CN1764481A - 细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了细胞制剂，能够用于病人的分泌生物学活性因子诸如激素或蛋白的细胞可以长期稳定地保持在聚乙烯醇中，本发明还提供了细胞制剂的生产方法以及通过给病人施用细胞制剂预防以及治疗内分泌/代谢疾病，血友病，骨疾病或癌症的方法。
Description
技术领域
本发明涉及可用于人或者动物的药物组合物的细胞制剂。尤其是，本发明涉及的细胞制剂中细胞能够产生/分泌可用于活体的生物学活性因子诸如激素以及蛋白，或者细胞能够对可以稳定地保留持续时间段的有害物质解毒，从而显示出通过施用于病人预防/治疗内分泌/代谢疾病，血友病，骨疾病或者癌的效力。
背景技术
生物人造器官是通过包含活细胞以及生物组织以及提供病人所需的代谢功能，更具体地，调节病人代谢功能的生物学活性因子诸如激素以及蛋白预防或者治疗病人疾病的装置。同具有免疫抑制剂的副作用以及供体需求与供给的问题的活的供体器官移植以及比较，生物人造器官可以通过通过免疫分离膜保护细胞来自活体的防御机制，并且优点在于不仅可用于异体移植而且可用于不用免疫抑制剂的异种移植。
生物人造器官可以通过改变其中所含的细胞种类治疗任何种类的疾病。例如，生物人造胰岛中包括胰岛素分泌细胞，例如胰岛细胞，并且用于给患者提供从胰岛细胞分泌的胰岛素使血糖水平正常化。产生凝血因子的生物人造器官中包括产生凝血因子的肝细胞并且用于治疗由于VIII因子或者XI因子的不足引起血液凝固失调的血友病。此外，产生生长激素的生物人造器官中包括分泌生长激素(hGH)细胞并且用于垂体性侏儒等由生长激素分泌不足所引起的疾病的治疗。同样，给生物人造器官添加分别分泌甲状旁腺激素以及红细胞生成素的细胞可以用于治疗诸如甲状旁腺功能减退以及贫血的其它疾病。
生物人造器官可以形成多种形状。例如微胶囊形状以及用高分子聚合物包封细胞的大胶囊形状。其特征在于其中包含的细胞通过高分子聚合物的膜交联结构抵抗活体的防御机制并且从细胞分泌的激素等通过利用高分子聚合物的分子渗透性提供给活体。
近年来用于微胶囊型人造器官等的高分子聚合物聚乙烯醇(在下文称为PVA)引起了人们的注意。聚乙烯醇通常被用于食品以及医药领域，更具体地用作外科缝合线，与食物接触的容器等等。同样，使用PVA用于人造关节软骨材料的技术已经公开(例如非专利文献No.1)并且在临床领域(例如非专利文献No.2)中已经高度评价了其安全性。
PVA通过化学或者物理处理变成凝胶并且形成任何形成。作为化学处理，通常采用向含PVA(例如非专利文献No.3)的水溶液添加戊二醛(交联剂)以及盐酸(催化剂)的方法，向玻璃板等施加含PVA的水溶液并且将玻璃板浸入水Na2SO4/KOH溶液的方法(例如非专利文献No.4)等等。同样，所使用的物理处理通常可以包含在-80℃猝灭含PVA的水溶液进行凝胶化的方法。然而，在使用PVA作为微胶囊型人造器官的高分子聚合物的情况下，这些化学或者物理处理的必要性成为了问题。
具体地，目前存在通过化学处理PVA制备PVA凝胶，形成袋状PVA凝胶膜并且将细胞置入袋内的方法。然而，对于这种方法，细胞可能由袋的封闭处理或者保留在PVA凝胶膜内的交联剂损坏或者由于细胞在袋内的凝结发生细胞坏死，其由于活细胞数目的减少或者生物活性的降低不可避免地引起激素分泌的减少。
因为不用使用化学试剂并且可以可以分散地包封在PVA凝胶内，优选物理处理因为不存在通过凝结细胞坏死的危险等等，然而有一种可能性就是细胞可能在-80℃猝灭的时候破裂。
人们希望生物人造器官内所含的细胞可以稳定地提供显示出病人所需代谢功能的生物学活性因子。因此，虽然PVA由于其特性是适合于这种微胶囊型生物人造器官的高分子聚合物，但是目前还没有建立其应用技术。因此，目前尚未出现如本发明利用PVA的有益特性并且其中细胞可以稳定地保留在PVA凝胶内的生物人造器官。
非专利文献No.1：
Kobayashi M.，et al.，Preliminary study of polyvinylalcohol-hydrogel(PVA-H)artificial meniscus，Biomaterials，2003，vol.24，p639-647
非专利文献No.2：
C.C.Demerlis et.al，Review of the oral toxicity of PVA，Food andChemical Toxicology，2003，vol.41，p319-326
非专利文献No.3：
Krystyna Burczak et.al，Long-term in vivo performance andbiocompatibility of PVA hydrogel macrocapsules for hybrid-type artificialpancreas，Biomaterials，1996，vol.17，p2351-2356
非专利文献No.4：
Tai-Horn Young et al.，Assessment and modeling of PVAbioartificial pancreas in vivo，Biomaterials，2002，vol.23，p3495-3501
发明内容
本发明的目的是提供可用于人并且动物的药物组合物的细胞制剂。尤其是，本发明目的在于提供一种细胞制剂，其中能够分泌可用于病人的生物学活性因子诸如激素以及蛋白的细胞可以稳定地保留在PVA内持续的时间段，所述PVA是适用于生物人造器官的高分子聚合物，本发明还提供了制备这种细胞制剂的方法。此外，本发明的另一目的是提供用于通过给病人施用细胞制剂预防以及治疗内分泌/代谢疾病，血友病，骨疾病或者癌的方法。
