CN1708514A - 羟烷基淀粉衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，包括通式(I)的羟烷基淀粉在其反应之前未被氧化的还原性末端与通式(II)R′－NH－R″(II)的化合物反应，其中，R1、R2和R3独立地是氢、或者是线性或分支的羟烷基，其中R′或R″或者R′和R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应，本发明还涉及可以通过这种方法获得的羟烷基淀粉衍生物，以及含有这种羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。

Description

羟烷基淀粉衍生物
本发明涉及羟烷基淀粉衍生物，特别是可以通过以下方法获得的羟烷基淀粉衍生物，在该方法中，羟烷基淀粉与一种连接化合物的伯氨基或仲氨基反应。根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及可以通过一种方法获得的羟烷基淀粉衍生物，按照这种方法，羟烷基淀粉与一种连接化合物的伯氨基或仲氨基反应，产生的反应产物通过该连接化合物的至少另外一个反应基与一种多肽反应，优选地与一种糖蛋白反应，特别优选地与***反应。特别优选的一种羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。根据本发明，羟烷基淀粉，优选羟乙基淀粉，在其还原性末端与连接化合物反应，其还原性末端在反应前不被氧化。
羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的一种衍生物，可被体内的α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的一种取代衍生物，它在玉米淀粉中存在，浓度高达95％重量。HES显示有利的生物学性质，可以用作血容量替代剂，在临床血液稀释治疗中使用(Sommermeyer et al.，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；Weidler et al.，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支链淀粉由葡萄糖部分组成，其中主链中存在α-1，4-糖苷键，在分支位点处可见α-1，6-糖苷键。该分子的物理化学性质主要取决于糖苷键的类型。由于α-1，4-糖苷键具有切口，产生每圈大约有6个葡萄糖单体的螺旋结构。该聚合物的物理化学以及生物化学性质能够通过取代改变。羟乙基的引入可以通过碱性羟乙基化作用实现。通过改变反应条件，可以利用非取代葡萄糖单体中各羟基相对于羟乙基化的不同反应性。由于这一事实，技术人员能够有限程度地影响取代模式。
本领域中描述了一些生产羟乙基淀粉衍生物的方法。
DE 26 16 086公开了血红蛋白与羟乙基淀粉的偶联，其中第一步中，一种交联剂例如溴化氰(bromocyane)，与羟乙基淀粉结合，随后血红蛋白与中间产物连接。
HES应用的一个重要领域是稳定为获得特定生理效应而向例如循环***施用的多肽。这类多肽的一个具体例子是***，它是一种酸性糖蛋白，大约为34,000 kDa，是调节循环中的红细胞水平所必需的。
多肽和酶应用的一个众所周知的问题是这些蛋白质通常不能显示令人满意的稳定性。具体而言，***的血浆半衰期相对较短(Spivak and Hogans，1989，Blood 73，90；McMahon et al.，1990，Blood 76，1718)。这意味着治疗性血浆水平快速降低，必须进行重复静脉内施用。此外，在某些情况下，还观察到对这些肽的免疫应答。
通常认为，当多肽与聚合物分子偶联时，多肽的稳定性能够提高，且针对这些多肽的免疫应答降低。WO 94/28024公开了用聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性多肽显示免疫原性和抗原性降低，在血流中的循环远长于未偶联的蛋白质，即清除所需时间更长。然而，PEG-药物偶联物也有几个缺点，例如，它们不具有可以被体内降解途径组件识别的天然结构。因此，除了PEG-偶联物之外，还生产了其它偶联物和蛋白质聚合物。交联不同蛋白质和大分子(如聚合酶)的多种方法在文献中已有描述(参见，例如，Wong，Chemistry of protein conjugationand cross-linking，1993，CRCS，Inc.)。
本领域中公开的HES-药物偶联物具有HES不能与药物位点特异性地偶联的缺点。因此，这种偶联产生一种非常不均一的产物，它含有多种成分，由于在偶联步骤中三维结构被破坏，这些成分可能没有活性。因此，需要稳定性和/或生物活性提高的进一步改进的多肽。
生产这些偶联物的一种方法使用HES的一种氧化形式作为初始材料，该形式与一种交联化合物反应，其中所得产物与一种多肽反应，或者被进一步修饰后与一种多肽反应。该方法的一个主要缺点是，在第一步中，最初的HES必须被选择性氧化，通常在其还原性端氧化，方法是将末端的醛基和/或半缩醛基氧化为内酯，从而使整个过程更加困难且昂贵。
WO 02/08079 A2公开了含有活性剂与一种羟烷基淀粉的偶联物的化合物，其中该活性剂和羟烷基淀粉直接连接或者通过一种连接化合物连接。对于直接连接，该活性剂与羟烷基淀粉的反应在至少含有10％重量水的一种水性介质中进行。对于在水性介质中羟烷基淀粉在其还原性末端与含有结构单元-NH-的交联化合物反应产生的羟烷基淀粉衍生物，没有给出实例。所有实施例均涉及在进一步反应之前被氧化的羟烷基淀粉，因此WO 02/08079 A2的具体教导具有上述缺点。
因此，本发明的一个目的是提供一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，它允许羟烷基淀粉在其还原性末端与一种适当的化合物反应，其中该淀粉的还原性末端在反应之前未被氧化。
本发明的另外一个目的是提供一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，它允许羟烷基淀粉在其还原性末端与一种适当的化合物反应，其中该淀粉的还原性末端在反应之前未被氧化，该方法的特征还在于，羟烷基淀粉在其还原性末端与一种适当化合物反应的反应产物与至少一种其它化合物进一步反应。
本发明的另外一个目的在于提供如上所述的一种方法，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽，优选一种蛋白质，更优选***。
本发明的另外一个目的在于提供一种羟烷基淀粉衍生物，它可通过如上所述的一种方法获得，该方法包括烷基淀粉在其还原性末端与一种适当的化合物反应，其中该淀粉的还原性末端在反应之前未被氧化。
因此，本发明涉及一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，该方法包括通式(I)的羟烷基淀粉(HAS)：
以其反应之前未被氧化的还原性末端与通式(II)的一种化合物反应：
R′-NH-R″    (II)
其中，R1、R2和R3独立地是氢或者线性或分支的羟烷基，其中R′或R″或者R′和R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应。
在本发明中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。因此，在本发明中使用的术语羟烷基淀粉不只限于末端碳水化合物部分含有如通式(I)所示的羟烷基R1、R2和/或R3(为了简短起见)的化合物，也指如下化合物：其中位于淀粉分子HAS’的末端碳水化合物部分和/或其余部分任何位置的至少一个羟基被羟烷基R1、R2或R3取代。
在此处，烷基可以是线性或分支的烷基，它可以被适当取代。优选地，羟烷基含有1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子，更优选2-4个碳原子。因此，“羟烷基淀粉”优选包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中羟乙基淀粉和羟丙基淀粉是特别优选的。
含有两个或两个以上不同羟烷基的羟烷基淀粉也是可能的。
HAS中所含的至少一个羟烷基可以含有两个或两个以上的羟基。根据一个优选实施方案，HAS中所含的至少一个羟烷基含有一个羟基。
“羟烷基淀粉”也包括烷基是单取代或多取代烷基的衍生物。此处，只要HAS保持水溶性，优选烷基被卤素特别是氟、或者芳基取代。此外，羟烷基的末端羟基也可以被酯化或者醚化。
此外，也可以使用线性或分支的取代或未取代的链烯基代替烷基。
羟烷基淀粉是淀粉的一种醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本发明中也可以使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羟基的衍生物。这些衍生物可以是，例如，具有2-12个碳原子的未取代单羧酸或二羧酸的衍生物，或者是其取代衍生物的衍生物。特别有用的是具有2-6个碳原子的未取代单羧酸的衍生物，特别是乙酸的衍生物。此处，乙酰基淀粉、丁基淀粉或丙基淀粉是优选的。
此外，具有2-6个碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是优选的。
对于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二个羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的单烷基酯衍生物在本发明中也适用。
对于取代的单羧酸或二羧酸，取代基优选可以与上述取代的烷基残基的取代基相同。
淀粉的酯化技术在本领域公知(参见，例如Klemm D.et al，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，具体见chapter 4.4，Esterification of Cellulose(ISBN 3-527-29489-9)。
对于本发明的所有实施方案，羟乙基淀粉(HES)是最优选的。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
HES的特征主要在于分子量分布和取代程度。有两种方式可以描述取代程度：
1.以取代葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例描述取代程度(DS)。
2.以描述每葡萄糖部分之羟乙基数的“摩尔取代”(MS)来描述取代程度。
HES溶液作为多分散组合物存在，每个分子在聚合程度、分支位点数量和型式以及取代模式方面彼此不同。因此HES是不同分子量化合物的混合物。因此，利用统计学方法，根据平均分子量确定具体的HES溶液。在本文中，Mn计算为根据分子数的算术平均值。此外，Mw(重均分子量)代表根据HES质量的单位。
在本发明中，羟乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更优选的。对于羟乙基，羟乙基淀粉可以进一步显示0.1-0.8的摩尔取代程度，和2-20的C2：C6取代比。
对通式(I)的残基R1、R2和R3没有具体的限制，只要化合物(I)仍然能够与根据通式(II)的化合物反应。根据一个优选实施方案，R1、R2和R3独立地是氢或者具有1-10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基。氢和具有1-6个碳原子的羟烷基是优选的。烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是线性或分支的，并且可被适当取代。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或者具有1-6个碳原子的线性或分支羟烷基。
因此，R1、R2和R3可以是羟己基、羟戊基、羟丁基、羟丙基(如1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟异丙基、2-羟异丙基)、羟乙基(如1-羟乙基、2-羟乙基)或羟甲基。氢和羟乙基是优选的，氢和2-羟乙基是特别优选的。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
根据本发明，羟烷基淀粉与通式(II)的一种化合物反应，其中在与化合物(I)反应之前，化合物(II)可以与一种其它化合物反应，产生一种羟烷基淀粉衍生物。对于化合物(II)没有具体限制，只要化合物(II能够通过桥连R′与R″的NH基与化合物(I)在其未被氧化的还原性末端反应，产生一种羟烷基淀粉衍生物。
化合物(II)的优选残基R′是氢和烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以与桥连化合物(II)中R′与R″的NH基直接连接，或者根据另外一个实施方案，可以通过一个氧桥与桥连化合物(II)中R′与R″的NH基连接。烷基、芳基、芳烷基或烷芳基残基可以被适当取代。卤素，如F、Cl或Br，可以是优选的取代基。特别优选残基R′是氢、烷基和烷氧基，更优选是氢和未取代的烷基和烷氧基。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R′是氢或线性或分支的烷基或烷氧基。
在烷基和烷氧基中，含有1、2、3、4、5或6个C原子的基团是优选的。更优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特别优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R′是氢或甲基或甲氧基。
除了官能团X之外，R″还可以含有至少另外一个官能团W。该至少另外一个官能团W通常可以位于R″的任何地方。优选地，W直接连接到与R′连接的NH基上。
对官能团W通常没有具体限制，只要化合物(I)能够与化合物(II)反应。在优选实施方案中，官能团W含有结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团W选自：
和
其中，如果G存在两个，则独立地是O或S。
根据本发明优选的实施方案，其中R′是H，W与桥连R′与R″的NH基直接连接，R′和桥连R′与R″的NH基以及W组成下列基团之
Figure A0382503700183
对于R′和/或R″中(优选R″中)所含的至少一种官能团X，没有具体限制。允许与至少一种其它化合物反应的所有官能团通常都是可能的。
对于这种与一种其它化合物的反应，所述至少一种官能团与所述至少一种其它化合物之间所有种类的相互作用都是可能的。其中，所述至少一种官能团X能够与一种其它化合物反应，产生共价键、离子键和/或范德华连接，共价键是特别优选的。
其中，可提及下列官能团X：
-C-C-双键或C-C-三键或芳族C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-氨基-NH2或含有结构单元-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或者含有结构单元-O-NH-的羟氨基衍生物，如羟烷基氨基、羟芳基氨基、羟芳烷基氨基或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，它们均含有结构单元-NH-O-；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G是O或S，M是，例如：
--OH或-SH；
-烷氧基、芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；
-烷硫基、芳硫基，芳烷硫基或烷芳硫基；
-烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基氧基；
-活化酯，如羟胺的酯，其含有酰亚胺结构如N-羟基琥珀酰亚胺，或者含有结构单元O-N，其中N是杂芳基化合物的一部分，或者含有G＝O而没有Q，如含有取代芳基残基的芳氧基化合物，如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基；
其中不合Q或者Q是NH或杂原子，如S或O；
--NH-NH2或-NH-NH-；
--NO2；
-腈基；
-羰基，如醛基或酮基；
-羧基；
--N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-乙烯基卤素基团，如乙烯基碘或乙烯基溴基团，或乙烯基三氟甲磺酸酯(vinyltriflate)；
--C≡C-H；
--(C＝NH2Cl)-O烷基
--(C＝O)-CH2-Hal，其中Hal是Cl、Br或I；
--CH＝CH-SO2-；
-含有结构-S-S-的二硫醚基团；
-基团
-基团
在这些基团中，巯基、氨基、羟氨基、烷氧氨基和下列基团是特别优选的：
Figure A0382503700203
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中所述至少一个官能团X选自：-SH、-NH2、-O-NH2、-NH-O-烷基、-(C＝G)-NH-NH2、-G-(C＝G)-NH-NH2、-NH-(C＝G)-NH-NH2和-SO2-NH-NH2，其中G是O或S，如果G存在两个，则独立地是O或S。
对于涉及的烷氧基氨基，特别优选丙氧基氨基、乙氧基氨基和甲氧基氨基，甲氧基氨基-NH-O-CH3是特别优选的。
根据本发明的另一方面，所述至少一个官能团X可以是不能与一种指定的其它化合物直接反应，但是可以被化学修饰以便能够以希望的方式反应的基团。化合物(II)中所含的官能团X的这种修饰可以在化合物(II)与化合物(I)反应之前或者在化合物(II)与化合物(I)反应之后进行。如果化合物(II)含有至少两个任选地化学上不同的官能团X，那么可以在化合物(II)与化合物(I)反应之前修饰至少一个官能团X，在化合物(II)与化合物(I)反应之后修饰至少一个官能团X。
可在与一种其它化合物反应之前修饰的官能团X的例子包括可通过例如氧化修饰形成醛或酮基的1，2-氨基醇或1，2-二醇。
