CN1683418A

CN1683418A - 用大孔吸附树脂制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其产品

Info

Publication number: CN1683418A
Application number: CN 200510038035
Authority: CN
Inventors: 敖宗华; 符慧子; 邹锡良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2005-03-07
Publication date: 2005-10-19
Anticipated expiration: 2025-03-07
Also published as: CN100335505C

Abstract

用大孔吸附树脂制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其产品，涉及大孔吸附树脂层析分离和中草药有机成分的分离提纯技术领域。本发明对樟芝子实体或菌丝体采取热水提取，大孔树脂吸附水提取液和乙醇分级洗脱方法分别获得樟芝多糖和樟芝三萜。本发明也包括把本方法获得的具药理活性产品用于制备药物。所获得的樟芝三萜具有很好的抗肝癌细胞活性。用液－质联用分析，其主要有效成分是一新结构化合物，是将来开发中药、天然药物一类新药的优秀新化学实体。

Description

用大孔吸附树脂制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其产品

技术领域

本发明是建立一种用大孔吸附树脂层析分离制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法。本发明也包括利用本方法获得的具药理活性的产品及用于制备药物。涉及大孔吸附树脂层析分离和中草药有机成分的分离提纯技术领域。

技术背景

樟芝(Antrodia camphorata)是台湾一种著名的中药。野生子实体生长在台湾保护树种牛樟树树干腐朽之心材内壁，或枯死倒伏之牛樟木材阴暗潮湿之表面，很不容易被发现。樟芝在台湾有悠久的使用历史，原住民皆将樟芝视为是最珍贵的药材。野生上品在物以稀为贵的预期心理作用之下，天然樟芝的价格也日渐地水涨船高，目前被称为是全世界市场上最昂贵的野生真菌，市价往往高达每台斤新台币十多万元至数十万元不等，野生上品可达15000美元/公斤，可说是药材中的王中之王。目前，还不能人工培育樟芝子实体。在台湾，近几年已有十几家公司开发出用樟芝发酵菌丝体和发酵菌粉为主要原料的保健食品，可以调节生理功能、滋补强身、增强体力、增加免疫力、精神旺盛、促进新陈代谢、减少疲劳感。

近几年研究发现，樟芝子实体和发酵产物的主要药理活性物质是多糖、多酚和三萜。樟芝子实体和液体深层发酵菌丝体中粗多糖具有强的抗乙肝病毒表面抗原的活性，50ug/ml多糖浓度抗乙肝病毒(HBV)表面抗原的活性强于α-干扰素1000U/ml的剂量。而樟芝子实体和某些菌株液体深层发酵菌丝体产生的多糖还具有抗乙肝病毒e抗原的活性。这是首次发现来源于食用真菌中多糖具有在细胞水平抗HBV活性。

樟芝的抗氧化能力与所含的多酚、总三萜有关。环境及膳食中某些化学物质进入机体后通过体内的代谢过程．引起活性氧自由基大量生成、内源性抗氧化物质减少甚至耗竭，从而引发脂类、蛋白质等生物大分子的一系列改变生命机体之所以发生氧化损伤，从而导致一系列疾病如冠心病，动脉粥样硬化，癌症等。使用抗氧化剂可清除体内氧自由基，以达到保护人体细胞组织，保护心脑血管循环***、抗癌及延缓衰老等生理作用。樟芝三萜则具有抗HBV和抑制肿瘤，特别是抑制肝癌细胞的活性。

目前，樟芝中生理活性物质的分离纯化研究工作不多，适合工业化生产的资料更是缺乏，且步骤繁杂。

大孔吸附树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，20世纪70年代末逐渐应用到中草药有效成分提取分离过程中。在天然产物分离中常用的是非极性和中极性大孔树脂，其特点是吸附容量大、再生简单、效果可靠。目前还没有用大孔吸附树脂分离樟芝多糖和樟芝三萜的报道。

发明内容

本发明的目的是提供用大孔吸附树脂制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其产品，采用大孔树脂吸附工艺，可达到用一步操作实现工业化分离樟芝多糖和樟芝三萜的目的。

本发明的技术方案：用大孔吸附树脂层析分离制备樟芝中生理活性物质，具体是指多糖和三萜的方法。由于樟芝野生子实体或人工栽培子实体，固体栽培和液体发酵所得菌丝体产物中多糖和三萜都是其主要药理活性组分，因此，本发明所述的分离制备方法对樟芝野生子实体或人工栽培所得子实体、液体发酵和固体栽培所得菌丝体产物都适用。

对于液体发酵所得菌丝体产物可在发酵结束后在发酵罐内加快搅拌桨速度将菌丝体打碎，然后升高温度至90-100℃提取1-3小时。如用液体发酵所得菌丝体干燥物、野生子实体或人工栽培子实体、固体栽培所得菌丝体，则可打碎成适宜大小的碎块后，加入以所提取物干重计8-10倍重量的水，在90-100℃提取1-3小时。在提取结束后，可采用离心过滤法或板框过滤法除去不溶物，得提取清液。将所得清液浓缩至固形物含量10％(重量比)后准备上大孔吸附树脂柱吸附。

