CN1745099A - 修饰的可溶性t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可溶性T细胞受体(sTCR)，它包括(i)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，以及(ii)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链。(i)和(ii)各自包含所述TCR链的功能性可变结构域以及至少一部分恒定结构域，并且通过天然TCR中不存在的位于恒定结构域残基之间的二硫键相连，其特征在于，所述sTCR识别CD1－抗原复合物、细菌超抗原或肽－MHC/超抗原复合物。

Description

修饰的可溶性T细胞受体
本发明涉及识别CD1-抗原复合物、细菌超抗原和肽-MHC/超抗原复合物的可溶性T细胞受体(TCR)。
发明背景
天然TCRs
如在例如WO 99/60120中所描述的，TCR介导T细胞对特异性主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物的识别，并且这是免疫***细胞免疫的功能基础。
抗体和TCR是仅有的两种以特异方式识别抗原的分子，因而TCR是针对MHC所呈递的具体抗原肽的仅有的受体，其中所述外源肽经常是细胞内异常的唯一征兆。T细胞识别在T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接物理接触时发生，并由抗原特异性TCR与pMHC复合物的连接所启动。
天然TCR是与参与介导信号转导的CD3复合物的恒定的蛋白质相连的免疫球蛋白超家族的异源二聚体细胞表面蛋白。TCR存在αβ和γδ形式，它们结构类似但具有显著不同的解剖学分布以及或许不同的功能。MHC I类和II类配体也是免疫球蛋白超家族蛋白质但专门适用于抗原呈递，它们具有能在APC细胞表面呈递各种短肽片段的高度多态性的肽结合位点。
已知另外两类蛋白质能够作为TCR配体发挥作用。(1)CD1抗原是MHC I类相关分子，其基因位于与经典MHC I类和II类抗原不同的染色体上。CD1分子能以类似于常规的I类和II类MHC-肽复合物的方式向T细胞呈递肽和非肽(例如脂质、糖脂)部分。参见例如Barclay等，(1997)，《白细胞抗原概述》(The Leucocyte AntigenFactsbook)和Bauer(1997)Eur J Immunol 27(6)1366-1373。(2)细菌超抗原是能结合II类MHC分子和部分TCR的可溶性毒素(Fraser(1989)Nature 339 221-223)。许多超抗原对一个或两个Vβ片段具有特异性，而其他的表现出更随意的结合能力。在任何情况下，超抗原能够通过其以多克隆形式刺激部分T细胞的能力引起增强的免疫反应。
天然异源二聚αβTCR的胞外部分由两个多肽构成，每个具有近膜的恒定结构域和远膜的可变结构域(见图1)。每个恒定和可变结构域包括一个链内二硫键。可变结构域包含类似于抗体互补决定区(CDR)的高度多态性的环。TCR的CDR3与MHC所呈递的肽相互作用，并且CDR1和CDR2与所述肽和所述MHC相互作用。TCR序列的多样性经连锁的可变区(V)、多样区(D)、连接区(J)和恒定区(C)基因的体细胞重排产生。功能性α链多肽由重排的V-J-C区域形成，而β链由V-D-J-C区域构成。胞外恒定结构域具有近膜区域和一个免疫球蛋白区。存在称为TRAC的单一的α链恒定结构域和称为TRBC1和TRBC2(IMGT命名法)的两种不同的β恒定结构域。这些β恒定结构域之间存在4个氨基酸改变，其中3个在用于产生本发明所述的单链TCR的结构域范围内。这些改变都在TRBC1和TRBC2的外显子1范围内：N4K5→K4N5和F37→Y(IMGT编号，TRBC1→TRBC2差异)，两个TCRβ链恒定区之间最后一个氨基酸改变在TRBC1和TRBC2的外显子3中：V1→E。每种TCR胞外结构域的长度稍有变化。然而，精通本领域的技术人员使用诸如《T细胞受体概述》(The T Cell Receptor Facts Book)，Lefranc& Lefranc，Publ.Academic Press 2001等参考可以容易地确定结构域边界的位置。
可溶性TCR
可溶性TCR不仅可以用于研究特异性TCR-pMHC相互作用的目的，而且可能用作用于检测感染或用于检测自身免疫病标记的诊断工具。可溶性TCR也可以应用于染色，例如对细胞染色以说明在MHC背景下所呈递的具体抗原肽的存在。类似地，可溶性TCR可以用于向呈递特殊抗原的细胞递送例如细胞毒化合物或免疫刺激化合物等治疗性物质。可溶性TCR也可以用于抑制那些例如与自身免疫抗原肽反应的T细胞。
在许多情况下，由于蛋白质通过其跨膜区得以稳定，有一个以上多肽亚单位构成并具有跨膜结构域的蛋白质可能难以可溶形式进行生产。对于TCR就是如此，并反应在科学文献中，文献描述了截短形式的TCR，它们包含能被TCR特异性抗体识别(这表明所述抗体所识别的重组TCR的所述部分已经正确折叠)的或单独胞外结构域或胞外和胞质结构域，但它们不能以令人满意的得率进行生产、在低浓度下不稳定并且/或不能识别MHC-肽复合物。在WO 99/60120中回顾了这些文献。
许多文献描述了包含连接相应亚单位的天然二硫桥的TCR异源二聚体的生产(Garboczi等，(1996)，Nature 384(6605)：134-41；Garboczi等，(1996)，J Immunol157(12)：5403-10；Chang等，(1994)，PNAS USA 91：11408-11412；Davodeau等，(1993)，J.Biol.Chem.268(21)：15455-15460；Golden等，(1997)，J.Imm.Meth.206：163-169；美国专利No.6080840)。然而，虽然这样的TCR可以被TCR特异性抗体所识别，它们只在相对高浓度下识别其天然配体并且/或是不稳定的。
WO 99/60120中描述了一种正确折叠从而能识别其天然配体、在一段时间内稳定的、并能以合理的数量进行生产的可溶性TCR。这一TCR包含通过诸如亮氨酸拉链等一对C末端二聚肽分别与TCRβ或δ链胞外结构域二聚化的TCRα或γ链胞外结构域。这一生产TCR的策略通常适用于所有TCR。
Reiter等在Immunity，1995，2：281-287中详细描述了一种包含二硫键稳定的其中之一与假单胞菌外毒素(PE38)截短形式相连的TCRα和β可变结构域的可溶分子的构建。生产这一分子的已说明的理由之一是克服单链TCR固有的不稳定性。TCR可变结构域中新的二硫键的位置通过与先前已作介绍的抗体可变结构域的同源性进行确定(例如参见Brinkmann等，(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7538-7542，和Reiter等，(1994)Biochemistry 33：5451-5459)。然而，由于在抗体和TCR恒定结构域之间没有这样的同源性，这样的技术不能用于确定TCR恒定结构域之间新的链间二硫键的适当位置。
鉴于可溶性TCR的重要性，对于生产这样的分子的其他方法会存在需求。尤其希望提供识别CD1-抗原复合物、细菌超抗原和肽-MHC/超抗原复合物的其他的可溶性TCR。本发明所述的TCR提供了能再多种原核和真核表达***中生产的稳定的、可溶的多肽。出于经济原因尤其优选细菌表达。