可在与一种其它化合物反应之前修饰的官能团X的另外一个例子是通过与例如根据下列通式的化合物反应而修饰的-NH2基：
产生下列通式的结构：
它对例如巯基具有反应性。
可在与一种其它化合物反应之前修饰的官能团X的另外一个例子是通过与例如根据下列通式的化合物反应而修饰的-NH2基：
Figure A0382503700213
产生下列通式的结构：
Figure A0382503700221
它对例如巯基具有反应性。
所述至少一个官能团X可以与桥连R’与R”的NH基直接连接。因此，根据本发明的一个优选实施方案，官能团X相当于R″。X与桥连R’与R”的NH基直接连接的化合物的具体例子包括：
H2N-NH2或
或
本发明包括的这种化合物的另外一个具体例子是NH3。
根据本发明的另外一个实施方案，桥连R’与R”的NH基可以与所述至少一个官能团X用线性或分支的烷基或环烷基或芳基或芳烷基或芳基环烷基或烷芳基或环烷基芳基隔开，其中这些基团可以含有至少一个杂原子如N、O、S，并且这些基团可以被适当取代。分隔桥连R’与R”的NH与所述至少一个官能团X的基团的大小可以根据具体的需要调整。分隔基团通常含有1-60个、优选1-40个、更优选1-20个、更优选1-10个、更优选1-6个、特别优选1-4个碳原子。如果含有杂原子，分隔基团通常含有1-20个、优选1-8个、特别优选1-4个杂原子。根据本发明特别优选的实施方案，分隔基团含有1-4个氧原子。分隔基团可含有具有例如5-7个碳原子的任选地分支的烷基链或芳基或者环烷基，或者芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是线性和/或环状烷基。根据一个更优选的实施方案，分隔基团是具有1-20个、优选1-8个、更优选1-6个、更优选1-4个、特别优选2-4个碳原子的烷基链。如果含有杂原子，则含有1-4个氧原子的链是特别优选的。
X与桥连R’与R”的NH基被分隔开的化合物(II)的具体例子包括：
分隔桥连R’与R”的NH基与所述至少一个官能团X的基团可以被适当取代。优选的取代基是例如卤素原子，如F、Cl、Br或I。
分隔桥连R’与R”的NH基与所述至少一个官能团X的基团可以含有一个或多个切割位点，如
-S-S-
该位点允许在预定位点容易地切割所产生的化合物。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，化合物(II)是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺
Figure A0382503700252
或碳酰肼
Figure A0382503700253
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(II)是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺或碳酰肼。
如果化合物(II)含有一个或多个手性中心，则化合物(II)可以是R构象或者S构象，或者是相对于每一个手性中心的外消旋化合物。
如上所述，化合物(I)可以与化合物(II)反应，或者与在与化合物(I)反应之前已经与至少一种其它化合物反应了的化合物(II)反应。
化合物(I)与化合物(II)的反应可以在至少一种适当的溶剂中进行。各溶剂或者两种或两种以上溶剂的混合物可以根据反应条件的具体需要和化合物(I)和化合物(II)的化学性质调整。根据本发明的一个特别优选的实施方案，水可以作为溶剂单独使用，或者与至少另外一种溶剂组合使用。所述至少另外一种溶剂可以是DMSO、DMF、甲醇和乙醇。水之外的优选溶剂是DMSO、DMF、甲醇和乙醇。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应在一种水性体系中进行。
如本发明中所用的术语“水性体系”指一种溶剂或溶剂的混合物，其中含有基于溶剂重量的至少10％重量的水，优选至少50％重量，更优选至少80％重量，更优选至少90％重量，或者可达100％重量的水。优选的反应介质是水。
对于反应过程中的温度，没有具体限制，只要反应产生希望的羟烷基淀粉衍生物即可。
如果化合物(I)与化合物(II)反应，且化合物(II)是一种羟胺或酰肼，则温度优选为5-45℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
如果化合物(I)与化合物(II)反应，且该反应是还原胺化，则温度优选地高达100℃，更优选20-95℃，更优选25-90℃，更优选70-90℃，特别优选75-85℃。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(II)是一种羟胺或酰肼，化合物(I)与化合物(II)的反应在5-45℃下进行。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应是一种还原胺化，在25-90℃下进行。
在反应过程中，温度可以变化，优选在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
化合物(I)与化合物(II)的反应时间可以根据具体需要改变，通常是1小时到7天。
如果化合物(II)是一种羟胺或酰肼，反应时间优选为1小时-3天，更优选地2小时-48小时。
如果化合物(I)与化合物(II)的反应是还原胺化，反应时间优选是2小时-7天。
化合物(I)与化合物(II)反应的pH值可以根据具体需要(如反应物的化学性质)调整。
如果化合物(II)是羟胺或酰肼，pH值优选为4.5-6.5。
如果化合物(I)与化合物(II)的反应是还原胺化，pH值优选为8-12。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(II)是一种羟胺或酰肼，化合物(I)与化合物(II)的反应在pH4.5-6.5下进行。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应是还原胺化，在pH8-12下进行。
上述反应条件的具体例子包括，例如：如果化合物是一种羟胺，反应温度约为25℃，pH约为5.5，如果化合物(I)与化合物(II)的反应是还原胺化，反应温度约为80℃，pH约为11。
反应混合物的适当pH值可以通过添加至少一种适当的缓冲液调节。优选的缓冲液包括乙酸钠缓冲液、磷酸或硼酸盐缓冲液。
根据本发明的一个优选实施方案，化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应。
必要时，在化合物(I)与化合物(II)反应之前，可以用至少一种适当的保护基保护所述至少一个官能团X。在这个方面，可以使用所有可能防止受保护的化合物(II)通过所述至少一个官能团X与化合物(I)反应的保护基。因此，可以根据要保护的官能团X的化学性质，根据例如在其中进行反应的溶剂，或者根据反应混合物的pH，选择保护基。优选的保护基包括苄氧羰基、叔丁氧羰基、甲氧基苯基、2，4-二甲氧基苯基、三芳基甲基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、单甲基三苯甲基、二甲基三苯甲基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺化合物、2-(三烷基甲硅烷基)乙氧基羰基化合物、Fmoc、叔丁基或三烷基甲硅烷基。
如果化合物(II)中存在两个或两个以上不同的官能团X，则至少一个基团可以被保护，而至少另外一个基团可以不被保护。
在化合物(I)与化合物(II)反应后，所述至少一个保护基可以在反应产物中存在，或者可以通过适当的方法除去，如通过本领域技术人员公知的常规方法除去。如果两个不同的官能团X用适当的保护基保护，则可以除去至少一个保护基，以使至少一个官能团X可以与至少一种其它化合物进一步反应，并且使至少另外一个官能团受到保护，直到含有化合物(I)与化合物(II)的反应产物与一种其它化合物反应。之后可以除去仍然受到保护的官能团的保护基，使剩下的官能团X可以与一种其它化合物反应。
为了防止反应产生如下一种羟烷基淀粉衍生物，使用至少一个保护基可能至关重要：该羟烷基淀粉含有已经与两个或两个以上化合物(I)反应的化合物(II)，即多HAS取代的化合物(II)。化合物(I)与过量的化合物(II)反应也可以获得相同效果。如果在本发明的方法中使用过量的化合物(II)，化合物(II)与化合物(I)的摩尔比优选为2-100。
一旦化合物(I)与化合物(II)形成反应产物，即可利用至少一种适当的方法从反应混合物中分离。必要时，在分离之前可以利用至少一种适当的方法沉淀反应产物。
如果首先沉淀反应产物，例如，可以在适当温度下使反应混合物接触至少一种与反应混合物中所含的溶剂或溶剂混合物不同的溶剂或溶剂混合物。根据使用水作为溶剂的本发明的一个特别优选的实施方案，在一定温度下，优选在-20-+50℃，特别优选在0-25℃下，反应混合物接触乙醇与丙酮的混合物(优选1∶1混合物，表示这些化合物等体积)。
反应产物的分离可以用包括一个或多个步骤的一种适当的方法进行。根据本发明的一个优选实施方案，首先利用一种适当的方法，如离心或过滤，将反应产物与反应混合物或反应混合物与例如乙醇-丙酮混合物的混合物分离。第二步，可以进一步处理分离的反应产物，如处理后的透析、离心过滤或正压式过滤、离子交换层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据一个更优选的实施方案，分离的反应产物首先优选用水透析，然后冻干，直到根据产物希望的特性反应产物的溶剂含量足够低。冻干可以在20-35℃下，优选地在25-30℃下进行。
这样分离的化合物(I)与化合物(II)的反应产物可以通过所述反应产物中所含的至少一个官能团X与至少一种其它化合物进一步反应。
根据官能团X的化学性质，可以使用能够与基团X形成化学键的任何可能的化合物。对于该反应，可以使用一种或多种适当的溶剂，可以根据具体需要调节所有反应参数，如反应过程中的温度、反应时间、反应物的比例或反应混合物的pH值。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，能够与所述至少一个官能团X形成化学键的所述至少一种化合物是一种多肽或至少两种不同多肽的混合物。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的官能团X与多肽反应。
根据本发明的另外一个特别优选的实施方案，能够与所述至少一个官能团X形成化学键的所述至少一种其它化合物是一种交联化合物，它能够与化合物(I)和化合物(II)的反应产物的所述至少一个官能团X形成第一种化学键，与第二种化合物形成第二种化学键。
根据本发明的一个更优选的实施方案，第二种化合物是一种多肽或至少两种不同多肽的混合物。
在本发明的这个实施方案中，化合物(I)与化合物(II)的反应产物，即第一种羟烷基淀粉衍生物，能够与交联化合物反应，产生第二种羟烷基淀粉衍生物。这第二种羟烷基淀粉衍生物随后可以与第二种化合物(优选多肽)反应，产生第三种羟烷基淀粉衍生物。
然而，化合物(I)与化合物(II)的反应产物，即第一种羟烷基淀粉衍生物，也可以与交联化合物和第二种化合物(优选多肽)的反应产物反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中通过一种其它化合物中所含的官能团V与化合物(I)和化合物(II)的反应产物中所含的官能团X反应，化合物(I)与化合物(II)的反应产物与所述一种其它化合物反应，该其它化合物是一种交联化合物。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中通过一种其它化合物中所含的官能团V与化合物(I)和化合物(II)的反应产物中所含的官能团X反应，化合物(I)与化合物(II)的反应产物与所述其它化合物反应，该其它化合物是一种交联化合物，在与化合物(I)和化合物(II)的反应产物反应之前，该交联化合物已经与第二种其它化合物反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中第二种其它化合物是一种多肽，优选***，它通过交联化合物中所含的官能团X的反应，与交联化合物反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(II)与第一种其它化合物(优选一种交联化合物)反应，产生第一种反应产物，这第一种反应产物与第二种其它化合物反应，产生第二种反应产物，这第二种反应产物与化合物(I)反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中第一种其它化合物(优选一种交联化合物)与第二种其它化合物(优选一种多肽)反应，产生第一种反应产物，该第一种反应产物与化合物(II)反应，产生第二种反应产物，该第二种反应产物与化合物(I)反应，产生羟烷基淀粉衍生物。
根据本发明特别优选的实施方案，利用交联化合物在化合物(II)或化合物(I)与化合物(II)的反应产物与第二种其它化合物之间形成化学键，其中与交联化合物反应的第二种其它化合物的官能团是-SH基或醛基或酮基，与交联化合物反应的化合物(II)或化合物(I)与化合物(II)的反应产物的官能团是含有结构-NH-、特别优选地含有-NH2的基团。
在本发明中，术语“交联化合物”指能够在化合物(II)或化合物(I)和化合物(II)的反应产物与至少一种指定的第二种其它化合物之间形成键连的化学化合物。根据第二种其它化合物的化学性质，交联化合物含有至少一个官能团V，V能够与化合物(II)或化合物(I)和化合物(II)的反应产物中所含的官能团X反应，还含有至少另外一个官能团，它能够与第二种其它化合物形成化学键。交联化合物中含有的至少另外一个官能团可以是以上关于官能团X所述类型的官能团。
可以利用交联化合物延长化合物(I)与第二种其它化合物(优选多肽)之间总化学桥接的长度，和/或影响含有或不含第二种其它化合物的所得反应产物的化学性质，和/或提供在几种第二种其它化合物与化合物(I)、(II)和交联化合物的反应产物之间形成键的可能性，和/或化学修饰化合物(I)与(II)的反应产物中所含的官能团X，以使该反应产物能够与一种指定的其它化合物反应。
因此，本发明上述讨论的实施方案，即涉及为了提供与第二种其它化合物(优选多肽)所含-SH基反应的可能性，用如下一种其它化合物对具体为-NH2基的官能团X进行化学修饰的实施方案：
或
是化合物(I)和化合物(II)的反应产物与一种交联化合物反应的具体实例。
根据本发明的一个优选实施方案，官能团V可以是以上关于基团X所述类型的官能团。
根据另外一个优选实施方案，官能团X或官能团V是一个巯基，官能团V或官能团X优选地选自：
其中Hal是Cl、Br或I，优选Br或I。
根据另外一个优选实施方案，官能团X或官能团V选自如上所述的活化酯，或任选地转化为活化酯的羧基。在这种具体情况中，官能团V或官能团X分别含有化学结构-NH-。
因此，交联化合物是含有至少两个相同或不同的官能团的化合物。对于两个官能团，交联化合物可以是同双功能或异双功能化合物。同双功能交联化合物，例如，提供化合物(I)和化合物(II)的反应产物与第二种其它化合物形成桥接的可能性，该反应产物和该其它化合物含有相同类型的官能团。异双功能交联化合物，例如，提供化合物(I)和化合物(II)的反应产物与第二种其它化合物形成一个桥接的可能性，该反应产物和该其它化合物含有彼此不能反应的官能团。
交联化合物的至少两个官能团可以直接连接在一起，或者可以用一个线性或分支的烷基或环烷基或芳基或芳烷基或芳基环烷基或烷芳基或环烷基芳基隔开，其中这些基团可以含有至少一个杂原子，如N、O、S，其中这些基团可以被适当地取代。分隔交联化合物的至少两个官能团的基团的长度可以根据具体需要调整。分隔基团通常含有1-60个，优选1-40个，更优选1-20个，更优选1-10个，更优选5-10个碳原子。如果含有杂原子，分隔基团通常含有1-20个，优选1-8个，特别优选1-4个杂原子。根据一个更优选的实施方案，分隔基团是1-20个碳原子的烷基或芳烷基链。而且，该交联化合物还可含有至少一个如以上对于化合物(II)所述的切割位点。
在本发明中提到的交联化合物的其它例子例如可以按照以下列表分类：
交联化合物的类型   能够与第二种其它化合物(优选多肽)反应的官能团 官能团V
    A   酰肼(醛反应性) 马来酰亚氨基(SH反应性)
    B   酰肼(醛反应性) 吡啶基二硫基(SH反应性)
    C   碘烷基(SH反应性) N-琥珀酰亚胺酯(胺反应性)
    D   溴烷基(SH反应性) N-琥珀酰亚胺酯(胺反应性)
    E   马来酰亚氨基(SH反应性) N-琥珀酰亚胺酯(胺反应性)
    F   吡啶基二硫基(SH反应性) N-琥珀酰亚胺酯(胺反应性)
    G   乙烯基砜(SH反应性) N-琥珀酰亚胺酯(胺反应性)
在本说明书结尾处的表1中列出了交联化合物的一些优选实例。
如果所述至少一种其他化合物，例如交联化合物，含有一个或多个手性中心，所述至少一种其它化合物可以是R构象或者S构象，或者是相对于每一个手性中心的外消旋化合物。
本发明中使用的术语“多肽”指一种化合物，其含有至少两个通过肽键(即含有结构-(C＝O)-NH-的键)连接的氨基酸。多肽可以是天然存在的化合物，或非天然存在的多肽，后者含有天然存在的氨基酸和/或至少一种非天然存在的氨基酸。多肽的骨架即多肽链，可以进一步用至少一种适当的取代基取代，从而含有至少一个侧链。所述至少一个官能团Y可以是多肽骨架的一部分，或者是骨架的至少一个取代基的一部分，其中以下实施方案是可能的：其含有至少一个作为多肽骨架一部分的官能团，和至少一个作为多肽骨架的至少一个取代基的一部分的官能团。
对于所述多肽没有任何限制，只要该多肽含有至少一个官能团Y。该官能团Y可以与多肽骨架直接连接，或者是该骨架侧链的一部分。侧链或官能团Y或者这两者可以是天然存在的多肽的一部分，或者可以在与官能团X反应之前被引入一种天然存在的多肽内或至少部分非天然存在的多肽内。
而且，该多肽可以至少部分是任何人或动物来源的。在一个优选实施例中，该多肽是人源的。
该多肽可以是一种细胞因子，特别是***，抗凝血酶(AT)如AT III，白介素特别是白介素-2、IFN-β、IFN-α、G-CSF、CSF、白介素-6和治疗性抗体。
