CN109337953A - 一种桦褐孔菌素d提取物及其制备方法与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种桦褐孔菌素D提取物及其制备方法与检测方法。经过桦褐孔菌粗粉制备、酵母菌发酵液配制、桦褐孔菌发酵液制备、桦褐孔菌发酵提取物制备、桦褐孔菌发酵萃取物制备、桦褐孔菌素D提取物制备等步骤得到桦褐孔菌素D提取物。该桦褐孔菌素D提取物中桦褐孔菌素D的含量较高。本发明还提供了采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D含量的方法。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桦褐孔菌素D提取物及其制备方法与检测方法。
技术背景：
桦褐孔菌，拉丁名：Inonotusobliquus(Fr.)Pilat，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymeno-mycetes)、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、锈革菌科(Hymenochaetaceae)、褐卧孔菌属(纤孔菌属)(In-onotus)。我国还称其为桦癌褐孔菌、斜管纤孔菌或白桦茸等。
桦褐孔菌的菌丝体极其耐寒，生活在木材中的菌丝体能耐零下40℃的低温。主要分布在北半球北纬45°～50°的地区，如北美的北部、芬兰、波兰、俄罗斯的西西伯利亚、远东部分地区、日本的北海道地区、我国的黑龙江省大小兴安岭、吉林省长白山地区等。
现代研究表明，桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗氧化作用、降血糖作用、抗病毒作用、保肝作用、抗衰老作用、免疫调节、防治艾滋病等的多种药理作用，对呕吐、腹泻、胃肠功能紊乱、胃及十二指肠溃疡、肝炎、胃炎和肾炎有一定的治疗作用。
通过对桦褐孔菌菌核进行有效成分的提取，抗癌成分的研究、免疫调节作用的研究及药理实验表明，桦褐孔菌具有明显的抗癌作用。桦褐孔菌菌核含有的特效成份β-D甘露糖、抗氧化物质明显高于其他菇类。而且桦褐孔菌菌丝体的液体深层发酵培养物和桦褐孔菌菌核有效成分的提取物可以作为健康食品的主要原料，用来开发生产保健食品、药用饮料等多种绿色健康食品。
现代研究显示，桦褐孔菌发酵产物与其野生资源具有相同或相似的药理活性，在某些方面发酵产物的药用疗效甚至优于子实体及菌核，这对桦褐孔菌的进一步研究和开发具有重要的意义。
徐州师范大学于2008年12月02日申请了中国发明专利，专利名称为一种发酵培养桦褐孔菌的方法，申请号为200810227890.4，授权公告号为CN101748159 B，该发明通过向桦褐孔菌的发酵培养的发酵液中加入链格孢霉菌细胞壁碎片来培养桦褐孔菌，获得的桦褐孔菌胞内和胞外的酚类化合物的积累和抗氧化活性明显提高。
黑龙江省科学院微生物研究所于2010年12月16日申请了中国发明专利，专利名称为一种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法，申请号为201010591235.4，授权公告号为CN 102115350 B，该发明要解决现有桦褐孔菌深层发酵菌丝体收率低和深层发酵有效成分桦褐孔菌胞内多糖、胞外多糖产量低的问题。深层发酵培养基由羧甲基纤维素、葡萄糖、大豆粉、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和余量的水制成。深层发酵：一、配制桦褐孔菌深层发酵培养基；二、接种桦褐孔菌；三、分两阶段深层发酵。使用的深层发酵培养基及桦褐孔菌深层发酵方法，可获得更高的菌丝体收率和胞内、胞外多糖。
桦褐孔菌含有多种化学成分，主要包括多种三萜类、木脂素类、黑色素类、叶酸衍生物、多糖等。其中，桦褐孔菌素D(3-羊毛甾-8,24-二烯-21-醛)是桦褐孔菌中一种非常重要的活性成分，具有有抗肿瘤活性，还具有抗突变和抗氧化等活性。其结构式如下：
成都中医药大学药学院张仕瑾，四川省医学科学院谢运飞在桦褐孔菌中首次发现了桦褐孔菌素D，并于2015年在《中草药》杂志上发表了相关论文《桦褐孔菌三萜类化学成分研究》(载于《中草药》杂志2015年第46卷第16期第2355-2360页)。
但在自然条件下，桦褐孔菌素D在桦褐孔菌中的含量很低，约为0.0003％，如何提高桦褐孔菌中桦褐孔菌素D的含量，并得到含量较高的桦褐孔菌素D的提取物，是当前亟需解决的技术问题。
发明内容：
本发明的目的是提供桦褐孔菌素D提取物的制备方法。
本发明的另一目的是提供该桦褐孔菌素D提取物含量测定方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种桦褐孔菌素D提取物是采用生物发酵法进行发酵、提取制备的。
所述的桦褐孔菌素D提取物，是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌烘干，粉碎，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，灭菌，冷却，然后接种葡萄汁酵母，再加入木糖，然后培养，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，发酵培养，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入乙醇溶液，连续超声逆流提取，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入NaHCO3水溶液，充分混合浸泡后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用大孔吸附树脂柱，水洗，洗脱液弃去，以丙酮-0.25moL·L-1磷酸溶液混合溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