本发明的第一个方面提供了一种可溶的T细胞受体(sTCR)，它包括(i)除了其跨膜结构域的完整或部分TCRα链，以及(ii)除了其跨膜结构域的完整或部分TCRβ链，其中(i)和(ii)各自包含一个功能性可变结构域和至少一部分TCR链的恒定结构域，并且通过天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接，其特征在于所述sTCR识别CD1-抗原复合物、细菌超抗原或肽-MHC/超抗原复合物。
本发明的另一个方面提供了一种识别CD1-抗原复合物、细菌超抗原或肽-MHC/超抗原复合物的可溶αβ形式的T细胞受体(sTCR)，其中共价二硫键将α链恒定结构域免疫球蛋白区的一个残基与β链恒定结构域免疫球蛋白区的一个残基连接。
本发明所述sTCR具有不包含可能具有免疫原性或可能导致所述sTCR快速从体内清除的异源多肽的优点。此外，本发明所述TCR具有与其来源的天然TCR高度类似的三维结构，并且由于其结构相似性，它们大概不具有免疫原性。
本发明所述的TCR是可溶的。在本申请的上下文中，溶解度被定义为TCR以1毫克/毫升的浓度在磷酸盐缓冲液(PBS)(KCl 2.7mM，KH2PO4 1.5mM，NaCl 137mM和Na2PO4 8mM，pH7.1-7.5.Life Technologies，Gibco BRL)中作为单分散的异源二聚体得以纯化并且90％以上所述TCR在25℃孵育1小时后保持单分散的异源二聚体形式的能力。为了评价TCR的溶解度，将其首先如实施例2中所述进行纯化。纯化后，100微克TCR使用例如PBS平衡的Pharmacia Superdex 75 HR柱通过分析型尺寸排阻色谱进行分析。另外100微克TCR 25℃孵育1小时随后如前所述通过尺寸排阻色谱进行分析。随后通过积分分析尺寸排阻图并比较对应于单一分散的异源二聚体的峰面积。相应的峰可以通过与已知分子量的蛋白质标准品的洗脱位置比较得以确定。所述单一分散的异源二聚可溶性TCR分子量约50kDa。如上所述，本发明所述TCR是可溶的。然而，如下更详细所述，所述TCR可以与化学部分偶联从而所得复合物是不可溶的，或它们可以存在于不溶的固体支持物的表面。
这里所使用的TCR氨基酸的编号遵循《T细胞受体概述》(T Cell ReceptorFactsbook)，2001，LeFranc & LeFranc，Academic Press中所述的IMGT***。在这一***中，α链恒定结构域具有以下表述：TRAC*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“A”表示α链基因；C表示恒定区；以及“*01”表示等位基因1。β链恒定结构域具有以下表述：TRBC1*01。在这种情况下，存在两种可能的恒定区基因“C1”和“C2”。每个等位基因编码的翻译的结构域可以包括几个外显子的遗传编码；因此它们也是特异的。氨基酸按照其所在具体结构域的外显子进行编号。
天然TCR的胞外部分包括两条多肽(αβ或γδ)，其中每条具有近膜的恒定结构域和远膜的可变结构域(见图1)。每个恒定和可变结构域包含一个链内二硫键。可变结构域包含类似于抗体互补决定区(CDR)的高度多态性环。TCR的CDR3与MHC所呈递肽相互作用，并且CDR1和2与所述肽和MHC相互作用。TCR的多态性通过连锁的可变区(V)、多态区(D)、连接区(J)和恒定基因的体细胞重排产生。功能性的α链多肽由重排的V-J-C区形成，而β链包括V-D-J-C区。胞外恒定结构域具有一个近膜区和一个免疫球蛋白区。所述近膜区包括跨膜结构域和近膜半胱氨酸残基之间的氨基酸。所述恒定的免疫球蛋白结构域包括从近膜半胱氨酸延伸到连接区起始处的其余恒定结构域氨基酸残基，并具有存在免疫球蛋白类折叠的特点。存在称为Cα1或TRAC*01的单一α链恒定结构域和称为Cβ1或TRBC1*01和Cβ2或TRBC2*01的两种不同β恒定结构域。这些不同的β恒定结构域之间的差异体现在外显子1的氨基酸残基4、5和37。这样，TRBC1*01在其外显子1中含4N、5K和37，以及TRBC2*01在其外显子1中含4K、5N和37Y。每种TCR胞外结构域的长度稍有不同。
本发明中，在位于各自链的恒定结构域(或其部分)中的残基之间引入了二硫键。TCR各自的链包含结合时足以能与其相应TCR配体(CD1-抗原复合物、超抗原或超抗原/pMHC复合物)相互作用的部分。这样的相互作用可以使用BIAcore 3000TM或BIAcore 2000TM仪器进行测量。WO99/6120提供了对分析TCR与MHC-肽复合物所需方法的详细描述并且这些方法同样适用于TCR/CD1和TCR/超抗原的研究。为了使这些方法适用于TCR/CD1相互作用的研究，需要可溶形式的CD1，Bauer(1997)Eur JImmunol 27(6)1366-1373中对其生产进行了描述。
在一个实施方案中，本发明所述sTCR各自的链也包含其链内二硫键。本发明所述TCR可以包含所述各自完整的TCR链胞外恒定Ig区，以及优选地所述各自链的完整的胞外结构域，也就是说包含近膜区。在天然TCR中存在一个连接各自链的保守近膜区的二硫键。在本发明的一个实施方案中，不存在这一二硫键。这可以通过将适当的半胱氨酸残基(分别是TRAC*01基因外显子2的氨基酸4以及TRBC1*01和TRBC2*01基因的氨基酸2)突变为其他氨基酸、或截短各自链以排除所述半胱氨酸残基得以实现。如本发明所述的一种优选的可溶性TCR包含C末端截短的天然α和βTCR链，从而使得形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基得以排除，即在所述半胱氨酸端1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基处截短。然而需要指出的是本发明所述TCR中可以存在链间二硫键，并且在某些实施方案中，仅有一条TCR链具有形成天然链间二硫键的天然半胱氨酸残基。这一半胱氨酸可以用于TCR与化学部分的连接。
然而，TCR各自的链可以较短。由于恒定结构域不直接参与与肽/MHC配体的接触，C末端截短位置可以充分改变而不会引起功能的丢失。
另外，可以存在比这里所优选的更大的恒定结构域片段，即恒定结构域不需要在紧邻形成链间二硫键的半胱氨酸前截断。例如，可以包含除跨膜结构域的完整的恒定结构域(即胞外和胞质结构域)。在这种情况下可以优选将形成细胞TCR中链间二硫键的半胱氨酸残基突变成不参与二硫键形成的其他氨基酸，或删除一个或多个这些残基。
由于其在TCR的配体结合能力成熟中没有任何作用，并且在有些情况下可能妨碍功能性可溶性TCR的形成，如果可溶性TCR在例如大肠杆菌等原核细胞中表达，可以去除信号肽。在多数情况下，从成熟TCR链中去除信号肽的切割位点是预测的而不是实验确定的。改造表达的TCR使其在N末端少或多一些氨基酸(例如10个以内)可能对可溶性TCR的功能(即识别CD1的能力)没有显著影响。可以添加原始蛋白序列中不存在的某些添加。例如，如果其不影响TCR的抗原结合位点的正确结构和折叠，可以添加有助于TCR纯化的短的标签序列。
对于在大肠杆菌中表达，可以在预测的成熟蛋白序列的N末端起始点设计一个甲硫氨酸残基以启动翻译过程。
TCR链可变结构域中许多残基对于抗原特异性和功能性来说不是必需的。因此，在这一结构域中可以引入多个突变而不影响抗原特异性和功能性。TCR链恒定结构域中许多残基对于抗原特异性和功能性来说不是必需的。因此，在这一结构域中可以引入多个突变而不影响抗原特异性。
