案中，所述多肽是GLP-1(7-37)或其类似物与免疫球蛋白的Fc部分的片断或其类似物之间的融合多肽。在又一个实施方案中，所述多肽是exendin-4(1-39)或其类似物与免疫球蛋白的Fc部分的片断或其类似物之间的融合多肽。
在另一个实施方案中，所述多肽选自下组物质：人胰岛素、人胰岛素前体、人胰岛素类似物、人胰岛素类似物前体、GLP-1(7-37)类似物、exendin-4(1-39)类似物、及其衍生物。在另一个实施方案中，所述多肽选自含有至少一个甲氧基或乙氧基部分的人胰岛素衍生物。在另一个实施方案中，所述多肽选自下组物质：
苏氨酸甲酯B30人胰岛素，
苏氨酸乙酯B30人胰岛素，
AspB28人胰岛素，
苏氨酸甲酯B30AspB28人胰岛素，
苏氨酸乙酯B30AspB28人胰岛素，
LysB28ProB29人胰岛素，
MetB-1ArgB0LysB28ProB29人胰岛素原，
LysB3GluB29人胰岛素，
GlyA21ArgB31ArgB32人胰岛素，
des(B30)人胰岛素，
NεB29-十四烷酰des(B30)人胰岛素，
NεB29-石胆酰(litocholoyl)-γ-谷氨酰des(B30)人胰岛素，
NεB29-辛酰des(B30)人胰岛素，以及
NεB29-辛酰人胰岛素。
在又一个实施方案中，所述多肽选自人血清白蛋白、***、TNF-α、白细胞介素、IGF-1、IGF-2、人生长激素、促生长素抑制素、人胰岛淀粉样多肽(human amylin)及其类似物。
在通过本发明的方法再生的色谱固定相上纯化的多肽可通过多肽生产领域已知的各种技术生产。大于3000道尔顿的多肽通常是通过发酵或细胞培养生产的，而更小的多肽可通过化学肽合成来生产。决定最适当生产方法的其它重要因素还有：要生产的多肽的量和多肽的结构，例如二硫键和其它修饰。来自发酵或细胞培养的多肽一般是通过在适当的培养基中培养重组宿主细胞，例如细菌、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞生产的。所述培养基可以是程度不同地化学定义的培养基，它含有宿主细胞的生长和产物形成所需的营养物，例如糖、氮源、盐、维生素和其它生长因子。一旦在培养基中培养了微生物或细胞并且任选使它们破裂，培养基就含有所需产品与剩余的培养基组分、宿主细胞产生的杂质和产品相关的杂质的混合物。宿主细胞产生的杂质主要是多肽、核酸和细胞碎片。在回收或早期纯化步骤中将产品与这些不相关的杂质分离。在最后的纯化步骤(精加工)中，广泛应用色谱处理步骤将与产品多肽密切相关的杂质与产品多肽分离。
多肽的合成还可通过下列方法进行：Merrifield型化学的固相合成、溶液相方法、或者本领域已知的半合成方法。在回收和最后纯化步骤之间可进行一个或多个化学转化步骤。这样的化学修饰可通过前体多肽的水解，其中，多肽上的氨基酸延伸被从多肽切断。这样的氨基酸延伸在培养获得的多肽的情况下可用于增强宿主细胞的表达，或者它可用于特异性地纯化多肽，例如通过亲和色谱，例如组氨酸标记的多肽的IMAC纯化。化学转化还可能是生产多肽衍生物的化学修饰，例如通过酰化、聚乙二醇化或酯化。这样的化学修饰是本领域熟知的(参见例如WO 98/08871、WO 99/43706、US 5,424286、WO 00/09666、WO 00/66629、WO 01/04156和WO 02/90388)。
本发明另一方面是上述再生色谱固定相的方法在减小通过色谱柱长度的压力降中的应用。
本发明又一方面是上述再生色谱固定相的方法在生产治疗用多肽中的应用。
本发明又一方面是色谱固定相，它已通过将所述色谱固定相与再生溶液接触而再生了，所述再生溶液含有至少一种有机酸和少于约75％w/w的水。本发明又一方面是色谱固定相，它已通过将所述色谱固定相与再生溶液接触而再生了，所述再生溶液含有至少一种有机酸和少于约1％w/w的水。
在一个实施方案中，所述色谱固定相已通过上述方法再生了。在另一个实施方案中，所述色谱固定相已通过一种方法再生了，所述方法中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，优选少于0.1％的水，更优选少于0.02％的水，最优选少于0.001％的水。在又一个实施方案中，再生的色谱固定相是二氧化硅，或是取代的二氧化硅物质。
本发明另一方面涉及通过一种方法生产的多肽产品，所述方法包括下列步骤：
a)应用通过本发明的再生方法生产的色谱固定相纯化多肽或其前体，以及
b)分离所述多肽或其前体而给出所得的多肽产品。
本发明又一方面涉及通过一种方法生产的多肽产品，所述方法中，应用按照本发明的方法再生的色谱固定相。
本发明又一方面涉及用于实施本发明的再生方法的自动化色谱处理设备，它包括管道和控制***。
本发明又一方面涉及通过一种方法制备的药物组合物，所述方法包括下列步骤：
a)首先应用通过本发明的方法再生的色谱固定相纯化多肽或其前体，
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物上可接受的赋形剂掺和。
本发明又一方面涉及通过一种方法制备的药物组合物，所述方法包括下列步骤：
a)首先应用这种方法再生的色谱固定相纯化多肽或其前体，所述方法中，将所述色谱固定相与再生溶液接触，该再生溶液含有至少一种有机酸和少于0.5％的水，优选少于0.1％的水，更优选少于0.02％的水，而最优选少于0.001％的水，以及
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物上可接受的赋形剂掺和。
实施例
应用关于下列可商购的化学品和材料的首字母缩略词：
HCOOH：甲酸
EtOH：乙醇
AcOH：乙酸
ODDMS：十八烷基二甲基取代的二氧化硅颗粒(ODDMS二氧化硅)
用于实施例1～68、70～71、73～74和76的甲酸具有98～100％(根据生产商)的规定纯度，而且用于实施例72的甲酸的纯度为99.9％。
缩写CV如色谱学领域中已知的那样表示柱体积。
实施例1～68
实施例1～68的试验的整个方案如下：
1)测定没有压力问题的柱(新的未用过的柱)的反压(back pressure)和谷值高度。
2)引入压力和性能问题。
3)测定有压力问题的柱的反压和谷值高度。
4)柱的再生。
5)测定再生后的柱的反压和谷值高度。
反压和谷值高度的测定：
将相同类别的硅胶用于这部分所述的所有试验。所述硅胶是ODDMS200，15μm硅胶。基本上应用相同批号的硅胶(批号是205144)(全部柱始于874-)。
将硅胶填入10mm×250mm钢柱，应用DesB30胰岛素作为试验物质在功能度试验(functionality test)中进行测试，用含有氯化钙和氯化钾盐的水-乙醇混合物(见表1)洗脱。将洗脱时的反压以及DesB30胰岛素和最近的杂质(在胰岛素峰的前面)之间的谷值高度用作测试柱恢复它的性能情况的试验参数。
DesB30胰岛素的洗脱时间可能因温度和其它试验参数的小变化而受一些试验变化的支配。当不同试验中的DesB30胰岛素的洗脱时间相同时，谷值高度是柱分离性能的理想比较。当试验之间的DesB30胰岛素的洗脱时间改变时，谷值高度是柱分离性能的不太好的量度。所有其它参数相等时，保留时间越长，谷值高度就会越低。
表1.功能度试验中应用的溶液
  入口   缓冲液   类别   含量(w/w)
  A11   1   平衡缓冲液   20％乙醇
A12 2 洗脱缓冲液A   25％乙醇，1.5％KCl，0.4％CaCl2和0.15％三乙醇胺(pH7.4，用HCl调节)
B1 3 洗脱缓冲液B   35％乙醇，1.5％KCl，0.4％CaCl2和0.15％三乙醇胺(pH7.4，用HCl调节)
  A13   4   再生缓冲液   70％乙醇和6.9％乙酸
  A18   应用   DesB30胰岛素   Na2EDTA溶液，pH7.5，乙醇
功能度试验是在以Unicorn 4.0为控制软件的ktaexplorer 100A上在23±2℃下进行的，并且运行下列柱循环(见表2)：
表2.功能度试验中的柱循环(CV是柱体积)
 操作   CV(no.)   体积(ml)
 平衡   3   58.9
 加载   0.8   15
 洗涤1   1   19.6
 洗脱   10   196.3
 洗涤2   0.5   9.8
 漂洗   2   39.3
测试填充了硅胶(批号205144)的柱，反压测定到3.4±0.1MPa。同样测定了引入压力问题之前其它柱的反压。试验表明，如果处理后这些值恢复了，柱就恢复了它的性能。
还在引入压力和性能问题前后以及在柱的再生后，对各个柱测定了谷值高度。
压力和性能问题的引入：
以下列3种方式之一引入压力和性能问题：
1)在功能度试验中应用了柱，但在加载后从***取出并置于70℃下达1～16小时。随后测定反压和谷值高度进行功能度试验的其余测试。
2)在烧杯中将ODDMS硅胶(25g)与DesB30胰岛素(0.14g)、0.1M Tris缓冲液(22ml)和乙醇(15ml)在50℃下搅拌1小时。然后滗去硅胶并填充在钢柱(10mm×250mm)中。进行功能度试验测定反压和谷值高度。
