CN1678736A - 热稳定的核糖核酸酶h - Google Patents
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Abstract
在基因工程中特别有用的具有RNA酶H活性的多肽,编码所述多肽的基因和生产所述多肽的遗传工程方法。
Description
技术领域
本发明涉及多肽,更具体地涉及具有核糖核酸酶H活性的多肽,它对于遗传工程是特别有意义的。本发明还涉及用于通过遗传工程生产所述多肽的基因。本发明还涉及通过遗传工程生产所述多肽的方法。
背景技术
存在内型和外型核糖核酸酶(RNA降解酶)。它们的底物特异性是不同的,它们参与复杂的生理活动。已知酶,例如核糖核酸酶T1,核糖核酸酶T2,核糖核酸酶H,核糖核酸酶P,核糖核酸酶I,核糖核酸酶II,核糖核酸酶III,核糖核酸酶IV,核糖核酸酶L具有核糖核酸酶活性。
W.H.Stein和P.Hausen于1969年从小牛胸腺中首次分离出核糖核酸酶H(在下文中也称作RNA酶H)。目前将RNA酶H分成细胞RNA酶H和病毒RNA酶H。细胞RNA酶H广泛地存在于真核生物(例如各种动物细胞和酵母)和原核生物(例如大肠杆菌)中,而病毒RNA酶H则存在于RNA肿瘤病毒中。细胞中存在几种RNA酶H活性。它们需要二价金属离子,例如Mg2+和Mn2+。
来自大肠杆菌的RNA酶H是由155个氨基酸组成的水解酶,分子量为约17kDa,具有特异性地以内切方式只剪切DNA-RNA杂交体中的RNA链的底物特异性。得到的寡聚物在5′端具有磷酸基,在3′端具有羟基。
已经鉴别出RNA酶H I和RNA酶H II为来自大肠杆菌的RNA酶H。已经证实,RNA酶H I在Col E1质粒的复制中起下述生理作用:1)它降解结合到正常复制起点以外的区域的RNA,确保正常的复制起点;2)它合成对正常复制起点具有特异性的RNA引物;另一方面,仍不清楚RNA酶H II的功能。
RNA酶H具有下述列举的基于底物特异性的应用,人们的注意力集中在将RNA酶H作为非常有用的酶:
1)在cDNA克隆基础上除去模板mRNA;
2)除去mRNA中的poly(A)区域;和
3)裂解RNA。
随着遗传工程的发展,认为RNA酶H日益变得重要。但是,该酶在大肠杆菌中的表达水平非常低。然后,已经试图使用重组DNA技术来生产该酶。现在,BRL、Amersham Pharmacia Biotech,Takara Bio等公司已经供应使用重组DNA技术生产的RNA酶H。
这些可以商业获得的重组RNA酶H是使用大肠杆菌作为宿主来生产的(Kanaya等.,The Journal of Biological Chemistry,264:11546-11549(1989))。已经报导了使用大肠杆菌从嗜热生物中生产RNA酶H的方法,它比来自大肠杆菌的RNA酶H更稳定得多(Kanaya等.,Dai 2 Kai NipponTanpakukougakukai Nenkai Program/Abstract(1990)69页;日本专利No.2533671)。但是,使用大肠杆菌从嗜热生物中生产的RNA酶H的酶活性比来自大肠杆菌的RNA酶H的活性低。
如上所述,只是获得了热稳定的RNA酶H,它的产率和酶活性都低于来自大肠杆菌的RNA酶H。因此,为了拓展RNA酶H的用途,需要开发热稳定的RNA酶H,且其产率和酶活性等同于或高于来自大肠杆菌的RNA酶H。
这样,为了解决上述问题,已经克隆了具有不同热稳定性的RNA酶H。其实例包括WO 02/22831中所述的来自热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、Thermococcus litoralis、速生热球菌(Thermococcus celer)和Pyrococcus horikoshii的RNA酶H。
其它的实例包括来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(NucleicAcids Research,卷19,No.16,4443-4449页(1991)、美国专利号5268289)、激烈热球菌(美国专利号5610066),热球菌属物种(Pyrococcus sp.)KOD1(JP-A 11-32772)和闪烁古生球菌(Journal of Molecular Biology,卷307,541-556页(2001))的RNA酶H。
但是,已经存在许多有待改善的关于这些RNA酶H的问题,例如低热稳定性、降低的对具有短RNA链的DNA-RNA杂交体的活性和低特异性的活性。这样,为了满足被认为随着遗传工程的发展而变得越来越重要的RNA酶H的重要性,已经需要开发其它的具有独特的底物特异性或作用模式的热稳定的RNA酶H。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种具有RNA酶H活性的多肽,它对遗传工程是告诉有价值的,一种编码所述多肽的基因和通过遗传工程生产所述多肽的方法。
考虑到上述的环境,为了得到热稳定的RNA酶H,本发明的发明人已经进行了深入的研究和筛选。结果,本发明的发明人已经发现了具有高RNA酶H活性的热稳定的RNA酶H多肽。而且,本发明的发明人已经发现,这样得到的热稳定的RNA酶H在利用遗传工程技术的生产中的产率较高。这样,已经完成了本发明。
本发明如下所述。本发明的第一方面涉及具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽,它选自由下述多肽组成的组:
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽;
(b)具有这样的氨基酸序列的多肽,其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代;和
(c)具有这样的氨基酸序列的多肽,它与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少54%的同源性。
本发明的第二方面涉及编码具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽的核酸,它选自由下述核酸组成的组:
(a)编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的核酸;
(b)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸,其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代;
(c)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少54%的同源性;
(d)具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸;
(e)由核苷酸序列组成的核酸,其中在SEQ ID NO:2的核苷酸序列中有至少一个核苷酸被删除、添加、***或取代,这样该核苷酸的删除、添加、***或取代导致翻译成氨基酸序列;
(f)能够在严紧条件下与(a)至(d)中的任意一种核酸或其互补链杂交的核酸;和
(g)具有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少61%的同源性的核苷酸序列的核酸。
本发明的第三方面涉及包含第二方面的核酸的重组DNA。
本发明的第四方面涉及用第三方面的重组DNA转化的转化体。
本发明的第五方面涉及生产具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽的方法,该方法包括:
培养第四方面的转化体;和
从培养物中收集具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽。
