CN1727351A - 高纯度植物磷脂酰肌醇化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以大豆为原料，经溶剂提取、分离纯化，制备磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)，初级品纯度约85％，再利用大孔树脂柱层析技术，建立一套简便、高效、低成本、少污染，大批量制备高纯度PI的新工艺，PI纯度大于96％。大量实验证明，已知PI具有极显著的选择性杀伤多种人源癌细胞的活性(文献：1)，最新报道PI有望成为预防、治疗老年痴呆症的有效天然化合物(文献：2)。本发明可为开发危害人类健康的新药研究提供基本原料。我们首次应用本发明制备的高纯度PI，制成乳剂、脂质体，对荷瘤动物进行注射、口服抑瘤实验，证明单独使用PI或与临床常用抗癌药物紫杉醇、环磷酰胺等联用，皆显示安全、有效、靶向、广谱及增效的优异特性。
Description
技术领域
本发明是以豆科植物种子为原料，建立一套简便有效、提取、分离纯化，大批量制备高纯度植物磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol(简称PI)的生产工艺，并用此工艺制备的化合物，制成针剂及口服液乳剂、微囊或脂质体。
我们是国内外第一次将PI进行了荷瘤动物抑瘤注射及口服试验，并与环磷酰胺、紫杉醇等做了联合用药，均取得非常显著的抑瘤效果(见附表1，2，3)。我们多年科研实践证明，本发明的生产方法正确、合理，产品安全有效。
背景技术
植物PI是磷脂类化合物最重要的成分之一，它不仅是细胞膜的重要结构物质，而且具有重要的生物活性，美国科学家(1983)首次发现高纯度植物PI具有靶向、广谱、杀伤多种癌细胞的活性[1]，2003年日本科学家首次发现植物PI化合物，还可能用于治疗、预防老年痴呆症(AD)[2]。
[1]United States Patent 4，999.344
Jett-Tilton，et al.March 12，1991(包括美国科学家1983第一篇文献)。
[2]Neuros Lett.350：105-8，2003.
至今，在PI的研究专利中，尚无大批量制备高纯度PI的方法专利。
二十多年来，科研工作所用PI化合物，不论天然或化学合成的，几乎都是从大型生化试剂公司购买，PI化合物商品已知都是用制备型TLC或与之相当的干柱层析技术，再经分离纯化获取小量产品(mg级)，仅限于癌细胞和脑细胞科研用，至今尚无大批量制备高纯度PI化合物的技术，也没有用于动物，更无口服实验的报道。
发明内容
本发明的目的是，根据植物磷脂类各组分化合物的物理、化学性质的差异，建立了一套简便有效的提取工艺；再用新型大孔树脂柱层析技术，建立制备PI化合物的精制工艺，使之能达到大批量工业化生产PI纯品的目的。
本发明的主要目的是，应用该方法生产PI化合物，为制备适于临床口服或注射用药物制剂提供基本原料。
本发明制备生产PI化合物的方法的特征是，应用植物豆科种子，经粉碎，有机溶剂浸提、水洗、有机溶剂转溶、酒精沉淀、离心、再经大孔树脂分离纯化、在惰性气体环境中，减压干燥即可获得PI化合物纯品，纯度大于96％。
本发明的优点及效果：(1)本发明的生产工艺简便、有效，不需特殊设备；(2)生产中使用的大部分有机溶剂，尚可回收、套用，污染极小，大大降低成本；(3)应用本发明的生产方法所制备的PI化合物与SIGMA标准品Rf值相同；(4)抑瘤生物活性极显著，联合用药增效也极显著；(5)应用本发明的生产方法所制备的PI化合物符合针剂制剂的标准；(6)证明本发明工艺设计方法科学、合理，产品质量、生物活性都达到药用制剂标准。
具体实施方式：
通过下述实例，可有助于理解本发明的基本内容：
一.PI化合物初级纯品的制备：本发明是利用生物细胞膜总磷脂的各组分的化学组成、结构、性质的差异，在不同溶剂(氯仿、甲醇、乙醇、水)，在不同温度下(-20～50℃)，利用各化合物溶解度选择性的差异，可有效分离出植物PI初级纯品(TLC检查，PI含量大于85％)。
实施例1.优质黑豆粉1Kg，加入氯仿∶甲醇∶水(1∶1∶1v/v)，(1∶2∶1v/v)，5-20倍体积，50C°以下浸泡24-72小时时，分出提取液，分层后减压浓缩，若溶剂显灰色，可加入药业活性炭(3-5g)回流一小时，脱色、过泸，泸液再减压浓缩，回收溶剂，得黑豆总磷脂(纯度约85％)。
实施例2.优质黄豆粉1Kg，加入氯仿∶甲醇∶水(1∶1∶1v/v)，(1∶2∶1v/v)，5-20倍体积，50C°以下浸泡24-72小时时，分出提取液，分层后减压浓缩，过泸，泸液再减压浓缩，回收溶剂，得黄豆总磷脂(纯度约85％)。黄豆得率高于黑豆。