还可以在更低温度下进行该方法，但那样就需要更长的反应时间。
3)1)和2)的组合。首先，如2)中那样处理硅胶，但在填充后如1)中那样处理柱。
下表4中列出了用于各个柱的方法。
柱的再生(即，压力和性能问题的消除)：
柱的再生也是在ktaexplorer 100A上进行的。该操作的柱循环可见于下表3中。再生后，再次在功能度试验中检测柱并测定反压。
表3.再生下的柱循环。
 操作   溶剂   CV(no.)   体积(ml)
 洗涤1   EtOH   3   58.9
 再生   见表4和5   2   39.3
 放置   -   0   30分钟
 再生   见表4和5   2   39.3
 洗涤2   EtOH   3   58.9
在22℃和40℃下测试不同的溶剂(将整个HPLC***置于选定的温度±1℃下的冰箱中)。关于各个柱的具体条件示于表4中，官能度试验的结果示于表5中。
关于各个柱的具体试验条件；
表4.关于各个柱的试验条件
  实施例编号 柱编号   通过下列编号的方法引入问题 再生溶剂   温度(℃)
  1   204377/1   1   HCOOH   22
  2   874-32/1   2   HCOOH   22
  3   874-32/2   3   HCOOH   22
  4   874-32/7   2   HCOOH   22
  5   874-33/9   2   HCOOH   22
  6   874-33/6   3   HCOOH   22
  7   874-24/22   2   HCOOH   40
  8   874-24/10   3   AcOH   22
  9   874-24/15   2   AcOH   22
  10   874-24/23   2   AcOH   40
  11   874-31/1   2   AcOH   40
  12   203635/5   1   HCOOH/AcOH 99∶1   22
  13   874-24/6   3   HCOOH/AcOH 99∶1   22
  14   205019/1   1   HCOOH/AcOH 99∶1   40
  15   204770/1   1   HCOOH/AcOH 3∶1   22
  16   874-24/26   2   HCOOH/AcOH 3∶1   40
  17   204888/1   1   HCOOH/AcOH 1∶1   22
  18   874-24/27   2   HCOOH/AcOH 1∶1   40
  19   204923/1   1   HCOOH/AcOH 1∶3   22
  20   874-24/28   2   HCOOH/AcOH 1∶3   40
  21   203251/3   1   HCOOH/EtOH 99∶1   22
  22   874-24/4   2   HCOOH/EtOH 99∶1   22
  23   204815/1   1   HCOOH/EtOH 99∶1   4O
  24   204815/1   1   HCOOH/EtOH 3∶1   22
  25   204888/1   1   HCOOH/EtOH 3∶1   40
  26   874-24/5   3   HCOOH/EtOH 1∶1   22
  27   874-24/16   2   HCOOH/EtOH 1∶1   22
  28   204923/1   1   HCOOH/EtOH 1∶1   40
  29   204550/1   1   HCOOH/EtOH 1∶3   22
  30   874-24/17   2   HCOOH/EtOH 1∶3   22
  31   204770/1   1   HCOOH/EtOH 1∶3   40
  32   203635/5   1   HCOOH/水 99∶1   22
  33   874-24/24   2   HCOOH/水99∶1   40
  34   204377/1   1   HCOOH/水95∶5   22
  35   874-24/29   2   HCOOH/水95∶5   40
  36   202985/2   1   HCOOH/水4∶1   22
  37   874-24/30   2   HCOOH/水4∶1   40
  38   204550/1   1   HCOOH/水1∶1   22
  39   874-24/31   2   HCOOH/水1∶1   40
  40   874-33/5   3   HCOOH/水1∶1   40
  41   874-24/7   3   HCOOH/水1∶3   22
  42   874-24/18   2   HCOOH/水1∶3   22
  43   204770/1   1   HCOOH/水1∶3   40
  44   874-24/8   3   AcOH/水99∶1   22
  45   874-24/19   2   AcOH/水99∶1   40
  46   874-24/11   3   AcOH/水3∶1   22
  47   874-24/20   2   AcOH/水3∶1   40
  48   874-31/2   2   AcOH/水3∶1   40
  49   874-33/4   3   AcOH/水3∶1   40
  50   874-24/12   3   AcOH/水1∶1   22
  51   874-24/25   2   AcOH/水1∶1   40
  52   874-31/3   2   AcOH/水1∶1   40
  53   874-24/13   3   HCOOH/苯酚/水1∶1∶1   22
  54   874-24/21   2   HCOOH/苯酚/水1∶1∶1   22
  55   874-32/3   2   1500ppm次氯酸钠   22
  56   874-33/11   3   1500ppm次氯酸钠   22
  57   874-33/14   2   1500ppm次氯酸钠   22
  58   874-32/4   2   过甲酸   22
  59   874-33/13   3   过甲酸   22
  60   874-33/18   2   过甲酸   22
  61   874-32/5   2   1.5M甲醛   22
  62   874-33/12   3   1.5M甲醛   22
  63   874-33/15   2   1.5M甲醛   22
  64   874-32/6   2   6M盐酸胍   22
  65   874-33/10   3   6M盐酸胍   22
  66   874-33/17   2   6M盐酸胍   22
  67   874-33/19   2   EtOH(60％w/w)/0.1M NaOH   22
  68   874-33/20   3   EtOH(60％w/w)/0.1M NaOH   22
关于各个柱的功能度试验结果：
表5.按照表4中列出的条件在引入问题前后和再生柱以后进行的功能度试验测定的反压和谷值高度。
RT是DesB30胰岛素的保留时间，而谷值高度(HV)是关于DesB30胰岛素和最近的杂质。
  实施例编号           反压(MPa)                           性能
  问题之前   问题以后   再生后       问题之前       问题以后         再生后
RT ml   HVmAU   RTml   HVmAU   RTml   HVmAU
  1   3,8   6,2   3,8   140,2   38,4   144,3   36,1
  2   3,4   5,8   3,6   141,2   39,6   146,6   62,0   138,6   44,5
  3   3,4   ＞10   3,7   141,2   39,6   -   -   137,9   45,9
  4   3,4   4,4   3,4   141,2   39,6   146,6   62,0   139,0   43,2
  5   3,4   4,7   3,4   141,7   41,9   134,6   63,0   139,2   42,9
  6   3,4   ＞10   3,6   141,7   41,9    -   -   140,1   45,8
  7   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   137,2   48,6
