CN1763099A - 制备单克隆抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备单克隆抗体的方法，该方法包括用能够表达特定抗原的重组腺病毒对动物进行免疫，由该动物获得产生抗该抗原的抗体的细胞以制备杂交瘤，由杂交瘤获得单克隆抗体。

Description

制备单克隆抗体的方法

技术领域

本发明属于免疫学和基因工程领域。具体而言，本发明提供一种新的制备单克隆抗体的方法，该方法包括用能够表达特定抗原的重组腺病毒对动物进行免疫，由该动物获得产生抗该抗原的抗体的细胞以制备杂交瘤，由杂交瘤获得单克隆抗体。

背景技术

长期以来，人们制备的特异性免疫血清抗体，不论是从人还是从动物获得的，也不论是主动免疫获得的还是被动免疫获得的，都是由许多B淋巴细胞克隆所产生的非均质性抗体，也称多克隆抗体，它们实际上都是由许多种具有不同特性的抗体所组成的混合抗体。

1975年8月7日，英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein发表了“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”这一著名论文[参见：Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature，1975，256(5517)：495-7]，从而创立了具有划时代意义的新技术——利用B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体。这一技术的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和制剂，促进了细胞生物学、免疫学、遗传学、微生物学、生物化学及基础与临床医学等众多学科的发展。它和遗传工程技术一样，被认为是具有巨大生命力和发展前途的新技术，Kohler和Milstein也由于这一杰出贡献而荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有以下显著特点：(1)高度均一性：单克隆抗体是由起始于一个B淋巴细胞的单克隆系所分泌，因此是每一个抗体分子的结构都相同的均一抗体；(2)高度特异性：单克隆抗体只专一地针对抗原分子上单个抗原决定簇起反应，一般不会发生交叉反应；(3)来源稳定，可大量生产：当得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系后，可以通过体外培养的方法制备单克隆抗体，也可以将杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔内，然后从荷瘤小鼠的腹水中收获大量单克隆抗体。

由于单克隆抗体具有上述优点，大大推动了对生物活性物质在分子水平上的研究，如对微生物的分子流行病学调查、快速诊断、抗原物质和致病因子的分析、以及对传染病的预防和治疗等方面，都提供了强有力的手段。

但是单克隆抗体的制备一般至少历时几个月，涉及到很多实验环节，并且受很多因素的影响。在诸多的影响因素中，抗原的制备、动物免疫及免疫方法等是能否获得杂交瘤及其特异性单克隆抗体的先决因素。在制备单克隆抗体的过程中，一般所用的抗原多为可溶性的蛋白质抗原，有时用细菌、病毒等颗粒性抗原，也可用细胞或组织抗原。用蛋白质作为免疫用抗原时，往往存在制备时间较长、纯化方法繁琐等缺点。有很多蛋白在细胞或组织中含量很低，难以纯化获得，给免疫和筛选带来困难。而直接用细菌或病毒作为免疫用抗原时，可能存在下列问题：(1)有些微生物为致病性微生物，如SARS病毒，具有较强的感染性，在生物安全上存在一定问题；(2)有的细菌或病毒本身表达抗原水平较低，免疫动物后往往不易获得良好的免疫效果，这也是单克隆抗体技术工作中经常遇到的极为棘手的问题。

发明内容

因此，本发明提供一种新的制备单克隆抗体的方法，该方法包括用能够表达特定抗原的重组腺病毒对动物进行免疫，由该动物获得产生抗该抗原的抗体的细胞以制备杂交瘤，由杂交瘤获得单克隆抗体。

在本发明的方法中，重组腺病毒粒子中可以添加常规佐剂，或者不添加佐剂，直接以病毒粒子进行免疫。免疫途径可以是任何常规的免疫方式，优选的免疫途径是经鼻或者口服。

本发明的方法中，所述抗原可以是任何由重组腺病毒可以表达的抗原形式。在本发明的具体实施方案中，所述抗原是一种蛋白。更具体而言，所述蛋白是GGII1、GGII3、GGII4或GGII7型杯状病毒衣壳蛋白或其混合物。

在优选实施方案中，本发明方法中使用的重组腺病毒为rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C或rvAdGGII7C。

本发明方法中，所述表达特定抗原的重组腺病毒是通过将外源基因***腺病毒载体制备得到的。所述***外源基因的重组腺病毒最好经过扩增和纯化后再用于免疫动物。腺病毒扩增和纯化可以采用本领域技术人员熟知的常规手段进行。

为了方便地获得单克隆抗体，可以将本发明中获得的产生单克隆抗体的杂交瘤接种到动物体内.由荷瘤动物腹水获得单克隆抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述动物为小鼠，所述产生抗体的细胞为脾细胞。