本发明的第六方面涉及具有热稳定的核糖核酸酶H活性的、可以通过培养转化有质粒pApr108的转化体来获得的多肽。根据布达佩斯条约,具有该质粒的大肠杆菌菌株于2002年8月20日(原始保藏日)以保藏号FERM BP-8433保藏在国际专利生物保藏机构国立高级工业科学和技术研究所(International Patent Organism Depositary,National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology),AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki 305-8566,日本。
附图说明
图1举例说明了本发明的RNA酶H的热稳定性。
实施本发明的最佳方式
在下文中,将详细描述本发明。
如这里所使用的,RNA酶H是指具有特异性地以内切方式只剪切DNA-RNA杂交体中的RNA链的底物特异性的水解酶,其中剪切得到的寡聚物在5′端具有磷酸基,在3′端具有羟基。
虽然无意限制本发明,如这里使用的关于多肽的“具有热稳定的RNA酶H活性”是指多肽在70℃或以上的温度孵育15分钟后具有RNA酶H活性。
例如,可以如下测定热稳定的RNA酶H活性。
将1mg poly(rA)或poly(dT)(均来自Amersham Pharmacia Biotech)溶解到含有1mM EDTA的1ml 40mM tris-HCl(pH7.7)中,制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后将poly(rA)溶液(至20μg/ml的终浓度)和poly(dT)溶液(至30μg/ml的终浓度)加入到含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA和4%甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。混合物在37℃反应10分钟,然后冷却到4℃,制备poly(rA)-poly(dT)溶液。
将1μl酶溶液加入到100μl poly(rA)-poly(dT)溶液中。将混合物在40℃反应10分钟。向其中加入10μl 0.5M EDTA终止反应。然后在260nm测定吸光度。作为对照,向反应混合物中加入10μl 0.5M EDTA,得到的混合物在40℃反应10分钟,然后测定吸光度。通过从没有EDTA的反应的吸光度减去对照吸光度确定一个值(吸光度差异)。这样,通过酶反应从poly(rA)-poly(dT)杂交体释放出来的核苷酸的浓度就在吸光度差异的基础上予以确定。这样,可以确定根据本发明的热稳定的RNA酶H活性。
作为选择,可以如下确定根据本发明的热稳定的RNA酶H活性。将100μl已经在40℃孵育的反应混合物[20mM HEPES-氢氧化钾(pH8.5),0.01%牛血清白蛋白(Takara Bio),1%二甲基亚砜,4mM醋酸镁,20μg/ml poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech),30μg/ml poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]加入到1μl待测定活性的酶溶液中。混合物在40℃反应10分钟。然后通过加入10μl 0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。然后在260nm测定吸光度。
将RNA酶H的1个单位定义为增加对应于在10分钟内释放出1nmol核糖核苷酸的A260的酶量,它可以根据下面的方程计算:
单位=[吸光度差异×反应体积(ml)]/0.0152
本发明的多肽通过具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽来举例说明。本发明还包括具有这样的氨基酸序列的多肽,其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代,只要它表现出热稳定的RNA酶H活性。
在天然存在的多肽的中会产生氨基酸序列的突变,例如氨基酸的删除、***、添加或取代。这种突变可以由于多态性或编码多肽的DNA的突变,或由于多肽的体内修饰或在合成后的纯化过程中产生。但是,已知这种突变的多肽可表现出基本上与没有突变的多肽等同的生理或生物活性,如果这样的突变是在对于维持多肽的活性或结构并不重要的区域。
这可以应用到这样多肽,其中该突变被人工地导入了多肽的氨基酸序列。在该情况下,会产生更多的不同突变。例如,已知其中的人白细胞介素-2(IL-2)的氨基酸序列中的半胱氨酸残基替换为丝氨酸的多肽保持白细胞介素-2活性(Science,224:1431(1984))。
而且,已知某些多肽具有对它们的活性不是必不可少的肽区域。这样的肽区域可以通过要分泌到细胞外的多肽中的信号肽或在蛋白酶的前体中发现的前序列或前原序列来例证。大多数这样的区域在翻译或转化为活性多肽后被去除。这样的多肽的一级结构与没有去除该区域的多肽不同,但是最终表现出相同的功能。
根据本发明分离的具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的基因编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。该多肽具有热稳定的RNA酶H活性。本发明的多肽包括这样的多肽,其中的对于其活性不是必不可少的肽区域已经从其中删除。
当通过遗传工程生产多肽时,可以将与目标多肽的活性无关的肽链添加到多肽的氨基端或羧基端。例如,为了提高目标多肽的表达水平,可以制备融合多肽,其中将在要使用的宿主中高水平表达的多肽的部分氨基端区域添加到目标多肽的氨基端。在另外一种情况下,为了有利于表达的多肽的纯化,可以将对特异性的底物具有亲和力的肽添加目标多肽的氨基端或羧基端。如果添加的肽不会对目标多肽的活性产生不利的影响,则可以保留添加。如果必要,可以将它设计成能够通过适当的处理将其从目标多肽去除,例如通过蛋白酶的限制酶切。
这样,本发明包括具有这样的氨基酸序列的多肽,其中在这里公开的SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代,如果它具有热稳定的RNA酶H活性。
而且,本发明包括具有这样的氨基酸序列的多肽,其与在这里公开的SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少54%、优选地60%、更优选地70%、最优选地85%的同源性,如果它具有热稳定的RNA酶H活性。
同源性可以使用例如计算机程序DNASIS-Mac(Takara Bio)、计算机算法FASTA(3.0版;Pearson,W.R.等.,Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988)或计算机算法BLAST(2.0版,Altschul等.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)来确定。
例如,本发明包括具有这样的氨基酸序列的多肽,其与来自深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)的核糖核酸酶H的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)有至少54%的同源性,如果它具有热稳定的RNA酶H活性。
本发明的多肽的生产可以例如通过(1)从生产本发明的多肽的微生物的培养物中纯化,或(2)从含有编码本发明的多肽的核酸的转化体的培养物中纯化。
(1)从生产本发明的多肽的微生物的培养物中纯化
生产本发明的多肽的微生物通过深处古生球菌(DSM5631)例证,它可以从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH购买。该微生物在适合于微生物生长的条件下培养。优选地,使用能提高目标多肽表达水平的培养条件。根据用于纯化蛋白的常规方法,可以纯化在细胞或培养基中生成的目标多肽。
可以用培养热稳定的细菌的常规方法来培养上述菌株。向培养基中添加能被该菌株利用的营养物质。例如,淀粉可以用作碳源,而胰蛋白胨、蛋白胨和酵母提取物可以用作氮源。可以向培养基中添加作为微量元素的金属盐,例如镁盐、钠盐或铁盐。另外,可以有利地使用人工海水来制备培养基,例如对于热稳定的海生细菌。
