CN1724636A

CN1724636A - 塔玛亚历山大藻的高密度培养方法

Info

Publication number: CN1724636A
Application number: CN 200410009359
Authority: CN
Inventors: 胡晗华; 石岩峻; 丛威; 康瑞娟; 蔡昭铃
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2004-07-21
Filing date: 2004-07-21
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2024-07-21
Also published as: CN1295323C

Abstract

本发明属于微藻的培养领域，特别是涉及塔玛亚历山大藻的高密度培养方法。在培养初期采取静置或温和搅拌的方式，使之利用培养基中的碳源和其它营养先增殖一段时间，待细胞密度达到一定程度后再实施通气，从而使藻细胞避开了培养初期由搅拌或通气引起的剪切所导致的细胞损伤。通入的气体中可配有一定比例的二氧化碳以提供藻细胞生长所需的碳源，同时维持一定的pH值。在培养初期只供给适度的氮、磷浓度，使之在培养初期能够快速增殖，在培养后期氮、磷成为生长的限制因素的时候补加氮、磷，从而缓解了后期氮、磷的缺乏，使之能够持续增殖，达到高的细胞密度。

Description

塔玛亚历山大藻的高密度培养方法

技术领域

本发明属于微藻的培养领域，特别是涉及塔玛亚历山大藻的高密度培养方法。

背景技术

塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是一种可产生神经麻痹性毒素(PSP)的海洋甲藻，是常见的赤潮藻类。由它引发的有毒赤潮常发生于日本、欧洲以及北美东北沿海。在我国胶州湾及南海海域曾发现塔玛亚历山大藻种或其孢囊，在厦门地区虾塘曾达到赤潮密度。国内外研究者们对引发该藻赤潮的环境和营养因子及产毒规律进行了大量研究，如文献：

1.Parker NS，Negri AP，Frampton DMF，Rodolfi L，Tredici MR，Blackburn SI.Growth of thetoxic dinoflagellate Alexandrium minutum(Dinophyceae)using high biomass culturessystems.J.Appl.Phycol.，2002，14：313-324。

2.Wang D，Ho AYT，Hsieh DPH.Production of C2 toxin by Alexandrium tamarense CI01using different culture methods.J.Appl.Phycol.，2002，14：461-468。

3.Kevin JF.Toxin production in migrating dinoflagellates：a modeling study of PSP producingAlexandrium.Harmful Algae，2002，1：147-155。

4.Hamasaki K，Horie M，Tokimitsu S，Toda T，Taguchi S.Variability in toxicity of thedinoflagellate Alexandrium tamanrense isolated from Hiroshima Bay，western Japan，as areflection of changing environmental conditions.J.Plank.Res.，2001，23(3)：271-278。

塔玛亚历山大藻所产毒素表现出强烈的生物活性。它的毒素组成成份较广，主要为N-磺基甲酰类毒素(C1、C2)、膝沟藻类毒素(GTX)和氨基甲酸酯类毒素(STX)，有很高的药用价值。但是由于塔玛亚历山大藻具有鞭毛，对剪切敏感，生长容易受到水流运动的抑制，室内培养难度大，培养密度低，如文献：

1.Estrada M，Berdalet E.Effects of turbulence on phytoplankton.In：Anderson DM，CembellaAD，Hallegraeff GM eds.Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms.Berlin：SpringerVerlag，1998，601-618。

2.Andrew RJ，Michael IL. Mechanisms of fluid shear-induced inhibition of population growthin a red-tide dinoflagellate.J.Phycol.，2002，38：683-694。

3.Juhl AR，Latz MI.Mechanisms of fluid shear-induced inhibition of population growth in ared-tide dinoflagellate.J.Phycol.，2002，38：689-694。

4.Sullivan JM，Swift E.Effects of small-scale turbulence on net growth rate and size of tenspecies of marine dinoflagellates.J.Phycol.，2003，39：83-94。

5.Sullivan JM，Swift E，Donaghay PL，Rines JEB.Small-scale turbulence affects the divisionrate and morphology of two red-tide dinoflagellates.Harmful Algae，2003，2：183-199。