所述的桦褐孔菌素D提取物，优选是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经35～45℃烘干，粉碎，过20～30目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶8～12mL，在110～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为13～17％，再加入葡萄汁酵母重量0.03％～0.05％的木糖，然后在36～38℃的条件下培养25～35h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶0.5～1.5mL∶25～35mL，在36～38℃下，发酵培养32～40h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入3～5倍量70％～80％的乙醇溶液，在35～45℃、25～35KHz的条件下连续超声逆流提取40～50min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.4～0.6moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶10～20mL∶0.5～1.5mL，充分混合浸泡20～30h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶7～9，上样体积1～2BV，水洗3～7BV，流速为0.5～1.5BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶0.5～1.5的洗脱剂进行洗脱7～9BV，流速为0.5～1.5BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
所述的桦褐孔菌素D提取物，最优选是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
一种桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量；该桦褐孔菌素D提取物是采用生物发酵法进行发酵、提取制备的。
所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，流动相：乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇混合溶液；检测波长：410～430nm；流速：0.5～2.0mL·min-1；柱温20～40℃；进样量：5～20μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品，置于量瓶中，加的乙腈-水混合溶液溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物，置于量瓶中，加乙腈-水混合溶液，超声，再加乙腈-水混合溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液置于量瓶中，加乙腈-水混合溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌烘干，粉碎，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，灭菌，冷却，然后接种葡萄汁酵母，再加入木糖，然后培养，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，发酵培养，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入乙醇溶液，连续超声逆流提取，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入NaHCO3水溶液，充分混合浸泡后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用大孔吸附树脂柱，水洗，洗脱液弃去，以丙酮-0.25moL·L-1磷酸溶液混合溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，优选步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为10∶38～42∶28～32∶18～22的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：418～426nm；流速：0.5～1.5mL·min-1；柱温25～30℃；进样量：5～20μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品5～20mg，置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物90～110mg，置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液，超声10～20min，再加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1～2mL置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经35～45℃烘干，粉碎，过20～30目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶8～12mL，在110～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为13～17％，再加入葡萄汁酵母重量0.03％～0.05％的木糖，然后在36～38℃的条件下培养25～35h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶0.5～1.5mL∶25～35mL，在36～38℃下，发酵培养32～40h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入3～5倍量70％～80％的乙醇溶液，在35～45℃、25～35KHz的条件下连续超声逆流提取40～50min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.4～0.6moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶10～20mL∶0.5～1.5mL，充分混合浸泡20～30h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶7～9，上样体积1～2BV，水洗3～7BV，流速为0.5～1.5BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶0.5～1.5的洗脱剂进行洗脱7～9BV，流速为0.5～1.5BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，最优选的步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为10∶40∶30∶20的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：422nm；流速：1.0mL·min-1；柱温28℃；进样量：10μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品10mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg·mL-1的对照品储备液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物100mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液，超声15min，再加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