培养可以是静止培养(standing culture)或搅拌培养。例如,可以使用在Applied and Environmental Microbiology,55:2086-2088(1992)中记载的渗析培养方法。优选地,根据要使用的菌株或培养基的组成来确定培养条件和培养时间,以便使多肽的产率最大化。
为了得到多肽,首先制备无细胞提取物。无细胞提取物的制备可以是例如通过离心、过滤等从培养物中收集细胞,然后破碎细胞进行。用于高效提取目标酶的细胞破碎方法可以选自超声处理、珠破碎、水解酶处理等。如果多肽是分泌到培养物上清液中,培养物上清液中的多肽是通过硫酸铵沉淀、超滤等浓缩。浓缩的多肽用作无细胞提取物。可以用纯化蛋白的常规方法来从这样得到的无细胞提取物中分离多肽。例如,可以组合使用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等。
(2)从用含有编码本发明的多肽的核酸的重组DNA转化的转化体的培养物中纯化
本发明的多肽可以从用含有编码本发明的多肽的核酸(例如,具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸)的重组DNA转化的转化体中获得。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽是使用具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸生成。
本发明的多肽可以从通过培养转有本发明的质粒pApr108的转化体得到的培养物中纯化。
关于待转化的宿主没有特别的限制。其实例包括常规用于重组DNA领域的那些,例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母、丝状真菌、植物、动物、培养的植物细胞和培养的动物细胞。
例如,本发明的多肽可以这样得到:通过在常规培养条件下,例如于37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,5g/l NaCl,pH7.2)中培养含有质粒(其中本发明的核酸连接在lac启动子或T7噬菌体启动子的下游)的大肠杆菌直至对数生长期,以1mM的终浓度向其中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷,再于37℃培养以在培养的细胞中表达多肽。
培养后通过离心收集细胞,超声破碎,通过离心收集的上清液用作无细胞提取物。该无细胞提取物表现出热稳定的RNA酶H活性。可以通过使用已知的方法,例如离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析和硫酸铵沉淀从无细胞提取物中纯化本发明的多肽。自然地,在上述的纯化过程中得到的部分纯化的产物也表现出RNA酶H活性。由于在含有连接到本发明的核酸上的质粒的大肠杆菌中表达的本发明的多肽是热稳定的,它可以如下纯化。例如,在40℃或更高的温度加热培养的细胞和/或无细胞提取物大约10分钟,除去来自宿主的热变性的不溶蛋白。可以为热处理合适地选择最佳温度或时间。
如上所述,当使用含有编码多肽的核酸的转化体在常温(例如37℃)表达本发明的多肽时,得到的表达产物保持活性、热稳定性等。就是说,本发明的多肽能呈现出其固有的高级结构,即使它是在与原始生成细胞的生长温度非常不同的温度下被表达。
本发明的核酸是编码本发明的多肽的核酸。更具体地,它是(1)编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的核酸,或编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸,其中在序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代,且具有热稳定的RNA酶H活性;(2)具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸;(3)具有这样的核苷酸序列的核酸,它能够在上述严紧条件下与(1)或(2)的核酸杂交,或与上面(1)或(2)的核苷酸序列有至少61%、优选地70%、更优选地80%、最优选地90%的同源性,且编码具有热稳定的RNA酶H活性的多肽,或类似物。
核苷酸序列的同源性可以使用计算机程序DNASIS-Mac或计算机算法FASTA(3.0版)或BLAST(2.0版)确定。
如这里使用的,核酸是指单链的或双链的DNA或RNA。如果上面(2)的核酸是RNA,它由这样的核苷酸序列代表,例如其中将SEQ ID NO:2的核苷酸序列中的T替换为U。
例如,本发明的核酸可以如下得到。
可以如下分离具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的上面(2)的核酸。根据常规方法,从为本发明的多肽进行上述培养的深处古生球菌(DSM5631)中制备基因组DNA。该基因组DNA用于构建DNA文库。核酸可以从DNA文库中分离。也可以通过使用基因组DNA作模板的聚合酶链式反应(PCR)扩增具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸来得到核酸。
而且,在本发明提供的编码本发明的多肽的核酸的核苷酸序列(例如SEQ ID NO:2的核苷酸序列)的基础上,可以得到编码与本发明的多肽相似的具有热稳定的RNA酶H活性的多肽的核酸。更具体地,使用编码本发明的多肽的核酸或核苷酸序列的一部分作为杂交探针,可以从从细胞中提取出的DNA、使用DNA作模板得到的PCR产物等中筛选出编码具有热稳定的RNA酶H活性的多肽的DNA。作为选择,使用基因扩增方法,例如使用在上述核苷酸序列的基础上设计的引物的PCR,可以扩增编码具有热稳定的RNA酶H活性的多肽的DNA。另外,可以化学合成编码具有热稳定的RNA酶H活性的多肽的DNA。根据该方法可以得到上面(1)或(3)的核酸。
根据上述方法,可以得到只含有目标核酸的一部分的核酸片段。在该情况下,可以如下得到完整的目标核酸。测定得到的核酸片段的核苷酸序列,以确定该片段是目标核酸的一部分。使用作为探针的核酸片段或其一部分进行杂交。或者,使用在核酸片段的核苷酸序列的基础上合成的引物进行PCR。
“在严紧条件下的杂交”是指核酸能在T.Maniatis等.(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory(1989)所述的条件或类似条件下进行杂交。例如,它是指在下述条件下的杂交能力。在含有0.5%SDS、0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%菲可(Ficoll)400和0.01%变性的鲑鱼***核酸的6×SSC(1×SSC:0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠,pH7.0)中,于50℃将其上固定有核酸的膜与探针孵育12-20小时。孵育后,在37℃,在含有0.5%SDS的2×SSC中洗涤膜,同时将SSC浓度下调至0.1×且温度上调至50℃,直到来自固定的核酸的信号能从背景中区分开,然后检测探针。如上所述确定这样得到的新型核酸编码的蛋白的活性,由此确定该核酸是否是目标核酸。
如果要使用寡核苷酸探针,虽然无意限制本发明,“严紧条件”是指,例如,在含有6×SSC、0.5%SDS、5×Denhardt’s和0.01%变性的鲑鱼***核酸的溶液中,在[Tm-25℃]的温度下孵育过夜。
可以例如根据下面的方程确定寡核苷酸探针或引物的Tm:
Tm=81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)
其中N为寡核苷酸探针或引物的链长度;%G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶残基在寡核苷酸探针或引物中的含量。
如果寡核苷酸探针或引物的链长度小于18个碱基,可以估算Tm,例如,为A+T(腺嘌呤和胸腺嘧啶)残基数目乘以2(℃)得到的积与G+C残基数目乘以4(℃)得到的积之和:
