CN1676530A - 枸杞***半乳聚糖蛋白、制备工艺、用途及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从宁夏枸杞子(Lycium barbarumL.)中提取、分离、纯化得到的重均分子量在30,000－100,000道尔顿之间的***半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins.AGPs)，简称枸杞AGPs。含量＞80％。取适量的枸杞AGPs，加入一种或多种药学上可以接受的辅剂，制成注射剂。每个注射剂量单位至少含30mg本发明物质。用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症和作为抗癌的辅助剂。可以是单独用药，也可与其它多糖或G－CSF等联合用药。
Description
本发明涉及中药制药领域。具体涉及一种从宁夏枸杞子(Lyciumbarbarum L.)中提取、纯化得到的重均分子量在30,000-100,000道尔顿之间的***半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins.AGPs)，简称枸杞AGPs。含量＞80％。具备高等植物AGPs的化学特点：1.多糖∶蛋白＝80-95％∶5-20％。2.糖组成特点：主要含有***糖(Ara)和半乳糖(Gal)，两者的摩尔百分比之和＞50％。3.糖链：Ara主要为5-、2，5-和3，5-连接。Gal主要为6-和3，6-连接。4.氨基酸(AA)组成特点：羟脯氨酸(Hyp)：15-20％，丝氨酸(Ser)：10-20％，苏氨酸(Thr)：5-10％，谷氨酸(Glu)：5-10％，甘氨酸(Gly)：5-10％，天冬氨酸(Asp)：5-10％，丙氨酸(Ala)：5-10％。5.重均分子量：30,000-100,000道尔顿。6.溶解性：溶于水。本发明还涉及枸杞AGPs的制备工艺、制剂及其用途，同时本申请还提供了所述枸杞AGPs与黄芪提取物、当归提取物或G-CSF的组合物，通过组合能够使各组分协同增效。
枸杞子为茄科枸杞属植物宁夏枸杞的干燥成熟果实。枸杞为落叶灌木，花期5-6月，果期6-11月。
中医认为：枸杞子性味甘、平。功效为养肝明目、补肾益精，润肺。用于治疗肝肾阴亏、精血不足、腰膝酸软，头晕目眩。随着现代医学、药学和分子生物学的发展，人们对枸杞子的药理作用也有了进一步的认识。耿长山等(军事医学科学院院刊.1987(11)：476)，(中草药，1988.19.(7)：25)对枸杞多糖(LBP)的药理作用研究表明：枸杞多糖(LBP)能显著增加正常小鼠的脾重和提高外周血T淋巴细胞百分数。王柏昆等(中国药理学与毒理学杂志.1990(4)：1)发现：枸杞多糖(LBP)可以对抗环磷酰胺对小鼠T细胞、CTL细胞和NK细胞的免疫抑制作用。周志文等(中国药理学与毒理学杂志.1991(5)：1)发现枸杞多糖(LBP)可以促进小鼠骨髓造血干细胞(CFU-S)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和红系爆增式集落形成细胞(BFU-E)的增殖，因此，探讨以枸杞多糖作为有效部位用于生血，提高免疫功能，很有前景。
本发明提供一种从枸杞子中提取、纯化得到的重均分子量在30,000-100,000道尔顿之间的***半乳聚糖蛋白(Arabinogalactanproteins.AGPs)，简称枸杞AGPs。含量＞80％。
主要工艺流程如下：枸杞子洗净后，加水在100℃提取(加水量为3-4倍，每次提取1.0小时，共提取2次)。提取液60-65℃减压浓缩至稀稠膏状，冷却后进行30-45％醇沉，4℃静置8-12小时。收集上清液，喷雾干燥，即得枸杞AGPs粗品。将枸杞AGPs粗品用水溶解，浓度为4-6％，用截留分子量为10K的超滤膜超滤(MWCO＝10,000)，保留液上SP Sepharose离子交换柱，洗脱液为pH5-6，30-50mM的缓冲液(取分析纯的酸及其盐，用水分别配制所需浓度的溶液，按不同比例混合即得)，缓冲液可以选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等。收集流出液共3个柱体积，用截留分子量为5K的超滤膜超滤(MWCO＝5,000-8,000)，保留液上DEAE Sepharose离子交换柱，洗脱液为pH5-6，30-50mM的缓冲液(取分析纯的酸及其盐，用水分别配制所需浓度的溶液，按不同比例混合即得)，缓冲液可以选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等。收集流出液共3个柱体积，用截留分子量为5K的超滤膜超滤(MWCO＝5,000-8,000)，保留液经70％乙醇沉淀两次，离心，收集沉淀。沉淀加水反溶，浓度为20-30％，喷雾或冷冻干燥，即得含量在80％以上的枸杞AGPs。