通过如下实验研究验证本发明的技术效果：
实验一：HPLC法测定桦褐孔菌素D提取物中桦褐孔菌素D的含量
1材料与方法
1.1材料与试剂
桦褐孔菌购于黑龙江大兴安岭漠河洪峰山特产加工经销有限公司，经40℃烘干粉碎过40目筛。桦褐孔菌素D对照品(纯度≥98％)，由本实验室自制；甲醇、甲酸、异丙醇(均为色谱纯)，由天津市康科德科技有限公司生产，购于哈尔滨德利时有限公司；其余试剂为分析纯。
1.2仪器与设备
Waters高效液相色谱仪；电子天平，由上海精密仪器仪表有限公司提供；电热鼓风干燥箱，由南京华奥干燥设备有限公司提供；电热数显恒温水浴锅，由西安太康生物科技有限公司提供。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱(规格：4.6mm×250mm，5μm)；流动相：体积比为10∶40∶30∶20的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：422nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：28℃；进样量：10μL。
2.2桦褐孔菌素D提取物的制备
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1.00Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物300.32mg。
2.3对照品溶液的制备
精密称定桦褐孔菌素D对照品10mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg·mL-1的对照品溶液。
2.4供试品溶液的制备
精密称定桦褐孔菌提取物100mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液，超声15min，再加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.5阴性对照溶液的制备
用体积比为80∶20的乙腈-水溶液作为试样溶液，即得阴性对照溶液。
3结果与分析
3.1标准曲线的制作
精密量取对照品溶液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，混匀，得到各级标准溶液。
取各级标准溶液，按本发明提供的色谱条件进样分析，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，进行回归分析。
回归方程：Y＝1.6852X－18.264，r＝0.9998。
结果表明，桦褐孔菌素D在35.9～298.6μg·mL-1范围内，线性关系良好。
3.2专属性实验
精密吸取对照品溶液10μL、供试品溶液10μL、阴性对照溶液10μL，按本发明提供的色谱条件，进样测定，结果显示，分离度较好，阴性对照无干扰，见说明书附图1、附图2、附图3。
3.3精密度实验
取桦褐孔菌素D对照品溶液，进样6次，测定并记录峰面积，计算相对标准差(RSD)为0.28％，表明仪器精密度良好。
3.4稳定性实验
取同一供试品溶液，分别在1、10、20、30、40、50min进样测定，记录峰面积，计算RSD为0.42％，表明供试品溶液在50min内稳定。
3.5重复性实验
取桦褐孔菌素D提取物6份，按本发明提供的方法制备供试品溶液，按本发明提供的色谱条件进行测定，其平均含量为35.6％，RSD为1.24％。说明重复性良好。
3.6加样回收率实验
分别取已知含量的桦褐孔菌素D提取物6份，各20.00mg，精密称定，分别精密加入精密称定桦褐孔菌素D对照品，按本发明提供的方法制备供试品溶液，按本发明提供的色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。
表1加样回收率实验(n＝9)
3.7样品含量测定
采用本发明建立的方法测定对6批桦褐孔菌素D提取物中的桦褐孔菌素D含量，结果见表2。
表2 6批样品中桦褐孔菌素D的含量
4讨论
4.1供试品溶液制备中超声提取时间的考察
本发明对供试品溶液中制备中的超声提取时间进行了考察，分别对超声10min、15min、20min、25min的提取效果进行实验，结果显示，超声提取15min的效果最好。
4.2流动相的选择
本发明分别考察了甲醇-水、甲醇-水-甲酸、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇等体系，最终确定体积比为10∶40∶30∶20的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇溶液为流动相，出峰时间适当，无拖尾。
综上，本发明提供的HPLC法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量的方法简单、易行，检测方法精密度高，重复性好，稳定性好，可以用于本品的检测。
实验二：不同提取纯化方法制备桦褐孔菌素D提取物提取的纯度与含量的比较研究
1不同提取纯化方法制备的桦褐孔菌素D提取物
1.1提取物Ⅰ：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)提取物Ⅰ制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得提取物Ⅰ300.61mg。
1.2提取物Ⅱ：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)提取物Ⅱ制备：取步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌粗粉、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到提取物Ⅱ20265.62mg。
1.3提取物Ⅲ：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)提取物Ⅲ制备：将步骤(1)所得的桦褐孔菌粗粉进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得提取物Ⅲ23286.63mg。