[(A+T)×2+(G+C)×4]
根据本发明,本发明包括能够在严紧条件下与编码本发明的多肽的核酸杂交的核酸,只要它能编码具有热稳定的RNA酶H活性的多肽,即使它不具有这里公开的上述的相同核苷酸序列。
已知为每个氨基酸指定了1至6个密码子(3个碱基的组合),它们在基因中定义氨基酸。这样,许多核酸都能编码一个特定的氨基酸序列,虽然它依赖于氨基酸序列。天然的核酸不一定是稳定的。在核苷酸序列中发生突变不是异常的。核酸中发生的突变可能不会改变编码的氨基酸序列(称作沉默突变)。在该情况下,可以认为产生了编码相同氨基酸序列的不同核酸。这样,人们不能否认在含有编码一个特定的氨基酸序列的分离的核酸的生物的传代过程中会产生编码相同氨基酸序列的不同核酸的可能性。而且,如果人们使用各种遗传工程技术,不难人工产生编码相同氨基酸序列的不同的核酸。
例如,如果在编码目标蛋白的原始核酸中使用的密码子是在要通过遗传工程生产蛋白的宿主中使用较低的密码子,蛋白的表达水平会较低。在该情况下,为了提高目标蛋白的表达水平,人工地将密码子转化成一个在宿主中常用的密码子而不改变编码的氨基酸序列(例如JP-B 7-102146)。无需说明,可以如上所述人工制备编码一个特定氨基酸序列的不同核酸。它们也会自然产生。
可以将编码本发明的多肽的核酸(例如具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸)连接到合适的载体上,以构建重组DNA。关于用于构建重组DNA的载体没有特别的限制。例如,可以使用质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。选择对目标重组DNA合适的载体。
而且,可以通过将重组DNA转入合适宿主中生成转化体。关于用于生成转化体的宿主没有特别限制。可以使用微生物例如细菌、酵母和丝状真菌以及培养的来自动物、植物、昆虫等的细胞。可以通过培养转化体以在培养物中生产本发明的多肽来大量生产本发明的多肽,。
(3)本发明的多肽
如上得到的本发明的多肽可以用于核酸扩增方法,例如在WO00/56877或WO 02/16639中记载的。根据在嵌合的核酸(例如DNA-RNA-DNA)中的RNA部分的长度,可以降低一些常规RNA酶H的RNA酶H活性。本发明的多肽较不敏感影响RNA部分的长度。这样,可以优选地用于如WO 02/064833中所述的碱基取代检测方法或BioTechniques,卷.20,No.2,240-248页(1996)中所述的循环探针方法。由于本发明的多肽具有这样的性质——其在95℃处理15分钟后仍然可以保留RNA酶H活性,它可以用于多种用途。
实施例
下面的实施例更详细地解释了本发明,但是不应当理解为限制其范围。
实施例1
深处古生球菌RNA酶H基因的克隆
(1)从深处古生球菌制备基因组DNA
将从10ml培养物中收集的深处古生球菌细胞(购自DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH;DSM5631)悬浮到100μl含有20%蔗糖和50mM tris-HCl(pH8.0)的混合物中。向其中加入20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml溶菌酶氯化物水溶液(Nacalai Tesque)。混合物在20℃反应2小时。反应后,向反应混合物中加入800μl含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的混合物、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Bio)和50μl 10%硫酸月桂酯钠水溶液。混合物在37℃孵育1小时。反应后,对混合物进行苯酚-氯仿萃取、乙醇沉淀和空气干燥。然后将沉淀溶解到50μl TE中,以得到基因组DNA溶液。
(2)克隆RNA酶H基因的中间部分
在不同热稳定的RNA酶H的氨基酸序列间的保守部分的基础上,合成了寡核苷酸RN-F1(SEQ ID NO:3)和RN-R2(SEQ ID NO:4)。
使用5μl在实施例1-(1)中制备的深处古生球菌基因组DNA溶液作为模板,100pmol每一种RN-F1和RN-R2作为引物,在100μl体积中进行PCR。根据所附的方法,用TaKaRa Ex Taq(Takara Bio)作为PCR的DNA聚合酶。PCR如下进行:94℃进行30秒、45℃进行30秒和在72℃进行1分钟,进行50个循环。反应后,对反应混合物进行Microcon-100(Takara Bio),以除去引物并浓缩反应混合物,以得到约0.5-kb DNA片段AprF1R2。
(3)克隆RNA酶H基因的上游和下游部分
测定在实施例1-(2)中得到的约0.5-kb片段AprF1R2的核苷酸序列。在测定的核苷酸序列的基础上,合成用于克隆上游部分的特异性寡核苷酸AprRN-1(SEQ ID NO:5)和用于克隆下游部分的特异性寡核苷酸AprRN-2(SEQ ID NO:6)。另外,合成了表1所示的48个引物。表1中的tag序列如SEQ ID NO:7所示。
表1
5′-tag序列-NN-SSSSSSS-3’
(N:G,A,T和C的混合物;S代表下面的核苷酸序列)
编号 核苷酸序列 编号 核苷酸序列 编号 核苷酸序列
1 ggagcag 19 gtaacgg 37 gcgcaag
2 ggcaaag 20 gtaagcg 38 gcgcttg
3 ggcaacg 21 gtacacg 39 gcggacg
4 ggcacag 22 gtagacg 40 gcgtaag
5 ggcattg 23 gtagcgg 41 gctacgg
6 ggccaag 24 gtcaacg 42 gctcacg
7 ggccttg 25 gcaccag 43 gctccag
8 ggctaag 26 gcagacg 44 gcttgcg
9 ggctacg 27 gcagcag 45 gcttggg
10 ggctcag 28 gcatggg 46 ggacacg
11 ggctttg 29 gccaaag 47 ggaccag
12 gggacag 30 gccacag 48 ggagacg
13 gggcaag 31 gccattg
14 gggcttg 32 gcccaag
15 gggtacg 33 gcccttg
16 ggtaacg 34 gcctacg
17 ggtacgg 35 gcctcag
18 ggtagcg 36 gcctttg
在含有下述物质的反应混合物中进行PCR:1μl作为模板的在实施例1-(1)中制备的深处古生球菌基因组DNA溶液,20pmol AprRN-1或20pmol AprRN-2和20pmol表1所列的48个引物中的一个的组合,20mM tris-醋酸盐(pH8.5),50mM醋酸钾,3mM醋酸镁,0.01%BSA,30μM每一种dNTP和2.5单位TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio)。如下进行PCR:在94℃孵育3分钟;和在98℃进行10秒、在50℃进行10秒和在72℃进行40秒,进行40个循环。对每一个PCR产物的一部分进行琼脂糖凝胶电泳。用Microcon-100(Takara Bio)除去来自选择产生单一带的反应混合物的引物,和浓缩反应混合物。直接对浓缩物进行测序,以筛选含有RNA酶H的上游或下游部分的片段。结果表明,约600-碱基对的PCR扩增片段Apr-1A5含有RNA酶H基因的上游部分,约500-碱基对的PCR扩增片段Apr-2D9含有下游部分。
(4)克隆整个RNA酶H基因
在核苷酸序列的基础上,合成引物AprNde(SEQ ID NO:8)和AprBam(SEQ ID NO:9)。