本发明的发明者经过广泛地研究实现了以上的目的并且已经发现可以降低PVA凝胶内细胞的死亡比以及损坏并且细胞可以通过预先用细胞防腐剂，例如Euro-Collins溶液，Cell Banker或者UW溶液，然后将PVA与细胞混合引起PVA的凝胶化，处理PVA稳定地保留在PVA内。更实际地，发现通过首先将粉末PVA溶解入液体细胞防腐剂，并将细胞分散在产生的溶液中，猝灭混合溶液中的细胞并且使PVA凝胶化，可以获得能够抑制PVA内细胞存活比减少以及生物学活性因子的分泌能力退化并且更进一步稳定地长期提供激素或者蛋白的细胞制剂。本发明的发明者基于这些发现进行了更进一步的研究并且完成了本发明。
简而言之，发明涉及
(1)细胞制剂，含有与细胞防腐剂混合的聚乙烯醇内的细胞；
(2)上述(1)所述的细胞制剂，其中细胞表面更进一步涂有细胞外基质；
(3)上述(1)或者(2)所述的细胞制剂，更进一步含有生长因子；
(4)上述(1)到(3)任一项所述的细胞制剂，其中细胞是选自如下的一种或者两种或者多种细胞：胰岛细胞，胰腺内分泌细胞，肝细胞，垂体前叶细胞，生长激素分泌细胞，骨细胞，甲状腺激素分泌细胞以及甲状旁腺激素分泌细胞；
(5)上述(1)到(4)任一项所述的细胞制剂，其中细胞用细胞防腐剂处理；
(6)上述(1)到(5)任一项所述的细胞制剂，其中的细胞是转化细胞；
(7)上述(1)到(6)任一项所述的细胞制剂，具有薄片，板，棒，管或者念珠的形状；
(8)上述(1)到(7)任一项所述的细胞制剂，其中细胞防腐液是Euro-Collins溶液，Cell Banker，或者UW溶液；
(9)上述(1)到(8)任一项所述的细胞制剂，其通过皮下，肌内或者腹膜内移植给哺乳动物；
(10)预防以及治疗内分泌或者代谢疾病的方法，包括使用上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂；
(11)上述(10)所述的预防以及治疗内分泌或者代谢疾病的方法，其中内分泌或者代谢疾病是糖尿病或者垂体性侏儒；
(12)预防以及治疗血友病的方法，包括使用上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂；
(13)预防以及治疗骨疾病的方法，包括使用上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂；
(14)预防以及治疗癌症的方法，包括使用上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂；
(15)预防以及治疗肝功能不全或者先天性代谢缺陷的方法，包括使用上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂；
(16)制备细胞制剂的方法，包括将细胞防腐剂与聚乙烯醇混合，以及将细胞与聚乙烯醇混合，以及使包含所产生的细胞的聚乙烯醇凝胶化；以及
(17)上述(1)到(9)任一项所述的细胞制剂，其是用于人或者动物使用的药品。
附图说明
图1是显示薄片状胰岛细胞制剂生产方法的示意图。
图2是显示培养1天后制造实施例1，比较实施例1或者游离胰岛细胞的活细胞的回收率的试验结果的图。
图3是显示培养1天后制造实施例1，比较实施例1或者游离胰岛细胞的胰岛素含量的试验结果的图。
图4是显示随着时间的推移制造实施例1，比较实施例1或者胰岛细胞的胰岛素分泌的试验结果的图。
图5是随时间的推移观察到的制造实施例1或者比较实施例1中胰岛细胞的显微照片。
图6是显示制造实施例2或者游离胰岛细胞的胰岛素分泌的试验结果的图。
图7是显示移植小鼠组以及患糖尿病小鼠组的存活时间的图。
图8是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组血糖水平改变的图。
图9是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组体重改变的图。
图10是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组BUN(血液尿素氮)水平改变的图。
图11是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组肌酸酐水平改变的图。
图12是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组24小时尿量的改变的图。
图13是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组24小时葡萄糖排出量的改变的图。
图14是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组尿酮水平的改变的图。
图15是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组24小时尿白蛋白排出量的改变的图。
图16是显示移植小鼠组，患糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组1，5-AG水平的改变的图。
上述图中，参考数字1表示胰岛细胞；2表示PVA+EC溶液；3表示PVA+EC凝胶；4以及6表示网孔薄片；5以及7表示玻璃板；以及8表示包含胰岛细胞的薄片状细胞制剂。
本发明的最佳实施方式
本发明的特征在于包含与细胞防腐剂混合的PVA中的细胞制剂并且包含在PVA内可用于病人的产生/分泌生物学活性因子诸如激素以及蛋白的细胞。
用于本发明的PVA没有特殊的限制只要不背离本发明的目的并且优选具有可足以用于滴眼剂中角膜保护器/补湿器，内科材料诸如防肠粘连膜，以及食品接触材料诸如食品包装膜的纯度。也可以包含商业化产品，以及通过由醋酸乙烯酯产生聚醋酸乙烯酯继之以水解获得的冻干产品。在生产PVA的情况下，可以根据已知的常规方法进行生产方法以及冻干燥法。PVA优选地具有约5,000到16,600的平均分子量以及约85％或者更高的皂化程度。