  8   3,4   ＞10   ＞10   134,5   54,3   -   -   -   -
  9   3,4   4,7   4,4   134,5   54,3   136,5   47,8   135,9   48,4
  10   3,4   4,7   3,9   134,5   54,3   136,5   47,8   135,0   50,1
  11   3,4   4,2   4,2   134,5   54,3   149,5   44,7
  12   3,0   3,7   2,8   136,1   42,7   130,3   51,9
  13   3,4   ＞10   3,5   134,5   54,3   -   -   145,2   44,4
  14   3,5   ＞10   3,5   139,9   44,1   -   -   135,9   44,8
  15   3,5   ＞10   3,3   138,7   40,6   -   -   127,3   54,7
  16   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   139,3   45,0
  17   3,0   ＞10   2,9   139,2   30,4    -   -   130,2   36,2
  18   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   137,1   47,0
  19   3,1   ＞10   3,0   130,2   36,2   -   -   133,3   57,2
  20   3,4   4,7   3,5   134,5   54,3   136,5   47,8   136,6   47,5
  21   2,2   3,4   2,3   131,6   32,9   133,8   35,2
  22   3,4   5,2   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   135,1   50,1
  23   3,4   5,8   3,3   148,5   29,6   142,0   65,0
  24   3,3   6,2   3,1   135,2   35,4   135,3   34,0
  25   3,1   9   3,1   157,0   24,7   -   -   151,3   31,9
  26   3,4   ＞10   ＞10   134,5   54,3   -   -   -   -
  27   3,4   4,7   3,5   134,5   54,3   136,5   47,8   136,2   46,9
  28   3,2   ＞10   3,5   139,7   44,7   -   -   148,0   35,7
  29   2,8   ＞10   ＞10   142,4   23,2   -   -   -   -
  30   3,4   4,7   4,1   134,5   54,3   136,5   47,8   137,6   44,2
  31   3,6   ＞10   ＞10   147,4   38,7   -   -   -   -
  32   3,1   6,9   3,1   143,8   34,7   136,3   41,4
  33   3,4   4,7   3,3   134,5   54,3   136,5   47,8   132,1   55,8
  34   3,7   ＞10   3,9   140,6   41,6   -   -   145,8   34,5
  35   3,4   4,7   3,6   134,5   54,3   136,5   47,8   139,8   42,0
  36   2,4   5,1   2,3   145,8   22,0   134,1   32,0
  37   3,4   4,7   3,5   134,5   54,3   136,5   47,8   140,3   45,4
  38   2,6   4,6   2,7   126,6   27,2   135,9   34,5
  39   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   140,4   42,2
  40   3,4   ＞10   4,1   141,7   41,9   -   -   141,8   64,0
  41   3,4   ＞10   ＞10   134,5   54,3   -   -    -   -
  42   3,4   4,7   3,3   134,5   54,3   136,5   47,8   137,0   45,6
  43   3,4   5,8   3,8   131,9   47,0   145,0   40,8
  44   3,4   ＞10   ＞10   134,5   54,3   -   -   -   -
  45   3,4   4,7   4,3   134,5   54,3   136,5   47,8   135,2   42,9
  46   3,4   ＞10   5,2   134,5   54,3   -   -   134,2   119,3
  47   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   134,4   64,0
  48   3,4   4,2   3,5   134,5   54,3   137,3   47,7
  49   3,4   ＞10   5,6   141,7   41,9   -   -   141,9   73,4
  50   3,4   ＞10   9   134,5   54,3   136,5   47,8   -   -
  51   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   134,9   50,7
  52   3,4   4,2   3,5   134,5   54,3   126,9   62,7
  53   3,4   ＞10   4,1   134,5   54,3   -   -   137,7   46,1
  54   3,4   4,7   3,4   134,5   54,3   136,5   47,8   138,6   45,0
  55   3,4   4,4   3,8   141,2   39,6   146,6   62,0   138,0   46,2
  56   3,4   ＞10   ＞10   141,7   41,9   -   -   -   -
  57   3,4   4,7   4,1   141,7   41,9   134,6   63,0   149,8   39,3
  58   3,4   4,4   3,6   141,2   39,6   146,6   62,0   138,2   46,1
  59   3,4   ＞10   3,5   141,7   41,9   -   -   135,5   52,3
  60   3,4   4,7   3,3   141,7   41,9   134,6   63,0   135,1   54,1
  61   3,4   4,4   3,7   141,2   39,6   146,6   62,0   137,7   49,4
  62   3,4   ＞10   ＞10   141,7   41,9   -   -   -   -
  63   3,4   4,7   3,9   141,7   41,9   134,6   63,0   147,6   40,7
  64   3,4   4,4   3,5   141,2   39,6   146,6   62,0   139,4   45,0
  65   3,4   ＞10   ＞10   141,7   41,9   -   -   -   -
  66   3,4   4,7   3,8   141,7   41,9   134,6   63,0   137,4   53,4
  67   3,4   4,7   3,5   141,7   41,9   134,6   63,0   138,4   39,1
  68   3,4   ＞10   3,9   141,7   41,9   134,6   -   138,8   49,3
实施例69
柱使用寿命-色谱溶剂/洗脱剂。