根据一个优选实施方案，该多肽是抗凝血酶(AT)，优选AT III(Levy JH，Weisinger A，Ziomek CA，Echelard Y，RecombinantAntithrombin：Production and Role in Cardiovascular Disorder，Seminarsin Thrombosis and Hemostasis 27，4(2001)405-416；Edmunds T，VanPatten SM，Pollock J，Hanson E，Bernasconi R，Higgins E，Manavalan P，Ziomek C，Meade H，McPherson J，Cole ES，Transgenically ProducedHuman Antithrombin：Structural and Functional Comparison to HumanPlasma-Derived Antithrombin，Blood 91，12(1998)4661-4671；MinnemaMC，Chang ACK，Jansen PM，Lubbers YTP，Pratt BM，Whittaker BG，Taylor FB，Hack CE，Friedman B，Recombinant human antithrombin IIIimproves survival and attenuates inflammatory responses in baboonslethally challenged with Escherichia coli，Blood 95，4(2000)1117-1123；Van Patten SM，Hanson EH，Bernasconi R，Zhang K，Manavaln P，ColeES，McPherson JM，Edmunds T，Oxidation of Methionine Residues inAntithrombin，J.Biol.Chemistry 274，15(1999)10268-10276)。
根据另外一个优选实施方案，该多肽是人IFN-β，特别是IFN-β1a(参见Avonex，REBIF)和IFN-β1b(参见BETASERON)。
另外一种优选的多肽是人G-CSF(粒细胞集落刺激因子)。参见，例如，Nagata et al..，The chromosomal gene structure and two mRNAs forhuman granulocyte colony-stimulating factor，EMBO J.5：575-581，1986；Souza et al.，Recombinant human granulocyte colony-stimulatingfactor：effects on normal and leukemic myeloid cells，Science 232(1986)61-65；Herman et al.，Characterization，formulation，and stability ofNeupogen (Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor，in：Formulalion，characterization，and stability ofprotein drugs，Rodney Pearlman and Y.John Wang，eds.，Plenum Press，New York，1996，303-328。
如果使用至少两种不同多肽的混合物，则这两种多肽在例如分子量、氨基酸数量和/或序列、不同糖基化程度、取代基的数量和/或化学性质或通过适当化学键(如二硫键)连接的多肽链的数量方面可能不同。
根据本发明的一个优选实施方案，优选按照至少上述方法之一，分离化合物(I)与化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物进一步反应)，该反应产物然后与一种多肽反应形成至少一个化学键，该多肽含有至少一个官能团Y，官能团Y能够与化合物(I)与化合物(II)的反应产物的所述至少一个官能团X反应。多肽如蛋白质的官能团Y是，例如：
-SH-OH
Figure A0382503700351
或者是可以通过N-糖基化或O-糖基化与该多肽连接的碳水化合物部分。
在本发明中，术语“碳水化合物部分”指羟基醛或羟基酮，以及它们的化学修饰(见Rmpp Chemielexikon，Thieme Verlag Stuttgart，Germany，9th edition 1990，Volume 9，pages 2281-2285，和此处引用的文献)。此外也指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。该术语也包括化学氧化的天然存在的碳水化合物部分。氧化的碳水化合物部分的结构可以是环状或线性的。
碳水化合物部分可以与多肽骨架直接连接。优选地，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一部分。更优选地，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的末端部分。
在一个更优选的实施方案中，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的半乳糖残基，优选是碳水化合物侧链的末端半乳糖残基。如下文所述，通过除去末端唾液酸随后氧化，该半乳糖残基能够与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
在另外一个优选实施方案中，化合物(I)与化合物(II)的反应产物与碳水化合物侧链的一个唾液酸残基连接，优选地与碳水化合物侧链的末端唾液酸残基连接。
末端碳水化合物部分的氧化可以以化学或酶学方法进行。
化学氧化多肽碳水化合物部分的方法在本领域公知，包括高碘酸盐处理(Chamow et al.，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
通过化学氧化，原则上能够氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通过选择温和条件(1mM高碘酸盐，0℃，不同于严格条件：10mM高碘酸盐，室温1小时)，优选地可以氧化碳水化合物侧链的末端唾液酸。
此外，碳水化合物部分也可以用酶氧化。氧化各种碳水化合物部分的酶在本领域公知，例如，对于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。如果准备氧化末端半乳糖部分，如果在能够连接唾液酸与碳水化合物链的细胞例如在哺乳动物细胞中，或者在遗传修饰后能够连接唾液酸与碳水化合物链的细胞中生产多肽，最终必须(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化学或酶学方法在本领域中公知(Chaplin andKennedy(eds.)，1996，Carbohydrate Analysis：a prac-tical approach，具体见Chapter 5 Montreuill，Glycoproteins，pages 175-177；IRL PressPractical approach series(ISBN 0-947946-44-3))。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽通过多肽中所含的氧化的碳水化合物部分反应。
根据本发明的另外一个优选实施方案，多肽的官能团是巯基。因此，化合物(I)与化合物(II)的反应产物可以通过硫醚基团与该多肽连接，其中S原子可能来源于该多肽所含的任何巯基。
多肽中本身可能存在巯基。另外，可以用一种适当的方法向多肽中引入巯基。其中包括化学方法。如果多肽中含有二硫桥键，则可以还原-S-S-结构，产生巯基。也可以将多肽中存在的氨基转化为SH基，方法是该多肽通过氨基与一种化合物反应，该化合物含有至少两个不同的官能团，其中一个能够与氨基反应，另外一个是SH基或SH基的前体。氨基的这种修饰可以被认为是如下方案的一个例子，其中蛋白质首先与化合物(L)反应，化合物(L)含有至少两个不同的官能团，其中一个能够与氨基反应，另外一个是SH基，产生的反应产物然后与例如含有HAS和化合物(D)的HAS衍生物反应，该衍生物含有能够与SH基反应的官能团。也可以通过多肽的突变引入SH基，例如通过向多肽内引入半胱氨酸或适当的SH功能性氨基酸，或者例如从多肽上除去一个半胱氨酸，从而使多肽中的另外一个半胱氨酸不能形成二硫键。
在该实施方案中，特别优选使多肽与一种反应产物反应，该反应产物是化合物(I)和化合物(II)的反应产物与一种交联化合物反应产生的。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与一种交联化合物反应，产生的反应产物与多肽通过多肽中所含的氧化的碳水化合物部分和/或巯基进一步反应。
使用***(EPO)作为一种特别优选的多肽。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中该多肽是***。
EPO可以来源于任何人(参见，例如，Inoue，Wada，Takeuchi，1994，An improved method for the purification of human erythropoietin withhigh in vivo activity from the urine of anemic patients，Biol.Pharm.Bull.17(2)，180-4；Miyake，Kung，Goldwasser，1977，Purication of humanerythropoietin.，J.Biol.Chem.，252(15)，5558-64)或者另外一种哺乳动物，可以从自然存在的来源(如人肾脏、人胚胎肝脏，或动物，优选猴肾)中纯化获得。此外，“***”或“EPO”也包括EPO变体，其中一个或多个氨基酸(例如1-25个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1个或2个)已经被置换为另外的氨基酸，并显示红细胞生成活性(参见，例如EP 640 619 B1)。红细胞生成活性的测定在本领域中有描述(关于体外活性的测定，参见，例如Fibi et al.，1991，Blood，77，1203 ff；Kitamura et al.，1989，J.Cell Phys.，140，323-3341991，Blood，77，1203 ff；关于EPO体内活性的测定，参见Ph.Eur.2001，911-917；Ph.Eur.2000，1316 Erythropoietini solutio concentrata，780-785；European Pharmacopoeia(1996/2000)；European Pharmacopoeia，1996，Erythropoietin concentrated solution，Pharmaeuropa.，8，371-377；Fibi，Hermentin，Pauly，Lauffer，Zettlmeissl.，1995，N-and O-glycosylationmuteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21cells，Blood，85(5)，1229-36；(在第1、2、3天对雌性NMRI小鼠注射EPO和修饰的EPO型(等量50ng蛋白质/小鼠)，在第4天采集血样，测定网织红细胞))。关于EPO活性测定的其它出版物包括：Barbone，Aparicio，Anderson，Natarajan，Ritchie，1994，Reticulocytesmeasurements as a bioassay for erythropoietin，J.Pharm.Biomed.Anal.，12(4)，515-22；Bowen，Culligan，Beguin，Kendall，Villis，1994，Estimation of effective and totalerythropoiesis in myelodysplasia usingserum transferrin receptor and erythropoietin concentrations，withautomated reticulocyte parameters，Leukemi，8(1)，151-5；Delorme，Lorenzini，Giffin，Martin，Jacobsen，Boone，Elliott，1992，Role ofglycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin，Biochemistry，31(41)，9871-6；Higuchi，Oh-eda，Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka，Ochi，1992；Role of sugar chains in the expression of thebiological activity of human erythropoietin，J.Biol.Chem.，267(11)，7703-9；Yamaguchi，Akai，Kawanishi，Ueda，Masuda，Sasaki，1991，Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in humanerythropoietin on its production and biological properties，J.Biol.Chem.，266(30)，20434-9；Takeuchi，Inoue，Strickland，Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi，Takasaki，Kobata，1989，Relationship between sugarchain structure and biological activity of recombinant humanerythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(20)，7819-22；Kurtz，Eckardt，1989，Assay methods forerythropoietin，Nephron.，51(1)，11-4(German)；Zucali，Sulkowski，1985，Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass andsilicic acid，Exp.Hematol.，13(3)，833-7；Krystal，1983，Physical andbiological characterization of erythroblast enhancing factor(EEF)，a lateactingerythropoietic stimulator in serum distinct from erythropoietin，Exp.Hematol.，11(1)，18-31。
优选重组生产EPO。包括在真核或原核细胞中生产，优选地在哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞中或者在适于重组生产EPO的其它任何细胞型中生产。此外，EPO也可以在转基因动物中(例如在体液中，如奶、血液等)、在转基因鸟特别是在家禽优选在鸡的蛋中，或者在转基因植物中表达。
多肽的重组生产在本领域中公知。通常包括用一种适当的表达载体转染宿主细胞，在能够生产多肽的条件下培养宿主细胞，以及从宿主细胞中纯化多肽。关于详细信息，参见例如：Krystal，Pankratz，Farber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin to homogeneity by arapid five-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression and purification of arecombinant human erythropoietin produced using abaculovilms vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1。
在一个优选实施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列(见EP148 605 B2)。
EPO可以含有通过N-和/或O-连接的糖基化作用与EPO连接的一个或多个碳水化合物侧链，优选1-12个、更优选1-9个、更优选1-6个、特别是1-4个、特别优选4个碳水化合物侧链，即EPO被糖基化。当在真核细胞中生产EPO时，多肽通常在翻译后糖基化。因此，在哺乳动物特别是在人、昆虫或酵母细胞内的生物合成过程中，碳水化合物侧链可以与EPO连接。糖基化EPO的结构和性质在本领域中已经广泛研究(参见EP 428 267 B1；EP 640 619 B1；Rush，Derby，Smith，Merry，Rogers，Rohde，Katta，1995，Microheterogeneity oferythropoietin carbohydrate structure，Anal Chem.，67(8)，1442-52；Takeuchi，Kobata，1991，Structures and functional roles of the sugarchains of humanerythropoietins，Glycobiology，1(4)，337-46(综述)。