PVA优选地为细粒的冷冻干燥产品其很容易悬浮在诸如生理盐水以及磷酸盐缓冲液的溶液中。
与细胞防腐剂混合的PVA是指PVA内含有细胞防腐剂的PVA。用于本发明的细胞防腐剂没有特别的限制并且可以包含通常用于动物细胞防腐的溶液以及商业化防腐溶液，例如，Euro-Collins溶液，CellBanker(编码630-01601：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.Osaka，Japan)以及UW溶液(ViaSpan：Bristol-Myers Squibb Company，USA)。他们可以是商业化的或者实验室内制备的组合物。在实验室制备的情况下，优选通过将每一组分添加以及混合在蒸馏水中以及通过用过滤器对所获得的溶液过滤进行除菌进行制备。
例如，Euro-Collins溶液的组成显示在下表1中。
表1
| 组分 | g/L |
| D-葡萄糖 | 35.0 |
| K2HPO4 | 7.4 |
| KH2PO4 | 2.05 |
| KCl | 1.12 |
| NaHCO3 | 0.84 |
| 烟酰胺 | 1.22 |
同样，UW溶液(ViaSpan)的组成显示在下表2中。
表2
| 组分 | g/L |
| Pentafraction(注解1) | 50 |
| 乳糖酸 | 35.83 |
| 磷酸二氢钾 | 3.4 |
| 硫酸镁 | 1.23 |
| 棉子糖 | 17.83 |
| 腺苷 | 1.34 |
| 别嘌呤醇 | 0.136 |
| 总谷胱甘肽 | 0.922 |
| 氢氧化钾 | 5.61 |
| 氢氧化钠 | 调节到pH7.4 |
| 注射用水 | q.s. |
注解1：美国专利4,798,824
PVA中含有细胞防腐剂的PVA例如可以通过将PVA与细胞防腐剂混合产生。所产生的包括细胞防腐剂的PVA希望是无菌的。PVA和细胞防腐剂的混合方法没有特别的限制，然而例如为将商业化的粒状PVA悬浮在蒸馏水中等，将产生的PVA悬浮液通过加热和灭菌(高压灭菌等)溶解并且灭菌，以及向获得的无菌含水PVA溶液添加并且混合细胞防腐剂。加热和灭菌处理以及本身的无菌处理可以根据已知的传统方法进行。
本发明中，除了上述混合方法产生的含有细胞防腐剂的PVA可以称作用细胞防腐剂处理的PVA，因此，理所当然用细胞防腐剂处理的PVA也在本发明的范围内。
通过将含水悬浮PVA溶液和细胞防腐剂混合获得的混合溶液(在下文中，称作PVA-细胞防腐液)中PVA的含量基于PVA-细胞防腐液按重量计通常为约2到5％，更优选地约2.5到3.5％，尤其优选地约2.5到3％。因为在该浓度范围内最容易进行PVA的凝胶化，并且PVA凝胶具有将细胞包胶在本发明的细胞制备中的优选强度。如果用于保存细胞的细胞防腐剂的浓度为1时，PVA-细胞防腐液中细胞防腐剂的浓度通常为约0.8到1，更优选地约0.9到1，尤其优选地约0.95到1。因为如果浓度超出这个范围，细胞有时不能稳定地成活。因此，在本发明中，优选制备或者购买浓度为约2到10倍于正常细胞防腐液浓度的浓缩细胞防腐液，然后与上述含水悬浮PVA溶液(例如10倍高浓度细胞防腐液∶含水PVA悬浮溶液＝1∶9)适当混合获得约1浓度的含有细胞防腐剂的PVA-细胞防腐液。
本发明的细胞制剂可以此外含有用于保护细胞的二甲亚砜(DMSO)和血清白蛋白，抑制微生物污染的抗生素等，用于保持细胞活力的维生素诸如烟酰胺。此外，在本发明中，可以补充Pharmaceutical AffairsLaw通常允许的其他添加剂例如显示持续脱模性质的试剂，等渗剂，pH值校正剂等等。向细胞制剂添加这些其它添加剂的方法没有特别限制，然而优选在生产溶液时以无菌的方式将它们添加给上述PVA-细胞防腐液。其含量优选在未抑制其中所含细胞生长/存活和/或细胞分泌生物学活性因子的范围，以及不背离本发明的范围和实质的精神。
用细胞防腐剂处理的PVA如上所述以无菌的方式产生因此，本发明的细胞制剂很少被微生物污染并且可以在室温下(约15到35℃)长期保存。
用于本发明的细胞可以包括胰岛细胞，胰腺内分泌细胞，肝细胞，垂体前叶细胞，生长激素分泌细胞，骨细胞，甲状腺激素分泌细胞以及甲状旁腺激素分泌细胞。这些细胞优选地来源于哺乳动物诸如人类，猪，大鼠以及小鼠，以及那些产生/分泌对病人有效的生物学活性因子诸如激素以及蛋白质的哺乳动物。细胞类型的选择优选地取决于接收细胞制剂的病人的疾病类型。例如，产生胰岛素的胰岛细胞或胰腺内分泌细胞优选用于糖尿病患者等等；产生用于血友病患者等的凝血因子的肝细胞等；产生用于垂体性侏儒症病人等的垂体前叶细胞以及生长激素分泌细胞等；以及用于遭受诸如骨折的骨疾病的病人的产生骨形态发生蛋白(BMP)的骨细胞。通过遗传重组能够产生大量肿瘤生长抑制物质的转化细胞可以被用于癌症病人。此外，能够选择性代谢以及解毒有害代谢物的细胞可被用于患有由于肝功能不全，肾机能不全或先天性代谢缺陷积累有害代谢产物的疾病的病人。在患者因为患有多种疾病需要多种生物学活性因子的患者，可以组合两种或多种上述细胞。可以提供对上述病人有效的生物学活性因子因为本发明包括这些细胞。因此，本发明的细胞制剂的使用可以预防或治疗各种可通过供应生物学活性因子或解毒有害的代谢物治疗的疾病。
上述用于本发明的细胞可以是实验室建立的细胞系或从活体组织分离的细胞，然而它们优选地为分化但未***的细胞因为分化但未***的细胞比未分化的***细胞更可能产生/分泌靶激素以及蛋白。
从生命组织分离细胞的方法没有特别限制，并且可以采用已知的传统方法。例如，已知的方法包括通过正确方法提取组织，用中性蛋白酶，EDTA等然后用胰蛋白酶处理组织最终分离单细胞的方法。