或收集30-45％醇沉后的上清液，回收乙醇后用截留分子量为10K的超滤膜超滤及以后的步骤，同样得到枸杞AGPs。
本发明还提供了枸杞AGPs注射剂的制备方法：取适量的枸杞AGPs，加入一种或多种药学上可以接受的助溶剂、分散剂、载体或赋形剂，混合后制成适当注射剂如粉针、水针或冻干粉针。每个注射剂量单位至少含30mg本发明物。
本发明提供的枸杞AGPs用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症和作为抗癌辅助药。可以是单独用药，也可与其它多糖或G-CSF等药物联合用药。
本发明提供的枸杞AGPs在生血方面的药理作用为：体外实验的结果表明，单独使用枸杞AGPs，其浓度在50-400μg/ml时，可有效地刺激用植物血凝素(PHA)活化的人的外周血单核细胞产生白细胞介素6(IL-6)、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
枸杞AGPs与黄芪多糖、当归多糖或G-CSF组合后，能够发挥协同增效作用。当枸杞AGPs和黄芪多糖(参考封士兰等.黄芪多糖生产工艺研究.中成药.1997.19(12).5-6.中的工艺并加以改良后提取，纯化而得，多糖含量在95％以上)合并用药，枸杞AGPs浓度为100μg/ml，黄芪多糖浓度为100μg/ml时，与单独使用枸杞AGPs或黄芪多糖，浓度为200μg/ml比较，刺激用PHA活化的人的外周血单核细胞产生IL-6、GM-CSF和G-CSF的能力增强。当枸杞AGPs和G-CSF合并用药，枸杞AGPs用量为50mg/kg/d，G-CSF用量为100μg/kg/d，与单独使用枸杞AGPs，用量为50mg/kg/d，或单独使用G-CSF用量为100μg/kg/d相比较，刺激Balb/c小鼠产生粒/巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和红系爆增式集落形成细胞(BFU-E)的能力明显增强。
体内实验的结果表明，对接受放疗的Balb/C小鼠单独使用枸杞AGPs，当用药量为25-100mg/kg/d，皮下注射给药，连续使用7天，与安慰剂组比较，白细胞和血小板的恢复提前了4-7天。进一步的研究表明，给药组小鼠骨髓造血干细胞和粒、单系祖细胞数目增加，并诱导脾脏细胞生成IL-3、IL-6、GM-CSF和G-CSF。当枸杞AGPs和黄芪多糖合并用药，用药量为枸杞AGPs 50mg/kg/d，黄芪多糖50mg/kg/d，用法同上时，与单独使用枸杞AGPs或黄芪多糖，用药量为100mg/kg/d组相比较，白细胞的恢复提前了2-4天。当枸杞AGPs和当归多糖(参考张林维等.当归多糖的分离纯化及其部分性质的研究.生物学杂志.1998.15(3).12-14.并加以改良后提取，纯化而得。多糖含量在95％以上)合并用药时，用药量为枸杞AGPs 50mg/kg/d，当归多糖50mg/kg/d，用法同上时，与单独使用枸杞AGPs或当归多糖，用药量为100mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了。当枸杞AGPs和G-CSF合并用药，用药量为枸杞AGPs100mg/kg/d，G-CSF 1-3μg/kg/d，用法同上时，与单独使用G-CSF，用药量为1-3μg/kg/d或单独使用枸杞AGPs，用药量为100mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了3-4天。对接受化疗的Balb/C小鼠单独使用枸杞AGPs时，当用药量为25-100mg/kg/d，皮下注射给药，连续使用7天时，与安慰剂组比较，白细胞和血小板的恢复提前了4-7天。当枸杞AGPs和黄芪多糖合并用药，用药量为枸杞AGPs 50mg/kg/d，黄芪多糖50mg/kg/d，用法同上时，与单独使用枸杞AGPs或黄芪多糖，用药量为100mg/kg/d组相比较，白细胞的恢复提前了2-4天。当枸杞AGPs与当归多糖合并用药，用药量为枸杞AGPs 50mg/kg/d，当归多糖50mg/kg/d，用法同上时，与单独使用枸杞AGPs或当归多糖，用药量为100mg/kg/d组比较，白细胞，血小板和红细胞的恢复都提前了。当枸杞AGPs和G-CSF合并用药，用药量为枸杞AGPs 100mg/kg/d，G-CSF 1-3μg/kg/d，用法同上时，与单独使用G-CSF，用药量为1-3μg/kg/d时或单独使用枸杞AGPs，用药量为100mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了3-4天。