因此，本发明的羟烷基淀粉衍生物中每个EPO分子可以含有至少1个、优选1-12个、更优选1-9个、更优选地1-6个、特别优选1-4个HAS分子。每个EPO分子的HAS分子数可以在产物水解以及获得的单糖衍生化后，利用GC-MS，通过定量碳水化合物组成分析测定(见Chaplin and Kennedy(eds.)，1986，Carbohydrate Analysis：apractical approach，IRL Press Practical approach series(ISBN0-947946-44-3)，具体见Chapter 1，Monosaccharides，page 1-36；Chapter 2，Oligosaccharides，page 37-53，Chapter 3，NeutralPolysaccharides，page 55-96)。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，与EPO连接的碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一部分。更优选地，该碳水化合物部分是碳水化合物侧链的末端部分。在一个更优选的实施方案中，该碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一个半乳糖残基，优选地是碳水化合物侧链的末端半乳糖残基。如下文所述，通过除去末端唾液酸，随后氧化，该半乳糖残基能够与化合物(I)和化合物(II)的反应产物反应。在另外一个优选实施方案中，化合物(I)和化合物(II)的反应产物与碳水化合物侧链的唾液酸残基连接，优选地与碳水化合物侧链的末端唾液酸残基连接。唾液酸按如下文所述进行氧化。
特别优选地，通过除去末端唾液酸，随后氧化，使得半乳糖残基可以通过官能团X与化合物(I)和化合物(II)的反应产物反应，或者与化合物(I)、化合物(II)和交联化合物的反应产物反应。
如上所述，化合物(I)和化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物反应)可以与EPO中所含的巯基反应。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物反应)也可以与含于所述至少一种其它化合物(优选多肽，更优选***)中的巯基以及碳水化合物部分反应。
根据一个优选实施方案，该SH基可以与一个优选氧化的碳水化合物部分连接，例如通过使用羟胺衍生物，例如2-(氨氧基)乙硫醇盐酸盐(Bauer L.et al.，1965，J.Org.Chem.，30，949)，或者通过使用酰肼衍生物，例如巯基乙酸酰肼连接(Whitesides et al.，1977，J.Org.Chem.，42，332)。
根据一个进一步优选的实施方案，优选地将巯基引入EPO的氧化的碳水化合物部分中，更优选地引入作为EPO碳水化合物侧链一部分的氧化的碳水化合物部分中。
优选地，该巯基来源于天然存在的半胱氨酸，或者来源于添加的半胱氨酸。更优选地，EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。在一个更优选的实施方案中，化合物(I)与化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物反应)与半胱氨酸29反应，而半胱氨酸33被置换为另外一种氨基酸。或者，化合物(I)与化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物反应)也可以与半胱氨酸33反应，而半胱氨酸29被置换为另外一种氨基酸。
在本发明中，术语“添加的半胱氨酸”指多肽(优选EPO)含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸残基。
在本发明该方面中，半胱氨酸可以是在EPO的N端或C端添加的额外氨基酸。
此外，也可以通过将天然存在的氨基酸置换为半胱氨酸或适当取代的半胱氨酸来添加半胱氨酸。优选地，在本发明该方面中，EPO是人EPO，被置换的氨基酸残基是丝氨酸126。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物(任选地与一种交联化合物反应)与所述至少一种其它化合物反应的反应条件可以根据各自反应的具体需要调整，例如，所述至少一种其它化合物是多肽，或者所述至少一种其它化合物是交联化合物，或者所述至少一种其它化合物是交联化合物与多肽的反应产物。优选地可以使用至少一种上述缓冲化合物作为缓冲化合物。优选地可以使用至少一种上述溶剂作为溶剂或溶剂混合物。可以进行分离和/或后处理，其中优选的方法选自上述方法。
如果化合物(I)与化合物(II)的反应产物例如与作为其它化合物的一种多肽(优选EPO)进一步反应，优选水作为反应溶剂。除了水之外，还可以含有至少另外一种溶剂。作为优选可能使用的其它溶剂有DMSO、DMF、甲醇或乙醇。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与一种多肽(优选EPO)的反应在水性***中进行。
关于反应过程中采用的温度没有具体限制，只要反应产生希望的羟烷基淀粉衍生物，其含有通过所述至少一个官能团X与多肽反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物。反应温度优选为4-37℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽的反应在4-37℃下进行。
在反应过程中，温度可以变化，优选在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽反应的反应时间可以根据具体需要调整，通常为0.5-48小时，优选2-24小时，特别优选10-20小时。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽反应的pH值可以根据具体需要(如反应物的化学性质)调节。
例如，如果化合物(I)与化合物(II)的反应产物与一种其它化合物的反应通过官能团X(羟氨基-O-NH2)与多肽中所含的至少一个醛基反应来进行，pH优选为4.5-6，更优选约5.5。
如果化合物(I)与化合物(II)的反应产物例如进一步与作为其它化合物的交联化合物(优选EPO)反应，优选水作为反应溶剂。除了水之外，还可以含有至少另外一种溶剂。优选可能使用的其它溶剂有DMSO、DMF、甲醇或乙醇。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物的反应在水性***中进行。
关于反应过程中采用的温度没有具体限制，只要反应产生希望的羟烷基淀粉衍生物，其含有通过所述至少一个官能团X与该交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物。反应温度优选为4-37℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物的反应在4-37℃下进行。
在反应过程中，温度可以变化，优选地在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物反应的反应时间可以根据具体需要调整，通常为10分钟-10小时，优选20分钟-5小时，更优选30分钟-2小时。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物反应的pH值可以根据具体需要(如反应物的化学性质)调节。
例如，如果化合物(I)与化合物(II)的反应产物与一种交联化合物通过化合物(I)与化合物(II)的反应产物中所含的官能团X(氨基，-NH2)反应，pH优选为7-8.5，更优选约7.2。
例如，如果化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物反应的反应产物进一步与一种多肽(优选EPO)反应，优选用水作为反应溶剂。除了水之外，还可以含有至少另外一种溶剂。优选可能的其它溶剂有DMSO、DMF、甲醇或乙醇。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中进一步与交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽的反应在水性***中进行。
关于反应过程中采用的温度没有具体限制，只要反应产生希望的羟烷基淀粉衍生物，其含有化合物(I)与(II)的反应产物(通过交联化合物中所含的所述至少一个官能团X与交联化合物反应，并且进一步与一种多肽反应)。反应温度优选为4-37℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中进一步与交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽的反应在4-37℃下进行。
在反应过程中，温度可以变化，优选在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
进一步与交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽反应的反应时间可以根据具体需要调整，通常为0.5-48小时，优选2-24小时，特别优选10-20小时。
进一步与交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物与多肽反应的pH值可以根据具体需要(如反应物的化学性质)调节。
例如，如果进一步与交联化合物反应的化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过交联化合物中所含的官能团X氨基(-NH2)与多肽反应，pH优选为7-8.5，更优选约7.2。
在所有情况下，都可以通过添加至少一种适当的缓冲液调节反应混合物的适当pH值。优选的缓冲液包括乙酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液或硼酸盐缓冲液。
化合物(I)与化合物(II)的反应产物与所述至少一种其它化合物反应产生的反应产物(所述至少一种其它化合物是一种多肽或者一种交联化合物，该反应产物还含有化合物(I)、化合物(II)、一种交联化合物和一种多肽反应所产生的化合物)，可以通过至少一种适当的方法从反应混合物中分离，并且进行至少一种进一步的处理，如至少一种后处理例如透析和/或冻干。
一旦上述反应产物形成，即可以利用至少一种适当的方法从反应混合物中分离。
反应产物的分离可以用可能包括一个或多个步骤的一种适当的方法进行。
根据本发明的一个优选实施方案反应产物不含多肽时，优选利用离心过滤首先从反应混合物或反应混合物的混合物中分离反应产物。第二步，可以对分离的反应产物进行进一步的处理，如后处理例如透析和/或冻干。根据一个更优选的实施方案，分离的反应产物首先优选用水透析，然后冻干，直到根据希望的产物特性反应产物的溶剂含量足够低。
根据本发明的另外一个实施方案反应产物含有多肽时，优选如实施例7.8所述分离该反应产物。
根据本发明的另外一个实施方案，化合物(II)在与化合物(I)反应之前与一种其它化合物反应，即如上所述，在与化合物(I)反应之前，化合物(II)通过所述至少一个官能团X与含有至少一个官能团Y的至少一种其它化合物反应，产生化合物(II)的一种衍生物。
如果化合物(II)首先与一种其它化合物(优选一种多肽，更优选地EPO)反应，优选水作为反应溶剂。除了水之外，还可能含有至少另外一种溶剂。优选可能的其它溶剂有DMSO、DMF、甲醇和乙醇。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中在与化合物(I)反应之前，化合物(II)与一种其它化合物(优选一种多肽，更优选地EPO)的反应在水性***中进行。
关于反应过程中采用的温度没有具体限制，只要反应产生所希望的化合物(II)的衍生物，其含有化合物(II)通过至少一个官能团X与所述至少一种其它化合物(优选一种多肽，更优选地EPO)反应的反应产物。反应温度优选为4-37℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中化合物(II)与所述至少一种其它化合物的反应在4-37℃下进行。
在反应过程中，温度可以变化，优选在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
化合物(II)与所述至少一种其它化合物反应的反应时间、pH值可以根据具体需要(如反应物的化学性质)调整。可以通过添加至少一种适当的缓冲液调节反应混合物的适当pH值。优选的缓冲液包括乙酸盐、磷酸盐或硼酸盐缓冲液，如乙酸钠、磷酸钠或硼酸钠缓冲液。
化合物(II)与所述至少一种其它化合物反应产生的反应产物可以通过至少一种适当的方法从反应混合物中分离，并且进行至少一种进一步的处理，如至少一种后处理例如透析和/或冻干。
一旦化合物(II)与至少一种其它化合物形成反应产物，即可以利用至少一种适当的方法从反应混合物中分离。
反应产物的分离可以用如上所述的可能包括一个或多个步骤的一种适当方法进行。
如果希望和/或必要，可以在化合物(II)与所述至少一种其它化合物反应之前，用一种适当的保护基保护桥连化合物(II)之R′和R″的NH基。可以使用上述保护基之一作为保护基。在化合物(II)与所述至少一种其它化合物(如一种多肽，更优选EPO)的反应产物与化合物(I)反应之前，通过至少一种适当的方法除去保护基。
如果化合物(II)首先与一种交联化合物反应，或者与一种交联化合物与一种多肽的反应产物反应，所有反应条件都可以根据这些反应的具体需要调整。其中可以使用上述缓冲液体系和/或溶剂。
第二步，化合物(II)与所述至少一种其它化合物的反应产物与化合物(I)反应。
对于这个反应，所有反应条件都可以根据这些反应的具体需要调整。其中可以使用上述缓冲液体系和/或溶剂。
化合物(II)与所述至少一种其它化合物的反应产物与化合物(I)反应产生的反应产物可以通过至少一种适当的方法从各自的反应混合物中分离，并且进行至少一种进一步的处理例如至少一种后处理，如透析和/或冻干。在本文中可以使用上述所有适当的方法。
含有或者不含交联化合物的HAS-多肽偶联物的分离通常可以用已知用来纯化天然和重组多肽的方法进行，例如大小排阻层析、离子交换层析、RP-HPLC、羟基磷灰石层析、疏水作用层析或至少其中两种方法的组合。
HAS与多肽的共价连接能够在修饰蛋白质水解后通过碳水化合物组成分析证实。
在多肽的N-连接寡糖处的HAS修饰能够如下证实：除去HAS修饰的N-聚糖，在SDS-PAGE+/-Western Blotting分析中观察到预测的向较高迁移率的移动。
多肽在半胱氨酸残基处的HAS修饰能够根据以下情况证实：通过RP-HPLC和MALDI/TOF-MS不能在HAS修饰产物的蛋白水解片段中检测到相应的蛋白水解Cys-肽(Zhou et al.，1998，Application ofcapillaryelectrophoresis，liquid chromatography，electrospray-massspectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization-time offlight-mass spectrometry to the characterization of recombinant humanerythropoietin，Electrophoresis，19(13)，2348-55)。在蛋白水解消化Cys-修饰的多肽后，分离含有HAS的级分，可以通过常规氨基酸组成分析证实该级分中含有相应的肽。
以上公开的关于本发明HAS-多肽、涉及多肽或HAS性质的所有实施方案也适用于本发明生产HAS-多肽的方法。此外，以上公开的关于HAS-EPO或其制备的涉及一般意义上的肽或者涉及HAS的所有实施方案也适用于本发明生产HAS-多肽偶联物的方法。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，羟乙基淀粉与化合物(II)(优选地选自上述同双功能化合物和异双功能化合物)反应，产生的反应产物与糖蛋白反应、优选与***、优选与EPO碳水化合物侧链氧化的末端碳水化合物部分反应。
根据本发明的另外一个特别优选的实施方案，羟乙基淀粉与化合物(II)(优选选自上述同双功能化合物和异双功能化合物)反应，产生第一种羟乙基淀粉衍生物。这第一种羟乙基淀粉衍生物随后与一种交联化合物反应，产生第二种羟乙基淀粉衍生物。这第二种羟乙基淀粉衍生物随后与一种糖蛋白优选***、优选与糖蛋白中所含的-SH基反应，产生第三种羟乙基淀粉衍生物。优选地，该交联化合物是一种异双功能化合物。更优选地，该交联化合物与第一种羟乙基淀粉衍生物中所含的含有结构-NH-的官能团反应。更优选地，该官能团是-NH2。
本发明的一个优点是，在至少一个反应步骤、优选在所有反应步骤、有关反应步骤中，不需要使用在毒理学上危险的溶剂，因此在生产过程后不必除去这些溶剂来避免溶剂对产物的污染。此外，对于残余的毒理学上危险的溶剂，不必进行额外的质量控制。如果优选地除了水之外还使用有机溶剂，优选使用毒理学上不危险的溶剂，如乙醇和/或丙二醇。
本发明的另外一个优点是，在使用水性体系作为溶剂的步骤中避免了有机溶剂诱导的不可逆的或可逆的结构改变。因此，根据本发明的方法获得的多肽衍生物不同于在有机溶剂(如DMSO)中制备的多肽。
此外，也意外地发现，HAS与多肽(如EPO)在水溶液中的偶联使得副反应最小化或者避免了副反应。因此，本发明方法的这个实施方案产生高纯度的改良的羟烷基淀粉产物。
根据另外一个方面，本发明也涉及可以通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物，该方法包括通式(I)的羟烷基淀粉(HAS)
Figure A0382503700481
在所述反应之前未被氧化的还原性末端，与通式(II)的化合物反应：
R′-NH-R″    (II)
其中，R1、R2和R3独立地是氢、或线性或分支的羟烷基，其中R′或R″或者R′和R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应。
如以上本发明的方法部分所述，使用O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺作为优选的化合物(II)，使用羟乙基淀粉作为优选的羟烷基淀粉。