在用于本发明的细胞为胰岛细胞的情况下，可以通过已知的胶原酶处理的分离方法进行从生命组织分离细胞，例如J.Adam Van DerVliet等，Transplantation，45(2)，p493-495(1988)。
在用于本发明的细胞为胰腺内分泌细胞的情况下，例如可以根据日本专利申请2001-231548描述的方法进行分离。
以上述方法从生命组织分离的细胞优选地不含病原体诸如病原性的病毒。
优选地，实验室已经建立的细胞以及获自生命组织待的细胞在传代培养重复2或3次后培养在合适的培养基中直至铺满并且用于本发明。例如，在用于本发明的细胞是胰岛细胞或胰腺内分泌细胞(在下文中称为胰腺内分泌细胞等等)时，这些细胞优选地在补充有10％胎牛血清(在下文中缩写为FBS)以及烟酰胺(Sigma，St.Louis，MO，USA)的CMRL-1066培养基中进行传代培养。通过已知方法诸如胰蛋白酶处理或胶原酶处理再次将传代培养的细胞分离成单细胞用作本发明的细胞。
用于本发明的细胞可以为转化细胞，其中导入了编码病人所需的生物学活性因子诸如激素或蛋白的基因。转化细胞的应用使有效地大量生产靶生物活性因子成为可能。编码这些生物学活性因子的基因的碱基序列已经公开，并且这些基因包括例如，例如获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或容易商业获得的基因，以及通过从已知序列产生寡核苷酸探针并且使用所述探测通过已知的传统方法例如PCR扩增法以及DNA合成法实施合成获得的合成基因。例如，使用包含编码肿瘤生长抑制蛋白基因的转化细胞可以使使用本发明的细胞制剂预防以及治疗癌症成为可能。
尽管对导入编码上述生物学活性因子肽的基因的宿主细胞没有特别的限制，可以采用用于遗传重组技术领域通常使用的已知的常规宿主细胞。作为除了上述胰岛细胞，胰腺内分泌细胞，肝细胞，垂体前叶细胞，生长激素分泌细胞以及骨细胞外的宿主细胞，还有例如猴COS-7细胞，Vero细胞，中国仓鼠CHO细胞(在下文中缩写为CHO细胞)，dhfr基因缺陷的中国仓鼠CHO细胞(在下文中缩写为CHO(dhfr-)细胞)，小鼠BALB/3T3细胞，小鼠L细胞，小鼠AtT-20细胞，小鼠C127细胞，小鼠骨髓瘤细胞，大鼠GH3细胞，人HeLa细胞，人FL细胞等等。
将基因导入本发明使用的细胞的方法没有特别限制并且可以通过已知的常规方法进行。例如，将基因导入重组表达载体诸如质粒或病毒，以及人工载体诸如脂质体以及微胶囊的传统已知方法。就使用重组载体来说，适用的方法例如为感受态细胞法(J.Mol.Biol.，53，p154(1970))，DEAE葡聚糖法(Science，215，p166(1982))，体外包装法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，72，p581(1975))，病毒载体法(Cell，37，p1053(1984))，显微注射法(Exp.Cell.Res.，153，p347(1984))，电穿孔法法(Cytotechnology，3，p133(1990))，磷酸钾法(Science，221，p551(1983))，脂转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，p7413(1987))，原生质体法(日本专利申请公开63-2483942，Gene，17，p107，(1982)，Molecular&General Genetics，168，p111(1979))。
尽管对将基因导入宿主细胞的载体没有特别限制，可以使用任何表达载体，只要能在其所导入的细胞中表达目的基因并且可以有效地产生生物学活性因子的肽。例如，动物病毒诸如噬菌体，例如λ噬菌体，腺病毒，腺病毒相关病毒(AAV)，逆转录病毒，痘病毒，疱疹病毒，单纯疱疹病毒，慢病毒(HIV)，仙台病毒，Epstein-Barr病毒(EBV)，牛痘病毒，脊髓灰质炎病毒，辛德毕斯病毒，SV40以及pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo，等等。
用于本发明的细胞优选地通过下列技术包含于PVA中。
将细胞添加并且混入上述产生的PVA-细胞防腐液中。待添加并且混合的细胞优选地预先用细胞防腐剂处理。事实上，细胞优选地预先悬浮在细胞防腐剂中并且通过离心然后与PVA-细胞防腐液混合。本发明细胞制剂中所含细胞的数目不能概括，因为它取决于所施用细胞制剂的病人的疾病类型以及程度，因此优选由医生确定细胞的数目。PVA细胞防腐液中细胞的数目优选地为约1×107到5×107个细胞/ml。调整细胞的数目在使细胞均匀地分散在PVA凝胶中并且细胞可以稳定地存活长持续时间又不由于细胞凝聚抑制氧以及营养素供应到细胞的范围。
同时，为了将用于本发明的细胞保持在稳定条件使得生物学活性因子的供应最佳化，本发明的细胞制剂此外可以包含粘多糖诸如透明质酸，软骨素硫酸，以及dermatanic酸；包含一或多种物质诸如erastin，骨胶原以及血纤维蛋白的胞外基质；和/或生长因子诸如肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，***(IGF)以及生长激素(GH)。可以包含一或多种这些生长因子。本发明中添加胞外基质和/或生长因子的方法可以是包括如下步骤的方法，例如将细胞浸入包含胞外基质以及生长因子的细胞培养基中用于在将上述PVA-细胞防腐液与细胞混合之前在细胞表面上形成胞外基质，或预先在PVA-细胞防腐液中添加胞外基质以及生长因子的方法等等。本发明细胞制剂中上述胞外基质以及生长因子的含量没有特别限制，然而必需在不抑制细胞维持以及生物学活性因子的分泌功能的范围内并且优选地在引起延长细胞存活时间以及延伸生物学活性因子分泌时间的效果的范围内。
