CN1687777A - 一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，其特征在于以普通玻璃基片或硅片作为载体，将活性官能基团醛基引入基片表面，生成能够有效牢固固定蛋白质的蛋白质芯片基片。其置备方法主要包括羟基化、APTES的自组装和对苯二甲醛的组装三步。对苯二甲醛中的两个醛基中的一个和基片表面的氨基基团发生反应并以C＝N双键结合，另外的活性醛基暴露在芯片表面，可以和蛋白质的氨基基团发生反应，生成C＝N双键，将蛋白质固定在玻璃或硅片表面上，本发明的优点是以价格较低的玻璃片和硅片作为蛋白质芯片的载体，降低了生产的成本；通过共价键将蛋白质固定在玻璃片或硅片表面，在蛋白质相互作用过程中不易脱落。制备方法简单，性能稳定，可大规模生产。

Description

一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法

技术领域

本发明涉及一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，这种醛基修饰的蛋白质芯片基片可以将蛋白质通过共价键固定在芯片表面。

技术背景

现在的蛋白质芯片是指在固相支持物(载体)表面固定大量蛋白探针(可以是抗原、抗体，受体、配体、酶、底物等)，形成高密度排列的蛋白质点阵。利用这种芯片和含有未知蛋白质的液体(体液或细胞和组织提取物)进行孵育反应，反应后用相应的检测***进行检测，最后应用计算机分析和比较相应检测蛋白质的表达情况。蛋白质芯片根据相互作用原理可分为抗原-抗体芯片，受体-配体芯片，酶-底物芯片和多肽芯片等。

蛋白质芯片的制作比DNA芯片的制作更为复杂，蛋白质很难在载体表面合成，合成的序列也很短，而且合成多肽序列的空间结构很难预测，因而目前蛋白质芯片多采用在基片表面直接点样的方法。其中重要的一个步骤是如何将这些点样的蛋白质固定在芯片表面。由于蛋白质种类繁多、性质各异，而载体表面只能用一种化学或生物基团修饰，这给探针与载体表面基团的结合带来困难。这是制备蛋白质芯片过程中首先要解决的问题。

有多种不同的方法和标签(Tag一种短的化合物链)用于蛋白质在固相支持物表面的固定。如非共价键的吸附以及共价键结合，用链亲和素的亲和捕获((1)Hoyer-Hansen G，Hamers M J，Pedersen A N，et al.Loss of ELISAspecificity due to biotinylation of monoclonal antibodies.[J]J.Immunol.Methods 2000，235(1-2)：91-9；(2)Rowe C A，Tender L M，Feldstein M J，et al.Array biosensor for simultaneous identification of bacterial，viral，and proteinanalytes.Anal.Chem.1999，71，3846-3852)。这些蛋白质固定技术各有优缺点，非共价键的吸附具有高吸附容量，较好地保持蛋白质的空间结构，较低的非特异性吸附等优点，但是物理的非共价吸附无法控制蛋白质吸附的数量以及蛋白质吸附的方向性，因而芯片的反应效率、反应的准确性和反应的重现性等方面都受到影响。

共价键的结合是在载体表面衍生活泼的化学基团，如醛基、环氧基、氨基、活化酯((3)MacBeath G，Schreiber S L.Printing proteins as microarrays forhigh-throughput function determination.Science 2000，289，1760-1763.(4)Ziauddin M，Sabatini D M.Microarrays of cell expressing defined cDNAs.Nature 2001，411，107-110.)。以及镍-氮川三乙酸钠螯合物((5)Templin M F，Stoll D，Schrenk M，et al.Protein microarray technology.Trends Biotechnol2002，20：160-166)等，用来固定蛋白质。短链两端各有一个功能基团的硅烷可以用于蛋白质分子在固相表面的固定，它的一个功能基团可以和玻璃表面的羟基反应，而另外一个功能基团(醛基或环氧基)可与蛋白质的氨基反应，还可以对该功能基团进一步化学修饰以达到反应的特异性。但是环氧基修饰基片过程较为复杂，固定效率不高，氨基修饰基片虽较为简单，但结合固定效果不理想。