另一方面，培养体系的氮(优选NaNO₃)、磷(优选NaH₂PO₄)对藻细胞的生长也有很大影响。过低的氮、磷浓度不利于藻细胞的增殖，过高的氮、磷浓度又对细胞构成抑制。目前的培养方法取适中的氮、磷浓度，使得培养后期由于氮、磷等营养的消耗，使得细胞难以继续增殖，从而影响细胞培养的最终密度。目前报导的塔玛亚历山大藻的培养密度一般在10³个细胞/ml的数量级，不超过10⁴个细胞/ml。

发明内容

本发明的目的是提供一种高密度培养塔玛亚历山大藻的方法，以解决人们对塔玛亚历山大藻的大量需要。

本发明的构思是这样的：

针对塔玛亚历山大藻具有鞭毛、对剪切力敏感的特点，在培养初期采取静置或温和搅拌的方式，使之利用培养基中的碳源和其它营养先增殖一段时间，待细胞密度达到一定程度后再实施通气，从而使藻细胞避开了培养初期由搅拌或通气引起的剪切所导致的细胞损伤。通入的气体中配有一定比例的二氧化碳以提供藻细胞生长所需的碳源，同时维持一定的pH值。当细胞达到一定密度后，随着培养基中的碳源(优选碳酸氢钠)的消耗，体系的pH值升高，碳源成为限制因素，此时通入含二氧化碳的空气，不仅补充了藻细胞生长所需的碳源，而且使得pH不再升高，保证培养环境的稳定，有利于藻细胞的增殖。

本发明在培养初期只供给适度的氮、磷浓度，使之在培养初期能够快速增殖，在培养后期细胞密度达到较高，对氮、磷的消耗加剧，使氮、磷成为生长的限制因素的时候补加氮、磷，从而缓解了后期氮、磷的缺乏，给细胞合适的营养环境，使之能够持续增殖，达到高的细胞密度。

本发明的塔玛亚历山大藻的高密度培养方法包括以下步骤：

(1)将对数生长期的塔玛亚历山大藻细胞接入透光的培养装置中，接种密度为10～500cells ml^-1，培养温度为14～30℃、光强为30～300μmol photon·m^-2·s^-1；装置中的培养基为f/2加富的人工海水(Harrison PJ，Waters RE，TaylorFJR，A broad spectrum artificial seawater medium for coastal and open oceanphytoplankton.J.Phycol.，1980，16：28～35)，改变培养基中氮(NaNO₃)、磷(NaH₂PO₄)的浓度，起始的氮(NaNO₃)浓度为0.05～1.0mmol/L、磷(NaH₂PO₄)浓度为0.002～0.05mmol/L；

(2)在培养开始的4～10天以前静置培养，或者采用转速不超过60转/分钟的温和搅拌，或者采用间隔0.5～2小时的定时搅拌；在培养开始的4～10天之后按照每升培养液体积以每分钟通入20～200ml的流量通入混合有0％～5％CO₂的空气，当通CO₂时维持培养液的pH值在7.6～8.8范围内；

(3)在培养开始后的4～12天的时候，当培养液中NaNO₃降低到0.02～0.04mmol/L时向培养体系补加NaNO₃，NaNO₃的补加量为0.2～2.0mmol/L培养液体积；

或者在培养开始后的8～18天的时候，当培养液中NaNO₃降低到0.002～0.004mmol/L，或培养液中NaH₂PO₄降低到0.005～0.02mmol/L时向培养体系补加NaNO₃和NaH₂PO₄，NaNO₃的补加量为0.2～2.0mmol/L培养液体积，NaH₂PO₄的补加量为0.02～0.2mmol/L培养液体积；

(4)培养至藻细胞密度或者浓度达到预定值，或者一定的时间，或者其它可以终止培养的条件出现。

本发明由于使塔玛亚历山大藻细胞在培养过程中避开了培养初期由搅拌或通气引起的剪切所导致的细胞损伤；由于通入的气体中配有一定比例的二氧化碳以提供藻细胞生长所需的碳源并维持一定的pH值；由于在培养初期只提供适量的氮、磷浓度、避免了浓度抑制使之在培养初期能够快速增殖，而在培养后期补加氮、磷，从而缓解了后期氮、磷的缺乏，使藻细胞能够持续增殖。使得最终得到的藻细胞密度达到10⁴个细胞/ml～10⁵个细胞/ml，远高于报导的一般培养密度。