TCRβ链包含一个在细胞或天然TCR中不成对的半胱氨酸残基。优选去除这一半胱氨酸残基或突变成其他残基以避免错误的链间或链内配对。这一半胱氨酸残基置换成例如丝氨酸或丙氨酸等其他残基对于体外重折叠效率能够具有显著的促进作用。
二硫键可以通过将各自链上的非半胱氨酸残基突变成半胱氨酸并且引起突变残基之间形成化学键的方式形成。优选天然TCR中其各自的β碳原子相距约6(0.6nm)(优选介于3.5(0.35nm)到5.9(0.59nm)区间)的残基，这样可以在替代天然残基而引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键。优选所述二硫键位于恒定免疫球蛋白区的残基之间，虽然可以位于近膜区的残基之间。可以引入半胱氨酸以形成二硫键的优选位点是TCRα链TRAC*01的外显子1中和TCRβ链的TRBC1*01或TRBC2*01中的以下残基：
  TCRα链   TCRβ链 天然β碳原子间隔(nm)
  Thr 48Thr 45Tyr 10Thr 45Ser 15   Ser 57Ser 77Ser 17Asp 59Glu 15 0.4730.5330.3590.5600.59
本发明所述的一种sTCR源自A6 Tax TCR(Garboczi等，Nature，1996，384(6605)：134-141)。在一个实施方案中，所述sTCR包括含外显子2的N端、TRAC*01的残基4(按照Garboczi等所使用的编号α链的氨基酸残基1-182)的完整TCRα链和含外显子2的N端、TRBC1*01和TRCB2*01的残基2(按照Garboczi等所使用的编号β链的氨基酸残基1-210)的完整TCRβ链。为了形成二硫键，TRAC*01中外显子1的丝氨酸48(按照Garboczi等所使用的编号，α链的丝氨酸158)以及TRBC1*01和TRBC2*01中外显子1的丝氨酸57(按照Garboczi等所使用的编号，β链的丝氨酸172)可以各自突变成半胱氨酸。这些氨基酸分别位于α和βTCR链恒定结构域的β铰链D中。
需要注意的是，在图3a和3b中，残基1(按照Garboczi等所使用的编号)分别是K和N。N末端甲硫氨酸残基在天然A6 Tax TCR中不存在，并且如上所述在相应的链在细菌表达***中生产的情况下有时存在。
目前人TCR中可以突变成半胱氨酸残基以形成新的链间二硫键的残基已被鉴定，精通本领域的技术人员应当能够以相同方式对任何TCR进行突变以产生具有新的链间二硫键的的该TCR的可溶形式。在人TCR中，精通本领域的技术人员只需要在相应TCR链中寻找以下基序以鉴别需要突变的残基(阴影中的残基是突变成半胱氨酸的残基)。
α链Thr 48：DSDVYITDK
Figure A0382601400111
VLDMRSMDFK(TRAC*01基因外显子1的氨
            基酸39-58)(SEQ ID 1)
α链Thr 45：QSKDSDVYI DKTVLDMRSM(TRAC*01基因外显子1的氨基
            酸36-55)(SEQ ID 2)
α链Tyr 10：DIQNPDPAV QLRDSKSSDK(TRAC*01基因外显子1的氨基
            酸1-20)(SEQ ID 3)
α链Ser 15：DPAVYQLRD
Figure A0382601400114
KSSDKSVCLF(TRAC*01基因外显子1的氨基
            酸6-25)(SEQ ID 4)
β链Ser 57：NGKEVHSGV
Figure A0382601400115
TDPQPLKEQP(TRBC1*01 & TRBC2*01基因
            外显子1的氨基酸48-67)(SEQ ID 5)
β链Ser 77：ALNDSRYAL
Figure A0382601400116
SRLRVSATFW(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外
            显子1的氨基酸68-87)(SEQ ID 6)
β链Ser 17：PPEVAVFEP
Figure A0382601400117
EAEISHTOKA(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外
            显子1的氨基酸8-27)(SEQ ID 7)
β链Asp 59：KEVHSGVST
Figure A0382601400118
PQPLKEQPAL(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外
            显子1的氨基酸50-69)(SEQ ID 8)
β链Glu 15：VFPPEVAVF PSEAEISHTQ(TRBC1*01 & TRBC2*01基因外
            显子1的氨基酸6-25)(SEQ ID 9)
在其他物种中，TCR链可能不包含与以上基序100％相同的区域。然而，精通本领域的技术人员应当能够使用上述基序鉴别TCRα或β链的等价部分并从而确定突变成半胱氨酸的残基。在这方面可以使用序列比对技术。例如，欧洲生物信息学研究所网站(http：//www.ebi.ac.uk/index.html)所提供的ClustalW可以用于比较上述基序和具体TCR链序列以对用于突变的TCR序列的相应部分加以定位。
本发明在其范围内包括人的二硫键相连的αβTCR，以及其他哺乳动物二硫键相连的αβTCR，这包括但不限于小鼠、大鼠、猪、山羊和绵羊。如上所述，精通本领域的技术人员应当能够确定与可以导入半胱氨酸残基以形成链间二硫键的上述人的位点等同的位点。例如，下面展示了小鼠Cα和Cβ可溶结构域的氨基酸序列，以及表示与上述能突变成半胱氨酸以形成TCR链间二硫键的人的残基等同的基序(其中相应残基用阴影表示)：
小鼠Cα可溶结构域：
PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKA
MDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP(SEQ ID 10)
小鼠Cβ可溶结构域：
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVH
SGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWP
EGSPKPVTQNISAEAWGRAD(SEQ ID 11)
人α链Thr 48的小鼠等价序列：ESGTFITDK
Figure A0382601400121
VLDMKAMDSK(SEQ ID 12)
人α链Thr 45的小鼠等价序列：KTMESGTFI
Figure A0382601400122
DKTVLDMKAM(SEQ ID 13)
人α链Tyr 10的小鼠等价序列：YIQNPEPAV QLKDPRSQDS(SEQ ID 14)
人α链Ser 15的小鼠等价序列：AVYQLKDPR
Figure A0382601400124
QDSTLCLFTD(SEQ ID 15)
人β链Ser 57的小鼠等价序列：NGREVHSGV
Figure A0382601400125
TDPQAYKESN(SEO ID 16)