取代的硅胶的使用寿命可能因应用于色谱柱的溶液例如缓冲液和再生溶液对硅胶的化学降解而受限制。取代的硅胶的化学降解可通过柱出口处硅的出现或者通过显示取代作用丧失的硅胶碳含量降低来观测。下列试验表明，在用三种色谱溶液长时间冲洗期间柱流出物中硅的出现和硅胶碳含量的减小：20％乙醇水溶液，洗脱剂1和洗脱剂2。洗脱剂2的组成是31％w/w乙醇、1.5％w/w KCl、0.40％w/wCaCl2、0.15％w/w三乙醇胺并且应用HCl将pH调节到pH7.4。洗脱剂1的组成是盐、缓冲剂、乙醇和pH3.0。
通过填充色谱柱的标准方法将一批ODDMS硅胶填充入4.0×250mm钢柱中。然后在开始用色谱洗脱剂连续冲洗之前用3CV乙醇将柱平衡。然后用色谱洗脱剂(20％EtOH，洗脱剂1或洗脱剂2)将5个柱分别冲洗1、3、7、12和16天。在适当的冲洗时间后，再用3CV乙醇平衡每个柱，从柱中取出硅胶。对用过的硅胶的样品进行碳含量分析，对用过的再生溶液的样品进行硅含量分析。第0天的结果是用来填充柱的硅胶的结果(碳含量)。
表6.通过测定残余的碳和释出的硅估测用典型的色谱洗脱剂长时间冲洗期间柱的使用寿命
  柱编号   色谱溶液   期间(天)   测定的C(％)   测定的Si(mg)   体积(mL)   相对C(％)
  100ODDMS4.0*250mm 204614/15204614/16204614/17204614/23204614/24 20％EtOH20％EtOH20％EtOH20％EtOH20％EtOH 01371216 19,4019,1419,1619,2619,2819,27 0,000,050,130,310,250,41 0136425154012701360 100,0098,6698,7699,2899,3899,33
204614/18204614/20204614/21204614/19204614/22 洗脱剂1洗脱剂1洗脱剂1洗脱剂1洗脱剂1   01371216   19,4018,6718,8518,7618,6418,67   0,000,150,360,871,330,86   01473608701325860   100,0096,2497,1696,7096,0896,24
            柱编号   20％EtOH(％v/v)   期间(天)   测定的C(％)   测定的Si(mg)   体积(mL)   相对C(％)
  200ODDMS4,0*250mm 204630/14204630/13204630/15204630/16204630/18 20％EtOH20％EtOH20％EtOH20％EtOH20％EtOH 01371216 9,809,619,669,729,699,69 0,000,030,090,090,180,28   0160430425610930 100,0098,0698,5799,1898,8898,88
204630/19204630/17204630/20204630/21204630/23 洗脱剂2洗脱剂2洗脱剂2洗脱剂2洗脱剂2   01371216   9,809,559,559,549,599,49   0,000,130,400,851,290,70   01254008501290700   100,0097,4597,4597,3597,8696,84
实施例70
柱的使用寿命-含甲酸的再生溶液。
取代的硅胶的使用寿命可能因应用于色谱柱的溶液例如缓冲液和再生溶液对硅胶的化学降解而受限制.取代的硅胶的化学降解可通过柱出口处硅的出现或者通过显示取代作用丧失的硅胶碳含量降低来观测。下列试验表明，在用含甲酸的再生溶液长时间冲洗期间柱流出物中硅的出现和硅胶碳含量的减小。所以，与应用色谱缓冲液或溶剂的情况相比，含甲酸的再生溶液不再破坏柱基体。
通过填充色谱柱的标准方法将一批ODDMS硅胶填充入4.0×250mm钢柱中。然后在开始用甲酸连续冲洗之前用3CV 100％EtOH将柱平衡。然后用甲酸再生溶剂(100％或80％)将5个柱分别冲洗1、3、7、12和16天。在适当的冲洗时间后，再用3CV乙醇平衡每个柱，从柱中取出硅胶。对用过的硅胶的样品进行碳含量分析，对用过的再生溶液的样品进行硅含量分析。第0天的结果是用来填充柱的硅胶的结果(碳含量)。
表7.通过测定残余的碳和释出的硅估测用含甲酸的溶液长时间再生期间柱的使用寿命
  柱类别   柱编号   甲酸(％)   期间(天)   测定的C(％)   测定的Si(mg)   体积(mL)   相对C(％)
  100ODDMS4.0*250mm   0204614/7204614/5204614/6204614/3204614/2   -100100100100100   01371212   19,4019,0018,9019,2618,9718,94   0,000,821,461,955,633,92   012451062014301100   100,0097,9497,4299,2897,7897,63
  0204614/8204614/10204614/9204614/11204614/12   -8080808080   01371216   19,4019,0819,0818,9317,0418,61   0,001,672,624,556,076,86   017741097010802090   100,0098,3598,3597,58N.D.95,93
  200ODDMS4.0*250mm   0204630/8204630/5204630/6204630/3204630/2   -100100100100100   01371212   9,809,569,509,419,679,63   0,000,621,771,021,311,22   08551080010201655   100,0097,5596,9496,0298,6798,27
  0204630/7204630/10204630/9204630/11204630/12   -8080808080   01371216   9,809,649,429,438,679,18   0,000,560,771,101,401,46   014144092014702000   100,0098,3796,1296,22N.D.93,67
实施例71
应用共焦激光扫描显微镜检术测定Source 30Q阴离子交换剂上的胰岛素纤丝
目的
应用共焦激光扫描显微镜检术的目的是目测不同的再生溶剂在除去Source 30Q上的胰岛素纤丝时效果如何。利用复杂的图像处理软件能有机会测定各图片上胰岛素纤丝的面积，给出更准确的判断而不是目视判断各图片。
共焦原理
应用CLSM的原理是用荧光染料将样品染色。将染色的样品置于显微镜下并且应用激光激发荧光染料。检测从荧光染料发出的光而形成图像。共焦激光扫描显微镜如同应用激光作为光源的常规共焦显微镜。来自激光的光经过双色分束器(dichromatic beamsplitter)穿过显微镜的物镜。双色分束器是这种仪器，即，能使来自激光的光向下穿过物镜到达样品，而从样品发出的光通过双色分束器并且向上到达光电倍增管，在这里检测到光并且形成图像。在双色分束器和光电倍增管之间放置了共焦针孔。共焦针孔起滤光器的作用，阻止从焦点区出来的所有的光到达光电倍增管。这意味着，形成的图像来自很窄的聚焦面。通过调节共焦针孔可以上下地移动通过样品的图像聚焦面从而沿显微镜的光(z)轴产生一系列图像。这一系列图像可收集到样品的3-D图像中。
Source 30Q
Source 30Q是一种基于粒径为30微米的单分散珠粒的强阴离子交换剂。该基体由聚苯乙烯/二乙烯基苯构成。Source 30Q在650nm以上的波长区给出弱的自身荧光。这说明了不用任何染色就可能看见Source 30Q颗粒。
Thioflavin T
用来对胰岛素纤丝染色的染料是已知用于对淀粉样蛋白染色的Thioflavin T。Thioflavin T具有宽的发射光谱，最大发射在低于490nm和高于530nm的范围内。这说明可能辨别来自胰岛素纤丝的光(绿光)和来自颗粒的自身荧光(红光)。
对Source 30Q上的胰岛素纤丝染色的方法
将0.0385g干燥的Source 30Q放入25～30ml玻璃杯。
将500μl 96％乙醇加到Source 30Q中。
添加4.5ml用NaOH调节到pH3的0.05M乙酸。
通过小心地振荡玻璃杯而将混合物混在一起。
添加20μl 116.62mM Thioflavin T在Milli-Q-水中的溶液。
将混合物小心地振荡5min。
现在将样品染色并且准备好在显微镜下分析。
将约40μl的一小滴混合物放入显微池(microscopic well)并且放入显微镜。
从池的不同位置拍摄各样品的10个2D图。
仪器
显微镜检条件
物镜：40*；油；NA？
激光器：氩488nm
激光强度：100％
共焦针孔：20μm
发射滤光器(No 2)：来自Chroma的515/30M