使用1μl在实施例1-(1)中制备的深处古生球菌基因组DNA溶液作为模板,20pmol每一种AprNde和AprBam作为引物,在100μl体积中进行PCR。根据所附的方法,用Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio)作为PCR的DNA聚合酶。PCR如下进行:在94℃进行30秒、在55℃进行30秒和在72℃进行1分钟,进行40个循环。用NdeI和BamHI(均购自Takara Bio)酶切约0.7-kb的扩增DNA片段。然后,通过将得到的DNA片段分别整合进质粒载体pTV119Nd(在该质粒中,pTV119N中的NcoI位点被转化成NdeI位点)或pET3a(Novagen)的NdeI和BamHI位点之间,构建质粒pAPR111Nd和pApr108。
(5)测定含有RNA酶H基因的DNA片段的核苷酸序列
根据双脱氧法,测定在实施例1-(4)中得到的***到pAPR111Nd和pApr108中的DNA片段的核苷酸序列。
测定的核苷酸序列分析表明存在一个推测是编码RNA酶H的开放阅读框架。pApr108中的开放阅读框架的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。从该核苷酸序列推测出的RNA酶H的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。PCR片段AprF1R2、Apr-1A5和Apr-2D9分别对应于SEQ ID NO:2中的第11个至第449个核苷酸区域、从第59个核苷酸向5’端的区域和从第373个核苷酸向3’端的区域。将用质粒pApr108转化的大肠杆菌HMS174DE3指定并标记为大肠杆菌HMS174/pApr108,并于2002年8月20日(原始保藏日)以保藏号FERM BP-8433保藏在国际专利生物保藏单位国立高级工业科学和技术研究所(International Patent Organism Depositary,National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology),AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki 305-8566,日本。使用DNA序列输入分析***DNASIS 3.6版(Takara Bio)的分析表明,24.4kDa蛋白的等电点为8.50。基于核苷酸序列对比,设想将该蛋白归入NA酶H II。
(6)深处古生球菌RNA酶H基因的表达
将pAPR111Nd转化的大肠杆菌JM109接种到10ml含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的LB培养基中,在37℃摇动培养过夜。培养后,将通过离心收集的细胞悬浮到176.3μl缓冲液(20mM tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA)中,超声破碎。将通过在12,000rpm离心超声处理的悬浮液10分钟得到的上清液在70℃加热10分钟,然后再在12,000rpm离心10分钟,以收集上清液作为加热的上清液。类似地,将pApr108转化的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,在37℃摇动培养过夜。培养后,根据如上所述方法处理通过离心收集的细胞,以得到Apr RNA酶H的加热的上清液。
如下测定加热的上清液的酶活性。
将1mg poly(rA)或poly(dT)(均购自Amersham Pharmacia Biotech)溶解到1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中,以制备poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。
然后将poly(rA)溶液(至终浓度20μg/ml)和poly(dT)溶液(至终浓度30μg/ml)加入到含有4mM MgCl2、0.1%DMSO和0.01%BSA的20mMHEPES-KOH(pH7.8)。混合物在40℃反应10分钟,然后冷却到4℃,以制备poly(rA)-poly(dT)溶液。
将1μl加热的Apr RNA酶H上清液加入到100μl poly(rA)-poly(dT)溶液中。混合物在40℃反应10分钟。向其中加入10μl 0.5M EDTA以终止反应。然后在260nm测定吸光度。作为对照,向反应混合物中加入10μl 0.5M EDTA,得到的混合物在40℃反应10分钟,然后测定吸光度。从没有EDTA的反应的吸光度中减去对照组的吸光度产生一个值——吸光度差。在吸光度差的基础上,测定通过酶反应从poly(rA)-poly(dT)杂交体释放出的核苷酸浓度。将RNA酶H的1个单位定义为增加对应于在10分钟内释放出1nmol核糖核苷酸的A260的酶量,它可以根据下面的方程计算。如果使用稀释过的酶溶液,基于稀释比例校正使用该方程得到的值:
单位=[吸光度差异×反应体积(ml)]/0.0152
作为结果,对加热的Apr RNA酶H上清液观察到了RNA酶H活性。
(7)纯化的RNA酶H制剂的制备
将用在实施例1-(4)中得到的pApr108转化的大肠杆菌BL21(DE3)接种到400ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,在37℃摇动培养17小时。培养后,将通过离心收集的细胞悬浮到500ml缓冲液A[20mMtris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,2mM苯基甲烷磺酰氟,10mM 2-巯基乙醇]中,超声破碎。将通过在14,000rpm离心超声处理的悬浮液30分钟得到的上清液在70℃加热15分钟。然后再在14,000rpm离心30分钟,收集上清液。这样得到400ml加热的上清液。
将加热的上清液加到用缓冲液A平衡的DE52阴离子交换柱(Whatman),用缓冲液A洗涤。作为结果,RNA酶H流过DE52柱。
将流过DE52柱的蛋白溶液加到用缓冲液B(20mM tris-HCl(pH7.0),1mM EDTA,100mM NaCl,10mM 2-巯基乙醇)平衡的P-II阳离子交换柱(Whatman),用100mM至1000mM的NaCl线性梯度洗脱。作为结果,得到用约500mM NaCl洗脱的RNA酶H级分。
使用聚乙二醇(PEG)20000将150ml RNA酶H级分浓缩至50ml的体积。向浓缩液中加入150mM缓冲液C(20mM tris-HCl(pH7.0),1mMEDTA,10mM 2-巯基乙醇),将混合物加到用缓冲液B平衡的肝素-琼脂糖OL-6B肝素亲和柱(Amersham BioSciences),用100mM至500mM的NaCl线性梯度洗脱。作为结果,得到用约250mM NaCl洗脱的RNA酶H级分。
使用PEG 20000将130ml RNA酶H级分浓缩至10ml的体积。将浓缩液中加到用缓冲液D(20mM tris-HCl(pH7.0),0.5mM EDTA,200mMNaCl,10mM 2-巯基乙醇)平衡的HiLoad 26/60 Superdex G200HR凝胶过滤柱(Amersham BioSciences),用缓冲液D洗脱。作为结果,得到25mlRNA酶H级分。
将35ml缓冲液C加入到25ml RNA酶H级分,将混合物加到用缓冲液B平衡的SP-琼脂糖FF阳离子交换柱(Amersham BioSciences),用100mM至500mM的NaCl线性梯度洗脱。作为结果,得到50ml用约250mM NaCl洗脱的RNA酶H级分。
通过使用Ultrafree-4 BIOMAX-5K(Millipore)离心,将50ml RNA酶H级分浓缩至11ml的体积。在Shape缓冲液(25mM tris-HCl(pH7.0),0.5mM EDTA,30mM NaCl,5mM 2-巯基乙醇,50%甘油)中透析11ml浓缩液,得到4.5ml RNA酶H溶液。
这样得到的RNA酶H用作Apr RNA酶H制剂。
如在实施例1-(6)中所述测量Apr RNA酶H制剂的酶活性。作为结果,对Apr RNA酶H制剂观察到RNA酶H活性。
实施例2:同源性研究