1.4提取物Ⅳ：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)桦褐孔菌萃取物制备：取步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌粗粉、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，桦褐孔菌萃取物。
(2)提取物Ⅳ制备：将步骤(1)所得的桦褐孔菌粗粉进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得提取物Ⅲ2284.69mg。
2.测定
采用本发明实验一所提供的HPLC法测定桦褐孔菌素D提取物中桦褐孔菌素D的含量的方法进行测定。
3.测定结果
测定结果见表3。
表3提取物中桦褐孔菌素D的含量
4.结论
由表3实验结果可见，采用本发明提供的制备方法得到的桦褐孔菌素D提取物，不仅提取得到得桦褐孔菌素D的质量多，而且提取物中的含量高。
附图说明：
图1为对照品溶液色谱图，其中1号峰为桦褐孔菌素D色谱峰。
图2为供试品溶液色谱图，其中1号峰为桦褐孔菌素D色谱峰。
图3为阴性对照溶液色谱图。
具体实施方式：
实施例1：
1、桦褐孔菌素D提取物及其制备
桦褐孔菌素D提取物的制备
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌1Kg经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物299.12mg。
2、桦褐孔菌素D的含量测定
采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为10∶40∶30∶20的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：422nm；流速：1.0mL·min-1；柱温28℃；进样量：10μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品10mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg·mL-1的对照品储备液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物100mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液，超声15min，再加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
(5)结果：桦褐孔菌素D质量101.82mg，含量为34.04％。
Claims (8)
1.一种桦褐孔菌素D提取物，其特征在于，该桦褐孔菌素D提取物是采用生物发酵法进行发酵、提取制备的。
2.如权利要求1所述的桦褐孔菌素D提取物，其特征在于，该桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌烘干，粉碎，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，灭菌，冷却，然后接种葡萄汁酵母，再加入木糖，然后培养，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，发酵培养，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入乙醇溶液，连续超声逆流提取，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入NaHCO3水溶液，充分混合浸泡后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用大孔吸附树脂柱，水洗，洗脱液弃去，以丙酮-0.25moL·L-1磷酸溶液混合溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
3.如权利要求2所述的桦褐孔菌素D提取物，其特征在于，该桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经35～45℃烘干，粉碎，过20～30目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶8～12mL，在110～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为13～17％，再加入葡萄汁酵母重量0.03％～0.05％的木糖，然后在36～38℃的条件下培养25～35h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶0.5～1.5mL∶25～35mL，在36～38℃下，发酵培养32～40h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入3～5倍量70％～80％的乙醇溶液，在35～45℃、25～35KHz的条件下连续超声逆流提取40～50min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.4～0.6moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶10～20mL∶0.5～1.5mL，充分混合浸泡20～30h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶7～9，上样体积1～2BV，水洗3～7BV，流速为0.5～1.5BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶0.5～1.5的洗脱剂进行洗脱7～9BV，流速为0.5～1.5BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
4.如权利要求3所述的桦褐孔菌素D提取物，其特征在于，该桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
5.一种桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量；该桦褐孔菌素D提取物是采用生物发酵法进行发酵、提取制备的。