因此，本发明也涉及可以通过一种方法获得的羟烷基淀粉衍生物，其中羟乙基淀粉通过其还原性末端与O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应。
根据反应条件、使用的溶剂或溶剂混合物和/或残基R′和/或R″，通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物可能具有下列结构(IIIa)：
Figure A0382503700491
因此，本发明也涉及如上所述的具有通式(IIIa)结构的羟烷基淀粉衍生物。
例如，如果R′是氢，通过上述方法获得的羟烷基淀粉衍生物也可以具有下列结构(IIIa)或(IIIb)，其中(IIIa)和(IIIb)可能均存在于反应混合物中，具有一定的平衡分布：
因此，本发明也涉及如上所述的具有通式(IIIb)结构的羟烷基淀粉衍生物。
而且，本发明也涉及如上所述的一种羟烷基淀粉衍生物，它以通式(IIIa)和(IIIb)之结构的混合物形式存在。
根据反应条件和/或反应所用化合物(II)的化学性质，通式(IIIa)的化合物可能在平伏位置或直立位置含有N原子，也可能存在具有一定平衡分布的这两种型式的混合物。
根据反应条件和/或反应使用的化合物(II)的化学性质，通式(IIIb)的化合物可能含有E或Z构象的C-N双键，也可能存在具有一定平衡分布的两种型式的混合物。
在有些情况下，可能希望稳定通式(IIIa)的化合物。特别是当通式(IIIa)的化合物在水性溶液中生产和/或使用时。作为稳定方法，酰化通式(IIIa)的化合物是特别优选的，特别是当R′是氢时。可以使用产生希望的通式(IVa)的羟烷基淀粉衍生物的所有适当试剂作为酰化剂。
根据本发明的特别优选的实施方案，作为酰化剂一部分的残基Ra是甲基。优选使用羧酸酐、羧酸酰卤和羧酸活化酯作为酰化剂。
因此，本发明也涉及可以通过上述方法获得的具有根据通式(IVa)结构的羟烷基淀粉衍生物。
酰化在0-30℃下进行，优选在2-20℃下进行，特别优选在4-10℃下进行。
在其它一些情况下，可能希望稳定通式(IIIb)的化合物。特别是当在水溶液中生产并且/或者使用根据通式(IIIb)的化合物时。作为稳定方法，特别优选还原通式(IIIb)的化合物，特别是当R′是氢时。可以使用产生希望的通式(IVb)的羟烷基淀粉衍生物的所有适当试剂作为还原剂。
根据本发明特别优选的实施方案，使用硼氢化物如NaCNBH3或NaBH4作为还原剂。
因此，本发明也涉及可通过上述方法获得的具有通式(IVb)结构的羟烷基淀粉衍生物。
还原在4-100℃下进行，优选在10-90℃下进行，特别优选在25-80℃下进行。
本发明还涉及化合物(IIIa)和(IIIb)、(IVa)和(IVb)、(IIIa)和(IVa)、(IIIa)和(IVb)、(IIIb)和(IVa)、(IIIb)和(IVb)、(IIIa)和(IIIb)和(IVa)、(IIIa)和(IIIb)和(IVb)、(IVa)和(IVb)和(IIIa)以及(IVa)和(IVb)和(IIIb)的混合物，其中(IIIa)和/或(IVa)可以独立地以在平伏或直立位置含有N原子的构象存在，和/或(IIIb)可能以具有C-N双键的E或Z构象存在。
根据本发明的一个方面，化合物(I)与化合物(II)反应，产生第一种反应产物。这第一种反应产物然后任选地按照至少一种上述方法稳定化。通过第一种反应产物的R″中所含的至少一个官能团X与至少一种其它化合物中所含的至少一个官能团Y反应，任选稳定化的第一种反应产物然后与所述至少一种其它化合物反应，产生第二种反应产物。这第二种反应产物然后任选地按照至少一种上述方法稳定化。
根据本发明的另一方面，所述至少一种其它化合物是一种多肽或一种交联化合物或一种交联化合物与一种多肽的反应产物。如果所述至少一种其它化合物是一种多肽，则该多肽中含有官能团Y。如果所述至少一种其它化合物是一种交联化合物，则官能团Y含在该交联化合物中，任选地多肽中也含有官能团Y。如果所述至少一种其它化合物是一种交联化合物与一种多肽的反应产物，则该交联化合物中含有官能团Y。
根据本发明的另一方面，通过化合物(II)中R″所含的至少一个官能团X与至少一种其它化合物中所含的官能团Y反应，化合物(II)与所述至少一种其它化合物反应，产生第一种反应产物。如上所述，该至少一种其它化合物优选是一种多肽或一种交联化合物或一种交联化合物与一种多肽的反应产物。这第一种反应产物然后与化合物(I)反应，其中通过化合物(I)的还原性末端与桥连化合物(II)的原始残基R′和R”的该第一种反应产物中的NH基反应，，产生第二种反应产物。这第二种反应产物然后任选地按照至少一种上述方法稳定化。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，使用羟乙基淀粉作为化合物(I)，使用O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺作为化合物(II)，使用碳水化合物侧链含有氧化的末端碳水化合物部分的EPO作为其它化合物。更优选地，羟乙基淀粉与O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应，产生第一种羟乙基淀粉衍生物，这第一种衍生物进一步与碳水化合物侧链含有氧化的末端碳水化合物部分的EPO反应，产生第二种羟乙基淀粉衍生物。在这种具体情况下，不用进行稳定化反应。
因此，本发明也涉及可通过下述方法获得的一种羟烷基淀粉衍生物，其中羟乙基淀粉通过其还原性末端与O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应，通过***碳水化合物侧链的氧化的末端碳水化合物部分，该反应产物与***反应。
根据本发明的另外一个特别优选的实施方案，使用羟乙基淀粉作为化合物(I)，使用O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺作为化合物(II)，使用含有马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚胺活性酯基团的一种异双功能交联化合物，使用含有至少一个-SH基的EPO(称为ThioEPO)作为多肽。更优选地，羟乙基淀粉与O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应，产生第一种羟乙基淀粉衍生物，这第一种衍生物进一步与交联化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯基团反应，产生第二种衍生物，这第二种衍生物通过马来酰亚胺基与ThioEPO反应，产生第三种羟乙基淀粉衍生物。
羟烷基淀粉衍生物在此处指HAS-EPO偶联物，是通过化合物(I)与化合物(II)和可能地一种交联化合物和***反应形成的，它具有以下优点：与偶联前的***相比，显示生物稳定性提高。这主要是由于以下事实：羟烷基淀粉衍生物很少甚至不被肝脏和肾脏的清除***识别，因此在循环***中存在时间更长。此外，由于HAS位点特异地连接，因此HAS与EPO偶联破坏EPO体内生物活性的危险被最小化。
本发明的HAS-EPO偶联物可能显示与重组天然EPO基本相同的体外生物活性，因为检测体外生物活性只测量与EPO受体的结合亲和力。测定体外生物活性的方法在本领域公知。
此外，HAS-EPO也显示比用作偶联初始材料的EPO(未偶联的EPO)更高的体内活性。测定体内生物活性的方法在本领域公知。
如果将未偶联的EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO偶联物可能显示110-300％、优选110-200％、更优选110％-180％、或者110-150％、最优选110％-140％的体内活性。
与Amgen的高度唾液酸化的EPO相比(见EP 428 267 B1)，如果将高度唾液酸化的EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO优选地显示至少50％、更优选至少70％、更优选至少85％、或者至少95％、至少150％、至少200％或者至少300％的高度唾液酸化EPO的体内活性。最优选地，它显示至少95％的高度唾液酸化EPO的体内活性。
本发明的HAS-EPO偶联物的高体内生物活性主要是由以下事实所致：由于它较少被肝脏的清除***识别，并且由于分子量较高被肾清除减少，因此该HAS-EPO偶联物在循环中比未偶联的EPO保持时间更长。测定EPO在循环中的体内半衰期的方法在本领域公知(Sytkowski，Lunn，Davis，Feldman，Siekman，1998，Humanerythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(3)，1184-8)。
因此，本发明的一个明显的优点是：提供了一种HAS-EPO偶联物，它可以比目前市售的EPO制品以更低的频率施用。标准EPO制品必须至少每3天施用一次，而本发明的HAS-EPO偶联物优选地每周施用两次，更优选每周一次。
此外，本发明的方法还具有能够以低成本生产有效EPO衍生物的优点，因为该方法不包括导致低终产率的复杂且耗时的纯化步骤，例如，不需要纯化掉已知显示低体内生物活性或者无体内生物活性的低唾液酸化的EPO形式。
此外，本发明还涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明HAS-多肽偶联物，优选HAS-EPO偶联物，更优选HES-EPO偶联物。在一个优选实施方案中，该药物组合物还含有至少一种用于***治疗的药学可接受的稀释剂、佐剂和/或载体。
因此，本发明也涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，或者在与化合物(I)反应之前，化合物(II)通过所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽。
根据本发明的优选实施方案，多肽(优选***)通过多肽中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分与化合物(II)反应，或者与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
根据本发明的一个更优选的实施方案，多肽(优选***)通过多肽中所含的氧化的碳水化合物部分与化合物(II)反应，或者与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
因此，本发明涉及如上所述的一种药物组合物，其中该多肽通过多肽中所含的氧化的碳水化合物部分与化合物(II)反应，或者与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
根据优选实施方案，该多肽是GCS-F、AT III、IFN-β或***，更优选***。
因此，本发明也涉及如上所述的一种药物组合物，其中该多肽是***。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，如上所述的药物组合物如下产生：在水性介质中，羟乙基淀粉与根据下列通式的化合物反应，
反应产物与***反应。
根据一个特别优选的实施方案，在上述反应之前，***用高碘酸钠氧化。
根据另外一个特别优选的实施方案，在反应之前，***被部分去唾液酸化，随后用高碘酸钠氧化。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，不包括含有根据实施例5所述以完全还原的巯基-EPO为基础生产的羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。
根据另外一个优选实施方案，本发明也涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的一种羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X与至少另外一种化合物反应，或者在与化合物(I)反应之前，化合物(II)通过所述至少一个官能团X与至少另外一种化合物反应，其中所述至少另外一种化合物是一种交联化合物，化合物(I)与化合物(II)的反应产物与该交联化合物的反应产物与一种多肽反应。
根据另外一个进一步优选的实施方案，本发明涉及上述药物组合物，其中多肽是***。
上述药物组合物特别适用于治疗贫血性疾病或造血功能障碍疾病或与之有关的疾病。
如此处所用的“治疗有效量”指对于指定病征和施用方案提供治疗效果的量。***同种型优选地通过肠胃外途径施用。选择的具体途径取决于治疗的疾病。优选***同种型作为一种制剂的一部分施用，该制剂还含有适当的载体如人血清白蛋白、适当的稀释剂如缓冲液、和/或适当的佐剂。需要的剂量是足以提高患者血细胞比容的量，因治疗的疾病的严重程度、使用的施用方法等而异。
优选地，本发明药物组合物的治疗目的是提高血液中的血红蛋白值至6.8mmol/l以上。为此，可以施用药物组合物，使得血红蛋白值每周提高0.6mmol/l-1.6mmol/l。如果血红蛋白值超过8.7mmol/l，优选地应当中断治疗，直到血红蛋白值低于8.1mmol/l。
本发明组合物优选地在适于皮下或静脉内或肠胃外注射的制剂中使用。为此，适当的赋形剂和载体是，例如：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯酸钠、聚山梨醇酯80(polysorbate 80)、HAS和注射用水。该组合物可以每周施用三次，优选每周两次，更优选每周一次，最优选每两周一次。
优选地，该药物组合物以0.01-10μg/kg患者体重的量施用，更优选0.1-5μg/kg、0.1-1μg/kg或0.2-0.9μg/kg、最优选0.3-0.7μg/kg、最优选0.4-0.6μg/kg体重。
优选地，每次通常施用10μg-200μg，优选15μg-100μg。
本发明还涉及在治疗人或动物体的方法中应用的本发明HAS-多肽。
本发明还涉及本发明HAS-EPO偶联物在生产治疗贫血性疾病或造血功能障碍性疾病或与之有关的疾病的药物中的应用。
本发明通过下列实施例、表和附图进一步说明，它们绝非意在限制本发明的范围。
附图简述
图1
图1显示根据实施例4.1产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例4.1偶联后的粗制品。
C道：EPO初始材料
图2
图2显示根据实施例4.3产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：根据实施例4.3偶联后的粗制品。
B道：EPO初始材料
C道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
图3
图3显示根据实施例6.1和6.4产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED (Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例6.4偶联后的粗制品。
C道：根据实施例6.1偶联后的粗制品。
D道：EPO初始材料
图4
图4显示根据实施例6.2、6.3、6.5和6.6产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例6.6偶联后的粗制品，基于实施例1.3b)。
C道：根据实施例6.5偶联后的粗制品，基于实施例1.1b)。
D道：根据实施例6.6偶联后的粗制品，基于实施例1.3a)。
E道：根据实施例6.5偶联后的粗制品，基于实施例1.1 a)。
F道：根据实施例6.2偶联后的粗制品。
G道：根据实施例6.3偶联后的粗制品。
K道：EPO初始材料。
图5
EPO-GT-1的SDS-PAGE分析，其中弱酸处理5分钟＝2道；10分钟＝3道；60分钟＝4道；未处理的EPO＝1道；显示除去N-聚糖后EPO的迁移率变化(+PNGASE)。
图6
从未处理的EPO中以及从在弱酸水解条件下孵育5分钟、10分钟、60分钟的EPO中分离的寡糖的HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法)图案。罗马数字I-V表示洗脱位置，I＝去唾液酸化的二分支(antennary)结构，II＝三唾液酸化的三分支结构(两种异构体)，III＝四唾液酸化的四分支结构+2个N-乙酰基乳糖胺重复，IV＝四唾液酸化的四分支结构+1个N-乙酰基乳糖胺重复；V＝四唾液酸化的四分支结构+不含N-乙酰基乳糖胺重复。不含及含有1-4个唾液酸的寡糖结构的洗脱区用括号表示。
图7
去唾液酸化后N-连接寡糖的HPAEC-PAD；显示了N-乙酰神经氨酸的洗脱位置；数字1-9表示标准寡糖的洗脱位置；1＝二分支；2＝三分支(2-4种异构体)，3＝三分支(2-6种异构体)，4＝四分支；5＝三分支+1个重复；6＝四分支+1个重复；7＝三分支+2个重复；8＝四分支+2个重复；9＝四分支+3个重复。
图8
温和处理的和未处理的EPO在唾液酸残基经受高碘酸盐氧化后的SDS-PAGE分析。1＝高碘酸盐氧化，未酸处理；2＝高碘酸盐氧化5分钟，酸处理；3＝高碘酸盐氧化，酸处理10分钟；4＝高碘酸盐氧化，未酸处理；5＝未高碘酸盐氧化且未酸处理的BRP EPO标准。
图9
从未处理的EPO中以及从在弱酸水解条件下孵育5分钟和10分钟，随后高碘酸盐处理的EPO中分离的天然寡糖的HPAEC-PAD图案。不含及含有1-4个唾液酸的寡糖结构的洗脱区用括号1-5表示。
图10
EPO-GT-1-A的HES修饰时间过程的SDS-PAGE分析：20μg等份的EPO-GT-1-A与羟胺修饰的HES衍生物X反应30分钟、2、4、17小时。1道＝30分钟反应时间；2道＝2小时反应时间；3道＝4小时反应时间；4道＝17小时反应时间；5道＝没有HES修饰的EPO-GT-1-A。左图显示在羟胺修饰的HES衍生物(流速：1 ml·min-1)X存在下，随着温育时间延长，EPO-GT-1-A的迁移率改变：1道＝30分钟反应时间；2道＝2小时反应时间；3道＝4小时反应时间；4道＝17小时反应时间；5道＝HES修饰的EPO-GT-1-A。右图显示相同样品用N-糖苷酶处理后的分析。