本发明提供的枸杞AGPs在增强免疫方面的药理作用为：体内实验的结果表明，当枸杞AGPs的用量在25-100mg/kg/d，可有效地刺激正常或接受化疗的Balb/C小鼠脾细胞产生干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)。枸杞AGPs还可提高S-180荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，刺激S-180荷瘤小鼠脾细胞产生白细胞介素2(IL-2)等细胞因子。
具体实施方式
实施例1
枸杞AGPs的制备
枸杞子40kg，加水提取2次，每次加水160kg，提取1.0小时，提取温度为100℃。合并提取液65℃减压浓缩至稀稠膏状，调整体积至20L，静置过夜，加入95％乙醇至终浓度38％，搅拌均匀，4℃放置10小时，5000×g离心10min，收集上清液，喷雾干燥，得枸杞AGPs粗品598g。将枸杞AGPs粗品598g用水溶解，浓度为4％，用截留分子量为10K的超滤膜超滤，保留液体积为9.2L，上200×300mm SPSepharose离子交换柱，洗脱液为pH5.2，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液，收集流出液共30L，用截留分子量为5K的超滤膜超滤，得保留液9.1L，保留液上DEAE Sepharose离子交换柱，洗脱液为pH5.2，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液，收集流出液共32L，用截留分子量为5K的超滤膜超滤(MWCO＝5,000-8,000)，得保留液6L。加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置10小时，5000×g离心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至6L，，加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置10小时，5000×g离心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至7L，喷雾干燥，得枸杞AGPs138g。AGPs含量为83％。
检测结果如下：
1.糖组成(Mol％)
| ***糖(Ara) | 鼠李糖(Rha) | 木糖(Xyl) | 甘露糖(Man) |
| 35.2 | 8.9 | 5.1 | 3.9 |
| 半乳糖(Gal) | 半乳糖醛酸(GalA) | 葡萄糖(Glu) | 葡萄糖醛酸(GluA) |
| 20.7 | 18.5 | 2.9 | 4.8 |
2.氨基酸组成(％)
| 羟脯氨酸(Hyp) | 丝氨酸(Ser) | 苏氨酸(Thr) | 谷氨酸(Glu) | 甘氨酸(Gly) | 天冬氨酸(Asp) |
| 16.60 | 19.50 | 5.57 | 7.59 | 9.40 | 5.63 |
| 丙氨酸(Ala) | 脯氨酸(Pro) | 半胱氨酸(Cys) | 酪氨酸(Tyr) | 缬氨酸(Val) | 甲硫氨酸(Met) |
| 7.11 | 6.48 | 0.018 | 3.72 | 3.55 | 0.20 |
| 亮氨酸(Leu) | 苯丙氨酸(Phe) | 组氨酸(His) | 赖氨酸(Lys) | 精氨酸(Arg) | 异亮氨酸(Ile) |
| 3.62 | 1.872 | 1.13 | 2.23 | 2.28 | 3.50 |
3.蛋白质含量和重均分子量
蛋白质含量：10.9％。
重均分子量：87,600道尔顿
实施例2
枸杞AGPs冻干粉针剂的制备
取实施例1所得30g枸杞AGPs，用含0.5％氯化钠、0.4‰的吐温-80、pH5.0，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，调整终体积至2000ml。0.22um滤膜除菌过滤，分装到1000个10ml西林瓶中，冻干即得。
实施例3
枸杞AGPs诱导PHA活化的人的外周血单核细胞
生成GM-CSF，G-CSF和IL-6
实验共分为6组：第1组试药为实施例1，浓度为50μg/ml。第2组试药为实施例1，浓度为100μg/ml。第3组试药为实施例1，浓度为200μg/ml，。第4组试药为实施例1，浓度为400μg/ml。第5组试药为用现有实验室方法提取、纯化得到的枸杞多糖(LBP)(王玲等，昆明医学院学报.1995.16(2))，浓度为400μg/ml。第6组试药为猪苓多糖注射剂(连云港东风制药厂)，浓度为400μg/ml。作为阳性对照。第7组为空白对照。