对在实施例1中得到的来自深处古生球菌(Apr)的RNA酶H的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列进行同源性研究。使用计算机算法FASTA(3.2版;Pearson,W.R.等.,Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988)作为研究程序进行同源性计算。
使用计算机算法FASTA对Apr RNA酶H进行基因数据库搜索。结果,Apr RNA酶H的氨基酸和核苷酸序列与假定为核糖核酸酶的一个的氨基酸和核苷酸序列的最高同源性分别为53%和60%。
实施例3:RNA酶H的热稳定性检验
使用在实施例1-(6)中得到的用pApr108转化的大肠杆菌研究深处古生球菌RNA酶H的热稳定性。培养该大肠杆菌菌株,将从培养物中制备的粗酶提取物在95℃加热15分钟,根据实施例1-(6)中所述的方法检测RNA酶H活性。结果,对来自深处古生球菌的RNA酶H观察到RNA酶H活性。
另外,将浓度为5单位/ml的处于热处理缓冲液(25mM tris-HCl(pH8.0),5mM巯基乙醇,30mM NaCl,0.5mM EDTA,0.1%BSA,50%甘油)中的Apr RNA酶H在50、60、70、80或90℃加热10分钟,检测残余活性。以0.2单位/ml的终浓度,将热处理的或未热处理的样品加入到活性检测溶液(在终浓度,32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8),100mM醋酸钾,1%DMSO,0.05%BSA,4mM醋酸镁,0.2μM底物DNA-RNA-DNA和1μM模板W49(SEQ ID NO:16))。用探针W3(SEQ ID NO:15)检测每个酶单位的降解速度。结果如图1所示,将未热处理的RNA酶H的活性定义为100。Apr RNA酶H在50至80℃加热后具有几乎100%的活性,在90℃反应10分钟后具有86.9±7.0%的残余活性。
实施例4:使用含Apr RNA酶H的ICAN***进行HBV检测的研究
通过TA克隆,将对应于部分HBV X蛋白基因(SEQ ID NO:10)的560-碱基对的PCR-扩增片段***到pT7Blue T载体中。得到的质粒用作HBV阳性对照。
反应混合物的组成如下:在终浓度,32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8),100mM醋酸钾,1%DMSO,0.01%BSA,4mM醋酸镁,600μM每一种dNTP,11单位的BcaBEST DNA聚合酶,50pmol的每一种引物HBVF-2(SEQ ID NO:11)和HBVR-1(SEQ ID NO:12),103个拷贝的HBV阳性对照和1.625、3.25、6.5或13单位的Apr RNA酶H(终体积25μl)。将反应混合物置于已经设定在55℃的热循环器中,孵育60分钟。
反应后,3μl的每一种反应混合物在3.0%琼脂糖凝胶上进行电泳。结果,使用各量的RNA酶H观察到76-碱基对的目标扩增产物。
使用102拷贝、10拷贝或1拷贝的HBV阳性对照,进行类似的实验检测HBV阳性对照的灵敏度。结果,当加入6.5单位的Apr RNA酶H时,观察到最高灵敏度,能够检测出1拷贝的HBV阳性对照。
接着,按照WO 02/22831所述制备来自激烈热球菌的RNA酶H II(PfuRNA酶H II),来自闪烁古生球菌的RNA酶H II(Afu RNA酶H II)和来自Thermococcus litoralis的RNA酶H II(Tli RNA酶H II)。使用上述的ICAN***,用它们检测HBV,将灵敏度于用Apr RNA酶H观察到的进行对比。当使用Pfu RNA酶H II时,在10拷贝HBV阳性对照的灵敏度的条件下加入2.2单位的酶观察到最高灵敏度。当使用Afu RNA酶H II时,在10拷贝HBV阳性对照的灵敏度的条件下加入2.2单位的酶观察到最高灵敏度。当使用Tli RNA酶H II时,在10拷贝HBV阳性对照的灵敏度的条件下加入8单位的酶观察到最高灵敏度。
如上所述,使用ICAN***,使用Apr RNA酶H检测HBV基因可以检测到1个拷贝的HBV阳性对照。这样,证实了能够达到最高灵敏度。
实施例5
Apr RNA酶H的底物的降解速度与底物形式的差异的比较
使用在其序列中含有不同数目的RNA的三个DNA-RNA-DNA(探针W1(SEQ ID NO:13)、探针W2(SEQ ID NO:14)和探针W3(SEQ ID NO:15))之一作为底物检测RNA酶H的降解速度,检测差异。另外,使用上述的底物,对比了如WO 02/22831所述制备的来自激烈热球菌的RNA酶H II(PfuRNA酶H II)和来自Pyrococcus horikoshii的RNA酶H II(Pho RNA酶H II)与来自嗜热栖热菌(Tth RNA酶H I)(Toyobo)的RNA酶H I的剪切速度。
如果含有探针W1、探针W2或探针W3的溶液暴露于位于最大激发波长FAM(495nm)附近的波长的光,作为底物5’端的修饰的FAM会在最大波长519nm发射荧光。但是,荧光因为作为3’端的修饰的DABCYL的荧光共振能量传递(FRET)而受到削弱。如果底物被RNA酶H剪切,在519nm的荧光强度会因为释放FRET而增强。这样,通过确定剪切底物之前和之后在519nm测得的荧光强度的差异,可以监测底物的降解。
如果底物浓度与酶浓度相比足够高,酶反应产物的量与时间成比例增加。如果要通过使用与酶量相比足够过剩量的底物确定在519nm的荧光强度来监测降解速度,使用线性方程可以约计反应开始时每单位时间的荧光强度的增加。近似线的斜率对应于单位时间的荧光强度的增加((荧光强度)/(分钟))。假设当荧光强度的增加达到平台期且荧光强度达到其最大值时反应***中的底物被完全降解,则(最大荧光强度)-(酶切前的荧光强度)对应于每单位的降解的底物量的荧光强度的增加。基于该值和单位时间的荧光强度的增加((荧光强度)/(分钟))可以确定反应速度v((降解的底物的量)/(分钟))。
以0.4、0.8、1.6或2.4单位/ml的终浓度,将Apr RNA酶H加入活性检测溶液(在终浓度,32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8),100mM醋酸钾,1%DMSO,0.05%BSA,4mM醋酸镁,0.2μM底物DNA-RNA-DNA和1μM模板W49(SEQ ID NO:16))。用实时PCR测量仪器Smart Cycler(Takara Bio)检测RNA酶H反应和荧光强度。通过在55℃反应100分钟,确定反应速度v((降解的底物的量)/(分钟))。在由反应速度v((降解的底物的量)/(分钟))相对于Apr RNA酶H浓度绘图制备的标准曲线的斜率的基础上,确定每个酶单位的反应速度((降解的底物的量)/(分钟·单位))。使用Pfu RNA酶H II、Pho RNA酶H II或Tth RNA酶H I以类似的方法进行活性测量,以确定每个酶单位的反应速度((降解的底物的量)/(分钟·单位))。关于Tth RNA酶H I,以10、20、30或40单位/ml的终浓度将Tth RNA酶H加入到活性测量溶液中。
使用探针W1、探针W2或探针W3确定的各酶的每酶单位的反应速度如表2所示。pmol/(分钟·单位)的值显示在表中。在括号中标明了将使用探针W3的每酶单位的反应速度定义为100%的相对反应速度。使用AprRNA酶H,在所有各种RNA数目的情况下,都观察到比使用其它RNA酶H观察到的更高的剪切速度。使用具有两个RNA的底物观察到最高剪切速度。使用具有一个或两个RNA的底物观察到的剪切速度接近于使用具有三个RNA的底物观察到的剪切速度。
表2
探针W1(RNA=1) 探针W2(RNA=2) 探针W3(RNA=3)
Apr RNA酶H II 17.0(61.6) 41.1(148.9) 27.6(100)
Pfu RNA酶H II 3.3(34.8) 5.3(55.9) 9.5(100)
Pho RNA酶H II 2.7(55.6) 3.2(67.8) 4.8(100)
Tth RNA酶H I 0.0(0) 0.0(2.2) 1.4(100)
如上所述,证明了Apr RNA酶H的剪切速度对RNA长度的影响不太敏感,它可以用于核酸扩增反应和核酸检测反应。
工业应用性