本发明用表达特定抗原的重组腺病毒免疫动物，可成功制备针对所述抗原的单克隆抗体，与传统的制备单克隆抗体的方法相比，整个过程可缩短3～5倍。

附图说明

图1：重组腺病毒及病毒样颗粒分别免疫小鼠后抗体产生的抗体滴度比较。

图2：单克隆抗体的特异性-Western-blot鉴定结果。

(A.V1E3杂交瘤细胞株分泌抗体的特异性：1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；

B.V1E9杂交瘤细胞株分泌抗体的特异性：1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；

C.V1D6杂交瘤细胞株分泌抗体的特异性：1.rvBacGGII1C；2.rvBacGGII3C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII7C；5.rvBacFB1；

D.V6D6杂交瘤细胞株分泌抗体的特异性：1.rvBacFB1；2.rvBacGGII7C；3.rvBacGGII4C；4.rvBacGGII3C；5.rvBacGGII1C)

图3：V1E3杂交瘤细胞株与GGII4型杯状病毒衣壳蛋白反应的免疫荧光结果(A.rvBacGGII4C；B.rvBacFB1；C.Sf9细胞)。

图4：V1E9杂交瘤细胞株与GGII4型杯状病毒衣壳蛋白反应的免疫荧光结果(A.rvBacGGII4C；B.rvBacFB1；C.Sf9细胞)。

图5：V1D6杂交瘤细胞株与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白反应的免疫荧光结果(A.rvBacGGII1C；B.rvBacGGII3C；C.rvBacGGII4C；D.rvBacGGII7C；E.rvBacFB1；F.Sf9细胞)。

图6：V6D6杂交瘤细胞株与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白反应的免疫荧光结果(A.rvBacGGII1C；B.rvBacGGII3C；C.rvBacGGII4C；D.rvBacGGII7C；E.rvBacFB1；F.Sf9细胞)。

具体实施方式

腺病毒(Ad)载体是目前被广泛应用的一种载体，已发现人类腺病毒有50多个血清型，其中分子生物学特性研究得最为详细的是2型和5型，大多数腺病毒载体就是以Ad5为基础构建的。腺病毒具有众多优点：(1)作为真核基因调控研究的模式***之一，人类对腺病毒在分子水平已有相当的认识；(2)腺病毒有中等大小的基因组，适合于用最少的病毒序列构建高容量的载体，同时也易于进行重组基因技术操作；(3)腺病毒可感染的宿主细胞范围广泛，包括成纤维、上皮、内皮、基质细胞等；(4)外源基因表达量高；(5)安全、可靠；(6)病毒滴度高，容易培养纯化，生产成本较低；(7)病毒基因组存在于细胞染色体外，避免了因整合引起的基因突变。由于腺病毒载体具有上述特点，使其在基因疫苗、基因治疗及蛋白功能等的研究中受到人们的青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一。

在本发明中，用表达目的蛋白的重组腺病毒作为免疫原免疫小鼠，是基于以下原因：

(1)抗原制备快，操作安全。用腺病毒载体把一个目的蛋白基因包装成重组腺病毒，用于免疫动物，大约需2周时间。而传统的方法制备单克隆抗体时是用基因工程生产蛋白或细胞或微生物作为免疫原，或者费时费力，或者存在安全风险。例如用原核表达***表达蛋白，首先把基因克隆到原核表达载体上，进行诱导表达，再根据表达蛋白的性质对其进行纯化，欲获得纯化的蛋白，常常需要数周乃至数月的时间。采用微生物作为免疫原时，需要大量培养和纯化该微生物。但是，对于高致病性细菌、病毒等微生物，如SARS病毒、埃博拉病毒等，通过大量培养、纯化获得抗原存在实验室感染的风险，需要生物安全3级或4级实验室，一般单位难以具备，而腺病毒通常在生物安全2级实验室就可以操作，容易实现。

(2)抗原纯化方法简单。以重组腺病毒作为抗原，只需扩增病毒后进行超速离心这一步骤即可达到纯化目的；而用蛋白作为抗原时，纯化步骤繁琐，需经过离子交换、亲和层析、凝胶过滤和疏水相互作用等一系列纯化步骤，才可以获得纯化的抗原。

(3)重组腺病毒滴度高。我们制备的重组腺病毒滴度可达10⁸～10⁹以上，免疫时抗原用量少，只需100μl左右病毒液。而用蛋白或病毒(细菌)作为免疫原，首次免疫即需100μg左右的纯化蛋白或病毒，这使得在制备抗原时工作量加大。

(4)重组腺病毒作为免疫原时不需要佐剂，免疫方式简单。重组腺病毒抗原为颗粒性抗原，免疫动物时不需要添加佐剂，可以直接进行经鼻或口服免疫。而用蛋白或病毒(细菌)抗原作为抗原免疫动物时，需要添加佐剂以增加其抗原性，再进行免疫，一般通过皮下注射、腹腔注射等途径。用细胞抗原则免疫原性较弱。