6.如权利要求5所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，流动相：乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇混合溶液；检测波长：410～430nm；流速：0.5～2.0mL·min-1；柱温20～40℃；进样量：5～20μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品，置于量瓶中，加的乙腈-水混合溶液溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物，置于量瓶中，加乙腈-水混合溶液，超声，再加乙腈-水混合溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液置于量瓶中，加乙腈-水混合溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌烘干，粉碎，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，灭菌，冷却，然后接种葡萄汁酵母，再加入木糖，然后培养，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，发酵培养，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入乙醇溶液，连续超声逆流提取，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入NaHCO3水溶液，充分混合浸泡后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用大孔吸附树脂柱，水洗，洗脱液弃去，以丙酮-0.25moL·L-1磷酸溶液混合溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
7.如权利要求6所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为10∶38～42∶28～32∶18～22的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：418～426nm；流速：0.5～1.5mL·min-1；柱温25～30℃；进样量：5～20μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品5～20mg，置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物90～110mg，置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液，超声10～20min，再加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1～2mL置于10～20mL量瓶中，加体积比为75～85∶25～15的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经35～45℃烘干，粉碎，过20～30目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶8～12mL，在110～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为13～17％，再加入葡萄汁酵母重量0.03％～0.05％的木糖，然后在36～38℃的条件下培养25～35h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶0.5～1.5mL∶25～35mL，在36～38℃下，发酵培养32～40h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入3～5倍量70％～80％的乙醇溶液，在35～45℃、25～35KHz的条件下连续超声逆流提取40～50min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.4～0.6moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶10～20mL∶0.5～1.5mL，充分混合浸泡20～30h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶7～9，上样体积1～2BV，水洗3～7BV，流速为0.5～1.5BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶0.5～1.5的洗脱剂进行洗脱7～9BV，流速为0.5～1.5BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
8.如权利要求7所述的桦褐孔菌素D提取物的含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定桦褐孔菌提取物中桦褐孔菌素D的含量，步骤如下：
(1)色谱条件：色谱柱：C18柱，规格：4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为10∶40∶30∶20的乙腈-水-0.15％磷酸溶液-异丙醇；检测波长：422nm；流速：1.0mL·min-1；柱温28℃；进样量：10μL；
(2)对照品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌素D对照品10mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液溶解至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg·mL-1的对照品储备液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定桦褐孔菌提取物100mg，置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液，超声15min，再加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL置于10mL量瓶中，加体积比为80∶20的乙腈-水溶液至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
(4)测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
所述桦褐孔菌素D提取物是采用如下方法制备的：
(1)桦褐孔菌粗粉制备：取桦褐孔菌经40℃烘干，粉碎，过24目筛，得到桦褐孔菌粗粉，备用；
(2)酵母菌发酵液配制：将脱脂大豆粉溶于纯净水中，脱脂大豆粉与纯净水的比例为1g∶10mL，在120℃下灭菌25min，冷却至室温，然后接种葡萄汁酵母，接种量为15％，再加入葡萄汁酵母重量0.04％的木糖，然后在37℃的条件下培养30h，得到酵母菌发酵液，备用；
(3)桦褐孔菌发酵液制备：将步骤(1)所得桦褐孔菌粗粉与步骤(2)所得酵母菌发酵液，以及纯净水进行混合，桦褐孔菌粗粉、酵母菌发酵液、纯净水三者的比例为1g∶1mL∶30mL，在37℃下，发酵培养36h，得到桦褐孔菌发酵液，备用；