人β链Ser 77的小鼠等价序列：KESNYSYCL SRLRVSATFW(SEQ ID 17)
人β链Ser 17的小鼠等价序列：PPKVSLFEP
Figure A0382601400127
KAEIANKQKA(SEQ ID 18)
人β链Asp 59的小鼠等价序列：REVHSGVST
Figure A0382601400131
PQAYKESNYS(SEQ ID 19)
人β链Glu 15的小鼠等价序列：VTPPKVSLF
Figure A0382601400132
PSKAEIANKQ(SEQ ID 20)
在本发明的优选实施方案中，所述TCR的(i)和(ii)各自包括与第二TCR的恒定结构域的全部或部分融合的第一TCR的功能性可变结构域，第一和第二TCR来自相同的物种并且链间二硫键位于所述天然TCR中不存在的相应完整或部分恒定结构域中的残基之间。在一个实施方案中，所述第一和第二TCR是人源的。换言之，所述二硫键相连的恒定结构域作为在这之上可以融合可变结构域的框架。所获得的TCR应是从中获得第一TCR的天然TCR充分相同的。这样的***使得在稳定的恒定结构域框架上方便地表达任何功能性可变结构域成为可能。
上述A6 Tax sTCR的恒定结构域，或甚至是任何具有上述新的链间二硫键的突变αβTCR的恒定结构域可以用作在这之上可以融合异源可变结构域的的框架。所述融合蛋白优选地尽可能多地保持所述异源可变结构域的构象。因此，优选所述异源可变结构域与恒定结构域在所引入的半胱氨酸残基和恒定结构域N端之间的任何位置进行连接。对于A6 Tax TCR，在α和β链上所引入的半胱氨酸残基优选地分别位于TRAC*01外显子1的苏氨酸48(按照Garboczi等所使用的编号，α链的苏氨酸158)以及TRBC1*01和TRBC2*01外显子1的丝氨酸57(按照Garboczi等所使用的编号，β链的丝氨酸172)。因此，优选异源α和β链可变结构域结合位点分别位于残基48(按照Garboczi等所使用的编号159)或58(按照Garboczi等所使用的编号173)和α或β恒定结构域N端之间。
异源α和β链恒定结构域中对应于A6 Tax TCR中结合位点的残基可以通过序列同源进行鉴别。所述融合蛋白优选地构建成在所述结合位点N端包含全部所述异源序列。
如以下更详细的叙述，本发明所述sTCR在其C或N端可以与一化学部分衍生或与之融合。由于位于结合位点远侧，优选C末端。在一个实施方案中，一条或两条TCR链在其C和/或N末端都具有一个这样的化学部分可以与之融合的半胱氨酸残基。
可以以足够纯的形式或作为经纯化或分离的制剂形式提供本发明所述的可溶性TCR(优选人的)。例如，可以以与其他蛋白质充分分离的形式提供。
可以在多价复合物中提供多种本发明所述的可溶性TCR。因此，本发明在一个方面提供了一种多价T细胞受体(TCR)复合物，它包括多种如这里所述的可溶性T细胞受体。优选地，多种可溶性TCR中的每一种是相同的。
另一方面，本发明的提供了一种用于检测选自CD1-抗原、细菌超抗原和MHC-肽/超抗原复合物的TCR配体的方法，所述方法包括：
(i)提供如这里所述的可溶性T细胞受体或多价T细胞受体复合物；
(ii)使所述可溶性T细胞受体或多价T细胞受体复合物与TCR配体接触；以及
(iii)检测可溶性T细胞受体或多价T细胞受体复合物与TCR配体的结合。
在本发明所述的多价复合物中，TCR可以是多聚体的形式，并/或可以是存在于例如脂质体等脂质双层之上或与之结合。
如本发明所述的多价TCR复合物的最简单的形式包括相互之间优选地经接头分子相连(例如共价或其他方式相连)的2、3、4或更多T细胞受体分子的多聚体。合适的接头分子包括但不限于诸如亲和素、链亲和素、中性链亲和素(neutravidin)和extravidin等每个具有4个生物素结合位点的多价结合分子。这样，生物素化的TCR分子可以形成具有多个TCR结合位点的T细胞受体多聚体。多聚体中TCR分子的数量将取决于相对于用以产生多聚体的接头分子数量的TCR数量，并且也取决于任何其他生物素化分子的存在与否。优选的多聚体是二聚、三聚或四聚TCR复合物。
远大于TCR四聚体的结构可以用于表达CD1-抗原复合物的示踪或靶向。优选的结构介于10纳米到10微米直径范围内。每种结构可以以充分间距排列多个TCR分子以使所述结构上2个或更多TCR分子能同时结合细胞上2个或更多CD1-抗原复合物并因此提高多聚体结合部分对所述细胞的亲合力。
用于本发明的合适的结构包括诸如脂质体的膜结构和优选诸如小珠等颗粒的固体结构(例如乳胶珠)。可以用T细胞受体分子在外包被的其他结构也可适用。优选地，所述结构是用T细胞受体多聚体而不是单一的T细胞受体分子包被的。
在使用脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可以附着或以其他方式与膜相连。这样的技术对于精通本领域的技术人员是熟知的。
本发明所述多价TCR复合物中可以包含诸如毒素或治疗性部位的标记或其他部分。例如，所述标记或其他部分可以包含在混合分子多聚体中。这样的多聚体分子的实例是含3个TCR分子和1个过氧化物酶分子的四聚体。这可以通过将TCR和酶按照3∶1的摩尔比混合以形成四聚化合物，并将所需复合物与任何不含正确分子比率的复合物分离得以实现。如果空间阻碍不影响或不显著影响所述分子的所需功能，这些混合分子可能包含分子的任何组合。由于空间阻碍大概不会发生，链亲和素分子上结合位点的分布适于混合分子。
其他生物素化TCR的方法也是可能的。例如，可以使用化学生物素化。虽然生物素标签序列中某些氨基酸是必需的，可以使用其他的生物素化标签(Schatz，(1993).Biotechnology N Y 11(10)：1138-43)。用于生物素化的混合物也可以改变。酶需要Mg-ATP和低离子强度，虽然这两个条件可以改变，例如，可能使用较高的离子强度和较长的反应时间。可能使用不同于亲和素或链亲和素的其他分子以形成TCR的多聚体。可以适用以多价形式结合生物素的任何分子。另外，可以设计完全不同的连接(诸如聚组氨酸标签与螯合的镍离子(Quiagen产品指南，1999，第3章《蛋白质表达、纯化、检测与试验》(Protein Expression，Purification，Detection andAssay)第35-37页))。优选地，所述标签位于蛋白质的C末端从而将在与对应的TCR配体相互作用中的空间阻碍最小化。
两条TCR链或其中之一可以用例如适于诊断目的标记物等可检测的标记物标记。这样，本发明提供了一种用于检测选自CD1-抗原、细菌超抗原、和MHC-肽/超抗原复合物的TCR配体的方法，该方法包括TCR配体与如本发明所述的对所述TCR配体特异的TCR或多聚TCR复合物接触；以及检测TCR或多聚TCR复合物与TCR配体的结合。在使用生物素化异源二聚体形成的四聚TCR中，荧光链亲和素(商业现货)可以用于提供可检测的标记物。荧光标记的四聚体适于在FACS分析中使用，例如用以检测携带对所述TCR特异的肽的抗原呈递细胞。
可以对本发明所述可溶性TCR进行检测的另一种方式是通过使用TCR特异性抗体，尤其是单克隆抗体。存在多种商业提供的诸如αFl和βFl等分别识别α和β链恒定区的抗TCR抗体。
本发明所述TCR(或其多价复合物)可以另外或此外与例如在细胞杀伤中使用的毒素部分或诸如白介素或细胞因子等免疫刺激剂等治疗性物质相连(例如共价或以其他方式相连)。本发明所述多价TCR复合物与非多聚T细胞受体异源二聚体相比对于TCR配体可以具有增强的结合能力。因此，本发明所述多价TCR复合物尤其可以用于对呈递具体抗原的细胞的体内或体外示踪或靶向，并且也可以用作生产其他具有这样用途的多价TCR复合物的中间体。因此所述TCR或多价TCR复合物可以以体内使用的药学上可接受的配方提供。