目前已知杯状病毒科主要分为4个属：Lagovirus，Vesivirus，Norovirus(诺如病毒)和Sapovirus(札如病毒)，后两种属于人类杯状病毒[参见：Green KY，et al.The role of human caliciviruses in epidemicgastroenteritis.Arch.Virol.Suppl.1997，13：153-165；Green KY，et al.Taxonomy of the caliciviruses.J.Infect.Dis.2000，181(Suppl.2)：S322-S330.]，其中，诺如病毒有3个遗传组(GG)：GGI，GGII和GGIII，札如病毒有4个遗传组：SGI，SGII，SGIII和SGIV，但只有GGI、GGII组诺如病毒和SGI、SGII、SGIV组札如病毒感染人类(参见：Katayama K，et al.Phylogenetic analysis of the complete genome of 18Norwalk-like viruses.Virology.2002，299：225-239；Okada M，et al.Molecular epidemiology and phylogenetic analysis of Sapporo-like viruses.2002，Arch.Virol.147：1445-1451.)。近来的研究表明，GGI、GGII型诺如病毒分别有14和17个遗传型(参见：Kageyama T，et al.Coexistenceof multiple genotypes，including newly identified genotypes，in outbreak ofgastroenteritis due to norovirus in Japan.J.Clin.Microbiol.2004，42：2988-2995.)。

杯状病毒为单股正链RNA病毒，无包膜，直径约27～40nm，基因组约为7.4～8.3kb，由3个开放读码框架(ORF)组成。ORF1编码非结构蛋白，包括螺旋酶、3CL蛋白酶和RNA多聚酶蛋白，ORF2和ORF3编码结构蛋白，其中ORF2编码一个主要结构蛋白——衣壳蛋白，ORF3编码与衣壳蛋白相关的一个小蛋白，可能与起始基因组的壳体化有关。由于目前缺乏有效的细胞培养***，通过基因工程方法制备病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)是目前杯状病毒抗原制备的主要方法。单克隆抗体捕捉粪便中的病毒抗原是目前杯状病毒检测的主要方法。

衣壳蛋白是杯状病毒的主要结构蛋白，其中GGII1型诺如病毒衣壳蛋白基因全长1608个核苷酸，编码535个氨基酸，GGII3型Noro病毒衣壳蛋白基因全长1647个核苷酸，编码548个氨基酸，GGII4型诺如病毒衣壳蛋白基因全长1620个核苷酸，编码539个氨基酸，GGII7型诺如病毒衣壳蛋白基因全长1623个核苷酸，编码540个氨基酸，这一结构蛋白包含杯状病毒生命所需的多种功能，如结构整合、感染性、病毒和细胞的相互作用及其免疫原性等。

在本发明中，发明人利用表达人杯状病毒衣壳蛋白的重组腺病毒免疫小鼠制备了抗衣壳蛋白的单克隆抗体。但是，本领域技术人员可以理解，本发明可用于针对任何抗原的单克隆抗体的制备。

在本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或抗原决定簇并与之结合的性质。

术语“单克隆抗体的反应性”是指在适宜的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。

术语“细胞株”是指通过选择或克隆法，从原代培养物或细胞系所获得的单细胞来源的培养物。

为了更清楚地理解本发明的实质，下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例是示例性的，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

实施例

本实施例的内容是用表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的重组腺病毒作为混合抗原免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用分别表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的昆虫细胞裂解液作为筛选抗原，成功快速地制备了针对杯状病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。

1、表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的重组腺病毒的制备

(1)重组腺病毒载体的构建

用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切穿梭质粒pShuttle-CMV(美国Stratagen公司)：pShuttle-CMV 10μl，BamH I和XhoI各1μl，10×缓冲液2μl，H₂O 6μl。37℃孵育2h，用TAKARA公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段。

用BamHI和XhoI分别双酶切含有衣壳蛋白基因的质粒pUC57/GGII1C、pUC57/GGII3C、pUC57/GGII4C、pUC57/GGII7C，反应体系为：质粒20μl，BamHI和XhoI各1.5μl，10×缓冲液5μl，H₂O22μl。37℃孵育2h，用TAKARA公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

Bgl II和BamH I为同尾酶，可以直接建立连接体系，酶切产物pShuttle-CMV分别与GGII1C、GGII3C、GGII4C、GGII7C进行连接反应：载体片段pShuttle-CMV 0.5μl，目的片段GGII1C、GGII3C、GGII4C、GGII7C各3μl，连接缓冲液2ul；T4DNA连接酶(TAKARA公司产品)1μl；H₂O 13.5μl，12℃连接16h。取10μl连接产物转化E.coli DH10B感受态细胞。挑取卡那霉素(K+)抗性克隆，用含K+的LB培养液培养12～16h后，以碱裂解法小量制备质粒，用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，得到重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV/GGII1C、pShuttle-CMV/GGII3C、pShuttle-CMV/GGII4C和pShuttle-CMV/GGII7C。