(4)桦褐孔菌发酵提取物制备：取步骤(3)所得桦褐孔菌发酵液，加入4倍量75％的乙醇溶液，在40℃、30KHz的条件下连续超声逆流提取45min，滤过，收集滤液，药渣在上述条件下再重复连续超声逆流提取一次，两次的提取的滤液合并，将合并后的滤液浓缩，真空干燥，得到桦褐孔菌发酵提取物，备用；
(5)桦褐孔菌发酵萃取物制备：取步骤(4)所得桦褐孔菌发酵提取物，加入氯仿，再加入浓度为0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液，桦褐孔菌发酵提取物、氯仿、0.5moL·L-1的NaHCO3水溶液三者的比例为1g∶15mL∶1mL，充分混合浸泡24h后，收集氯仿萃取液，剩余物质按照上述方法，再萃取一次，将两次的萃取液合并，滤过，滤液挥干氯仿，干燥，得到桦褐孔菌发酵萃取物，备用；
(6)桦褐孔菌素D提取物制备：将步骤(5)所得的桦褐孔菌发酵萃取物进行柱层析分离，选用H-30型大孔吸附树脂柱，树脂柱径高比为1∶8，上样体积1BV，水洗5BV，流速为1BV/h，洗脱液弃去，以丙酮∶0.25moL·L-1磷酸溶液＝1∶1的洗脱剂进行洗脱8BV，流速为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得桦褐孔菌素D提取物。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825540A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-31 | 青岛农业大学 | 一种桦褐孔菌非糖类提取物的制备方法及其应用 |
| CN113069484A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-07-06 | 黑龙江中医药大学 | 一种抗衰老药物及其微胶囊制剂的制备方法 |
| CN116120480A (zh) * | 2023-01-06 | 2023-05-16 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种同时提取白桦茸多糖和桦褐孔菌素的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101418325A (zh) * | 2008-12-03 | 2009-04-29 | 王�琦 | 桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途 |
| US20130287829A1 (en) * | 2000-10-04 | 2013-10-31 | Paul Edward Stamets | Controlling insects and arthropods using preconidial mycelium and extracts of preconidial mycelium from entomopathogenic fungi |
| CN106978465A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-07-25 | 杭州娃哈哈科技有限公司 | 一种提高桦褐孔菌总三萜发酵产量的发酵方法 |
| CN107841523A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-27 | 浙江大学 | 利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法 |
-
2018
- 2018-11-01 CN CN201811292267.7A patent/CN109337953B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130287829A1 (en) * | 2000-10-04 | 2013-10-31 | Paul Edward Stamets | Controlling insects and arthropods using preconidial mycelium and extracts of preconidial mycelium from entomopathogenic fungi |
| CN101418325A (zh) * | 2008-12-03 | 2009-04-29 | 王�琦 | 桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途 |
| CN106978465A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-07-25 | 杭州娃哈哈科技有限公司 | 一种提高桦褐孔菌总三萜发酵产量的发酵方法 |
| CN107841523A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-27 | 浙江大学 | 利用群体感应分子诱导从桦褐孔菌中提取三萜类物质方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张仕瑾: "桦褐孔菌三萜类化学成分研究", 《中草药》 * |
| 范柳萍: "桦褐孔菌多糖的分离纯化及其组成分析", 《食品工业科技》 * |
| 郑勤琴: "高效液相色谱和超高效液相色谱在药物分析中的应用研究", 《上海畜牧兽医通讯》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109825540A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-31 | 青岛农业大学 | 一种桦褐孔菌非糖类提取物的制备方法及其应用 |
| CN109825540B (zh) * | 2019-03-28 | 2020-05-08 | 青岛农业大学 | 一种桦褐孔菌非糖类提取物的制备方法及其应用 |
| CN113069484A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-07-06 | 黑龙江中医药大学 | 一种抗衰老药物及其微胶囊制剂的制备方法 |
| CN116120480A (zh) * | 2023-01-06 | 2023-05-16 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种同时提取白桦茸多糖和桦褐孔菌素的方法 |
| CN116120480B (zh) * | 2023-01-06 | 2024-04-26 | 湖南杰萃生物技术有限公司 | 一种同时提取白桦茸多糖和桦褐孔菌素的方法 |
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