二.PI化合物精品的制备：
实施例3.初级纯品进一步精制：
本发明是根据PI化合物总磷脂的组成、结构及化学性质的不同，为了进一步提高PI纯度，首次选用新型大孔树脂柱层析技术，包括大孔强酸型树脂，也可用大孔弱碱型树脂，进一步进行纯化，溶剂用氯仿∶甲醇(1∶1v/v)，(1∶2v/v)，或(2∶1v/v)；洗脱液在惰性气体环境中，进行减压浓缩、真空干燥，即可有效分离、纯化，获得PI化合物纯品，其纯度大于96％。每Kg黄豆粉PI得率大于500mg，每克成本约200元RMB。
鉴别方法：取上述方法获得的PI纯品，与SIGMA公司PI纯品进行对照实验，使用高效硅胶板，溶剂***为氯仿∶甲醇∶水∶氨水(65∶25∶4∶0.5v/v)，用磷钼酸显色剂喷雾显色，结果显示，本方法制备的PI纯品，与进口PI标准品Rf值一致。
对本发明制备的PI纯品做了多次抑瘤生物活性验证，现列举三个有代表性的抑瘤实验结果，列表如下：
附表：1，2，3，
表1PI对小鼠S180实体瘤的抑瘤作用 2001/12
| 组别 | 动物只数 | 体重( x±s) | 瘤重(克)x±s | 抑瘤率(％) | P值 | ||
| 始 | 终 | 始 | 终 | ||||
| 对照组PI组ip | 1010 | 109 | 22.2±1.622.0±1.5 | 28.2±2.626.3±2.6 | 2.43±0.41.54±0.49 | 36.6 | ＜0.001 |
PI给药剂量为1500mg/Kg
表2紫杉醇、PI及二者合用对小鼠S180抑瘤实验 2002/3/12
| 组别 | 动物数只 | 体重( X±S)克 | 瘤重( X±S)克克 | 抑瘤率％ | t | P | |
| 初 | 终 | ||||||
| 对照1.紫杉醇ip2.PI ip3.PI+紫杉醇 | 10101010 | 20.2±1.020.1±0.920.1±1.120.1±0.8 | 24.3±1.722.8±2.122.1±2.320.7±1.8 | 2.1±0.621.38±0.631.44±0.530.84±0.38 | 34.231.460.0 | 2.582.565.48 | ＜0.05＜0.05＜0.001 |
1.紫杉醇 5mg/Kg×7d ip
2.PI 500mg/Kg×7d ip
3.联合用药：紫杉醇 5mg/Kg+PI 500mg/Kg×7d ip
表3环磷酰胺、PI对小鼠***U14实体瘤的抑制作用 2003/1
| 组别 | 动物只数 | 体重g( x±s) | 瘤重g( x±s) | 抑瘤率(％) | t | P | ||
| 始 | 终 | 始 | 终 | |||||
| (1)对照组(2)PIpo组*(3)PIip组(4)CTX组ip(5)合用组ip | 1010101010 | 101051010 | 18.8±0.618.7±0.718.7±0.518.6±0.518.7±0.5 | 27.7±2.726.5±2.828.4±2.327.4±2.825.8±1.9 | 2.38±0.231.78±0.542.02±0.251.58±0.521.29±0.49 | 25.215.133.645.8 | 3.232.784.456.37 | ＜0.01＜0.05＜0.001＜0.001 |
(1)对照组：给蒸馏水0.2ml只，PO×7d；(2)PI口服组：500mg/kg×7d；
*(3)PI腹腔注射组：500mg/kg×3d(第三天意外死亡5只)；(4)CTX组：20mg/kg×1d；
(5)联合用药组：PI 500mg/kg Po×7d+CTX 20mg/kgi p×1d
*第(3)组实验动物仅给PI三天，七天后检查抑瘤效果，P值仍＜0.05，证明PI活性在体内可维持很长时间。
Claims (3)
1.一种适于大批量、提取、分离、纯化，制备磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)的方法，其特征是，植物豆科种子为原料，经粉碎、有机溶剂浸提、分溶，有机溶剂转换，乙醇沉淀、离心，真空干燥，即可获得PI化合物初级纯品，纯度约90％。
2.根据权利要求1所述的PI制备方法，其特征是，由此制备方法所获得的初级纯品，再经大孔树脂处理，选用不同溶剂***，达到进一步分离、纯化的目的，所制备的产品为高纯度PI，纯度大于96％。
3.根据权利要求2.其特征是，我们首次应用高纯度PI制成乳剂、脂质体，用于荷瘤动物抑瘤实验，口服、注射抑瘤效果极显著，与临床常用抗癌药联合使用，增效作用也极显著(见附表：1，2，3)。
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