本发明也提供了一种用于向靶细胞递送治疗性物质的方法，该方法包括潜在的靶细胞与如本发明所述的TCR或多价TCR复合物在允许所述TCR或多价TCR复合物与靶细胞结合的条件下相接触，其中所述TCR或多价TCR复合物是对所述TCR复合物特异的并具有与之相连的治疗性物质。
所述可溶性TCR或多价TCR复合物尤其可以用于向呈递特定抗原的细胞的区域递送治疗剂。这可以用于多种情况，尤其是针对癌症。治疗剂可以这样递送使得它局部地而不是仅对其所结合的细胞发挥其功能。这样，一种具体策略设计了与肿瘤抗原特异的T细胞受体或多价TCR复合物相连的抗肿瘤分子。
许多治疗剂可以用于这一目的，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化疗物质(例如顺铂)。为确保毒性作用在所需区域发挥，毒素可以位于与链亲和素相连的脂质体中使得所述化合物缓慢释放。这会防止体内运输过程中的破坏作用并确保所述毒素在TCR与相应抗原呈递细胞结合后具有最大作用。
其他适当的治疗剂包括：
·小分子细胞毒物质，即分子量小于700Da的具有杀伤哺乳动物细胞能力的化合物。这样的化合物也可以包含具有细胞毒作用的有毒金属。此外，需要理解，这些小分子细胞毒物质也包括前药，即在生理条件下降解或转化以释放细胞毒物质的化合物。这样的物质的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西他赛、依托泊甙、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer sodiumphotofrin II、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替康、trimetreate、葡糖醛酸、auristatin E、长春新碱和阿酶素；
·肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞的能力的蛋白质或其片段。实例包括蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；
·放射性核素，即随着一种或多种α或β粒子或γ射线的同时发射而衰退的元素的不稳定同位素。实例包括碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；
·前药，如抗体引导的前药酶等；
·免疫刺激剂，即刺激免疫反应的化学成分。实例包括诸如IL-2的细胞因子，诸如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等等趋化因子，诸如抗CD3抗体或其片段等抗体或其片段，补体激活因子、异种基因蛋白结构域、同种基因蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域以及病毒/细菌肽。
本发明所述的可溶性TCR或多价TCR复合物可以与能将前药转化成药物的酶相连。这使得前药仅在其需要的位置转化成药物(即由sTCR靶向)。
通过使药物由于可溶性TCR的特异性而局部化可以提高对多种疾病的治疗。
例如HIV、SIV、EBV、CMV等有药物存在的病毒疾病会受益于在受感染细胞周围释放或活化的药物。对于癌症来说，局限于肿瘤或转移灶周围会提高毒素或免疫刺激剂的作用。在自身免疫疾病中，免疫抑制药物可以缓慢释放，这在较长的时间跨度上具有更局部的作用而对个体的整体免疫能力的影响降至最低。在防止移植排斥中，免疫抑制药物的作用可以以相同方式加以优化。对于疫苗递送，疫苗抗原可以局限在抗原呈递细胞的周围，从而增强抗原的功效。所述方法也可以用于造影的目的。
本发明所述可溶性TCR可以通过与特异TCR配体结合并从而抑制T细胞活化而用于调节T细胞活化。这一方法可以用于例如I型糖尿病等涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫疾病。为此需要有对相应pMHC所呈递的特异肽表位的知识。
也设计了本发明所述可溶性TCR和/或多价TCR复合物在制备用于治疗癌症或自身免疫疾病的组合物中的应用。
也提供了一种治疗癌症或自身免疫病的方法，该方法包括对有此需要的患者使用有效量的如本发明所述的可溶性TCR和/或多价TCR复合物。
如在抗癌症和自身免疫治疗中所常见的，本发明的sTCR可以与其他用于癌症和自身免疫病的治疗的物质以及在相似患者组中所发现的其他相关条件组合使用。
如本发明所述的药剂通常应作为无菌的、通常应包含药学上可接受的载体的药物组合物的一部分进行提供。这一药物组合物可以是任何适当形式的(取决于所需的对患者的给药方法)。它可以以单位剂量的形式提供，通常应在密封容器中提供并可以作为试剂盒的一部分提供。这样的试剂盒通常应(虽然不是必须的)包括使用说明书。它可以包括多种所述的单位剂量形式。
所述药物组合物可以适用于通过任何适当途径的给药，例如通过口腔(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或透皮)、***或注射(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。这样的组合物可以通过药剂学领域内已知的任何方法进行制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合。
适用于口腔给药的药物组合物可以以诸如胶囊或药片的分散单位；以粉末或颗粒；以溶液、糖浆或悬浮液(水性或非水性液体中的；或如可食用泡沫；或如乳剂)等形式提供。对于药片或硬胶囊来说适当的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。适用于软胶囊的赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体的多元醇等等。对于溶液和糖浆的制备，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。悬浮液的制备中油(例如植物油)可以用于提供水包油或油包水悬浮液。适用于透皮给药的药物组合物可以以计划与受体上皮长时间保持紧密接触的分散的膏药形式提供。例如，活性成分可以如Pharmaceutical Research，3(6)：318(1986)中通常所述的经离子渗透从膏药进行递送。适用于局部给药的药物组合物可以配制成药膏、乳膏、悬浮液、洗液、粉末、溶液、糊剂、胶体、喷剂、气雾剂或油。对于眼睛或例如口腔和皮肤等其他外部组织的感染，所述组合物优选使用局部用的药膏或乳膏。在配制成药膏的情况下，活性成分可以与含蜡或水混药膏基质使用。另外，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质配制成乳膏。适用于眼睛局部给药的药物组合物包括眼滴液，其中活性成分溶解或悬浮在适当的载体(特别是水性溶剂)中。适用于口腔局部给药的药物组合物包括锭剂和漱口液。