大孔吸附树脂柱的准备：将市售的非极性大孔吸附树脂，如D-101，或中极性大孔吸附树脂，如HPD400等装入层析柱。层析柱的材质最好选用玻璃柱，如工业化生产可采用不锈钢柱，然后按树脂操作要求，一般用100％乙醇洗脱至洗脱液加水不浑浊为宜。接着用蒸馏水洗柱至洗脱液无乙醇味，层析柱备用。

将过滤步骤所得浓缩液用适宜的缓慢流速上柱吸附，在上样后用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，洗脱时流速也不宜过快。樟芝多糖为极性物质，不被非极性和中极性大孔树脂吸附，故存在于蒸馏水洗脱部分，将此部分洗脱液浓缩至原体积的5-10％，浓缩后加乙醇至终乙醇浓度为70-80％后，4℃静置冷藏24小时，收集所得沉淀即得樟芝多糖。

然后选用递增乙醇浓度洗脱，用50-60％浓度的乙醇继续洗脱层析柱去除色素杂质，弃去此洗脱液，然后用80-100％浓度的乙醇继续洗脱层析柱，每个浓度洗脱3-4个柱体积，樟芝三萜可被较高浓度的乙醇水溶液洗出。选用适当型号的大孔树脂可得到活性较高的总三萜。

在本发明中采用的是非极性和中极性大孔吸附树脂，如非极性的D-101和中极性的HPD400等。不同厂家生产的大孔吸附树脂对樟芝多糖和樟芝三萜都具有分离效果，但分离能力有一定差异，所分得的产物生理活性也不完全相同。

本发明的有益效果：本发明将大孔吸附树脂层析技术成功用于分离制备樟芝多糖和樟芝三萜，为中药材王中之王的樟芝的有效药理活性产品的大规模工业化提取和纯化提供了一种可行的方法，为所获药理活性产品的进一步的开发和应用奠定了基础。

樟芝多糖具有在细胞水平抗乙肝病毒(HBV)的活性。所获得的樟芝三萜组分兼具抗氧化和抗肝癌细胞活性。D-101树脂层析制备的樟芝三萜在100ug/ml时，对人正常肝细胞的抑制率为5.2％，而对人肝癌细胞HepG2和Bel7402的抑制率分别可达21％和12％。HPD400树脂层析制备的樟芝三萜在100ug/ml时，对人正常肝细胞的抑制率为10％，而对人肝癌细胞HepG2和Bel7402的抑制率分别可达30％和44％，表明其具有很好的抗肝癌细胞活性。用液-质联用分析，其主要有效成分是一新结构化合物，是将来开发中药、天然药物一类新药的优秀新化学实体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例中所用的样品为液体发酵樟芝菌丝体，所举实例并非限制本专利的适用范围。

实施例1：用非极性大孔树脂D-101分离制备樟芝多糖和樟芝三萜

层析柱用内径4cm，长80cm的玻璃层析柱，内装D-101填料(由天津市海光化工有限公司生产)，高50cm，相应的填料体积为628ml。将樟芝液体发酵产物的水提取液配制成100mg/ml上样，上样量为140ml，上样和洗脱的流速保持5ml/min。上样结束后用1900ml的蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩后加入乙醇至终乙醇浓度达75％，4℃静置冷藏24小时，收集得白色沉淀，真空干燥得樟芝多糖2.6g。

水洗后用递增乙醇浓度洗脱，用50-60％浓度的乙醇继续洗脱层析柱去除色素杂质，弃去此洗脱液，然后用80-100％浓度的乙醇继续洗脱层析柱，樟芝三萜主要存在于80-100％乙醇洗脱液中，洗脱液呈无色透明，浓缩干燥得淡黄色产物0.08g，占发酵产物干重得率为0.23％。

实施例2：用中极性大孔树脂HPD400分离制备樟芝多糖和樟芝三萜

层析柱用内径4cm，长80cm的玻璃层析柱，内装HPD400填料(由河北沧州宝恩化工有限公司生产)，高50cm，相应的填料体积为628ml。将樟芝液体发酵产物的水提取液配制成100mg/ml上样，上样量为140ml，上样和洗脱的流速保持5ml/min。上样结束后用1900ml的蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩后加入乙醇至终乙醇浓度达75％，4℃静置冷藏24小时，收集得白色沉淀，真空干燥得樟芝多糖2.5g。

水洗后用递增乙醇浓度洗脱，用50-60％浓度的乙醇继续洗脱层析柱去除色素杂质，弃去此洗脱液，然后用80-100％浓度的乙醇继续洗脱层析柱，洗脱液呈无色透明，浓缩干燥得白色结晶0.175g，占发酵产物干重得率为0.50％。