(2)重组腺病毒的获得

对于上述克隆有外源基因的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV/GGII1C、pShuttle-CMV/GGII3C、pShuttle-CMV/GGII4C和pShuttle-CMV/GGII7C，分别取约500ng重组穿梭质粒，分别用Pme I(美国New England Biolabs公司)单酶切以线性化，无水乙醇沉淀，溶于6μl ddH₂O中备用。

用线性化的重组穿梭质粒与约100ng pAdEasy-1腺病毒骨架质粒(美国Stratagen公司)共同电转化E.coli BJ5183(美国Stratagen公司)感受态细胞(参见：He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：2509-14)，取细菌悬液涂于含50μg/ml卡那霉素的LB培养板中，于37℃培养16～20h，挑选10～20个较小的菌落，接种于3ml含有卡那霉素(25μg/ml)的SOC培养液内，置37℃摇床，培养12～16h，碱裂解法小量提取质粒DNA，获得了重组腺病毒质粒pAdEasyGGII1C、pAdEasyGGII3C、pAdEasyGGII4C和pAdEasyGGII7C，用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析后，用Pac I(美国New EnglandBiolabs公司)酶切进一步鉴定，可产生4.5Kb左右的片段。将所得的重组腺病毒质粒转化以氯化钙法制备的宿主菌DH10B(rec A1，end A1)(美国Invitrogen公司)感受态细胞，在此宿主菌中可产生高拷贝数的质粒，挑取目的克隆，经BamH I和Pac I酶切鉴定后，-70℃保存备用。

用QIAGEN Plasmid Midi Kit(德国Qiagen公司)提取重组腺病毒质粒，用Pac I酶切后，无水乙醇沉淀回收目的DNA片段，溶于无菌去离子水中。在转染前24h将293细胞(美国Invitrogen公司)接种于T-12.5细胞培养瓶(美国BD公司)中，转染时细胞的丰度为50％～70％。将Pac I酶切线性化后的20μl重组腺病毒DNA及3μl的Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)分别与100μl M液[无抗生素、无血清的含有谷氨酰胺及NaHCO₃的DMEM培养液(美国Invitrogen公司)]充分混匀，室温孵育15min，混合两种悬液室温继续作用30min。在上述等待的时间里，移去293细胞的原培养液，用2ml M液洗细胞2次。补加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的复合物中，轻轻混匀后加至洗涤过的293细胞上，37℃，5％CO2孵育5h，移去含DNA/脂质体复合物的培养液，补加含10％新生牛血清(美国Hyclone公司)的DMEM完全培养液，继续培养，第二天换为含2％新生牛血清的维持液，继续培养。在转染后6～7d，细胞出现肿胀、变圆等细胞病变(CPE)。收集细胞与上清液一起-70℃、37℃反复冻融3次，取适量的冻融液接种293细胞，用含2％新生牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2培养箱中培养，观察细胞病变，按上述方法收病毒传代一次。获得的重组腺病毒命名为rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C和rvAdGGII7C。

2、表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白重组杆状病毒的制备

(1)杆状病毒表达载体的构建

用EcoR I和Xho I(TAKARA公司)双酶切杆状病毒表达载体pFastBac 1(美国Invitrogen公司，以下简称pFB 1)，体系为：pFB1 10μl，EcoR I和XhoI各1μl，10×缓冲液2μl，H₂O 6μl。37℃ 2h，用TAKARA公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收回收载体片段。

同时用EcoR I和Xho I双酶切含有衣壳蛋白基因的质粒pUC57/GGII1C、pUC57/GGII3C、pUC57/GGII4C和pUC57/GGII7C。反应体系为：质粒20μl，EcoR I和Xho I各1.5μl，10×缓冲液5μl，H₂O22μl。37℃ 2h，用TAKARA公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收目的片段。

将上述线性化的载体pFB1分别与目的基因GGII1C、GGII3C、GGII4C及GGII7C进行连接反应，反应体系为：载体pFB1 0.5μl；目的片段3μl，连接缓冲液2μl；T4 DNA连接酶(TAKARA公司)1μl；补H₂O至20μl，12℃连接16h。取10μl连接产物分别转化E.coli DH10B感受态细胞。挑取Amp抗性克隆，用含Amp的LB培养液培养12～16h后，以碱裂解法小量制备质粒，用EcoR I和Xho I分别进行双酶切鉴定，得到重组杆状病毒表达载体pFB1/GGII1C、pFB1/GGII3C、pFB1/GGII4C和pFB1/GGII7C。