适用于直肠给药的药物组合物可以栓剂或灌肠剂的形式提供。其中载体是固体的适用于鼻腔给药的药物组合物包括颗粒大小介于例如20到500微米的粗粉末，它以吸入方式给药，即从将靠近鼻子的粉末容器中经鼻腔快速吸入。其中载体是液体的、作为鼻喷剂或鼻滴剂给药的药物组合物包括活性成分的水或油溶液。适用于通过吸入给药的药物组合物包括可以通过多种类型的测定剂量增压气雾器、喷雾器或吹药器等产生的细小颗粒粉尘或薄雾。适用于***给药的药物组合物可以以***栓剂、棉条、乳膏、胶体、糊剂、泡沫或喷雾剂型等形式提供。适用于注射给药的药物组合物包括可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得剂型与目标受体的血液充分等压的溶质的水性或非水性无菌注射溶液；以及可以包含悬浮剂和增稠剂的水性或非水性无菌悬浮液。可以用于注射用溶液的赋形剂包括例如水、乙醇、多元醇、甘油和植物油。所述组合物可以在单位剂量或多剂量容器中提供，例如密封的安瓿和小瓶，并可以在冷冻干燥(冻干)条件下保存，在使用前仅需添加例如注射用水等无菌液体载体。即时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和药片进行制备。
药物组合物可以包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、加湿剂、乳化剂、柔化剂、着色剂、着味剂、盐(本发明所述物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲液、包被剂或抗氧化剂。除了本发明所述物质以外，它们也可以包含具有治疗活性的物质。
本发明所述物质的剂量可以在宽泛的区间变动，这取决于所治疗的疾病或功能紊乱、所治疗个体的年龄和状况等等，并且医师应最终决定所使用的适当剂量。所述剂量可以适当地经常重复。如果产生副作用，按照通常的临床实践可以降低剂量的数量和/或频率。
基因克隆技术可以用于提供本发明所述的sTCR(优选地以充分纯的形式)。这些技术公开在例如Sambrook等的《分子克隆》(Molecular Cloning)，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)中。因此，本发明的另一个方面提供了一种核酸分子，它包含编码本发明所述可溶性TCR一条链的序列，或与其互补的序列。这样的核酸序列可以通过从T细胞克隆中分离TCR编码核酸并进行适当的突变(通过***、删除或置换)获得。
核酸分子可以是分离的或重组的。它可以与载体结合并所述载体可以组合进宿主细胞。这样的载体和适当宿主形成了本发明的另一个方面。
本发明也提供了一种用于获得TCR链的方法，该方法包括将这样的宿主细胞在引起TCR链表达的条件下孵育并随后纯化所述多肽。
本发明所述可溶性TCR可以通过在例如大肠杆菌等细菌中以包含体形式表达和随后的体外重折叠获得。
TCR链的重折叠可以在适当的重折叠条件下在体外进行。在具体实施方案中，具有正确构象的TCR通过在包含例如尿素的增溶剂的重折叠缓冲液中重折叠溶解的TCR链得以实现。优选地，尿素可以以至少0.1M或至少1M或至少2.5M或约5M的浓度存在。另一种可以使用的增溶剂是浓度介于0.1M和8M之间、优选至少1M或至少2.5M的胍。重折叠之前，优选地使用还原剂以确保半胱氨酸残基的完全还原。此外可以按需要使用诸如DDT和胍等变性剂。重折叠步骤之前可以使用不同的变性剂和还原剂(例如尿素、β-巯基乙醇)。重折叠过程中可以使用另外的氧化还原对，诸如胱胺/半胱胺氧化还原对、DTT或β-巯基乙醇/大气氧、以及还原和氧化形式的半胱氨酸。
折叠效率也可以通过向重折叠混合物添加某些其他蛋白质成分(例如分子伴侣蛋白)加以提高。蛋白质通过流经固定化小分子伴侣的柱已经实现了重折叠的提高(Altamirano等，(1999).Nature Biotechnology 17：187-191；Altamirano等，(1997).Proc Natl Acad Sci USA 94(8)：3576-8)。
另外，本发明所述可溶性TCR可以通过在诸如昆虫细胞的真核细胞***中表达获得。例如未决申请(WO 03/020763)公开了本发明所述相同的基本设计的肽-MHC结合的可溶性TCR在酵母和昆虫细胞中的表达，并且预测了在大量其他原核或真核***中的表达。因此，存在多种已用于膜结合TCR生产的哺乳动物表达***。例如，一项研究(Rubinstein(2003)J.Immunol 170(3)1209-1217)说明了体外逆转录病毒介导的用编码非天然膜结合TCR对成熟T细胞的成功转导，这导致产生了能够特异性杀伤表达被导入的TCR所识别的pMHC复合物的抗原呈递细胞的T细胞。进一步的研究(Pogulis(1998)Hum Gene Ther 9(15)2285-2297)使用了逆转录病毒***以用TCR基因转导小鼠骨髓细胞。转导的骨髓细胞随后导入小鼠并证明了导入的TCR的表达。
也设想了使用与先前对于抗体生产所证明的类似方法，本发明所述TCR可以表达在包括但不限于小鼠、大鼠、奶牛、绵羊和山羊等转基因动物的乳汁中。例如Sola(1998)J Virol 72(5)3762-3772描述了将编码嵌合抗体(IgA)的DNA导入小鼠并证明了可以产生能将导入的IgA分泌进乳汁的小鼠。
表达的TCR的纯化可以通过许多适用于所述TCR所表达的具体环境的不同的方法得以实现。可以使用离子交换或其他诸如凝胶过滤层析或亲和层析等蛋白质纯化方式。
本发明所述的可溶性TCR和多价TCR复合物也可以用于筛选诸如小化合物等具有抑制TCR与其配体结合能力的物质。因此，本发明的另一个方面提供了一种筛选抑制T细胞受体与选自CD1-抗原复合物、细菌超抗原和MHC-肽/超抗原复合物的TCR配体结合的物质的方法，该方法包括在存在待测物质的情况下监测本发明所述可溶性TCR与TCR配体的结合；以及挑选抑制这样的结合的物质。
用于这种筛选方法的合适的技术包括WO 01/22084中所述的基于表面等离子共振的方法。可以作为这一筛选方法基础的其他熟知的技术是闪烁接近分析(SPA)和增强型发光接近检测。
通过本发明所述的筛选方法所选出的物质可以用作药物或药物开发计划的基础，它经过修饰或其他方式改进以具有使其更适于作为药物给药的特征。这样的药物可以用于治疗包括多余的T细胞反应成分的病症。这样的病症包括癌症(例如直肠癌、卵巢癌、肠癌、头颈癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、***、膀胱癌、***癌或黑色素瘤)、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主病。
本发明每个方面的优选特点对于每个其他方面已作必要的修正。这里所提及的在先技术文献按照法律允许的最完整范围结合在本申请中。
                               实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，这不是以任何方式对本发明范围的限制。
下面参照附图进行说明，其中
图1是具有如本发明所述引入的链间二硫键的可溶性TCR的示意图。
图2a和2b分别显示了一种突变以引入一个半胱氨酸密码子的可溶的CD1结合TCR的α和β链的核酸序列。阴影表示所引入的半胱氨酸密码子。
图3a显示了包括用于形成新的链间二硫键的T48→C突变(下划线)的CD1结合TCRα链胞外氨基酸序列；图3b显示了包括用于形成新的链间二硫键的S57→C(下划线)的CD1结合TCRβ链胞外氨基酸序列。
图4是二硫键相连的CD1d结合可溶性TCR与可溶性CD1d特异性结合的BIAcore反应曲线。