发射滤光器(No 3)：来自Chroma的HQ650LP
显微镜：Nikon TH300，装备了来自Nikon的PCM2000共焦扫描头(光电倍增管)。
软件：Nikon EZ2000 Viewer 2.5.77
用于图像处理的软件：AnalySIS 3.00
图像处理
根据每个样品的10个2D图测定胰岛素纤丝的面积。为了保证以完全相同的方式处理每个样品，通过形成宏指令自动进行图像处理。宏指令如下所示。在excel工作表中归纳来自每个样品10张图的各独立纤丝的面积。在条形图中汇集从每个样品归纳的纤丝面积。
测定纤丝的面积的宏指令
Op.Display＝1；
docActivate(″picture name″)；
DbLoadImage ()；
MaximizeContrast ()；
ShadingCorrection(N*N average filter size；3；lower limit；1900；upper limit；2000)；
BinarizeColorImage(ColorThresholds：＝NULL，Phase：＝-1)；Invert ()；
EdgeEnhance(size；5；percent；70)；
SetFrame(Left：＝0，Top：＝0，Right：＝1023，Bottom：＝1023)；Detect ()；
ParticleResults()；
Op.Display＝6；
Option.BurnOverlay＝TRUE；
SaveAs(FileName：)；
docActivate(″Sheet*″)；
SaveAs(FileName：)；
Close(AskForSave：＝TRUE)；
表8.在应用不同的再生溶液再生硅胶前后用过的Source 30Q硅胶上纤丝的测定的面积
  再生溶液   纤丝的面积(任意单位)
  无   485
  无   458
  NaOAc(0.25％w/w NaOAc，0.24％w/wtris，42.5％w/w EtOH，pH7.5   154
  NaOH(1M)   101
  HCOOH∶水(50∶50)   68
  HCOOH(100％)   0
  HCOOH∶EtOH(50∶50)   0
应用纯的甲酸或者甲酸和乙醇的混合物观察到胰岛素纤丝的完全除去。甲酸∶水的50∶50混合物没有完全除去纤丝，尽管该混合物是比氢氧化钠(1M)更有效的再生溶液。
实施例72
用甲酸在生产规模再生RP-HPLC柱的标准操作方法。
下述操作方法适用于以生产规模纯化人胰岛素的四个色谱纯化步骤中应用的两类柱。
1类柱：
床高32.5cm
1.用约1.5CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速冲洗柱以便除去缓冲剂盐
2.逆转柱中的流向
3.用约1.1CV无水乙醇以4.5CV/h的流速冲洗柱
4.将1.1CV纯的甲酸以2.1CV/h的流速泵送到柱上
5.停止流动，让柱与甲酸静置30分钟
6.用约1.1CV无水乙醇以4.5CV/h的流速冲洗柱
7.用约1.1CV 20％w/w乙醇水溶液以4.5CV/h的流速冲洗柱
8.将柱中的流向转回正常流向
9.用最少4CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速平衡柱
柱现在准备好供再次使用
2类柱：
床高37.5cm
1.用约1.5CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速冲洗柱以便除去缓冲剂盐
2.逆转柱中的流向
3.用约1.0CV无水乙醇以3.9CV/h的流速冲洗柱
4.将0.92CV纯的甲酸以1.9CV/h的流速泵送到柱上
5.停止流动，让柱与甲酸静置30分钟
6.用约1.0CV无水乙醇以3.9CV/h的流速冲洗柱
7.用约1.0CV 20％w/w乙醇水溶液以3.9CV/h的流速冲洗柱
8.将柱中的流向转回正常流向
9.用最少4.0CV 20％w/w乙醇水溶液以4.6CV/h的流速平衡柱
柱现在准备好供再次使用
对于1类柱，每16次运行后用甲酸进行再生作为预防作用以阻止组分的积聚、柱反压的增大和池量(pool volumes)的增大。通过在色谱纯化I步骤中应用使用甲酸的再生操作，柱床的使用寿命延长到2000次运行。
对于2类柱，每60次运行后，或者如果观察到的增大的反压、增大的池量和杂质的积聚，就定期用甲酸进行再生。通过应用使用甲酸的再生操作，柱床的使用寿命在色谱纯化III步骤中延长到600次运行，而在色谱步骤IV中延长到900次运行。
在色谱纯化I、III和IV步骤中应用的柱基体由十八烷基二甲基取代的二氧化硅颗粒(ODDMS二氧化硅)构成。描述的标准操作方法适用于在生产规模应用的所有类型的取代二氧化硅基体。
该操作方法还用于基于Source Q材料的柱基体的甲酸再生操作方法。
下文示出了对色谱纯化III和IV的效果实例。
表9.色谱纯化III：对池量和反压的效果
  用甲酸(100％)再生之前
  池量(重量)   反压(输送泵上的最大压力)
  208kg   27巴
  用甲酸(100％)再生以后
  池量   反压(输送泵上的最大压力)
  165kg   17巴
再生使池量减小约21％，反压减小37％。
图4A-B示出了再生对色谱纯化III的制备色谱图的效果。
通过应用甲酸再生，实现了改良的分离作用和人胰岛素峰形(胰岛素峰是上图中始于时间8.20的大峰，而在下图中是始于时间14.02的大峰)。
实施例73
DEAE Sepharose的再生
利用纯的甲酸(100％HCOOH)再生了一批已用于纯化人生长激素的方法中的大量纯化循环的DEAE Sepharose。在再生前，Sepharose呈棕色，说明在硅胶上沉积的物质。再生后的Sepharose颜色浅得多。
利用比色计(Minolta CR-300)将再生过的Sepharose的样品与再生前的Sepharose比较以量化色差，参见表10中的结果。
表10.当作为浆料用甲酸的再生溶液再生时对DEAE Sepharose再生的评价
  分析的Sepharose材料            色坐标
  L(浅色)  A(红色)   b(黄色)
  用过的硅胶，再生前   68.81  2.37   17.22
  用过的硅胶，3小时再生后   84.99  0.66   11.55
  用过的硅胶，24小时再生后   87.94  0.35   7.64
  用过的硅胶，24小时再生后，此处，在12小时应用了新鲜再生溶液   85,85  0.69   8.81
  未用过的硅胶，即，从未用于色谱法的硅胶   86.44  -0.06   2.01
实施例74
含胰高血糖素聚集体的用过的硅胶的再生
胰高血糖素和胰高血糖素样肽(GLP-1和GLP-2)特别容易聚集，此时它们形成纤丝，即，β-片层结构的聚集体。在该实施例中，进行了一个模型试验，其中，将人胰高血糖素负载在二氧化硅柱上(如实施例1～68中所述)。让胰高血糖素溶液在30℃下的柱中静置3天以便模拟胰高血糖素的工业生产过程中遇到的问题而引起压力和性能问题。应用如实施例69中所述的洗脱剂2在22℃下以9mL/min的流速，测得柱上的压力为3.5MPa。
在应用甲酸(100％)的一个再生循环后，柱上的压力减小到2.67MPa，说明了甲酸作为再生溶液的效能。
实施例75
柱使用寿命-含0.1M NaOH和60％w/w乙醇水溶液的再生溶液
如实施例70中所述那样进行了该试验，不同的是，该试验中的再生溶液是常用于再生色谱固定相的碱性乙醇。
再生溶液的流速约为0.1mL/min，4天后终止了这些试验，因为柱上的压力都＞10MPa。直到柱失灵时的结果都示于表11中。
表11.用含0.1M NaOH和60％w/w乙醇水溶液的再生溶液长时间再生期间柱使用寿命的评价
  柱类型   柱编号   期间(天)   测定的C(％)   测定的Si(mg)   体积(mL)   相对C(％)
  200ODDMS4.0*250mm   0204630/26204630/25204630/24   0124   9.809.809.779.59   0,016.227.031.9   0116180228   10010099.797.9
实施例76
XAD 1180的再生
用于从澄清的发酵液浓缩胰岛素前体的反相聚合树脂XAD 1180的使用寿命由于疏水性杂质例如来自发酵液的有色化合物、肽和消泡剂的严重积聚而受限制。常规再生循环基于用含80％乙醇于0.1M柠檬酸，pH3.0中的再生溶液洗涤，随后与5％NaOH溶液一起在80℃下加热。该再生方法不能有效地除去积聚的杂质。
通过采用不同浓度和接触时间的乙醇和异丙醇、以静态方式进行的试验评价了从用过的树脂除去结合的消泡剂(Pluronic PE 6100和P2000)并且与甲酸再生进行比较(表12)。甲酸处理在除去吸附的杂质方面优于标准工业再生溶剂。
表12.不同的再生溶液在从用过的XAD 1180色谱固定相除去吸附的消泡剂杂质中的效率