实施例3：D-101和HPD400所制备的樟芝三萜用于抗氧化、抑制肝癌细胞的测定方法和结果

抗氧化测定方法：

准确称取20mg DPPH(2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味酰肼自由基)用无水乙醇溶解并定容于250毫升容量瓶中，则DPPH浓度为2×10^-4mol/l，取待测液和等体积2×10^-4mol/l DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀。30分后用无水乙醇作参比测定其吸光度A_i，测定波长517nm。同时测定2×10^-4mol/l DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A_c，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A_j。根据下列公式计算抑制率：

抑制率＝[1-(A_i-A_j)/A_c]×100％

其中：A_c未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；

A_i加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度；A_j待测液在测定波长的吸光度。

抗氧化测定结果：

D101所制备三萜的EC50(即50％抑制浓度)为1.9mg/ml，HPD400所制备三萜的EC50为6.3mg/ml。

抑制肝癌细胞测定方法：

完全培养液的配制：

RPMI1640培养液用无菌的1mol/L HCl或NaOH调pH至7.0～7.2，过滤除菌，用前加入10％小牛血清(FCS)，1％200mmol/L谷氨酰胺，100U/ml的青霉素和100μg/mL链霉素，即为完全培养液。

细胞培养：

人肝癌细胞株Hep G2生长在完全培养基中，于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。传代至旺盛生长后，试验24h前半量换液，0.4％台盼蓝鉴定活细胞数应为98％以上。所有实验均经二次以上重复证实。

MTT法细胞生长抑制实验

原理：MTT即3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2，5-diphenyltetrazoloium，中文名为3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑嗡。活细胞线粒体能够将黄色的MTT代谢生成紫色的结晶，用二甲亚砜溶解结晶后，测定570nm的光吸收。因为吸光度的大小与活细胞线粒体的代谢能力成正相关，从而与活细胞数量呈一定的相关性。因此，根据颜色的变化可以确定细胞的生长抑制情况。

方法：用0.25％胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养液调整Hep G2细胞浓度为1×10⁵～5×10⁵/mL，将Hep G2细胞加入96孔培养板中，每孔150μL。加入用完全培养液稀释成15μg/mL、50μg/mL的100％乙醇洗脱物溶液150μL，每个样品设四次重复，同时设空白对照，将细胞培养板移入CO₂培养箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养48h。培养结束后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，37℃继续孵育4h。然后弃去孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲亚砜，37℃保温10min，震荡60s，在酶联免疫检测仪上测定各孔在570nm处的吸光度值(OD值)，计算百分抑制率，并从量效时间曲线上计算出不同作用时间的IC₅₀。

抑制肝癌细胞测定结果：

D-101树脂层析制备的樟芝三萜在100ug/ml时，对人正常肝细胞的抑制率为5.2％，而对人肝癌细胞HepG2和Bel7402的抑制率分别可达21％和12％。HPD400树脂层析制备的樟芝三萜在100ug/ml时，对人正常肝细胞的抑制率为10％，而对人肝癌细胞HepG2和Bel7402的抑制率分别可达30％和44％，表明其具有很好的抗肝癌细胞活性。用液-质联用分析，其主要有效成分是一新结构化合物，是将来开发中药、天然药物一类新药的优秀新化学实体。

Claims

1、一种用大孔吸附树脂分离制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法，其特征是将樟芝子实体或菌丝体用热水提取，提取液过滤，过滤所得清液用大孔吸附树脂层析柱吸附，用3倍填料体积的蒸馏水洗脱，收集蒸馏水洗脱液，浓缩后用乙醇沉淀得樟芝多糖；再用乙醇分级洗脱层析柱，将洗脱液浓缩，干燥得樟芝三萜；具体工艺为：

热水提取：樟制子实体或菌丝体打碎后以干重计加入8-10倍重量的水，在90-100℃提取1-3小时；

过滤：提取结束后，用离心或板框过滤去除不溶物得提取清液，将所得清液浓缩至固形物含量10％；

层析柱吸附：将过滤步骤所得浓缩液在大孔吸附树脂层析柱上样吸附；

蒸馏水洗脱并制备樟芝多糖：用蒸馏水洗脱上样后的层析柱，收集洗脱液浓缩至原体积的5-10％，然后在浓缩液中加入乙醇至终乙醇浓度达70-80％，静置冷藏，收集所得沉淀，干燥即得樟芝多糖；

乙醇分级洗脱并制备樟芝三萜：用50-60％浓度的乙醇继续洗脱层析柱去除色素杂质，弃去此洗脱液，然后用80-100％浓度的乙醇继续洗脱层析柱，收集80-100％浓度的乙醇洗脱液浓缩、干燥得樟芝三萜。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是所用的樟芝原料包括野生子实体或人工栽培所得子实体，固体栽培或液体发酵所得菌丝体。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的大孔吸附树脂是非极性大孔树脂或中极性大孔树脂。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征是所述的非极性大孔吸附树脂是D-101树脂，中极性大孔吸附树脂是HPD400。

5、用权利要求1所述方法制备的产品，其特征是具有药理活性的产品分别是樟芝多糖和樟芝三萜。

6、如权利要求5所述的产品樟芝三萜的应用，其特征是用于治疗过氧化物导致的疾病或肝癌的药物。