本发明提供了对于遗传工程是高度有价值的具有RNA酶H活性的多肽、编码所述多肽的基因和通过遗传工程生产所述多肽的方法。由于本发明的RNA酶H是热稳定的,本发明提供了一种生产在工业上有利的RNA酶H的方法。
现在,可以将本发明的RNA酶H用于根据本发明的各种用途。
序列表独立文本
SEQ ID NO:3:用于克隆来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-F1
SEQ ID NO:4:用于克隆来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-R2
SEQ ID NO:5:用于克隆来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-1
SEQ ID NO:6:用于克隆来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-2
SEQ ID NO:7:tag序列
SEQ ID NO:8:用于扩增来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprNde
SEQ ID NO:9:用于扩增来自深处古生球菌的编码具有核糖核酸酶H II活性的多肽的基因的PCR引物AprBam
SEQ ID NO:11:扩增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸18-20是核糖核苷酸,其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO:12:扩增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22是核糖核苷酸,其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO:13:指定为探针W1的嵌合寡核苷酸。“核苷酸9是核糖核苷酸,其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO:14:指定为探针W2的嵌合寡核苷酸。“核苷酸9-10是核糖核苷酸,其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO:15:指定为探针W3的嵌合寡核苷酸。“核苷酸9-11是核糖核苷酸,其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO:16:指定为模板W49的寡核苷酸。
序列表
<110>宝生物工程株式会社
<120>热稳定RNA酶H
<130>663952
<150>JP2002-254153
<151>2002-08-30
<160>16
<210>1
<211>211
<212>PRT
<213>深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)
<400>9
Met Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu
20 25 30
Tyr Leu Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg
35 40 45
Arg Lys Arg Glu Glu Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Ser Leu Cys Lys
50 55 60
Val Lys Val Leu Lys Ile Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met
65 70 75
Glu Tyr Met Ser Ile Asn Glu Ile Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu
80 85 90
Ile Ile Arg Ser Leu Met Pro Lys Val Val Tyr Ile Asp Cys Pro
95 100 105
Asp Ile Asn Val Glu Arg Phe Lys His Glu Ile Glu Glu Arg Thr
110 115 120
Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His Lys Ala Asp Glu Ile Tyr Pro
125 130 135
Ile Val Ser Ile Ala Ser Ile Val Ala Lys Val Glu Arg Asp Phe
140 145 150
Glu Ile Asp Lys Leu Lys Lys Ile Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly
155 160 165
Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr Ile Glu Phe Leu Arg Ser Tyr Leu
170 175 180
Arg Glu His Lys Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg Lys Arg Trp Lys
185 190 195
Thr Leu Lys Arg Leu Thr Thr His Thr Leu Ser Asp Phe Phe Glu
200 205 210
Val
211
<210>2
<211>636
<212>DNA
<213>深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)
<400>2
atgattgctg ggatagacga agctggaaaa ggacctgtaa taggccctct tgtaatatgc 60
ggagtactgt gcgatgaaga gaccgtagaa tacttgaaga gcgtaggcgt taaagattca 120
aagaagctgg ataggaggaa gagagaggaa ctttacaata tcataaaatc gctttgcaag 180
gttaaggtat tgaaaatatc tgtcgaggat ttgaacaggt taatggaata catgagtata 240
aatgaaatct tgaagagagc ttacgttgaa ataataaggt ctttgatgcc taaagttgtg 300
tacatagact gtccagatat taatgtggag agatttaagc acgaaataga ggagagaacg 360
ggagtggagg tatttgcgag ccataaagcg gacgagatat atccaatagt atctatagct 420
tcgatagtcg caaaagttga aagggatttt gaaatagaca agctgaagaa gatttatgga 480
gactttggga gtggatatcc atcagatcta agaaccatcg aatttttaag gagttatcta 540
agggaacaca aaagttttcc accaatcgta agaaagagat ggaaaactct caaaagattg 600
acaacgcaca ctttaagcga tttctttgaa gtttag 636
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H
活性的多肽的基因的PCR引物RN-F1
<400>3
ggcattgatg aggctggnar rgg 23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物RN-R2
<400>4
ggtagggaaa gctgraancg 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H