(2)重组杆状病毒表达载体的转座反应

a)Luria Agar选择性培养基的制备

称取40g Luria Agar(美国Invitrogen公司)固体培养基溶于1L超纯水，分装至三角瓶中，10磅高压20min，待冷却至50℃左右，迅速加入下列物质的贮存液至终浓度分别为：卡那霉素(美国Sigma公司)50μg/ml，庆大霉素(美国Sigma公司)7μg/ml，四环素(美国Sigma公司)10μg/ml，Bluo-gal(美国Invitrogen公司)100μg/ml，ITPG(美国Invitrogen公司)40μg/ml。

b)转座反应

从-80℃冰箱取出DH10Bac感受态细胞(美国Invitrogen公司)置于冰上溶化，分别加入2μl重组表达载体质粒pFB1/GGII1C、pFB1I/GGII3C、pFB1/GGII4C、pFB1I/GGII7C和pFB1/90C，轻弹eppendorf管，混匀，置冰浴30min。42℃热休克90sec，置于冰浴稳定5min。加入900ul SOC培养液(美国Invitrogen公司)，置37℃缓慢振摇4-6h。分别取200ul菌液涂布Luria Agar选择性培养平板，37℃避光培养至少48h，观察蓝白斑生长情况。

(3)重组Bacmid DNA的分离

挑取上述平板上的白色菌落各3～4个，分别再在Luria agar平板上划线培养过夜，挑取仍为白斑的菌落，加至3ml的LB(卡那霉素50μg/ml，庆大霉素7μg/ml，四环素10μg/ml)中，37℃振摇培养24小时。取1.0ml的培养物，离心收集菌体，加入0.3ml溶液I[15mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，10mmol/LEDTA，100μg/ml RNase A(美国Sigma公司产品)]重悬菌体，加入0.3ml溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)混匀，室温放置5min，加入0.3ml 3mol/L的乙酸钾(pH5.5)，混匀，冰浴5～10min。13,000rpm离心10min，取上清，加入0.8ml的异丙醇，混匀，冰浴5～10min，13,000rpm离心15min，沉淀用70％的乙醇洗涤，置室温干燥，溶于50μl的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)中。

(4)重组杆状病毒的获得

昆虫细胞Sf9的培养采用含10％胎牛血清(杭州四季青公司)和P.S.(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，华北制药厂)的Grace培养基(美国Invitrogen公司)。转染前24h将细胞传至6孔细胞培养板(美国Costar公司)中，待细胞长至约50～70％丰度时进行转染。转染时准备下列溶液：溶液A：1-2μg重组Bacmid DNA与100μl无血清无抗生素的Grace培养基混合，溶液B：6μl Cellfectin转染试剂(美国Invitrogen公司)与94μl无血清、无抗生素的Grace培养基(美国Invitrogen公司)混合；将上述溶液A与溶液B混合，轻弹管壁混匀，室温孵育30min。在等待的时间内，用2ml无血清无抗生素的Grace培养基洗细胞2次，每孔加入0.8ml无血清、无抗生素的Grace培养基，在转染混合物孵育结束后，逐滴加入转染复合物。27℃孵育5h后，去除转染液，换为含10％胎牛血清的细胞培养液继续27℃培养。次日换为含2％胎牛血清的维持液，27℃培养72h。转染72h后，收获转染上清，分装至无菌冻存管中，此即为含重组病毒的原代毒种。获得的病毒原种分别为rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C。将病毒原种置4℃或-80℃保存。将此病毒感染Sf9细胞进行扩增传代。

3、小鼠的免疫

用293细胞分别扩增表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的重组腺病毒rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C、rvAdGGII7C，重组腺病毒感染细胞72h后，收集细胞置-80℃、37℃反复冻融3次后，于4℃，12,000rpm离心10min，取上清混合，作为免疫原免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(购自中国医学科学院动物学研究所)，每次免疫剂量为150μl/只，免疫途径为经鼻免疫，每间隔2周免疫一次，累计免疫4次后脾内注射进行加强免疫，剂量为100μl/只，3d后取脾融合。每次免疫后下次免疫前通过尾静脉取血收集血清，用ELISA方法测定血清IgG抗体滴度，细胞融合时通过眼球采血收集血清测定血清IgG抗体滴度。