实施例1-引物设计以及CD1结合TCRα和β链的突变
为了将TRAC*01中外显子1的CD1结合TCR苏氨酸48突变成半胱氨酸，设计了以下引物(突变用小写表示)：
5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT(SEQ ID 21)
5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G(SEQ ID 22)
为了将TRBC1*01和TRBC2*01中外显子1的CD1结合TCR丝氨酸57突变成半胱氨酸，设计了以下引物(突变用小写表示)：
5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC(SEQ ID 23)
5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G(SEQ ID 24)
PCR突变：
包含CD1结合TCR基因的表达质粒获自分离自CD1特异的CD1 T细胞克隆的cDNA。分别使用α链引物或β链引物按以下所述对TCRα或β链进行突变。100纳克质粒与5微升10mM dNTP、25微升10×Pfu缓冲液(Stratagene)、10单位Pfu聚合酶(Stratagene)并用H2O将最终体积调节为240微升。48微升所述混合物用稀释的引物补足，使50微升最终反应体积的终浓度为0.2μM。最初的95℃30秒变性步骤后，反应混合物在Hybaid PCR express PCR仪上进行15轮变性(95℃，30秒)、退火(55℃，60秒)和延伸(73℃，8分钟)。产物随后用10单位的DpnI限制性酶(New England Biolabs)在37℃下消化5小时。10微升消化产物转化感受态XL1-Blue细菌并在37℃生长18小时。挑取单菌落并在5毫升TYP+氨苄青霉素(16克/升细菌蛋白胨、16克/升酵母提取物、5克/升NaCl、2.5克/升K2HPO4、100毫克/升氨苄青霉素)生长过夜。质粒DNA按照生产商说明书在Qiagen mini-prep柱上纯化并且通过在牛津大学生物化学系测序装置上自动测序确定其序列。α链的相应的突变的核酸和氨基酸序列显示在图2a和3a中，β链的则显示在图2b和3b中。
实施例2-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化
将分别含突变的α链和β链的表达质粒单独转化入大肠杆菌BL21pLysS菌株，并在37℃下使氨苄青霉素抗性单菌落在TYP(100微克/毫升氨苄青霉素)培养基中生长至OD600达到0.4，随后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导3小时后通过在BeckmanJ-6B中以4000rpm离心30分钟收集细胞。细胞沉淀重悬在含50mM Tris-HCl、25％蔗糖(重量体积比)、1mM NaEDTA、0.1％(重量体积比)叠氮钠、10mM DTT，pH8.0的缓冲液中。经隔夜的冷冻-解冻步骤之后，在Milsonix XL2020超声仪中使用标准的12毫米直径探头将重悬细胞以1分钟短脉冲(burst)总共超声约10分钟。包含体沉淀通过在Beckman J2-21离心机上13000rpm离心30分钟得以回收。随后用去垢剂清洗3次以去除细胞碎片和膜组分。在Beckman J2-21中13000rpm离心15分钟沉淀之前，每次包含体沉淀在Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(重量体积比)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0)中匀浆。最后将包含体分成30毫克试样量并-70℃冻存。包含体蛋白质得率通过用6M盐酸胍溶解并用Bradford染料结合检测(PerBio)测量进行定量。
从冻存液解冻得到约120毫克(即4微摩尔)溶解的α链包含体以及30毫克(即1微摩尔)溶解的β链包含体，随后混合样品并将混合液稀释到15毫升胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA)以确保链完全变性。随后将含完全还原并变性的TCR链的胍溶液注入1升以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。该溶液静置24小时。随后将重折叠液透析两次，首先用10升100mM尿素、随后用10升100mM尿素、10mM Tris pH8.0。重折叠和透析步骤都在6-8℃进行。
通过将透析的重折叠液加载于POROS 50HQ阴离子交换柱并使用Akta纯化装置(Pharmacia)用50个柱体积以上的0-500mM NaCl梯度吸脱结合的蛋白将sTCR与降解产物及杂质分离。峰组分于4℃保存并在合并和浓缩之前用考马斯染色SDS-PAGE分析。最后，sTCR使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mMEDTA、0.05％诺乃洗涤剂p40)预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱进行纯化和特征描述。合并在相对分子量约50kDa处的洗脱峰并在通过BIAcore表面等离子共振分析进行特征描述之前进行浓缩。
实施例3-sTCR与CD1结合的BIAcore表面等离子共振分析
使用表面等离子共振生物传感器(BIAcore 3000TM)分析sTCR与其CD1配体的结合。如Bauer(1997)Eur J Immunol 27(6)1366-1373中所述，产生可溶性CD1复合物有助于这一分析，所述可溶性CD1复合物以半定向方式固定在链亲和素包被的结合表面，这允许同时有效检测可溶性T细胞受体与4个不同TCR配体(固定在各自的流动池中)的结合。手工注射HLA复合物允许简单地操纵固定的TCR配体的精确水平。
如此固定的化合物能结合T细胞受体和共受体CD8αα，这两者都可被注入可溶相中。甚至在低浓度(至少40微克/毫升)下获得了TCR的特异结合，这说明TCR是相对稳定的。如果在可溶相或固定相中使用sTCR，观察到sTCR的CD1结合结合性质在数量和质量上是相似的。这是对可溶形式部分活性的重要对照并也说明生物素化的CD1复合物与非生物素化复合物具有同样的生物学活性。
在BIAcore 3000TM表面等离子共振(SPR)生物感应器上分析含新的链间键的CD1结合sTCR和可溶性CD1之间的相互作用。SPR测量用反应单位(RU)表示的小流动池内感应器表面附近折射系数的变化，这一原理能用于检测受体配体相互作用以及分析其亲和力和动力学参数。通过在单独的流动池中固定CD1复合物制备探针流动池。随后通过sTCR以恒定的流速流经不同的流动池表面进行检测，这样测量了SPR反应。可溶sTCR以恒定流速注入并以不同浓度经过可溶性CD1复合物用于定义背景共振。
获得的CD1结合TCR和可溶性CD1之间相互作用的Kd值是6.0±0.3μM。

Claims (34)