图11
HES-EPO偶联物的Q-Sepharose级分的SDS-PAGE分析。1％的穿流液(flow-through)以及在高盐浓度下洗脱的1％级分用Speed Vac浓缩器浓缩，在样品缓冲液中加样到凝胶上。EPO蛋白用考马斯蓝染色。A＝样品I；B＝样品II；C＝样品III；K＝对照EPO-GT-1；A1、B1、C1和K1表示穿流液部分；A2、B2、C2和K2表示用高盐浓度洗脱的级分。
图12a
HES修饰的EPO样品A2(见图7)、对照EPO样品K2和EPO-GT-1-A的SDS-PAGE分析。为了除去N-连接的寡糖，在N-糖苷酶存在下消化EPO制品。所有EPO样品都显示迁移率向缺乏或含有O-聚糖的低分子量型转变。对于HES-修饰的EPO样品A2，在去-N-糖基化后观察到O-糖基化与非糖基蛋白带的比值较低，在30KDa左右检测到一条弥散的蛋白带，这推定代表O-聚糖残基的唾液酸处的HES-修饰(见星号标记的箭头)。
图12b
未处理的或者在N-糖苷酶存在下消化除去N-连接寡糖的HES-修饰的EPO样品A2(见图11)、对照EPO样品K2和EPO-GT-1A在温和水解后的SDS-PAGE分析(见图12a)。在N-糖苷酶处理之前的高分子量型A2和处理之后的高分子量型A(见有箭头及无箭头的括号)在样品酸处理后都消失。用于比较的BRP EPO标准不进行弱酸处理。
图13
从HES修饰的样品A、EPO-GT-1-A以及与未修饰的HES温育的对照EPO样品(K)中释放的N-连接寡糖物质的HPAEC-PAD分析。罗马数字I-V表示洗脱位置，I＝二唾液酸化的二分支结构，II＝三唾液酸化的三分支结构(两种异构体)，III＝四唾液酸化的四分支结构+2个N-乙酰基乳糖胺重复，IV＝四唾液酸化的四分支结构+1个N-乙酰基乳糖胺重复；V＝四唾液酸化的四分支结构+不含N-乙酰基乳糖胺重复；括号表示二、三、四唾液酸化的N-聚糖的洗脱区，如图6和图9的图例所述。
图14
从HES修饰的样品A、EPO-GT-1-A以及与未修饰的HES温育的对照EPO样品(K)中释放的N-连接寡糖物质的HPAEC-PAD分析。显示了标准寡糖混合物的保留时间：数字1-9表示标准寡糖的洗脱位置：1＝二分支；2＝三分支(2-4种异构体)，3＝三分支(2-6种异构体)，4＝四分支；5＝三分支+1个重复；6＝四分支+1个重复；7＝三分支+2个重复；8＝四分支+2个重复；9＝四分支+3个重复。
图15-21
图15-21显示从HES修饰的EPO和对照EPO制品中分离的酶释放的和化学去唾液酸化的N-聚糖的MALDI/TOF质谱。在m/z 1809.7、2174.8、2539.9、2905.0和3270.1处的主要信号([M+Na]+)对应于二到四分支的不含、含有一个或两个N-乙酰基乳糖胺重复的复杂型N-聚糖结构，并且伴有弱信号，这是由于为了对MS分析的样品去唾液酸化使用的酸水解条件引起岩藻糖或半乳糖损失所致。
图15
MALDI/TOF谱：HES-修饰的EPO A2的去唾液酸化寡糖。
图16
MALDI/TOF谱：EPO GT-1-A的去唾液酸化寡糖。
图17
MALDI/TOF谱：EPO K2的去唾液酸化寡糖。
图18
MALDI/TOF谱：EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图19
MALDI/TOF谱：酸水解5分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图20
MALDI/TOF谱：酸水解10分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图21
MALDI/TOF谱：酸水解60分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
实施例
实施例1：通过还原胺化形成羟乙基淀粉衍生物
实施例1.1羟乙基淀粉与1，3-二氨基-2-羟基丙烷的反应
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol1，3-二氨基-2-羟基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下温育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5 KD截留分子量，PerbioScience Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol1，3-二氨基-2-羟基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物也可以在25℃下温育3天。
实施例1.2羟乙基淀粉与1，2-二羟基-3-氨基丙烷的反应
Figure A0382503700622
a)向200mg羟乙基淀粉(HES 18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羟基-3-氨基丙烷(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下孵育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羟基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物可以在25℃下温育3天。
如G.Avigad，Anal.Biochem.134(1983)449-504所述，用高碘酸氧化切割反应产物中的1，2-二醇产生甲醛，通过对醛定量间接证实1，2-二羟基-3-氨基丙烷与HES的反应。
实施例1.3羟乙基淀粉与1，4-二氨基丁烷的反应
Figure A0382503700631
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18，000 D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下孵育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物也可以在25℃下温育3天。
实施例1.4羟乙基淀粉与1-巯基-2-氨基乙烷的反应
Figure A0382503700632
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1-巯基-2-氨基乙烷(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下孵育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1 (v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1-巯基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物也可以在25℃下温育3天。
实施例2：通过偶联形成羟乙基淀粉衍生物
实施例2.1：羟乙基淀粉与碳酰肼的反应
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1 M乙酸钠缓冲液pH5.2中，加入8mmol碳酰肼(Sigma Aldrich，Taufkrchen，D)。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.2：羟乙基淀粉与己二酸二酰肼的反应
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中，加入8mmol己二酸二酰肼(Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D)。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5 KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.3：羟乙基淀粉与1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲的反应
Figure A0382503700651
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中，加入8mmol 1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲(Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D)。在25℃下搅拌18小时后，向反应混合物中加入8ml水，悬液以4,500rpm离心15分钟。将澄清的上清液移至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，以4,500rpm离心15分钟。澄清的上清液用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScience Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.4：羟乙基淀粉与O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺的反应
O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺如Boturyn et al.Tetrahedron53(1997)5485-5492所述用市场售材料通过两步合成。
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000 D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中，加入8mmol O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例3***的氧化
氧化的***如实施例7所述生产。使用实施例7.11(c)所述的EPO-GT-1-A(未酸水解，用温和的高碘酸盐氧化处理的EPO-GT-1)作为氧化的***。
实施例4：羟乙基淀粉衍生物与实施例3的氧化的***的偶联
实施例4.1氧化的***与实施例2.1的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.1产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图1中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例4.2氧化的***与实施例2.3的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.3产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。
实施例4.3氧化的***与实施例2.4的反应产物的反应
用5 M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.4产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图2中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例5通过还原***形成巯基-EPO
241.5μg***(EPO-GT-1，见实施例7)在500μl 0.1M硼酸钠缓冲液，5mM EDTA，10mM DTT(Lancaster，Morcambe，UK)，pH8.3中37℃温育1小时。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，10KDMWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤除去DTT，随后用硼酸盐缓冲液洗涤3次，用磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15MNaCl，50mM EDTA，pH7.2)洗涤2次。
实施例6：用交联化合物偶联羟乙基淀粉衍生物与巯基***
在下列所有实施例中都使用N-(α-马来酰亚氨基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯(AMAS)作为交联化合物。
Figure A0382503700671
实施例6.1氧化的***与实施例2.1的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.1产生并且溶解于200μl0.1 M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下孵育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μ根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图3中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6.2氧化的***与实施例2.2的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.2产生并且溶解于200μl 0.1 M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkrchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5 KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000 rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于使用的HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6.3氧化的***与实施例2.3的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.3产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6.4氧化的***与实施例2.4的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.4产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图3中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6.5氧化的***与实施例1.1的反应产物和交联化合物的反应
向在80℃温育17小时以及25℃温育3天的根据实施例1.1产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mMEDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkrchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下孵育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6.6氧化的***与实施例1.3的反应产物和交联化合物的反应
向在80℃温育17小时(实施例1.3a)以及25℃温育3天(实施例1.3b)的孵育条件下根据实施例1.3产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmolHES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7 HES-EPO偶联物的制备性生产
概述
HES-EPO偶联物如下合成：将HES衍生物(平均分子量为18,000道尔顿；羟乙基取代程度为0.4)与重组人EPO的寡糖链上部分氧化(温和的高碘酸盐)的唾液酸残基偶联。根据碳水化合物结构分析，引入的修饰不影响核心寡糖链的结构完整性，因为经弱酸处理的HES-修饰聚糖的MALDI/TOF-MS显示完整的中性N-乙酰基乳糖胺型链，它与未修饰的EPO产物中所见的链无法区分。获得的结果表明，对于预先没有部分去除唾液酸而进行修饰的EPO制品，每个EPO分子至少连接3个修饰的HES残基。缺少前体蛋白质中约50％唾液酸残基的EPO变体在SDS-PAGE中显示类似的高表观分子量迁移率(60-110KDa比BRP EPO标准的40KDa)。在室温和pH3-10下的标准离子交换层析条件下，HES修饰的EPO稳定。
在红细胞正常的小鼠***中进行的EPO生物测定表明，根据欧洲药典用紫外线吸收值测定蛋白质，RP-HPLC测定EPO蛋白质并经BRP EPO标准制品校准，在该测定中，HES修饰的EPO具有比国际BRP EPO参照标准高2.5-3.0倍的比活性(IU/mg)。
实施例7.1材料与方法
(a)通过N-糖苷酶消化释放N-连接寡糖
样品与25单位(根据德国Roche Diagnostics的厂商说明书)重组PNGase F在37℃下温育过夜。根据SDS-PAGE中的蛋白质比迁移率的位移来监测完全消化。通过加入3倍体积的冷100％乙醇，并在-20℃下放置至少2小时，从多肽中分离释放的N-聚糖(Schroeter S et al.，1999)。通过在4℃下以13000 rpm离心10分钟除去沉淀的蛋白质。然后用500μl冰冷的75％乙醇再洗涤沉淀两次。合并上清液中的寡糖在真空离心机(Speed Vac浓缩器，Savant Instruments Inc.，USA)中干燥。聚糖样品在使用前用Hypercarb柱(25mg或100mg HyperCarb)如下脱盐：柱用500μl溶于0.1％TFA中的80％乙腈(v/v)洗涤3次，随后用500μl水洗涤3次。样品用水稀释至终体积为300μl-600μl，之后上柱，然后用水充分洗涤。寡糖用1.2ml(25mg柱；对于100mg柱为1.8ml)含有0.1％三氟乙酸(v/v)的25％乙腈水溶液洗脱。洗脱的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed Vac浓缩器中干燥。在某些情况下，通过将总(糖)蛋白样品＜100μg的消化混合物吸附到100mgHypercarb柱上，对N-糖苷酶释放的寡糖进行脱盐。