同时用表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9，提取病毒样颗粒[具体方法参见BALL JM，et al.Oral Immunization with Recombinant Norwalk Virus-LikeParticles Induces a Systemic and Mucosal Immune Response in Mice.JVirol.72(2)：1345-1353.)作为免疫原联合免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每次免疫剂量为50μg/只(0.5ml)，首次免疫与等量完全福氏佐剂混匀，腹腔注射，每间隔2周后与等量不完全福氏佐剂混匀免疫一次，剂量为25μg/只。以25μg/只剂量重复免疫2次后，用10μg/只剂量进行脾内注射进行加强免疫，3d后取脾融合。每次免疫后下次免疫前通过尾静脉取血收集血清，用ELISA方法测定血清IgG抗体滴度。

4、抗体滴度的间接ELISA测定

(1)筛选抗原(包被抗原)的制备

在T75细胞培养瓶(美国NUNC公司)中，待Sf9细胞(美国Invitrogen公司)生长至80％～90％丰度时，分别接种等量(MOI＝5)表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白的重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，感染后72h刮下病变的细胞，PBS洗涤后，分别用1ml PBS重悬4种重组杆状病毒，混合后进行超声裂解，条件为：功率：100W；工作时间：10s；间歇时间：15S；共超声10次。于4℃，12,000rpm离心10min后，收集上清作为筛选抗原包被96孔酶标板(美国NUNC公司)。

(2)间接ELISA测定抗体滴度

以超声裂解的重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C感染的Sf9细胞提取的胞浆蛋白作为混合抗原，用pH9.6的碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水至1000ml)进行1∶500稀释后包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。用PBST(NaCL 8.00g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄ 1.44g，KCL0.20g，Tween 20 0.50ml，加蒸馏水至1000ml)洗板3次，每次3min。每孔加300μl 1％牛血清白蛋白(BSA)封闭液[牛血清白蛋白组分V(美国Amresco公司)1g，溶于100ml PBS缓冲液，pH 7.4]，置37℃孵育2h后，用PBST洗板3次，每次3min。将适当稀释的免疫小鼠血清或杂交瘤培养上清加入酶标板中，100μl/孔，置37℃孵育1h后，用PBST洗板5次，每次3min，同时设空白对照和阴性对照。加1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)，100μl/孔，置37℃孵育1h后，用PBST洗板5次，每次3min。加TMB(美国Sigma公司)底物缓冲液，100μl/孔，置37℃避光孵育10min。加2mol/L H₂SO₄终止反应，100μl/孔。用Moldel 550酶标仪(美国Bio-Rad公司)测定A450值，以P≥0.2，样本检测值/阴性对照检测值≥2.1时，结果判为阳性。结果显示，第一次加强免疫后，抗体滴度为10,000，第二次加强免疫后，抗体滴度为100,000，三次加强免疫后抗体滴度可达320,000。从图1可以看出，重组腺病毒免疫效果明显好于重组蛋白免疫，其滴度相差1个数量级。

5、杂交瘤细胞株的获得

(1)饲养细胞的制备

将老龄雌性BALB/c小鼠脱颈处死后，浸泡于75％酒精中，3～5min后腹部朝上放置于超净工作台。剥离腹部皮肤，无菌条件下用10mlRPMI 1640培养液(美国Hyclon公司)冲洗腹腔数次。吸出冲洗液，放入50ml离心管(美国Corning公司)，1,000rpm，离心10min，弃上清。用含20％小牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培养液重悬细胞沉淀后，进行细胞计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml。加入96孔细胞培养板(美国Costar公司)，100μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)细胞融合

取脾内加强免疫3d的小鼠，眼球取血后，将其脱颈处死，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液后，按10∶1的比例将脾细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1,000rpm离心10min，弃上清，轻轻弹起细胞，置于37℃水浴中，于1min内将1ml 50％PEG 4000(美国Sigma公司)加入混合后的细胞，边加边旋转离心管，使细胞保持混匀状态。然后在37℃内静置90s，立即缓慢加入20ml 37℃预热的RPMI 1640重悬细胞，以终止反应，于1,000rpm离心10min，弃上清，加入含20％小牛血清(杭州四季青公司)、2％HAT(美国Sigma公司)、1％青链霉素(PS，美国Hyclon公司)的RPMI 1640培养液，轻轻混匀，调整细胞数为2×10⁶个/ml，加入已生长有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，1周后补加含20％小牛血清、1％HT(美国Sigma公司)和1％PS的RPMI 1640培养液。