  再生溶剂   浓度   时间(小时)   温度(℃)   树脂上消泡剂的浓度(ppm)
  乙醇   84％   2   25   20023
  乙醇   92％   2   25   13058
  乙醇   99％   2   25   8042
  乙醇   84％   6   25   25083
  乙醇   84％   2   50   14712
  乙醇   99％   6   50   9911
  异丙醇   70％   2   25   15899
  异丙醇   99％   2   25   3262
  甲酸   99％   2   25   670

Claims (45)

1.一种再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约75％w/w的水的再生溶液接触。
2.一种再生色谱固定相的方法，其中，将所述色谱固定相与含有至少一种有机酸和少于约1％w/w的水的再生溶液接触。
3.权利要求1～2任一项的方法，其中，所述有机酸的浓度至少约为25％w/w。
4.权利要求1～3任一项的方法，其中，所述有机酸是甲酸。
5.权利要求1～3任一项的方法，其中，所述有机酸是乙酸。
6.权利要求1～5任一项的方法，其中，所述再生溶液含有有机溶剂。
7.权利要求6的方法，其中，所述有机溶剂是乙醇。
8.权利要求6的方法，其中，所述有机溶剂是2～丙醇。
9.权利要求6的方法，其中，所述有机溶剂是乙腈。
10.权利要求6的方法，其中，所述有机溶剂选自甲醇、1-丙醇和己二醇。
11.权利要求1～10任-项的方法，其中，所述再生溶液含有少于0.5％的水，优选少于0.1％的水，更优选少于0.02％的水，而最优选少于0.001％的水。
12.权利要求1～11任一项的方法，其中，将所述色谱固定相与所述再生溶液在色谱柱内接触。
13.权利要求12的方法，其中，将所述色谱固定相再生而没有再填充所述色谱柱。
14.权利要求12的方法，其中，在所述再生过程中将色谱固定相流化。
15.权利要求12～14任一项的方法，其中，在将所述色谱固定相与所述再生溶液接触之前用水混溶性有机溶剂置换色谱洗脱剂或平衡缓冲液。
16.权利要求15的方法，其中，所述有机溶剂也存在于色谱洗脱剂或平衡缓冲液中。
17.权利要求15～16任一项的方法，其中，所述水混溶性有机溶剂也存在于再生溶液中。
18.权利要求1～11任一项的方法，其中，将所述色谱固定相与所述再生溶液在色谱柱外接触。
19.权利要求1～18任一项的方法，其中，所述色谱固定相是RP-HPLC基体。
20.权利要求1～17任一项的方法，其中，所述色谱固定相是二氧化硅或取代的二氧化硅物质。
21.权利要求20的方法，其中，所述色谱固定相是C16或C18取代的二氧化硅。
22.权利要求20的方法，其中，所述色谱固定相是C4、C8或苯基取代的二氧化硅。
23.权利要求20的方法，其中，所述色谱固定相是聚合材料。
24.权利要求1～23任一项的方法，其中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触至少1秒，优选至少1分钟，更优选至少5分钟，例如1分钟～24小时，1分钟～5小时，1分钟～2小时，10分钟～60分钟。
25.权利要求1～13任一项的方法，其中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触直到常规流速下通过色谱柱长度的压力降减小至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。
26.权利要求1～25任一项的方法，其中，所述色谱固定相与所述再生溶液的接触是在约5℃～50℃，优选10℃～40℃，更优选15℃～30℃，例如18℃～25℃范围内的温度下进行的。
27.权利要求1～26任一项的方法，其中，所述色谱固定相的使用寿命是至少500次色谱循环，优选至少700次色谱循环，更优选至少1000次色谱循环，最优选至少2000次色谱循环。
28.权利要求1～27任一项的方法，其中，每次色谱循环都将所述方法应用于所述色谱固定相，每2次色谱循环至少应用一次，每5次色谱循环至少应用一次，每20次色谱循环至少应用一次，每50次色谱循环至少应用一次，或者每100次色谱循环至少应用一次。
29.一种生产治疗用多肽或其前体的方法，它包括至少一个色谱处理步骤，其中，通过权利要求1～28任一项的方法将色谱固定相再生。
30.权利要求29的方法，其中，所述治疗用多肽是含有一个亲脂取代基的衍生物。
31.权利要求29的方法，其中，所述治疗用多肽选自下组物质：胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、exendin-4、TFF肽、人胰岛素、它们的类似物和衍生物。
32.权利要求29的方法，其中，所述多肽或其前体选自下组物质：Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰)))-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、exendin-4、Lys17Arg30-GLP-2(1-33)、Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-十六烷酰))GLP-2(1-33)和Gly2-GLP-2(1-33)。
33.权利要求29的方法，其中，所述多肽或其前体选自下组物质：
苏氨酸甲酯B30人胰岛素，
苏氨酸乙酯B30人胰岛素，
AspB28人胰岛素，
苏氨酸甲酯B30AspB28人胰岛素，
苏氨酸乙酯B30AspB28人胰岛素，
LysB28ProB29人胰岛素，
MetB-1ArgB0LysB28ProB29人胰岛素原，
LysB3GluB29人胰岛素，
GlyA21ArgB31ArgB32人胰岛素，
des(B30)人胰岛素，
NεB29-十四烷酰des(B30)人胰岛素，
NεB29-石胆酰-γ-谷氨酰des(B30)人胰岛素，
NεB29-辛酰des(B30)人胰岛素，以及
NεB29-辛酰人胰岛素。
34.权利要求1～33任一项的方法在减小通过色谱柱长度的压力降中的应用。
35.权利要求1～28任一项的方法在生产治疗用多肽中的应用。
36.通过将色谱固定相与再生溶液接触再生的色谱固定相，所述再生溶液含有至少一种有机酸和少于约1％w/w的水。
37.通过将色谱固定相与再生溶液接触再生的色谱固定相，所述再生溶液含有至少一种有机酸和少于约75％w/w的水。
38.已通过权利要求1～33任一项的方法再生的色谱固定相。
39.权利要求36～38任一项的色谱固定相，其中，所述色谱固定相是二氧化硅或取代的二氧化硅物质。
40.通过一种方法生产的多肽产品，所述方法包括下列步骤：
a)应用权利要求36～39任一项的色谱固定相纯化多肽或其前体，以及
b)分离所述多肽或其前体而给出所得的多肽产品。
41.通过一种方法生产的多肽产品，所述方法中应用了权利要求36～39任一项的色谱固定相。
42.用来实施权利要求1～33任一项的方法的自动化色谱处理设备，它包括管道和控制***。
43.通过一种方法制备的药物组合物，所述方法包括下列步骤：
a)首先应用通过权利要求1～33任一项的方法再生的色谱固定相纯化多肽或其前体，
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物上可接受的赋形剂掺和。
44.通过一种方法制备的药物组合物，所述方法包括下列步骤：
a)首先应用通过权利要求1的方法再生的色谱固定相纯化多肽或其前体，
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物上可接受的赋形剂掺和。
45.通过一种方法制备的药物组合物，所述方法包括下列步骤：
a)首先应用通过权利要求11的方法再生的色谱固定相纯化多肽或其前体，
b)然后干燥所述多肽，以及
c)最后与药物上可接受的赋形剂掺和。
CN2004800092934A 2003-04-08 2004-04-02 包括至少一个色谱处理步骤的生产治疗用多肽或其前体的方法 Expired - Lifetime CN1771080B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200300536 2003-04-08
DKPA200300536 2003-04-08
DKPA200400098 2004-01-26
DKPA200400098 2004-01-26
PCT/DK2004/000234 WO2004089504A1 (en) 2003-04-08 2004-04-02 Regeneration of chromatographic stationary phases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1771080A true CN1771080A (zh) 2006-05-10