1.一种可溶性T细胞受体(sTCR)，其包括(i)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，以及(ii)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中，(i)和(ii)各自包含功能性可变结构域和所述TCR链恒定结构域的至少一部分，并且通过天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键相连接，其特征在于，所述sTCR识别CD1-抗原复合物、细菌超抗原或肽-MHC/超抗原复合物。
2.如权利要求1所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)之一或两者包括所述TCR链的完整胞外恒定Ig结构域。
3.如权利要求1或2所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)之一或两者包括所述TCR链的完整胞外结构域。
4.一种可溶的αβ-形式的T细胞受体(sTCR)，其特征在于，一个共价二硫键连接α链恒定结构域免疫球蛋白区域的一个残基与β链恒定结构域免疫球蛋白区域的一个残基。
5.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，链间二硫键在天然TCR中是不存在的。
6.如权利要求5所述的sTCR，其特征在于，天然α和βTCR链在C端截断从而排除了形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基。
7.如权利要求5所述的sTCR，其特征在于，形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换成其他残基。
8.如权利要求7所述的sTCR，其特征在于，形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基被替换成丝氨酸或丙氨酸。
9.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，不存在存在于天然TCRβ链中的不成对的半胱氨酸残基。
10.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代天然TCR结构中其β碳原子相距小于0.6纳米的残基的半胱氨酸残基之间。
11.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代TRAC*01外显子1的Thr 48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间。
12.如权利要求1-10中任一项所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代TRAC*01外显子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 77的半胱氨酸残基之间。
13.如权利要求1-10中任一项所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代TRAC*01外显子1的Tyr 10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 17的半胱氨酸残基之间。
14.如权利要求1-10中任一项所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代TRAC*01外显子1的Thr 45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp 59的半胱氨酸残基之间。
15.如权利要求1-10中任一项所述的sTCR，其特征在于，天然TCR中不存在的二硫键位于替代TRAC*01外显子1的Ser 15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu 15的半胱氨酸残基之间。
16.如权利要求1、2和5-15中任一项所述的sTCR，其特征在于，(i)和(ii)各自包含与第二TCR全部或部分恒定结构域融合的第一TCR的功能性可变结构域，所述第一和第二TCR来自相同物种。
17.如权利要求16所述的sTCR，其特征在于，所述第二TCR的恒定结构域在形成非天然链间二硫键的残基的N端截断。
18.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，所述链之一或两者在其C或N端与一化学部分衍生或与之融合。
19.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，所述链之一或两者在其C和/或N端具有化学部分可以与之融合的半胱氨酸残基。
20.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，所述sTCR进一步包括可检测的标记物。
21.如上述任一权利要求所述的sTCR，其特征在于，所述sTCR与治疗剂相连。
22.一种多价T细胞受体(TCR)复合物，所述复合物包含多个如上述任一权利要求所述的sTCR。
23.如权利要求22所述的复合物，其特征在于，所述复合物包含sTCR多聚体。
24.如权利要求23所述的复合物，其特征在于，所述复合物包含优选经接头分子相互连接的2个、3个、4个或更多T细胞受体分子。
25.如权利要求22、23或24所述的复合物，其特征在于，所述sTCR或sTCR多聚体存在于脂质双层中或与颗粒相连。
26.一种用于检测选自CD1-抗原复合物、细菌超抗原或肽-MHC/超抗原复合物的TCR配体的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)提供如权利要求1-21中任一项所述的可溶性TCR或如权利要求22-25中任一项所述的多价T细胞受体复合物；
(ii)使所述可溶性TCR或多价TCR复合物与TCR配体接触；以及
(iii)检测可溶性TCR或多价TCR复合物与TCR配体的结合。
27.一种药物制剂，所述药物制剂包含如权利要求1-21中任一项所述的sTCR和/或如权利要求22-25中任一项所述的多价TCR复合物以及药学上可接受的载体。
28.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1-21中任一项所述sTCR的(i)或(ii)的序列或其互补序列。
29.一种载体，所述载体包含如权利要求28所述的核酸分子。
30.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求29所述的载体。
31.一种用于获得如权利要求1-21中任一项所定义的(i)或(ii)的方法，其特征在于，所述方法包括在造成所述肽表达的条件下孵育如权利要求30所述的宿主细胞，然后纯化所述多肽。
32.如权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括在适当的重折叠条件下混合(i)和(ii)。
33.如权利要求1-21中任一项所述的sTCR和/或如权利要求22-25中任一项所述的多价TCR复合物在制备用于治疗癌症或自身免疫病的组合物中的应用。
34.一种治疗癌症或自身免疫病的方法，所述方法给予有此需要的患者有效量的如权利要求1-21中任一项所述的sTCR和/或如权利要求22-25中任一项所述的多价TCR复合物。
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