活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-1
<400>5
ctcttcatcg cacagtactc cg 22
<210>6
<211>
22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H
活性的多肽的基因的PCR引物AprRN-2
<400>6
tttgcgagcc ataaagcgga cg
22
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>Tag序列
<223>
<400>7
ggcacgattc gataacg 17
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H活性的多肽的基因的PCR引物AprNde
<400>8
aatcgatggt gttcatatga ttgctgggat agacgaagc 39
<210>9
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增来自深处古生球菌的编码具有RNA酶H
活性的多肽的基因的PCR引物AprBam
<400>9
gcccacgccc tgggatccct aggctacggg tcctttaag 39
<210>10
<211>560
<212>DNA
<213>乙肝病毒
<400>10
ccttcccatg gctgctcggg tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct 60
acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg acccgtctcg gggccgtttg ggcctctacc 120
gtcccttgct ttctctgccg ttccagccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct 180
ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg 240
catggagacc accgtgaacg gccaccaggt cttgcccaag ctcttacata agaggactct 300
tggactctca gcaatgtcaa caaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa 360
agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag 420
gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctca 480
tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 540
attgacccgt ataaagaatt
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物。″核苷酸 .s
18-20为核糖核苷酸-其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸″
<400>11
ctcttggact ctcagcaaug 20
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增部分乙肝病毒X蛋白的嵌合寡核苷酸引物。″核苷酸
20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸″
<400>12
tcctcccagt ctttaaacam ac 22
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计为探针W1的嵌合寡核苷酸。″核苷酸9为核糖核苷酸-
其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸″
<400>13
cctacgccac cagctccaac 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计为探针W2的嵌合寡核苷酸。″核苷酸9-10为核糖核苷酸-
其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸″
<400>14
cctacgccac cagctccaac 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计为探针W3的嵌合寡核苷酸。″核苷酸9-11为核糖核苷酸-
其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸″
<400>15
cctacgccac cagctccaac 20
<210>16
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计为模板W49的寡核苷酸
<400>16
ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgac 49
Claims (6)
1.一种具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽,它选自由下述多肽组成的组:
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽;
(b)具有这样的氨基酸序列的多肽,其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代;和
(c)具有这样的氨基酸序列的多肽,它与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少54%的同源性。
2.一种编码具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽的核酸,它选自由下述核酸组成的组:
(a)编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的核酸;
(b)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸,其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有至少一个氨基酸残基被删除、添加、***或取代;
(c)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有至少54%的同源性;
(d)具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸;
(e)由核苷酸序列组成的核酸,其中在SEQ ID NO:2的核苷酸序列中有至少一个核苷酸被删除、添加、***或取代,这样该核苷酸的删除、添加、***或取代导致翻译成氨基酸序列;
(f)能够在严紧条件下与(a)至(d)中的任意一种核酸或其互补链杂交的核酸;和
(g)具有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列有至少61%的同源性的核苷酸序列的核酸。
3.一种重组DNA,其包含权利要求2定义的核酸。
4.一种转化体,其用权利要求3定义的重组DNA转化。
5.一种生产具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽的方法,该方法包括:
培养权利要求4定义的转化体;和
从培养物中收集具有热稳定的核糖核酸酶H活性的多肽。
6.一种具有热稳定的核糖核酸酶H活性的、可以通过培养转化体来获得的多肽,所述转化体中转移了由大肠杆菌HMS174/pApr108(保藏号FERM BP-8433)含有的质粒pApr108。
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