CN1771080B CN1771080B (zh) 2010-12-15

Family

ID=36118397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800092934A Expired - Lifetime CN1771080B (zh) 2003-04-08 2004-04-02 包括至少一个色谱处理步骤的生产治疗用多肽或其前体的方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20060102561A1 (zh)
KR (1) KR101198346B1 (zh)
CN (1) CN1771080B (zh)
BR (1) BRPI0408978B8 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102460147A (zh) * 2009-06-24 2012-05-16 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 可重复使用的色谱设备的鉴定
CN105424839A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 袁泳 高效液相色谱仪中反相填料柱的再生方法
CN105848746A (zh) * 2013-09-05 2016-08-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于层析重复利用的方法
CN105964606A (zh) * 2016-04-22 2016-09-28 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 延长色谱柱使用寿命的清洗方法
CN109011698A (zh) * 2018-08-25 2018-12-18 江苏曼氏生物科技股份有限公司 一种硅胶填料分离柱在线清洗及储存方法
CN112843789A (zh) * 2020-12-29 2021-05-28 上海赛梵科分离技术有限公司 ***二酚纯化中色谱填料和层析介质的再生方法
CN112933660A (zh) * 2020-09-11 2021-06-11 石家庄新奥环保科技有限公司 一种离子色谱保护柱再生方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007121271A (ja) * 2005-09-30 2007-05-17 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの測定方法及び測定のための装置
WO2010066676A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Upfront Chromatography A/S Method of removal of unbound, entrained and/or non-specifically adsorbed material from an affinity chromatography column
SG11201506804VA (en) 2013-03-21 2015-09-29 Sanofi Aventis Deutschland Synthesis of hydantoin containing peptide products
MX365465B (es) 2013-03-21 2019-06-04 Sanofi Aventis Deutschland Sintesis de productos peptidicos que contienen imida ciclica.
KR20230142566A (ko) * 2021-02-02 2023-10-11 바이오콘 바이오로직스 리미티드 실리카 기반 역상 크로마토그래피 물질의 재생 공정
WO2022236085A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Genzyme Corporation Composition and methods for sanitization

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4164481A (en) * 1978-01-27 1979-08-14 The Dow Chemical Company Process of regenerating a noble metal catalyst used in the reduction of organic nitro compounds
SU1270689A1 (ru) 1984-12-17 1986-11-15 Предприятие П/Я В-8644 Способ регенерации хроматографической колонки
US5077276A (en) * 1985-08-22 1991-12-31 Gropep Pty Ltd Growth factor
EP0420964A4 (en) 1989-04-11 1991-09-25 Immunobiology Research Institute, Inc. Lyophilized peptide formulations
DE4028120C2 (de) 1990-09-05 1996-09-19 Hoechst Ag Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten
US5837826A (en) * 1995-02-27 1998-11-17 Regents Of The University Of Minnesota Protein adsorption by very dense porous zirconium oxide particles in expanded beds
US6852690B1 (en) * 1995-08-22 2005-02-08 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Method and composition for enhanced parenteral nutrition
US6115233A (en) 1996-06-28 2000-09-05 Lsi Logic Corporation Integrated circuit device having a capacitor with the dielectric peripheral region being greater than the dielectric central region
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
DE19652713C2 (de) 1996-12-18 2001-11-22 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher
JPH10221323A (ja) * 1997-02-10 1998-08-21 Teijin Ltd 吸着カラムの連続使用方法及び装置
WO1998043738A1 (en) * 1997-03-31 1998-10-08 Battelle Memorial Institute Apparatus and method for ammonia removal from waste streams
DE69916811T2 (de) 1998-02-27 2005-04-14 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivate mit einem helix-gehalt über 25 %, die partiell strukturierte mizellenartige aggregate bilden
JP2002504527A (ja) 1998-02-27 2002-02-12 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 部分的に組織化したミセル様凝集物を形成する２５％を越えるヘリックス成分を有するｇｌｐ−２誘導体
ES2249933T3 (es) 1998-12-22 2006-04-01 Eli Lilly And Company Formulacion autoestable de peptido 1 tipo glucagon.