本发明的细胞制剂可以通过将PVA-细胞防腐液与细胞混合，然后冷却细胞混合溶液(在下文中称为含有细胞的PVA-细胞防腐液)，以及胶凝PVA产生。优选地通过将溶液保持在超低温约-20到-80℃约半天到3天的容器或超低温度约-80℃约18到30小时的容器中进行。
在本发明中，因为细胞防腐剂预先与PVA混合，即使在上述温度进行淬灭，可以抑制细胞坏死或损伤。此外，细胞可以分散的方法含在PVA凝胶中并且可以预防细胞的凝聚。
由于PVA的凝胶化，本发明的细胞制剂可以形成不同的形状诸如薄片，板，棒，管或者念珠状。例如，上述含有PVA-细胞防腐液的细胞被施用于玻璃板上并且连同玻璃板冷却产生薄板形式的细胞制剂。具有目的厚度的细胞制剂可以通过适当调整每单位玻璃板的表面面积的含有PVA-细胞防腐液的细胞的施用剂量产生并且通常约100到300μl/mm2。
本发明的细胞制剂可以与加强材料结合使用用于加强和/或简化处理。例如，在细胞制剂以薄板形状形成以加强并且简化处理的情况下，优选地通过将含有PVA-细胞防腐液的细胞固定在由树脂等制成的网筛薄片中进行凝胶化。具体地，在图1中，例如将由PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成的网筛薄片(4)置于玻璃板(5)上并且将上述含有PVA-细胞防腐液的细胞施用于网筛薄片(4)。将另一网筛薄片(6)放置其上并且将另一个玻璃板(7)放置其上将含有PVA-细胞防腐液的细胞以及具有玻璃板(5)和(7)的网筛薄片(4)以及(6)制成夹层。当保持原样时，冷却装配体到约-20到80℃将其形成薄片状凝胶。将上述网筛薄片优选地预先浸入PVA-细胞防腐液中。
上述加强料，例如网筛薄片优选地为对生物体安全的材料，即体内不可分解以及生物适合性优异的材料诸如PET等。因为如果本发明细胞制剂中的网筛薄片体内分解，就会发生细胞制剂与生命组织的粘连不仅使得细胞制剂有时难以维持长持续时间的效果而且对活体有害。当然，更不要说生物体中无害的的加强材料了，即使它们在体内分解也可用于本发明。
冷冻状态的细胞制剂优选地在冷冻状态激活后施用于生物体。优选地通过解冻细胞并在适当的培养基中再次培养进行冷冻细胞制剂中细胞的激活。尤其地，通过将冷冻状态的细胞制剂快速浸入在约37℃的细胞培养基诸如CMRL-1966中，并且在新培养基中再次培养解冻细胞约24小时进行此种激活。在细胞制剂含有DMSO的情况下，优选解冻细胞制剂用新的细胞防腐溶液例如UW溶液等冲洗，并且进一步浸于约4℃UW溶液中约24小时从凝胶中除去DMSO。更不必说在上述方法中解冻以及不含DMSO的细胞制剂也包含在本发明的细胞制剂内。
通过上述方法获得的细胞制剂的施用于生物体的方法取决于待施用病人疾病的类型、患处和严重性而不同，并且因此优选地由医生确定。在下文中，描述了优选的施用方法。
本发明细胞制剂施用的对象包括人以及除了人的哺乳动物，例如狗、猫、猴、兔、小鼠等等。
如上所述，本发明的细胞制剂可以适合于生物体施用位点的形式施用。此外，本发明的细胞制剂可以直接接触的方式移植到感染组织的施用位点，并且可以用相对轻微的侵入方式移植在皮下组织或肌肉中。例如，将管状的细胞制剂切成小片段并且通过使用外科缝针移植在皮下组织中，或者细胞制剂可以通过用细胞制剂填充的注射器注射在肌肉和皮下组织中。细胞制剂很容易从施用位点回收。在细胞制剂移植在皮下组织和肌肉中的情况下，如果移植位点中血管分布稀疏并且被认为难以供应用于细胞生长以及存活的氧气和营养素，可以连同已知的适当血管生成诱导物进行移植。血管生成诱导物可以预先添加在细胞制剂中或者可以单独施用。
从本发明的细胞制剂供应给患者的生物学活性因子诸如激素以及蛋白的剂量可以由医生考虑到所采用细胞分泌生物学活性因子以及移植期间细胞成活率的改变适当确定。例如，如果患者患糖尿病，预先体外测定待使用的细胞，例如胰岛分泌细胞胰岛素的分泌并且根据胰岛素分泌，细胞的数目，施用时间，以及细胞成活率的改变确定本发明的细胞制剂的胰岛素供应量。因为本发明的细胞制剂可以稳定地将细胞保存其中长持续时间，随着时间的推移生物学活性因子的分泌的退化比率很低。因此，本发明适于提供病人所需的生物活性因子，稳定地长期产生降低移植频率的细胞制剂。
可根据适于测定这些生物活性因子的定量测定方法定量测定用于本发明细胞制剂的的生物活性因子的分泌。例如，在其中所用细胞为胰岛分泌细胞的情况下的定量测定胰岛素的方法将在下面实施例中详细地描述。
实施例
本发明通过实施例的方式进行更具体的描述。然而，其不是将本发明限定于实施例。在实施例，％是指按重量计％，除非另作说明。
实施例1
(制造实施例1)含有胰岛细胞薄片状细胞制剂的制备
(1)胰岛细胞的制备
通过下面的方法由8到10周龄和300到350g重的Wister大鼠(Shimadzu animal Co.Ltd.Kyoto，Japan)分离胰岛细胞。
首先，将10ml含有I型胶原酶(Sigma，St.Louis，MO，USA，350U/mg)和XI型胶原酶(Sigma，St.Louis，MO，USA，2,200U/mg)的800U/ml和1500U/ml的Hank’s溶液，分别注射到大鼠的胰管中，提取胰腺并在37℃酶处理15到20分钟。添加冷的Hank’s溶液终止酶反应。用移液管分散胰腺组织以及离心来回收组织颗粒，然后用Hank’s溶液冲洗组织颗粒两次。1,000rpm离心1分钟。通过800μm大小尺寸的网筛薄片过滤组织悬液。滤液回收到50ml锥形管中并且离心(1,500rpm 3分钟)来获得组织颗粒。颗粒悬浮在含有27％葡聚糖(Sigma，St.Louis，MO，USA，分子量70.000)的Hank’s溶液中以及通过不连续密度-梯度离心进行离心。在这种情况下，最低层控制为27％的葡聚糖(密度1.094g/ml)，最上层制备成23％葡聚糖(密度为1.081g/ml)和11％葡聚糖(密度为1.041g/ml)的双层。400rpm不连续密度-梯度离心4分钟并且1,700rpm进一步离心10分钟。离心后，用Pustule移液管对两个最上层之间接触面的含有胰岛细胞的组分进行取样。用CMRL-1066培养基冲洗所获得的胰岛细胞两次(1,000rpm 3分钟)。