(b)通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI/TOF/TOF-MS)对寡糖的分析
使用Bruker ULTRAFLEX飞行时间(TOF/TOF)仪器：在阳离子及阴离子模式中使用2，5-二羟基苯甲酸作为紫外线吸收材料，在两种模式中均使用反射器(reflectron)，分析天然去唾液酸化的寡糖。对于MS-MS分析，选择母离子进行激光诱导的解离(LID)，获得的碎片离子用仪器的第二TOF阶段(LIFT)分离。浓度约为1-10pmol·μl-1的1μl样品溶液与等量的各自的基质混合。将该混合物点样到一个不锈钢靶上，在分析前在室温下干燥。
实施例7.2重组人EPO(EPO-GT-1)的制备和表征
如(Mueller PP et al.，1999，Dorner AJ et al.，1984)所述由重组CHO细胞表达EPO，根据欧洲药典所述的方法鉴定这些制品(Ph.Eur.4，Monography 01/2002：1316：Erythropoietin concentrated solution)。终产物的唾液酸含量为每nMol蛋白质12nMol(+/-1.5hMol)。N-连接寡糖的结构如(Nimtz et al.，1999，Grabenhorst，1999)所述通过HPAEC-PAD和MALDI/TOF-MS测定。获得的EPO制品含有二、三、四唾液酸化的寡糖(分别为2-12％、15-28％和60-80％，少量存在硫酸化和五唾液酸化链)。EPO制品的总糖基化特征类似于国际BRP EPO标准制品。
重组EPO的等电聚焦图案与国际BRP参照EPO标准制品相当，表明是相应的同种型。25％的EPO蛋白在多肽链的Ser126处缺乏O-糖基化。
实施例7.3部分去唾液酸化的EPO型的制备
EPO GT-1蛋白(2.84mg/ml)在20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0中加热到80℃，然后每1ml EPO溶液加入100μl 1N H2SO4；分别继续温育5分钟、10分钟、60分钟，产生不同唾液酸化程度的EPO制品。用多肽N-糖苷酶释放寡糖后对含有0-4个唾液酸的寡糖进行定量，通过用Hypercarb柱(25mg HyperSep Hypercarb；Thermo-Hypersil-Keystone，UK)脱盐进行N-连接链的分离。加入1N NaOH中和EPO制品，在液氮中冷冻，贮存于-20℃，直到下一步使用。
实施例7.4唾液酸化EPO型的高碘酸盐氧化
向溶解于3.5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH7.0中的10mg未处理或弱酸处理的EPO中加入1.5ml 0.1 M乙酸钠缓冲液pH5.5，混合物在冰浴中冷却到0℃；加入500μl10mM高碘酸钠，反应混合物在0℃下在暗处保持60分钟。加入10μl甘油，在暗处继续温育10分钟。使用VIVASPIN浓缩器(10,000 MWCO，PES Vivascience AG，Hannover，德国)，根据厂商推荐，在配备固定角转子的实验室离心机中以3000rpm脱盐，从试剂中分离部分氧化的EPO型。在液氮中冷冻后，EPO制品以4ml的终体积贮存于-20℃。
对100μg等份的部分氧化的EPO制品进行N-糖苷酶处理，寡糖如上所述用Hypercarb柱分离。寡糖通过弱酸处理去唾液酸化，用HPAEC-PAD分析，它们的保留时间与如(Nimtz et al.，1990和1993)所述的真正的标准寡糖相当。
实施例7.5用二硫赤藓糖醇还原EPO二硫醚
在30mM二硫赤藓糖醇(DTT)存在下，5mg EPO-GT-1在5ml 0.1M Tris/HCl缓冲液pH8.1中温育，37℃60分钟；使用Vivaspin浓缩器在4℃下除去DTT，更换缓冲液4个循环。最终的还原EPO制品冷冻于液氮中，在50mM乙酸钠缓冲液pH5.5中贮存于-20℃。
实施例7.6 EPO蛋白测定
EPO蛋白的定量测定如下进行：根据欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia4，Monography 01/2002：1316：Erythropoietinconcentrated solution)，在1cm径长的比色杯中测定280nm处的紫外线吸光度。另外，也可以使用RP-C4柱(Vydac Protein C4，目录号214TP5410，Grace Vydac，Ca，US)，通过RP-HPLC方法定量EPO；HPLC方法用***BRP1参照标准校准(EuropeanPharmacopoeia，Conseil de l′Europe B.P.907-F67029，Strasbourg Cedex1)。
实施例7.7用半乳糖氧化酶氧化去唾液酸化的EPO
在16μl过氧化氢酶(6214单位/200 ml)和80μl半乳糖氧化酶(2250单位/ml，来自Dactylium dendroides(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)存在下，4.485mg完全去唾液酸化的EPO在20mM磷酸钠缓冲液pH 6.8中温育，37℃过夜；在温育开始4小时和8小时后分两次加入20μl半乳糖氧化酶。
实施例7.8用于生物测定的EPO样品的制备
通过高碘酸盐或半乳糖氧化酶氧化的EPO蛋白制品与活化的HES温育，纯化EPO
EPO样品的纯化(除去未反应的HES衍生物)在室温下进行。EPO温育混合物(约5mg EPO蛋白)用缓冲液A(20mM N-吗啉丙烷磺酸[MOPS/NaOH]，在双蒸水中，pH 8.0)1∶10稀释，以0.5ml/min的流速上样到用10倍柱体积(CV)缓冲液A平衡的含有3ml Q-Sepharose HP(Pharmacia编号17-1014-03，批号220211)的柱上。用6-8倍柱体积的缓冲液A洗柱(流速＝0.8ml/min)，使用缓冲液B(20mM吗啉乙烷磺酸[MES/NaOH]，0.5M NaCl，在双蒸水中，pH6.5)以0.5ml/min的流速进行洗脱。根据280nm的紫外线吸光度检测EPO，洗脱到约6ml中。柱用3倍柱体积的缓冲液C(20mM MES，1.5MNaCl，在H2O中，调节为pH6.5)再生，用10倍柱体积的缓冲液A再平衡(流速＝0.7ml/min)。
用Vivaspin浓缩器和磷酸盐缓冲液(PBS)对Q-Sepharose步骤获得的EPO洗脱物进行缓冲液更换，每个样品进行3个离心循环；样品用PBS调节为2ml，贮存于-20℃。
从Q-Sepharose洗脱物中只获得＜25％的部分唾液酸化、随后温和高碘酸盐氧化的HES修饰的EPO型，因为在采用的条件下，基本EPO型不结合Q-Sepharose，并发现与未反应的HES衍生物一起出现在穿流液中。
实施例7.9采用脉冲安培检测的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)
使用配备CarboPac PAl柱(0.4×25cm)的Dionex BioLC***(Dionex，USA)，通过高pH阴离子交换(HPAE)层析以及脉冲安培检测器(PAD)，分析纯化的天然及去唾液酸化的寡糖(Schroter et al.，1999；Nimtz et al.，1999)。检测器电势(E)和脉冲持续时间(T)为：E1：+50mV，T1：480ms；E2：+500mV，T2：120ms；E3：-500mV，T3：60ms，输出范围为500-1500nA。然后将寡糖注射到用100％溶剂A平衡的CarboPac PAl柱上。对于去唾液酸化的寡糖，在40分钟内使用溶剂B的线性梯度(0-20％)，随后在5分钟内从将溶液B从20％线性提高到100％，进行洗脱(流速：1ml·min-1)。溶剂A是溶于双蒸水的0.2MNaOH，溶剂B由溶于溶剂A的0.6M NaOAc组成。对于天然寡糖，柱子用100％溶剂C(0.1M NaOH，溶于双蒸水)平衡，在48分钟内使用线性梯度(0-35％)的溶剂D，随后在10分钟内将溶剂D从35％线性提高到100％，进行洗脱(流速：1ml·min-1)。溶剂D由溶于溶剂C的0.6M NaAc组成。
实施例7.10通过GC-MS对N-聚糖、HES-修饰的N-聚糖和EPO蛋白进行单糖组成分析
在甲醇分解、N-再乙酰化和三甲基硅烷化后，通过GC/MS以相应甲基糖苷的形式分析单糖[Chaplin，M.F.(1982)A rapid and sensitivemethod for the analysis of carbohydrate.Anal.Biochem.123，336-341]。这些分析用Finnigan GCQ离子阱质谱仪(Finnigan MAT corp.，SanJose，CA)进行，其配备一个30m DB5毛细管柱，以阳离子EI模式运行。温度程序：80℃恒温2min，然后每分钟升高10度，至300℃。
根据保留时间和特有的断裂模式鉴定单糖。未校正的电子峰积分的结果用于定量。由于正位异构性和/或存在呋喃型和吡喃型而产生一个以上峰的单糖通过加和所有主峰来定量。0.5μg肌醇用作内部标准化合物。
实施例7.11结果
实施例7.11(a)弱酸处理的(部分去唾液酸化的)EPO-GT-1的N-聚糖的鉴定
如图5所示，在与N-糖苷酶孵温释放N-连接寡糖之前及之后，通过SDS-PAGE分析弱酸处理5、10或60分钟的EPO-GT-1制品。对N-连接寡糖进行HPAEC-PAD寡糖作图(图8)。未处理的EPO-GT-1含有＞90％的具有3或4个唾液酸残基的N-连接寡糖，而在弱酸存在下温育5分钟后，＜40％的碳水化合物链含有3或4个唾液酸残基。去唾液酸化的N-聚糖的HPAEC-PAD显示，检测的未处理的EPO-GT-1的中性寡糖比例在酸处理5、10或60分钟的制品中保持稳定。去唾液酸化聚糖的MALDI/TOF-MS显示，在弱酸处理蛋白质后存在＜90％的近端岩藻糖。
实施例7.11(b)高碘酸盐处理的EPO-GT-1的鉴定
对于预先酸处理5分钟和10分钟或者不予处理的温和高碘酸盐处理的EPO型，在图8中比较它们的SDS-PAGE迁移率。高碘酸盐氧化唾液酸所采用的条件不改变EPO制品的SDS-PAGE图案(比较图5)。唾液酸的氧化在HPAEC-PAD分析中导致寡糖向较早的洗脱时间迁移(比较图6和9)。
实施例7.11(c)HES-修饰的EPO衍生物的鉴定
(aa)用根据实施例2.4产生的羟胺修饰的HES衍生物X对EPO-GT-1-A进行HES修饰的时程(time course)
将400μg羟胺修饰的HES衍生物X加入溶于20μL 0.5M NaOAc缓冲液pH5.5中的20μg EPO-GT-1-A(温和高碘酸盐氧化的EPO，在温和高碘酸盐氧化之前未经酸水解)中，分别在30分钟、2、4、17小时后，通过将样品冷冻于液氮中，终止反应。随后将样品贮存于-20℃，直到进一步分析。
加入SDS-PAGE样品缓冲液，将样品加热到90℃，加样到SDS-凝胶上。如图10所示，温育时间延长导致向较高分子量蛋白质的移动增加。在羟胺修饰的HES衍生物X存在下温育17小时后，检测到一条弥散的考马斯蓝染色的蛋白带，根据分子量标准的位置，它在60-11KDa之间的区域迁移(见图10的左部分)。用N-糖苷酶处理后，大多数蛋白质向去-N-糖基化EPO的位置转移(见图10，右侧凝胶；箭头A表示N-糖苷酶的迁移位置；箭头B表示去-N-糖基化EPO的位置；推定在28KDa与36KDa分子量标准之间区域内所见的弥散蛋白带代表在分子的O-糖基化位点被HES修饰的EPO型。关于N-糖苷酶的特异性，我们由该结果得出结论，实际上HES-修饰发生在EPO蛋白的聚糖之高碘酸盐氧化的唾液酸残基处。
(bb)HES-EPO偶联物的鉴定
HES-EPO偶联物I(来源于温和高碘酸盐氧化后的EPO-GT-1，即来源于EPO-GT-1-A)、II(来源于酸水解5分钟且温和高碘酸盐氧化的EPO-GT-1)、III(来源于酸水解10分钟且温和高碘酸盐氧化的EPO-GT-1)如前所述合成。包括在相同缓冲液条件下的对照孵育(K)，其中包括未修饰的EPO-GT-1，并加入等量的未修饰的HES。为了随后进行HES-EPO衍生物的生物化学分析，进一步纯化这些温育混合物。
HES-EPO偶联物I、II和III以及对照孵育K的温育物如“材料与方法”(实施例7.8)所述进行Q-Sepharose纯化步骤，以除去过量的未反应HES试剂，后者预计出现在在离子交换柱的穿流液中。由于在预先酸处理的样品Ⅱ和III中含有大量的基础EPO型，我们预计在穿流液中含有这些孵育物的相当量的修饰的EPO产物。如图11所示，几乎所有来源于样品I的EPO都被Q-Sepharose柱保留，而样品III和II中只有约20-30％被回收到用高盐浓度洗脱的级分中。在SDS-PAGE中，与对照EPO相比，在穿流液和用高盐洗脱的级分中，与HES衍生物X温育产生的所有蛋白质物质都具有更高的表观分子量。
为了更详细地鉴定HES-修饰的EPO，将样品A和K(见图11)与高碘酸盐氧化形式EPO-GT-1-A进行比较。对样品进行N-糖苷酶处理，如图12a和12b所示，N-聚糖的释放在标准EPO制品的O-糖基化和非糖基化EPO型的位置处产生两条低分子量带。对于样品A，检测到另一条在28KDa mw标准的位置处迁移的带，提示在该EPO变体的O-聚糖处发生HES-修饰(参见实施例7.11(c)(aa))。在样品温和水解后，这条带(以及高度HES-修饰的高分子量形式的N-糖基化EPO，见图12a和12b)消失，这与在***的高碘酸盐氧化的唾液酸残基处发生HES修饰的看法一致。
使用能够从寡糖上完全除去唾液酸残基(以及唾液酸连接的HES衍生物)的条件，水解N-糖苷酶温育混合物的等份；中和后，将混合物吸附到小Hypercarb柱上进行脱盐。用水充分洗涤该柱，随后用含有0.1％三氟乙酸的40％乙腈水溶液洗脱结合的中性寡糖。对产生的寡糖进行MALDI/TOF-MS。来自样品A、EPO-GT-1-A和样品K的去唾液酸化的寡糖级分的波谱显示复合型寡糖有相同的质量数，m/z＝1810Da(二分支)，2175＝三分支，2540＝四分支，2906＝四分支+1个N-乙酰基乳糖胺重复，3271＝四分支+2个N-乙酰基乳糖胺重复；检测到对应于缺乏岩藻糖(-146)和半乳糖(-162)的弱信号，这可归因于去除唾液酸所采用的酸水解条件(见MALDI-图15、16、17)。
在一个平行实验中，将N-糖苷酶消化混合物吸附到1ml RP-C18柱上(寡糖预先没有用酸水解)，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液进行洗脱；在这些条件下，EPO蛋白完全保留在RP-材料上，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液从柱上洗下寡糖。用含有0.1％TFA的70％乙腈水溶液洗脱去-N-糖基化的EPO蛋白。中和N-糖苷酶处理的样品A、EPO GT-1-A和样品K经过RP-C18步骤获得的寡糖级分，如前所述用Hypercarb柱脱盐。在能够从聚糖上定量除去唾液酸的条件下进行弱酸处理之前(见图13)及之后(见图14)，对分离的寡糖进行HPAEC-PAD作图。
从HES修饰的样品A中获得的天然物质的HPAEC-PAD图只显示可以忽略的寡糖信号，而EPO GT-1-A-衍生的寡糖显示与图9所示样品(称为温和高碘酸盐处理后的EPO-GT-1的样品)相同的聚糖谱。由对照EPO样品(K)获得的寡糖的洗脱图产生预期的图案(比较图6的图)。为了比较，包括了用来比较和作为参照标准的国际BRP-EPO标准的天然寡糖谱。
在弱酸水解后，所有寡糖制品都显示相同的中性寡糖结构的洗脱图(见图14)，该结构具有二、三、四分支复杂型碳水化合物链的定性和定量组成，如作为本研究初始材料的EPO制品的方法部分所述。该结果证实，EPO样品的HES-修饰导致HES衍生物的共价连接，该衍生物可以用N-糖苷酶从EPO-蛋白质上分离下来，使用去唾液酸化碳水化合物的弱酸处理条件可以将其从N-聚糖上去除(见图12a+b)，因此该衍生物是酸不稳定的。
(cc)通过GC-MS对HES-EPO和HES-EPO N-聚糖进行的单糖组成分析
为了进一步证实EPO在分子N-聚糖处HES-修饰，用N-糖苷酶消化EPO样品，EPO蛋白吸附到RP-C18柱上，而寡糖物质如上所述被洗掉。如表2所示，只在半胱氨酸残基处HES修饰的EPO蛋白中和EPO样品A2的寡糖级分中检测到葡萄糖和羟乙基化葡萄糖衍生物。
实施例7.11(d)HES-修饰的EPO的生物活性的体内测定
按照欧洲药典所述方法在红细胞正常的小鼠***中进行EPO生物检测；进行EPO测定的实验室使用国际BRP EPO参照标准制品。对于HES-修饰的EPO A2制品，测得比活性平均值为每mg EPO蛋白294,600单位，表明与同样进行活性测定的包括国际BRP EPO参照标准制品的样品相比，比活性约高3倍。
研究结果总结于表3中。
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表1
Figure A0382503700831
Figure A0382503700851
Figure A0382503700861
Figure A0382503700871
表2
来自HES修饰的EPO和对照样品之聚糖的单糖组成分析
**单糖     I.来自A2的聚糖  II.来自EPO-GT-1A的聚糖     III.来自K2的聚糖     III.来自A2的聚糖     IV.来自EPO-GT-1A的聚糖   V.来自K2的聚糖     VI.半胱氨酸修饰的EPO蛋白*
岩藻糖     1935     3924     2602     2246     4461     2601     2181
甘露糖     6028     11020     9198     6379     11668     6117     6260