(3)阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆化

杆状病毒rvBacFB1为不含有外源基因的重组杆状病毒，可用于筛选与昆虫细胞成分及杆状病毒载体成分有交叉反应的假阳性抗体。细胞融合7～14天后，待细胞克隆长至视野的1/2～1/3大时，用表达重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C的昆虫细胞裂解液作为混合抗原包被酶标板，同时用表达rvBacFB1的昆虫细胞裂解液包被酶标板，吸取细胞上清液进行首次“扣除法ELISA”筛选。这种方法的原理是：表达杯状病毒衣壳蛋白的重组杆状病毒感染的昆虫细胞与不含有外源基因的重组杆状病毒rvBacFB1感染的昆虫细胞相比，两种细胞成分的差别是前者比后者多出杯状病毒衣壳蛋白成分而少了多角体蛋白成分，因此当分别用杂交瘤细胞上清与这两种细胞成分反应时，抗杯状病毒衣壳蛋白的特异性抗体只能与前者反应，而不能与后者发生反应，与两者都反应，或仅与后者反应，或与两者均不反应的克隆均不是抗杯状病毒衣壳蛋白的单克隆抗体。通过这种方法，我们确保了所获得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对杯状病毒衣壳蛋白的。筛选可识别杯状病毒衣壳蛋白，但与阴性对照rvBacFB1感染的细胞不反应的杂交瘤克隆，采用有限稀释法进行亚克隆，如此筛选3次，至细胞板上所有单克隆上清均只对杯状病毒衣壳蛋白有抗性，而对昆虫细胞成分及杆状病毒载体成分无抗性，将细胞扩大培养。

ELISA多次筛选后得到杂交瘤细胞株V1E3、V1E9、V1D6和V6D6，结果见表1。

表1杂交瘤细胞株的克隆化结果

克隆次数	细胞株(％)
					V1E3	V1E9	V1D6	V6D6
	123	9798100	9898100	9196100					92100100

6、单克隆抗体的亚类鉴定

用pH 9.6的碳酸盐缓冲液对羊抗鼠IgG(美国Sigma公司)进行1∶200稀释后，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜。加入1％BSA，300μl/孔，置37℃封闭2h。用PBS洗涤后，加入适当稀释的V1E3、V1E9、V1D6和V6D6细胞上清，100μl/孔，置37℃孵育1h。用PBS充分洗涤后，分别加入1∶2000稀释的HRP标记的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3(美国Sigma公司)，100μl/孔，置37℃孵育1h。用PBS充分洗涤后，以TMB 37℃避光显色10min后，用2mol/L H₂SO₄终止反应，在Moldel 550酶标仪上测定OD450值。结果如表2所示，V1E3、V1E9和V1D6细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1亚类，V6D6细胞株分泌的单克隆抗体为IgG2a亚类。

表2单克隆抗体的亚类鉴定结果

单克隆抗体	亚型
		V1E3V1E9V1D6V6D6	IgG1IgG1IgG1IgG2a

7、单克隆抗体的特异性鉴定

(1)ELISA鉴定

用表达重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C的昆虫细胞裂解液分别包被酶标板，吸取细胞上清液进行ELISA筛选，观察4株杂交瘤细胞V1E3、V1E9、V1D6和V6D6分泌的单克隆抗体与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白反应的特异性。结果显示(表3)，杂交瘤细胞株V1E3、V1E9分泌的抗体只对GGII4型杯状病毒衣壳蛋白有反应性；杂交瘤细胞株V1D6分泌的抗体对GGII1、GGII3和GGII4型杯状病毒衣壳蛋白有反应性，其中与GGII4型的反应最强，A450值最高；杂交瘤细胞株V6D6分泌的抗体对GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白均有反应性，且反应的强度相差不多。

表3单克隆抗体的特异性-ELISA鉴定结果

杯状病毒型别	细胞株
					V1E3	V1E9	V1D6	V6D6
	GGII1GGII3GGII4GGII7	--+-	--+-	+++-					++++

(2)Western-blot鉴定

待Sf9细胞生长至80％～90％丰度时，分别接种等量(MOI＝5)重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，感染后72h刮下病变的细胞，PBS洗涤后，细胞沉淀用200μl含蛋白酶抑制剂(美国Roche公司)的RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1％SDS，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠)冰上裂解1h，于4℃ 12,000rpm离心10min，将上清转移至另一新的eppendorf管中，用Pierce公司的BCA^TM Protein Assay Kit对提取的胞浆蛋白按厂商说明书方法进行定量后，调整蛋白浓度至终浓度5000μg/ml，加入5×SDS-PAGE电泳缓冲液，100℃加热变性后，取10μl总蛋白行12％SDS-PAGE电泳。电泳结束后，转印硝酸纤维素膜，用5％脱脂奶室温封闭2h后，分别用V1E3、V1E9、V1D6和V6D6杂交瘤细胞株的细胞上清室温孵育2h，用含0.05％Tween-20的TBS缓冲液(TBST)洗涤3次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(美国Sigma公司)室温孵育1h。TBST充分洗涤后，用SuperSignalWest Pico化学发光底物(Pierce公司)进行显色。结果显示，V1E3和V1E9细胞株分泌的单克隆抗体与rvBacGGII4C在约120kD处有浓集的特异性条带出现，我们推断为衣壳蛋白的二聚体形式；V1D6抗体与rvBacGGII4C在约120kD处也有浓集的特异性条带出现，与rvBacGGII3C在约60kD处有特异性条带出现，未检测出与rvBacGGII1C和rvBacGGII7C的反应性；V6D6抗体与rvBacGGII1C和rvBacGGII4C在约120kD处有特异性条带出现，与rvBacGGII3C在约60kD处有浓集的特异性条带出现，未检测出与rvBacGGII7C的反应性(图2)。