具体实施方式

比较例l

在2升锥形瓶中加入1.5升培养基，培养基为f/2加富的人工海水。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液，接种密度为500cells ml^-1，培养温度为22℃，用白色荧光灯提供光源，光照强度为60μmol photon·m^-2·s^-1，光暗周期为12小时∶12小时。0～8天静置培养，在对数生长的后期(第8天)开始通入无菌空气，通气量是30ml/分钟。至第12天细胞密度达到10200cells ml^-1；至第18天细胞密度达到11200cells ml^-1，毒素产量为4.5μg L^-1。

比较例2

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。始终静置培养，不通气。至第22天时最大细胞密度为6600cells ml^-1，毒素产量为1.8μg L^-1。

比较例3

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。始终连续通入无菌空气培养，空气流量为80ml分钟^-1。至第22天时最大细胞密度为5500cellsml^-1，毒素产量为1.2μg L^-1。

比较例4

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例l。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。始终保持间隔1小时的通无菌空气培养，通气量是30ml/分钟。至第22天时最大细胞密度为3500cells ml^-1，毒素产量为1.9μg L^-1。

比较例5

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。0～8天连续磁力搅拌培养，搅拌速度30转/分钟。在对数生长的后期(第8天)开始通入无菌空气，通气量是30ml/分钟，搅拌保持不变。至第14天，细胞密度达到7080cellsml^-1；至第18天，细胞密度达到9310cells ml^-1，毒素产量为4.6μg L^-1。

比较例6

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。始终保持间隔1小时的定时搅拌，搅拌速度为30转/分钟，不通气。至第22天时最大细胞密度为5300cells ml^-1，毒素产量为2.1μg L^-1。

比较例7

培养装置、培养基、培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同比较例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。始终保持连续磁力搅拌，搅拌速度为30转/分钟，不通气。至第22天时最大细胞密度为5200cellsml^-1，毒素产量为2.0μg L^-1。

比较例8

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基，培养基、培养温度、光照强度、接种密度同比较例1，光照为连续光照。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。接种后静置培养4天，然后通入无菌空气。空气流量为100ml分钟^-1。至第12天，最高细胞密度达到17190cell ml^-1，毒素产量为21.7μg L^-1。

比较例9

在250mL的三角瓶中加入100mL培养基，培养温度、光照强度同比较例1，光照为连续光照。培养基中除了氮(NaNO₃)浓度和磷(NaH₂PO₄)浓度外均同比较例1。起始的氮(NaNO₃)浓度为0.0882mmol/L、磷(NaH₂PO₄)浓度为0.036mmol/L。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液，接种密度为60cells.ml^-1。培养过程始终静置。接种后第10天(此时的氮(NaNO₃)浓度为0.03mmol/L、磷(NaH₂PO₄)浓度为0.02mmol/L)补加0.80mmol/L的NaNO₃，可使细胞密度在第20天达到19950cells ml^-1；第24天达到最高密度43540cellsml^-1。

比较例10

培养装置、起始培养基、培养温度、光照强度、光暗周期、接种密度同比较例9。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。培养过程始终静置。在接种后第14天(此时的氮浓度为0.003mmol/L、磷浓度为0.01mmol/L)同时补加0.80mmol/L的NaNO₃和0.072mmol/L的NaH₂PO₄，可使细胞密度在第20天达到17780cells ml^-1；第24天达到最高密度52300cells ml^-1。

实施例1

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基。培养基中除了氮(NaNO₃)浓度和磷(NaH₂PO₄)浓度外均同f/2加富的人工海水，起始的氮(NaNO₃)浓度为0.0882mmol/L、磷(NaH₂PO₄)浓度为0.036mmol/L。培养温度为22℃，用白色荧光灯提供光源，光照强度为60μmol·photon·m^-2·s^-1，光照为连续光照。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液，接种密度为500cells ml^-1。接种后静置培养4天，然后通入无菌空气，空气流量为150ml·分钟^-1。接种后第6天(此时的氮浓度为0.028mmol/L、磷浓度为0.021mmol/L)补加0.80mmol/L的NaNO₃，可使细胞密度在第14天达到20850cells ml^-1；第18天达到最高密度46630cells·ml^-1。