(2)PVA-Euro-collins溶液的制备
将PVA 3g(Gunse Co.生产：PVA-180H，Lot37435)悬浮在75ml蒸馏水中，然后加热溶解和通过高压锅灭菌处理(121℃，15分钟)两次。十倍浓度的Euro-Collin溶液(在下文中缩写为EC溶液)10ml，DMSO 5ml，FBS 10ml，和烟酰胺0.122g无菌添加至以及以及与获得的无菌含水PVA溶液混合，由此来获得无菌的3％PVA-EC溶液100ml。通过在100ml蒸馏水中混合表1所示组分以及通过0.22μm网筛过滤和灭菌来制备上述10倍浓度的EC溶液。其后，在室温下保存。
(3)细胞混合
在二氧化碳气体培养箱(5％CO2，37℃)中将(1)中获得的胰岛细胞在含有10％FBS和烟酰胺1.22g/L的CMRL-1066培养基中培养24小时。将含有1,000个胰岛细胞的培养液置于1.5ml离心管中并且以800rpm离心1分钟。将0.1毫升的Cell Banker(编码630-01601：Wako PureChemical Industries，Ltd.Osaka，Japan)添加于所获得的细胞颗粒并且悬浮细胞，然后静置5分钟。通过再次离心回收细胞。回收的细胞悬浮在(2)制备的100μl无菌的3％PVA-EC溶液中来获得含有胰岛细胞的PVA-EC溶液。
(4)薄片的形成
两个10mm×10mm平方的由PET制备的网筛薄片(Gunse Co.生产：TNO 60SS)预先浸于无菌的3％含水PVA溶液中5分钟，并且将薄片(4)之一置于玻璃板(5)上。(3)中获得的含有胰岛细胞的PVA-EC溶液均匀施加到上述网筛薄片(4)上，并且在其上放置另一个网筛薄片(6)来获得由网筛薄片(4)/含有胰岛细胞的PVA-EC溶液/网筛薄片(6)组成的三层薄片。此外在其上放置另一个玻璃板(7)来通过加压获得约1mm厚的三层构造的薄片，并且通过装配主体保持在-80℃24小时同时夹在两个玻璃板之间将PVA转变为凝胶(参见附图1)。
(5)片状胰岛细胞制剂的解冻以及细胞激活
(4)中获得的冷冻的薄片状胰岛细胞制剂在37℃ CMRL-1066培养基中快速解冻。解冻的薄片状胰岛细胞制剂浸于5ml的UW溶液(ViaSpan：Bristol-Myers Squibb Company，USA)中5分钟。重复此过程3次来除去薄片中含有的DMSO。薄片进一步浸于4℃的5ml UW溶液中24小时。用CMRL-1066培养基冲洗沉浸后的制剂两次，然后培养在CMRL-1066培养基中24小时(37℃，5％CO2)来获得含有激活细胞(制造实施例1)的薄片状胰岛细胞制剂。制造实施例1用于下述测试中。根据(2)所述的不使用10mlEC溶液，5ml DMSO，10ml FBS和0.122g烟酰胺制备无菌3％含水PVA溶液，且由溶液产生的薄片状胰岛细胞制剂用作比较实施例1。
(测试实施例1)制剂中细胞稳定性的确定
制造实施例1和比较实施例1的细胞，以及游离的胰岛细胞(200个细胞)分别培养在CMRL-1066培养基中24小时(5％CO2，37℃)。使用显微镜计算活细胞的回收率(％)对培养1天后的制造实施例1和比较实施例1中活细胞的数目，以及游离胰岛细胞的数目进行计数。回收率是相对于定义为100的培养之前细胞数目的值。
结果显示于附图2中。制造实施例1中活细胞的回收率为82％，其显著高于比较实施例1(约35％)的活细胞回收率，以及高于游离细胞的活细胞回收率。
(测试实施例2)制剂中胰岛素含量的确定
制造实施例1和比较实施例1的细胞，以及游离的胰岛细胞(200个细胞)分别培养在CMRL-1066培养基中一天(5％CO2，37℃)时间。研究培养1天后相应的胰岛素量。将制造实施例1和比较实施例1的细胞以及游离的胰岛细胞回收在盐酸-EtOH中，用刮铲分别磨碎，并且凝胶和制剂中的细胞用涡旋搅拌机(-20℃，24小时)进行搅拌以及悬浮在盐酸-EtOH中。测定相应细胞悬液中的胰岛素浓度。利用商业化胰岛素测定ELISA试剂盒Lbis Insulin Kit，Shibayagi)测定胰岛素。
结果显示于图3中。制造实施例1中的胰岛素含量为约205ng/毫升，其显著高于比较实施例1(约20ng/ml)的胰岛素含量，以及与游离细胞的胰岛素含量大约相同。
(测试实施例3)制剂胰岛素分泌以及细胞状态的确定
制造实施例1和比较实施例1的细胞，以及游离的胰岛细胞(200个细胞)培养在CMRL-1066培养基中(5％CO2，37℃)并且在1天，7天和14天后回收。回收后，回收的培养产物用于葡萄糖反应试验。葡萄糖反应试验进行如下。首先，制造实施例1和比较实施例1的回收细胞，以及游离的胰岛细胞分别培养在含有3.3mM葡萄糖和0.1％牛血清蛋白(BSA)CMRL-1066培养基中1小时(5％CO2，37℃)然后用不含葡萄糖的CMRL-1066培养基冲洗。再次重复此过程，以及在含有3.3mM葡萄糖的CMRL-1066培养基中进行此过程1小时然后测定各上清液中的胰岛素浓度。然后，在含有16.7mM葡萄糖的CMRL-1066培养基中进行培养1小时然后测定各上清液中的胰岛素浓度。
结果显示于图4中。在图4中，(a)显示了培养1天后胰岛素分泌的量(浓度)；(b)显示培养7天后的结果；和(c)显示培养14天后的结果。在比较实施例1中，观察到胰岛素分泌取决于葡萄糖浓度没有增加。相反，在制造实施例1中，培养1天，7天和14天后观察到胰岛素分泌取决于葡萄糖浓度的增加。此外，在游离细胞的情况下，培养7天后取决于葡萄糖浓度的胰岛素没有增加，在制造实施例1中观察到甚至培养14天后的增加。