制作蛋白质芯片首先要选择合适的基片作为蛋白质的载体，蛋白质芯片的载体要满足一下几个方面的要求：1)基片要能够适合高密度点样的要求；2)固定的蛋白质在杂交、洗脱和分析过程中不易脱落；3)不同批次基片之间以及同一基片各点之间均一性好；4)分析复杂蛋白质混合物时有较好的信噪比；5)蛋白质探针有较好的保质期；6)探针固定后能够保持蛋白质的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，它是一种在玻璃片或硅片表面进行醛基修饰，用来固定蛋白质，制作成的蛋白质芯片基片。

本发明解决的关键问题是如何对玻璃基片或硅基片进行一系列的化学表面处理，将活性的官能基团醛基引入到基片表面，提供一种供够有效而牢固地固定蛋白质的芯片或硅片基片。

该蛋白质芯片基片及其制备方法具有材料来源丰富、成本低廉，制作方法和流程简单、蛋白质固定牢固，固定效率高等特点，适合大规模蛋白质芯片基片的生产。

本发明所述的一种醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，包括羟基化、3-氨丙基-3乙氧基硅烷的组装和对苯二甲醛的组装三步，具体步骤是：

(1)首先用浓度为98％的H₂SO₄和30％的H₂O₂按体积比为7∶3的比例配制的洗液浸泡进行表面处理，使基片羟基化；

(2)将步骤(1)羟基化的基片清洗吹干后，在3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中组装；形成一层末端为氨基的单分子自组装膜；

(3)组装后基片经漂洗和吹干，在烘箱中烘烤，使3-氨丙基-3乙氧基硅烷完全(APTES)与芯片组装；

(4)将步骤组装后的基片，再在对苯二甲醛溶液中组装；表面形成活性醛基；

(5)取出漂洗，吹干，避光保存。

所述的基片为普通的玻璃基片或硅片，清洗是超声波清洗，然后用去离子水清洗。

在上述步骤(2)组装用的3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为30-45分钟。

在上述步骤(1)中所述的羟基化的基片是先用去离子水清洗，并用氮气吹干。

在上述步骤(3)中所述的烘箱烘烤温度为100-110℃，时间为45分钟。

在上述步骤(3)所述的组装后漂洗是用无水乙醇在摇床中漂洗，再用氮气吹干的；步骤(5)所述的组装后漂洗是用去离子水在摇床中漂洗，再用氮气吹干。

在上述步骤(4)所述对苯二甲醛溶液中组装，其溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为45-60分钟。

本发明所制作的醛基修饰的蛋白质芯片基片，其特征在于基片表面具有高密度的活性醛基，蛋白质固定在基片表面。

所述的高密度活性醛基，由于对苯二甲醛为刚性分子，不可任意扭曲，其分子中两个醛基只能有一个与基片表面上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个暴露在基片表面，和蛋白质的氨基基团发生反应，生成C＝N双键，将蛋白质固定在玻璃或硅片表面上。

所述的醛基修饰芯片基片的质量评价方法：

芯片基片的质量主要通过检测基片的荧光背景、固定效率赫里斯系数三个参数进行评价的。荧光背景是一个数值，指芯片基片用共聚焦扫描仪在一定扫描强度下进行扫描所得的平均荧光信号强度。为了不影响在使用过程中对荧光信号的判读，荧光背景信号应尽可能较低。固定率是芯片基片经点样固定后，洗涤液洗涤后荧光信号强度与洗涤前荧光信号强度的百分比，它反映了点样区蛋白质的固定效率。离散系数是固定率标准差S与固定率均数F之比，用百分数表示，其大小反映基片的均一性，离散系数越小，说明基片的均一性越好。

本发明旨在阐述芯片基片荧光背景和固定率的检测方法，FITC标记的IgG在醛基修饰芯片基片上的固定方法，同时给出按实施例1、2、3制备的醛基修饰蛋白质芯片的相应检测结果。(详见表1)