CN101181236A (zh) 1999-01-14 2008-05-21 安米林药品公司 新型exendin激动剂制剂及其给药方法
US6248683B1 (en) 1999-04-07 2001-06-19 Silicycle Inc. Process for the regeneration of used silica gel
WO2000069911A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
NZ517632A (en) 1999-08-09 2004-02-27 Pharmacia & Upjohn Spa Formulations for parenteral use of estramustine phosphate and albumin
JP2001133446A (ja) 1999-08-20 2001-05-18 Sekisui Chem Co Ltd 液体クロマトグラフ装置及びこれに用いる洗浄液
ATE298889T1 (de) 1999-10-08 2005-07-15 Vi Technologies Inc Von isoagglutinin befreite blutzusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung
JP4473999B2 (ja) 2000-01-17 2010-06-02 積水化学工業株式会社 カラム洗浄液
US6550320B1 (en) 2000-05-31 2003-04-22 Continental Ag System and method for predicting tire forces using tire deformation sensors
EP1319067A2 (en) 2000-09-13 2003-06-18 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
IL155812A0 (en) 2000-12-07 2003-12-23 Lilly Co Eli Glp-1 fusion proteins
CA2439455A1 (en) * 2001-02-28 2002-09-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Method for regenerating adsorbent
JP2002265383A (ja) 2001-03-14 2002-09-18 Mitsubishi Pharma Corp インターフェロンα注射用液状製剤
FI20010977A (fi) * 2001-05-09 2002-11-10 Danisco Sweeteners Oy Kromatografinen erotusmenetelmä
DK1412384T3 (da) 2001-06-28 2008-04-28 Novo Nordisk As Stabil formulering af modificeret GLP-1
WO2003074526A2 (en) * 2002-02-28 2003-09-12 Mallinckrodt Inc. Method and system for separation and purification of at least one narcotic alkaloid using reverse phase preparative chromatography
WO2003103572A2 (en) 2002-06-04 2003-12-18 Eli Lilly And Company Modified glucagon-like peptide-1 analogs
EP1545574B8 (en) * 2002-09-13 2014-09-24 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
DE10347975B4 (de) 2002-10-24 2008-10-09 Siemens Ag Einrichtung der programmierbaren Logik
RU2239827C1 (ru) 2003-05-12 2004-11-10 Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии Восстановление аналитических и препаративных колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии (вэжх)
EP1506809A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-16 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Regeneration of hydrolysis sensitive adsorbent matrices
US7449116B2 (en) * 2004-10-01 2008-11-11 Agilent Technologies, Inc. Methods and systems for protein separation

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102460147A (zh) * 2009-06-24 2012-05-16 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 可重复使用的色谱设备的鉴定
CN105848746A (zh) * 2013-09-05 2016-08-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于层析重复利用的方法
US10940401B2 (en) 2013-09-05 2021-03-09 Genentech, Inc. Method for chromatography reuse
CN105424839A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 袁泳 高效液相色谱仪中反相填料柱的再生方法
CN105964606A (zh) * 2016-04-22 2016-09-28 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 延长色谱柱使用寿命的清洗方法
CN109011698A (zh) * 2018-08-25 2018-12-18 江苏曼氏生物科技股份有限公司 一种硅胶填料分离柱在线清洗及储存方法
CN109011698B (zh) * 2018-08-25 2020-12-01 江苏曼氏生物科技股份有限公司 一种硅胶填料分离柱在线清洗及储存方法
CN112933660A (zh) * 2020-09-11 2021-06-11 石家庄新奥环保科技有限公司 一种离子色谱保护柱再生方法
CN112843789A (zh) * 2020-12-29 2021-05-28 上海赛梵科分离技术有限公司 ***二酚纯化中色谱填料和层析介质的再生方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20080312131A1 (en) 2008-12-18
US20060102561A1 (en) 2006-05-18
US9364772B2 (en) 2016-06-14
CN1771080B (zh) 2010-12-15
BRPI0408978B8 (pt) 2021-07-27
KR20060015496A (ko) 2006-02-17
BRPI0408978A (pt) 2006-04-04
KR101198346B1 (ko) 2012-11-06
BRPI0408978B1 (pt) 2018-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1198844C (zh) 高***蛋白生产方法
CN1088456C (zh) 取代的噁唑烷需钙蛋白酶和/或组织蛋白酶b抑制剂
CN1771080A (zh) 色谱固定相的再生
CN1132845C (zh) 获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素前体的改进的方法
CN1051317C (zh) 用置换色谱纯化血红蛋白产物的方法
CN1231478C (zh) 光学活性的哌啶中间体的制备方法和该中间体
CN1069736A (zh) 新的同配多肽
CN1543471A (zh) 糖链天冬酰胺衍生物的制备方法
CN1106003A (zh) 微粒体甘油三酯转移蛋白的抑制剂和方法
CN1061224A (zh) 吲哚和苯并咪唑取代的咪唑以及苯并咪唑衍生物的制备方法
CN101068833A (zh) 产生羧基端酰胺化肽的方法
CN1990486A (zh) N－氨基乙酰基－吡咯烷－2－腈和它们作为ddp－iv抑制剂的用途
CN1047078A (zh) 用作兴奋性基酸神经递质拮抗物和/或钙通道阻滞剂的聚胺和多肽
CN101052449A (zh) 从液体混合物中分离靶分子的方法和装置
CN1628129A (zh) 蛋白质制剂的稳定化
CN1159286C (zh) 1-烷氧羰基-3-苯丙基衍生物的制备方法
CN1057535C (zh) 生产疏水多肽、蛋白质或肽的方法
CN1131420A (zh) 无水结晶霉酚酸2-(4-吗啉代)乙酯(mycophenolate mofetil)及其静脉用制剂
CN1057099C (zh) 新的合成肽，其中间体及其生产方法
CN1637017A (zh) 维生素d衍生物结晶及其制备方法
CN1025676C (zh) 非肽的血管紧张肽原酶抑制剂的制备
CN1031267C (zh) 具有抗痴功效的血管紧张素转化酶抑制剂的制备方法
CN1865283A (zh) 固相多肽合成鲑鱼降钙素的制备方法
CN1781938A (zh) 制备棘白菌素衍生物的方法
CN1242062C (zh) 生产等电点高于8或低于5的多肽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20101215