半乳糖     8886     19935     14427     10570     16911     11555     10386
葡萄糖     17968     ---     ---     21193     痕量     痕量     33021
GlcNAc     7839     21310     14440     11360     15953     10503     10498
GlcHe1     5583     ---     ---     5926     ---     ---     14857
GlcHe2     1380     ---     ---     1,552     ---     ---     3775
NeuNAc     5461     822     4504     3895     4871     13562     13003
肌醇     1230     2310     1620     2050     1320     1134     1087
*对等量的Cys-HES-修饰的EPO蛋白进行组成分析；如上所述用Q-Sepharose柱通过层析从HES-孵育混合物中分离EPO蛋白，利用Vivaspin 5分离装置离心脱盐。**通过全三甲基甲硅烷基化甲基糖苷的单次GC，进行单糖测定；给出了峰的电子积分值，这些数值未对衍生化过程和每种化合物的回收过程中的损失进行校正。
表3
  样品号     样品描述 计算的EPO样品的比活性(根据A280nm和RP-HPLC测定)
    850247     1.HES-修饰的EPOA2     344,000U/mg
    850248     2.EPO-GT-1-A     82,268U/mg
    850249     3.对照EPO K2     121,410U/mg
    850250     4.BRP EPO标准     86,702U/mg
    850251     1.用4倍体积的PBS稀释     309,129U/mg
    850252     2.用4倍体积的PBS稀释     94,500U/mg
    850253     3.用4倍体积的PBS稀释     114,100U/mg
    850254     4.用4倍体积的PBS稀释     81,200U/mg
    850255     1.用4倍体积的PBS稀释     230,720U/mg

Claims (70)

1.一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，包括通式(I)的羟烷基淀粉
在其该反应之前未被氧化的还原性末端与通式(II)的化合物反应：
              R′-NH-R″          (II)
其中R1、R2和R3独立地是氢、或者是线性或分支的羟烷基，其中R′或R″或者R′和R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中R’是氢或者是线性或分支的烷基或烷氧基。
5.如权利要求4所述的方法，其中R’是氢或甲基或甲氧基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中除了官能团X之外，R″还含有至少另外一个官能团W，W与桥连R’与R″的NH基团直接连接，官能团W选自：
Figure A038250370003C1
和
Figure A038250370003C2
其中G是O或S，如果G存在两个，则独立地是O或S。
7.如权利要求6所述的方法，其中如果R′是H，则R′和桥连R′与R″的NH基团与W一起构成下列基团之一：
Figure A038250370003C3
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述至少另外一个官能团X选自：-SH、NH2、-O-NH2、-NH-O-烷基、-(C＝G)-NH-NH2、-G-(C＝G)-NH-NH2、-NH-(C＝G)-NH-NH2和-SO2-NH-NH2，其中G是O或S，如果G存在两个，则独立地是O或S。
9.如权利要求1-6或8中任一项所述的方法，其中通式(II)的化合物是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺或碳酰肼。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中化合物(I)与化合物(II)反应，化合物(II)在与化合物(I)反应之前不与其它化合物反应。
11.如权利要求10所述的方法，其中化合物(II)是一种羟胺或酰肼，化合物(I)与化合物(II)的反应在5-45℃下和pH 4.5-6.5下在水性介质中进行。
12.如权利要求10所述的方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应是还原胺化，在25-90℃下和pH 8-12下在水性介质中进行。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过所述至少一个官能团X与其它化合物反应。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述至少另外一种化合物通过所述至少一种其它化合物中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分反应。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述多肽是***。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中反应在4-37℃下进行。
18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其中反应在水性介质中进行。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述其它化合物是一种交联化合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中化合物(I)和(II)的反应产物与所述交联化合物的反应产物与第二种其它化合物反应。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第二种其它化合物(II)是一种多肽。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述第二种其它化合物通过所述至少一种其它化合物中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分反应。
23.如权利要求13所述的方法，其中所述其它化合物是一种交联化合物与第二种其它化合物的反应产物。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第二种其它化合物是一种多肽。
25.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中化合物(II)在与化合物(I)反应之前与其它化合物反应。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一种其它化合物通过所述至少一种其它化合物中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分反应。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述多肽是***。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中反应在4-37℃下进行。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中反应在水性介质中进行。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述其它化合物是一种交联化合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述交联化合物在与化合物(II)反应之前与第二种其它化合物反应。
33.如权利要求25所述的方法，其中所述其它化合物是一种交联化合物与第二种其它化合物的反应产物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第二种其它化合物是一种多肽。
35.一种生产羟乙基淀粉衍生物的方法，包括在水性介质中，通式(I)的羟乙基淀粉
Figure A038250370005C1
在其该反应之前未被氧化的还原性末端与通式(II)的化合物反应：
             R′-NH-R″             (II)
其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基，其中R′是氢或甲基或甲氧基，其中R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应，官能团X选自：-SH、NH2、-O-NH2、-NH-O-烷基、-(C＝G)-NH-NH2、-G-(C＝G)-NH-NH2、-NH-(C＝G)-NH-NH2和-SO2-NH-NH2，其中G是O或S，如果G存在两个，则独立地是O或S。
36.如权利要求35所述的方法，其中通式(II)的化合物是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺或碳酰肼。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X和多肽中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分，化合物(I)与化合物(II)的反应产物在水性介质中与多肽反应。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽是***。
39.如权利要求35所述的方法，其中通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X和多肽中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分，化合物(II)在水性介质中与多肽反应，产生的反应产物与化合物(I)反应。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述多肽是***。
41.一种生产羟乙基淀粉衍生物的方法，该方法包括在水性介质中，通式(I)的羟乙基淀粉：
在其该反应之前未被氧化的还原性末端与O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基，反应产物在水性介质中与***通过所述***中所含的氧化的碳水化合物部分反应。
42.一种可通过下述方法获得的羟烷基淀粉衍生物，该方法包括通式(I)的羟烷基淀粉(HAS)
在其该反应之前未被氧化的还原性末端，与通式(II)的化合物反应：
               R′-NH-R″         (II)
其中R1、R2和R3独立地是氢，或者是线性或分支的羟烷基，其中R′或R″或者R′和R″含有至少一个官能团X，在(I)与(II)反应之前或之后，X能够与至少一种其它化合物反应。
43.如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
44.如权利要求42或43所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
45.如权利要求42-44中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R′是氢或线性或分支的烷基或烷氧基。
46.如权利要求45所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R′是氢或甲基或甲氧基。
47.如权利要求42-46中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中除了官能团X之外，R″还含有至少另外一个官能团W，W与桥连R’与R″的NH基团直接连接，官能团W选自：
Figure A038250370007C2
       和
Figure A038250370007C3
其中G是O或S，如果G存在两个，则G独立地是O或S。
48.如权利要求47所述的方法，其中如果R′是H，则R′和桥连R′与R″的NH基团与W一起构成下列基团之一：
49.如权利要求42-48中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述至少一个官能团X选自：-SH、NH2、-O-NH2、-NH-O-烷基、-(C＝G)-NH-NH2、-G-(C＝G)-NH-NH2、-NH-(C＝G)-NH-NH2和-SO2-NH-NH2，其中G是O或S，如果G存在两个，则独立地是O或S。
50.如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通式(II)的化合物是O-[2-(2-氨基氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺或碳酰肼。
51.如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述衍生物具有根据通式(IIIa)的结构：
52.如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R′是氢，所述衍生物是通式(IIIa)的化合物或通式(IIIb)的化合物或通式(IIIa)和(IIIb)化合物的混合物。
Figure A038250370009C1
53.如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，或者化合物(II)在与化合物(I)反应之前，通过所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应。
54.如权利要求53所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过所述至少一种其它化合物中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分，所述至少一种其它化合物与化合物(II)反应，或者与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
55.如权利要求54所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽。
56.如权利要求55所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述多肽是***。
57.如权利要求53所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述其它化合物是一种交联化合物。
58.如权利要求57所述的羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物与交联化合物的反应产物与第二种其它化合物反应。
59.如权利要求57所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述第二种其它化合物是一种多肽。
60.如权利要求58所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述第二种其它化合物通过所述至少一种其它化合物中所含的巯基或氧化的碳水化合物部分反应。
61.如权利要求53所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述其它化合物是一种交联化合物与第二种其它化合物的反应产物。
62.如权利要求61所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述第二种其它化合物是一种多肽。
63.一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，或者在与化合物(I)反应之前，化合物(II)通过所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，其中所述至少一种其它化合物是一种多肽。
64.如权利要求63所述的药物组合物，其中所述多肽通过多肽所含的氧化的碳水化合物部分与化合物(II)反应，或者与化合物(I)与化合物(II)的反应产物反应。
65.如权利要求64所述的药物组合物，其中所述多肽是***。
66.如权利要求65所述的药物组合物，其中羟乙基淀粉在水性介质中与下列通式的化合物反应，
反应产物与***反应。
67.如权利要求66所述的药物组合物，其中***在反应之前用高碘酸钠氧化。
68.如权利要求66所述的药物组合物，其中***在反应之前被部分去唾液酸化，随后用高碘酸钠氧化。
69.一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求42所述的羟烷基淀粉衍生物，其中化合物(I)与化合物(II)的反应产物通过化合物(II)中所含的所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，或者在与化合物(I)反应之前，化合物(II)通过所述至少一个官能团X与至少一种其它化合物反应，其中所述至少一种其它化合物是一种交联化合物，化合物(I)与(II)的反应产物与该交联化合物的反应产物与一种多肽反应。
70.如权利要求69所述的药物组合物，其中所述多肽是***。
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