通过显微镜观察到的制造实施例1和比较实施例1中的细胞的结果，发现比较实施例1中的细胞从第一天已经被破坏。另一方面，观察到制造实施例1的细胞没有显著的破坏，并且发现甚至14天后细胞仍是相对稳定和成活的(附图5)。在图5中，(a)显示培养1天后细胞的图像；(b)显示培养7天后的结果；和(c)显示培养14天后的结果。
从该结果，发现在制造实施例1中胰岛细胞稳定地存活和长期稳定地维持活性并且针对葡萄糖浓度增加分泌胰岛素。因此，其证明了上述的EC溶液添加至PVA通过在PVA凝胶化时的淬火抑制了细胞坏死和损伤，且结果证明可以产生包含在PVA中并且能够保持胰岛素分泌和对葡萄糖浓度增加反应的具有高存活率胰岛细胞的细胞制剂。
实施例2
(制造实施例2)含有胰岛细胞薄片状细胞制剂的制备
(1)胰岛细胞的制备
通过吸入二***和腹内施用1mg/kg的戊巴比妥(Nembutal)对Wister大鼠进行全身麻醉。切开后，鉴别胆总管并且通过非-齿状钳子在Vater乳突附近形成一簇。在胆囊管的连接部分形成小的开口以及将套管***到胆总管中，并且扣紧和固定，并且注射相当于1200到1500u/毫升的XI型胶原酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)来膨胀胰腺。不用破碎，提取整个胰腺，置于三角瓶中，浸于37℃恒温槽中并且降解约18分钟。降解后，振荡三角瓶若干次来破碎胰腺并且用含有0.1％牛血清蛋白的Hank’s溶液冲洗三次。细胞悬浮在Hank’s溶液中之后，通过850μm-直径的筛网过滤器过滤来回收内容物。
利用特异性比重梯度的葡聚糖70分离胰岛。也就是说，来自上清液的胰岛细胞组分被均匀地搅拌在具有1.094比重的葡聚糖+Hank’s溶液中，然后缓慢倾入具有1.094比重的葡聚糖。在细胞层上缓慢地依次倾入具有1.081比重的葡聚糖和具有1.041比重的葡聚糖来形成4个层。以400rpm离心分层的样品4分钟并且进一步以1700rpm离心13分钟。通过人工挑选、冲洗和人工挑选纯化分离第一层和第二层之间的胰岛。冲洗4次之后，胰岛细胞在37℃，5％CO2，95％空气的恒温箱中培养过夜。培养基为CMRL 1066+10％灭活胎儿牛血清+抗生素-抗真菌溶液(Gibco，BRL)+烟酰胺。
(2)片状胰岛细胞制剂的制备
利用上述方式获得的胰岛细胞培养液，如实施例1中(2)，(3)，(4)和(5)描述的累死方式获得其中细胞被激活的薄片状胰岛细胞制剂(制造实施例2)。
(测试实施例4)制剂的胰岛素分泌
上述获得的胰岛细胞制剂(制造实施例，由制备1天之后)以及游离的胰岛细胞通过低浓度葡萄糖(3.3mM)和高浓度葡萄糖(16.7mM)和测试实施例3相同的方式进行刺激，并且通过ELISA测定分泌的胰岛素的量。
结果显示于图6中。由图6可见，本发明的胰岛细胞制剂针对葡萄糖刺激分泌胰岛素并且在相同的时间不低于游离的胰岛细胞。
(测试实施例5)移植测试
(1)糖尿病小鼠模型的产生
溶于柠檬酸缓冲液(pH 4.5)的200mg/Kg的链脲菌素通过腹内施用于8到10周龄的C57BL/6雄性小鼠。施用一周之后，测定血糖三次，且显示出350mg/dl或两或多倍更高血糖的小鼠鉴定为糖尿病患者并且用来实验。无链脲菌素的小鼠被用作小鼠的正常组。
(2)移植
如下进行胰岛细胞制剂的移植也就是说，***麻醉下通过正中切口对糖尿病模型小鼠(糖尿病发展1周或更长时间后)进行腹部切开手术，制造实施例2中获得的胰岛细胞制剂(制造实施例2)保留在腹部中并且腹壁靠近在两层中。这些小鼠定义为移植小鼠组。进行不含胰岛细胞的制剂移植的小鼠(已比较实施例1中相同的方法制备)定义为糖尿病小鼠组。
(3)存活时间的研究
移植后存活时间定义为0天后观察存活时间。
结果显示于附图7中。很明显从图7可以看出移植后4周，一半或者更多的糖尿病小鼠组死亡并且在传代观察期没有小鼠可以存活长达8周。另一方面，具有胰岛细胞的小鼠组中除了两个显示持续高血糖状态并且最终死亡的小鼠，其它的存活8周或更长时间(成活率高达8周：0％对81.8％；p＜0.001)。
(4)血糖/重量比测定
移植之前以及移植后1天，3天，5天以及7天测定血糖以及重量并且其后每周测定一次。每个组的血糖波动显示于图8中。至于移植组，移植后许多小鼠的血糖迅速降低到小于300mg/dl(13/16)并且观察到它们中大多数正常，然而逐渐地增加(保持小于300mg/dl的时间为3天到7周)。然而，与糖尿病小鼠组血糖轻微增加并且血糖水平显著地提高(p＜0.0001)并且移植后高达8周的生命复原显然改进。观察高达8周的9只小鼠中，6只小鼠经历了胰岛细胞制剂的取出并且它们中5只小鼠显示血糖再次增加。
每个组的平均重量波动显示于图9中。在移植小鼠组中，手术移植后体重降低，并且被认为是由于饮食不良，并且移植后进行高达3周的差异反复-测量分析中与糖尿病小鼠组没有显著差异。然而，手术移植后3周，体重开始增加，并且与传代期间平均重量降低最多的第一周相比3周后观察到显著增加(p＜0.05)。此外，移植后3周和4周平均重量显著地超过糖尿病小鼠的平均重量。
(5)测定肾脏功能
移植之前和移植后每周一次测定BUN(血液尿素氮)和肌酸酐。移植后8周取出胰岛细胞制剂并且取出后直至1周进行测定。
BUN的波动显示于图10中。移植胰岛细胞制剂之前测定的具有正常血糖的小鼠的BUN的平均值±SE为25.53mg/dl±1.804(20到38.9)。施用链脲菌素1周后糖尿病小鼠组中，41.3％显示BUN增加(24/58，糖尿病小鼠组：13/35对比移植的小鼠组：11/23，BUN)35mg/dl)。糖尿病小鼠组中的14只糖尿病小鼠，13小鼠在传代中显示高BUN值。
另一方面，对于移植小鼠组中的16只移植小鼠，发现9只显示手术之前BUN增加的小鼠移植后1周正常。移植后1周平均值降低的BUN值大致为正常值并且发现显著地不同于糖尿病小鼠组(p＝0.002)。