(1)荧光背景的检测

将蛋白质芯片***扫描仪Genepix 4000B，采用532nm波长检测，在PMT为750，激光强度为100％的条件下对基片的全部点样区域进行扫描，然后从扫描仪所带软件中读取荧光背景值。

(2)点样及固定

用点样仪Cartesian-prosy 5510-A的蛋白质芯片基片上设定的5个点样小区内点样(如图二所示)，在每个小区均匀点制5×5的矩阵，点样用的蛋白为FITC标记的IgG，浓度为0.09μg/μl。

点样后的基片，在37℃，相对湿度为75％的湿箱中避光固定12小时，固定后IgG与芯片基片的结合示意图如图三。

(3)固定率

将点样固定后的蛋白质芯片用扫描仪Genepix 4000B扫描，扫描波长为532nm，PMT为750，激光强度为100％，保存每个点样区的图片(如图4所示)，用扫描仪自带软件分析每个样点的荧光信号强度，为洗涤前该样点的荧光信号强度PO。

将扫描后的蛋白质芯片置于0.5％Tween-20 PBS缓冲液中漂洗5分钟，再置于PBS缓冲液中洗涤5分钟，然后用上述方法进行扫描，所得荧光信号强度为洗涤后改样点的荧光强度P1。

每个点样点的固定率Fi按式1算出

整个基片的固定率为所有样点的平均固定率F

$F=\frac{\underset{i=1}{\overset{125}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{Fi}}{125}----\left(2\right)$

(4)离散系数Cv(按式3计算)

$\mathrm{Cv}=\frac{S}{F}\×100\%----\left(3\right)$

其中F为平均固定率，S为标准差

$S=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{125}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{Fi}-F)}^2}{124}}----\left(4\right)$

本发明的优点和有益效果是：

1、本发明采用的基地材料为普通玻璃片或硅片，具有来源丰富、价格低廉等优点，所采用的方法和工艺流程简单，使用的设备简单，适合大规模生产。

2、用了分子自组装膜技术，将有机分子同过共价键牢固固定在玻璃基片或硅基片表面，在杂交、清洗和检测过程中不易脱落。

3、这种方法可保证表面醛基官能团的高密度和均一性，从而保证基片具有高固定率、低离散系数的特点。

4、采用刚性分子对苯二甲醛作为醛基化试剂，避免了同一分子中两个醛基都与表面上的氨基进行反应的可能性，保证了芯片基片表面具有高密度的活性醛基官能基团。

5、这种方法制备的芯片基片背景荧光较低，且芯片表面有一定的疏水性，在蛋白质样品点样过程中样点没有明显扩大，均一性好。

附图说明

图1醛基修饰蛋白质芯片基片的制备过程基片表面结构变化示意图

图中(1)——羟基化

    (2)——APTES自组装

    (3)——对苯二甲醛的组装

图2蛋白质与醛基修饰芯片基片的结合方式示意图

图3点样方阵荧光信号检测结果

其中左图为洗涤液洗涤前的检测结果，右图为洗涤液洗涤后的检测结果。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

一醛基修饰蛋白质芯片基片的制备

实施例1

醛基修饰蛋白质芯片基片采用的是普通的无色玻璃片或裁切后尺寸相当的硅片，其尺寸为：长75mm宽52mm厚1mm，硅片厚0.4mm。其制备过程主要包括羟基化、APTES的组装和对苯二甲醛的组装三步，该过程基片表面的的结构变化示意图如图1所示。醛基修饰的蛋白质芯片基片的制备步骤为：

(1)用无水乙醇将玻璃或硅基片超声清洗5分钟两次，然后再用去离子水超声清洗5分钟两次，洗去基片表面黏附物。

(2)将清洗后的基片在新配制的Piranha溶液(98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3体积比)中浸泡30Min，使玻片表面完全羟基化，取出基片用大量去离子水清洗，并用氮气流吹干。

(3)将表面羟基化的基片在10mmol/LAPTES(3-氨丙基-3-乙氧基硅烷)的无水乙醇溶液中组装30Min，取出基片用无水乙醇在摇床中漂洗两遍，并用氮气流吹干。