实施例2

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基，培养温度、光照周期、接种密度同实施例1。光照强度为100μmol·photon·m^-2·s^-1，起始培养基同实施例1。接入塔玛业历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。接种后保持间隔1小时的通无菌空气培养，通气量是30ml/分钟。培养4天后将无菌空气流量改为150ml·分钟^-1。接种后第6天(此时的氮浓度为0.031mmol/L、磷浓度为0.023mmol/L)补加0.80mmol/L的NaNO₃，可使细胞密度在第14天达到22850cells ml^-1；第18天达到最高密度44530cells·ml^-1。

实施例3

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基，培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同实施例1。起始培养基同实施例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。接种后静置培养5天，然后通入无菌空气，空气流量为100ml分钟^-1。在接种后第10天(此时的氮浓度为0.0026mmol/L、磷浓度为0.009mmol/L)同时补加0.80mmol/L的NaNO₃和0.072mmol/L的NaH₂PO₄，可使细胞密度在第15天达到18860cells ml^-1；第17天达到最高密度55600cells ml^-1。

实施例4

在2升锥形瓶中加入1.5升培养基，培养温度、光照周期、接种密度同实施例1。光照强度为100μmol·photon·m^-2·s^-1，起始培养基同实施例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。接种后始终保持连续磁力搅拌培养，搅拌速度30转/分钟。培养4天后通入无菌空气，无菌空气流量为80ml·分钟^-1。在接种后第10天(此时的氮浓度为0.0023mmol/L、磷浓度为0.0075mmol/L)同时补加1.0mmol/L的NaNO₃和0.08mmol/L的NaH₂PO₄，可使细胞密度在第14天达到19760cells ml^-1；第17天达到最高密度58500cells ml^-1。

实施例5

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基，培养温度、光照强度、光照周期同实施例1。起始培养基同实施例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液，接种密度为300cells ml^-1。接种后静置培养5天，然后通入混合有1％CO₂的无菌空气，并维持培养液的pH值在8.2～8.6范围内，空气流量为100ml·分钟^-1。接种后第7天(此时的氮浓度为0.03mmol/L、磷浓度为0.02mmol/L)补加0.80mmol/L的NaNO₃，可使细胞密度在第14天达到24650cells ml^-1；第18天达到密度48730cells·ml^-1；第22天达到最高密度76500cells ml^-1。

实施例6

在3升气升式光生物反应器中加入2.2升培养基，培养温度、光照强度、光照周期、接种密度同实施例1。起始培养基同实施例1。接入塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)种液。接种后保持间隔1小时的通无菌空气培养，通气量是30ml/分钟。培养6天后改为通入混合有5％CO₂的无菌空气，并维持培养液的pH值在7.8～8.2范围内，空气流量为50ml分钟^-1。在接种后第12天(此时的氮浓度为0.0022mmol/L、磷浓度为0.008mmol/L)同时补加0.80mmol/L的NaNO₃和0.070mmol/L的NaH₂PO₄，可使细胞密度在第16天达到24860cells ml^-1；第19天达到密度61600cells ml^-1；第23天达到最高密度77800cells ml^-1。

Claims

1.一种塔玛亚历山大藻的高密度培养方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

(1)将对数生长期的塔玛亚历山大藻细胞接入透光的培养装置中，装置中的培养基为f/2加富的人工海水，改变培养基中NaNO₃、NaH₂PO₄的浓度，起始的NaNO₃浓度为0.05～1.0mmol/L、NaH₂PO₄浓度为0.002～0.05mmol/L；

(2)在培养开始的4～10天以前静置培养，或者采用转速不超过60转/分钟的温和搅拌，或者采用间隔0.5～2小时的定时搅拌，在培养开始的4～10天之后按照每升培养液体积以每分钟通入20～200ml的流量通入混合有0％～5％CO₂的空气；

(4)培养至藻细胞密度或者浓度达到预定值，或者可以终止培养的条件出现。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(1)的接种密度为10～500cells ml^-1，培养温度为14～30℃、光强为30～300μmol photon·m^-2·s-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的步骤(2)通CO₂时维持培养液的pH值在7.6～8.8范围内。