此外，移植后8周进行胰岛细胞制剂取出的6只小鼠中，在取出后一周之内对4只小鼠进行BUN值测定并且与取出之前值比较都显示增加。
肌酸酐水平的改变显示于图11中。肌酸酐的正常值为0.351mg/dl±0.032(0.16到0.5)。糖尿病小鼠组中的几乎一半在链脲菌素施用后1周显示为高达0.5mg/dl并且在施用后4周发现所有的小鼠肌酸酐值均为正常。此外，肌酸酐增加后，在几个星期内所有小鼠死亡并且链脲菌素施用后没有小鼠成活直至10周。尽管移植小鼠组中的6只小鼠植入肌酸酐后显示增加，增加是轻微的并且小鼠在观察传代期间小鼠可以存活。尽管移植后5周移植小鼠组中的肌酸酐平均值仅仅超过0.5mg/dl，在任何时间该值恒定在大约0.4mg/dl并且与糖尿病小鼠组相比显著地降低(p＝0.0478)。此外，类似于BUN的情况，取出胰岛细胞后所有小鼠再次显示增加。
(6)尿检
收集24小时的尿并且测定尿量以及24小时尿糖***量，24小时尿白蛋白***量以及尿酮。所有移植小鼠组，糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组饲养在不限制饮水以及饮食的环境24小时，并且收集24小时的尿。通过Fuji DRI-CHEM***测定尿糖并且通过乘尿量计算的值被定义为尿糖***量。通过ELISA(Albuwell M(Exocill))测定尿白蛋白浓度并且乘24小时的尿量计算24小时的尿白蛋白***量。通过利用Urotape(Eiken)以及通过色调的记数评价尿酮。
24小时尿量的改变显示于图12中。移植小鼠组没有显示任何显著差异尽管稍微低于糖尿病小鼠组。
24小时尿糖量的改变显示于图13中。对于尿糖***量，移植小鼠组显示稍微低的值并且移植后3周显著差异(p＜0.0452)。
尿酮量的改变显示于图14中。对于尿酮量，糖尿病小鼠组以及移植小鼠组在移植之前都显示增加。在移植小鼠组中，移植后1周值正常化，并且其后该值与糖尿病小鼠组的值相比显著地降低(p＝0.0294)。
此外，尿白蛋白量的改变显示于图15中。在移植小鼠组中尿白蛋白量比糖尿病小鼠组低然而没有发现显著差异。
(7)测定1，5-脱水-D-葡糖醇(1，5-AG)
为了研究糖尿病的等级，进行1，5-AG测定。1，5-AG是与葡萄糖具有非常类似结构的多元醇并且主要获自食物并且大量地吸收并且积累在生物体中并且在肾中再吸收。它对葡萄糖有竞争性的作用，并且糖尿病患者体内，尿糖AG的重吸收被抑制确保AG在尿中的***以及血液中AG的降低。因此，1，5-AG对葡萄糖的动力敏感地反应因此，1，5-AG可以是反映糖尿病实时病症的标记。移植后每周一次从移植小鼠组，糖尿病小鼠组以及正常血糖小鼠组小鼠的尾部静脉取血液25μl并且通过用于动物的1，5-AG试剂盒(Nippon Kayaku Co，Ltd.)进行测定。
结果显示于图16中。从图可以清楚发现，与正常血糖小鼠组相比，糖尿病小鼠组显示显著低的1.5-AG浓度值，良好的反映了糖尿病的状态。移植小鼠组的平均值在1周以内与移植之前值相比增加。与糖尿病小鼠组的值相比，观察到显著的增加(p＝0.0203)。
(8)结论
从上述移植实验很清楚，本发明的胰岛细胞制剂通过移植制剂可有效改善糖尿病的状态并且预防糖尿病以及糖尿病肾机能不全引起的死亡。本发明胰岛细胞制剂的移植不仅可有效治疗糖尿病并且预防糖尿病的并发症。
工业实用性
本发明可以提供能够稳定地以及持久地将具有产生/分泌用于病人生物学活性因子诸如激素以及蛋白能力的细胞保持在PVA中的细胞制剂，所述PVA是用于人造器官的高分子聚合物的适当材料。此外，通过给病人施用细胞制剂，可以预防或治疗内分泌/代谢疾病，血友病，***骨疾病或癌症。因为本发明的胰腺细胞制剂可以长期稳定地保持细胞，产生移植频率的减少并且以多种形状形成，可以通过皮下或肌肉注射移植这种细胞制剂。
Claims (17)
1.细胞制剂，含有与细胞防腐剂混合的聚乙烯醇内的细胞。
2.权利要求1所述的细胞制剂，其中细胞表面进一步涂有细胞外基质。
3.权利要求1或者2所述的细胞制剂，进一步含有生长因子。
4.权利要求1到3任一项所述的细胞制剂，其中细胞是选自如下的一种或者两种或者多种细胞：胰岛细胞，胰腺内分泌细胞，肝细胞，垂体前叶细胞，生长激素分泌细胞，骨细胞，甲状腺激素分泌细胞以及甲状旁腺激素分泌细胞。
5.权利要求1到4任一项所述的细胞制剂，其中的细胞用细胞防腐剂处理。
6.权利要求1到5任一项所述的细胞制剂，其中的细胞是转化细胞。
7.权利要求1到6任一项所述的细胞制剂，具有薄片，板，棒，管或者念珠的形状。
8.权利要求1到7任一项所述的细胞制剂，其中的细胞防腐液是Euro-Collins溶液，Cell Banker，或者UW溶液。
9.权利要求1到8任一项所述的细胞制剂，其皮下，肌内或者腹膜内移植给哺乳动物。
10.预防以及治疗内分泌或者代谢疾病的方法，包括使用权利要求1到9任一项所述的细胞制剂。
11.权利要求10所述的预防以及治疗内分泌或者代谢疾病的方法，其中的内分泌或者代谢疾病是糖尿病或者垂体性侏儒。
12.预防以及治疗血友病的方法，包括使用权利要求1到9任一项所述的细胞制剂。
13.预防以及治疗骨疾病的方法，包括使用权利要求1到9任一项所述的细胞制剂。
14.预防以及治疗癌症的方法，包括使用权利要求1到9任一项所述的细胞制剂。
15.预防以及治疗肝功能不全或者先天性代谢缺陷的方法，包括使用权利要求1到9任一项所述的细胞制剂。
16.制备细胞制剂的方法，包括将细胞防腐剂与聚乙烯醇混合，以及将细胞与聚乙烯醇混合，以及使包含所产生的细胞的聚乙烯醇凝胶化。
17.权利要求1到9任一项所述的细胞制剂，其是用于人或者动物使用的药品。
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