(4)将上述基片放置在烘箱。在100℃条件下烘烤45Min使APTES(3-氨丙基-3-乙氧基硅烷)完全与基片组装。

(5)将组装后的基片在10mmol/L的对苯二甲醛的丙酮溶液中组装30Min，取出后用去离子水在摇床中漂洗两次，氮气吹干。

(6)室温避光保存修饰好的芯片。

由本实施例提供的醛基修饰的蛋白质芯片，蛋白质固定后结果如图3所示，而制作基片编号1-3，其固定的主要性能指标列于表1中。

实施例2

修饰工艺过程同实施例1，仅所使用的APTES的浓度为12mmol/L，对苯二甲醛的浓度为15mmol/L，蛋白质与醛基修饰的玻璃片结合方式如图2所示，固定效率列于表1中(编号4-6)。

实施例3

修饰工艺过程同实施例1，仅所使用的APTES的浓度为15mmol/L，组装时间为45Min。烘烤温度为110℃，时间为45分钟。对苯二甲醛的浓度为12mmol/L，组装时间为60Min。和蛋白质与醛基修饰的玻璃片结合方式如图2所示，固定效率列于表1中(编号7-9)

表1为按实施例1、2、3制备的醛基修饰的蛋白质芯片的荧光背景、固定率和离散系数检测结果。从该表结果可以看出依本发明所制备的醛基修饰蛋白质芯片具有低荧光背景，高固定率和低离散系数的特性。

表1

基片编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										荧光背景	3781	3920	3842	3657	4167	4526	4089	3915	4233
固定率(％)	41.2	38.13	47.53	45.26	39.48	42.14	45.81	37.45	38.55
										离散系数(％)	6.24	7.38	7.23	8.09	8.43	9.63	5.04	7.89	9.13

Claims (9)

1.一种醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于包括羟基化、3-氨丙基-3乙氧基硅烷的组装和对苯二甲醛的组装三步，具体步骤是：

(1)首先用浓度为98％的H₂SO₄和30％的H₂O₂按体积比为7∶3的比例配制的洗液浸泡进行表面处理，使基片羟基化；

(2)将步骤(1)羟基化的基片清洗吹干后，在3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中组装；形成一层末端为氨基的单分子自组装膜；

(3)组装后基片经漂洗和吹干，在烘箱中烘烤，使3-氨丙基-3乙氧基硅烷完全与芯片组装；

(4)将步骤组装后的基片，再在对苯二甲醛溶液中组装；表面形成活性醛基；

(5)取出漂洗，吹干，避光保存。

2.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于所述的基片为普通的玻璃基片或硅片，清洗是超声波清洗，然后用去离子水清洗。

3.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于步骤(2)组装用的3-氨丙基-3乙氧基硅烷的无水乙醇溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为30-45分钟。

4.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于步骤(1)中所述的羟基化的基片是先用去离子水清洗，并用氮气吹干。

5.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，其特征在于步骤(3)中所述的烘箱烘烤温度为100-110℃，时间为45分钟。

6.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法，其特征在于步骤(3)所述的组装后漂洗是用无水乙醇在摇床中漂洗，再用氮气吹干的；步骤(5)所述的组装后漂洗是用去离子水在摇床中漂洗，再用氮气吹干。

7.按权利要求1所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片及其制作方法，其特征在于步骤(4)所述对苯二甲醛溶液中组装，其溶液浓度为10-15mmol/L，组装时间为45-60分钟。

8.按权利要求1-7所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片的制作方法中任意一项权利要求所制作的醛基修饰的蛋白质芯片基片，其特征在于基片表面具有高密度的活性醛基，蛋白质固定在基片表面。

9.按权利要求8所述的醛基修饰的蛋白质芯片基片，其特征在于高密度活性醛基只能有一个与基片表面上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个暴露在基片表面，和蛋白质的氨基基团发生反应，生成C＝N双键，将蛋白质固定在玻璃或硅片表面上。

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