(3)间接免疫荧光鉴定

将已经预处理的无菌的盖玻片置于24孔细胞培养板(美国BD公司)中，将Sf9细胞接种至24孔板，次日待细胞生长至80～90％丰度时，以MOI＝5接种重组杆状病毒rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C，同时做rvBacFB1阴性对照和Sf9空白对照。72h后取出盖玻片，细胞首先用4％多聚甲醛固定30min，再以0.3％Triton-X-100室温作用20min，加1％BSA置37℃封闭1h后，用PBS(pH 7.4)洗细胞3次，每次3min。每盖玻片细胞分别加100μl V1E3、V1E9、V1D6和V6D6抗体，置37℃孵育30min。用PBS洗去未结合的一抗后，每盖玻片细胞加100μl FITC标记的抗鼠IgG二抗，置37℃孵育30min。用PBS洗去未结合的二抗后，以DAPI负染，PBS洗涤后，荧光显微镜下观察结果并照相。结果显示，V1E3和V1E9抗体：在rvBacGGII4C感染的Sf9细胞内可见特异性荧光，而在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII7C和rvBacFB1感染的Sf9细胞及空白Sf9细胞中均未见荧光(图3，图4)；V1D6抗体：在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C和rvBacGGII4C感染的Sf9细胞内可见特异性荧光，而在rvBacGGII7C和rvBacFB1感染的Sf9细胞及空白Sf9细胞中均未见荧光(图5)；V6D6抗体：在rvBacGGII1C、rvBacGGII3C、rvBacGGII4C和rvBacGGII7C感染的Sf9细胞内均可见特异性荧光，而在rvBacFB1感染的Sf9细胞及空白Sf9细胞中均未见荧光(图6)。

据ELISA和间接免疫荧光结果，V1D6与GGII1、GGII3和GGII4型杯状病毒衣壳蛋白具有反应性，V6D6与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型杯状病毒衣壳蛋白均有反应性；而Western-blot结果显示，V1D6只与GGII3和GGII4型杯状病毒衣壳蛋白有反应性，V6D6只与GGII1、GGII3和GGII4型杯状病毒衣壳蛋白有反应性。这提示，V1D6和V6D6与杯状病毒衣壳蛋白的反应可能存在构象依赖型表位，这可能与我们给动物的免疫原是具有完整结构的病毒蛋白有关；V1E3和V1E9与GGII4型杯状病毒衣壳蛋白具有反应性的特异性，这从ELISA、Western-blot和间接免疫荧光试验中均得到了证实。

以上结果可以看出，利用重组腺病毒免疫小鼠可以有效激发其表达外源蛋白的特异性抗体，并且其表达的抗原具有良好的免疫原性(可制备出构象依赖型抗体就是一个例证)。本发明的方法具有抗原制备简单，节省时间；不需要特殊的实验室设备；不需要免疫佐剂，免疫时间短；对于高致病性微生物可避免实验室生物危险等优点，在单克隆抗体研制中具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种制备单克隆抗体的方法，该方法包括用能够表达特定抗原的重组腺病毒对动物进行免疫，由该动物获得产生抗该抗原的抗体的细胞以制备杂交瘤，由杂交瘤获得单克隆抗体。

2.权利要求1的方法，其中重组腺病毒中不添加任何免疫用佐剂。

3.权利要求2的方法，其中通过经鼻或者口服途径对动物进行免疫。

4.权利要求1的方法，其中，所述抗原为一种蛋白。

5.权利要求4的方法，其中所述蛋白是GGII1、GGII3、GGII4或GGII7型杯状病毒衣壳蛋白或其混合物。

6.权利要求5的方法，其中所述重组腺病毒为rvAdGGII1C、rvAdGGII3C、rvAdGGII4C或rvAdGGII7C。

7.权利要求1的方法，其中，所述表达特定抗原的重组腺病毒通过将外源基因***腺病毒载体制备。

8.权利要求7的方法，其中所述***外源基因的重组腺病毒经过扩增和纯化后用于免疫动物。

9.权利要求1-8之一的方法，还包括将所述杂交瘤接种到动物体内，由荷瘤动物腹水获得单克隆抗体。

10.权利要求9的方法，其中，所述动物为小鼠，所述产生抗体的细胞为脾细胞。

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