从健康人全血中分离、洗涤得到人外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞数到1×106/ml，依次加入各管，每管1.0ml。再加入药液0.5ml(除空白对照外)，PHA液0.5ml(至终浓度4μg/ml)。37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，离心，收集上清。用相应的ELISA试剂盒分别检测GM-CSF，G-CSF和IL-6的生成量，用加药组产生的细胞因子量比空白对照组产生的细胞因子量(S/C)为表示活性的单位。
下表显示不同浓度的枸杞AGPs
诱导生成GM-CSF，G-CSF和IL-6的数量
| 分组 | 试药浓度(μg/ml) | G-CSF(S/C) | GM-CSF(S/C) | IL-6(S/C) |
| 1 | 50 | 5.8 | 1.8 | 76.4 |
| 2 | 100 | 18.9 | 7.0 | 130.6 |
| 3 | 200 | 24.5 | 9.7 | 386.6 |
| 4 | 400 | 30.7 | 12.7 | 551.1 |
| 5 | 400 | 7.2 | 3.9 | 58.1 |
| 6 | 400 | 11.2 | 5.9 | 9.0 |
从以上结果可以看出：枸杞AGPs能诱导PHA活化的人的外周血单核细胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6，且生成量与药物浓度呈正相关。枸杞AGPs的诱导效果明显优于同等剂量的LBP。
实施例4
枸杞AGPs与黄芪多糖合用强化PHA活化的人的外周血
单核细胞诱导生成GM-CSF，G-CSF和IL-6
试药共分为4组：第1组试药为实施例1，浓度为200μg/ml。第2组试药为黄芪多糖，浓度为200μg/ml。第3组试药为实施例1+黄芪多糖，浓度各为100μg/ml。第4组试药为猪苓多糖注射剂(连云港东风制药厂)，浓度为400μg/ml。作为阳性对照。未加药组作为空白对照。
从健康人全血中分离、洗涤得到人外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞数到1×106/ml。加入各管，每管1.0ml。各管再加入药液0.5ml(空白对照除外)，PHA液0.5ml(至终浓度4μg/ml)。37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，离心，收集上清。用相应的ELISA试剂盒检测GM-CSF，G-CSF和IL-2的生成量，用加药组产生的细胞因子量/空白对照组产生的细胞因子量(S/C)表示活性。
下表显示枸杞AGPs与黄芪多糖合用强化诱导生成
G-CSF，GM-CSF和IL-6
| 试药名称 | 试药浓度(μg/ml) | G-CSF(S/C) | GM-CSF(S/C) | IL-6(S/C) |
| 实施例1 | 200 | 29.2 | 8.7 | 430.6 |
| 黄芪多糖 | 200 | 24.0 | 9.5 | 280.2 |
| 实施例1+黄芪多糖 | 100+100 | 35.1 | 14.8 | 650.8 |
| 猪苓多糖 | 400 | 6.4 | 5.4 | 33.9 |
从以上结果可以看出：当枸杞AGPs与黄芪多糖合用时，刺激用PHA活化的人的外周血单核细胞产生IL-6，GM-CSF和G-CSF的能力增强。
实施例5
枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生
GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
试药分为4组：第1组.实施例1，用量50mg/kg/d。第2组.G-CSF(重组人粒细胞集落刺激因子.商品名：惠尔血.麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司)用量100μg/kg/d。第3组.实施例1+G-CSF，用量为实施例150mg/kg/d，G-CSF100μg/kg/d。第4组.安慰剂组。
雌性Balb/c小鼠，体重18-22g，随机分组，每组5只。皮下注射给药，每日一次，连续给药7天。取外周血，分离单核细胞，洗涤后用含有EPO(红细胞生成素)、IL-3、IL-6和干细胞因子等的培养基调整细胞数为1×105个/ml，依次加入35mm的培养皿，每皿加入1.0ml。5％CO2培养箱，37℃饱和湿度培养7天，在显微镜下计数含50个细胞的集落(BFU-E)。各皿加入染色剂1ml，5％CO2培养箱，37℃饱和湿度培养3.5小时，在显微镜下计数棕色的细胞集落(GM-CFC)。
下表显示枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生
GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
从以上结果可以看出：当枸杞AGPs和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
实施例6
枸杞AGPs促进接受放疗小鼠外周血象的恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例1，用量为25mg/kg/d。第2组为实施例1，用量为50mg/kg/d。第3组为实施例1，用量为100mg/kg/d。第4组为LBP，用量为100mg/kg/d。第5组为安慰剂组。第6组为正常对照组。
1-5组小鼠在0天接受X射线照射，照射量为500cGy。从照射当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药一周。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)和血小板(PLT)，连续观察4周。
外周血WBC(×109/L)的变化
外周血RBC(×1012/L)的变化
外周血PLT(×109/L)的变化
从以上结果可以看出：第1组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了4天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。第2组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第3组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第4组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了4天，P＜0.01。PLT的恢复与对照组相似，P＞0.05。
从以上结果可以看出：当枸杞AGPs的用量在25-100mg/kg/d时，可以促进接受放疗小鼠外周血象的恢复，特别是促进PLT和WBC的恢复，且恢复的情况与用药量呈正相关。LBP只有促进WBC的恢复的作用，且效果差于同等剂量的枸杞AGPs。
实施例7
枸杞AGPs与当归多糖合用促进
放疗小鼠外周血象全面恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例1，用量为100mg/kg/d。第2组为当归多糖，用量为100mg/kg/d。第3组为实施例1+当归多糖，用量为各50mg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
1-4组小鼠在0天接受X射线照射，照射量为500cGy。从照射当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药一周。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
外周血WBC(×109/L)的变化
外周血RBC(×1012/L)的变化
外周血PLT(×109/L)的变化
结果发现：第1组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第2组RBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。WBC和PLT的恢复与对照组近似，P＞0.05。第3组RBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。
从以上结果可以看出：联合使用枸杞AGPs和当归多糖，具有互补作用，既比单独用枸杞AGPs的RBC恢复时间提前，又比单独用当归多糖的WBC、PLT的恢复时间提前，可使照射后小鼠的外周血象尽快全面恢复。
实施例8
枸杞AGPs与黄芪多糖合用进一步促进接受化疗小鼠
外周血WBC的提前恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例1，用量为100mg/kg/d。第2组为黄芪多糖，用量为100mg/kg/d。第3组为实施例1+黄芪多糖，用量为各50mg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
1-4组小鼠在0天接受丝裂霉素C，尾静脉给药，给药量3.5mg/kg/d。连续用药3天。化疗当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药14天。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
外周血WBC(×109/L)的变化
外周血RBC(×1012/L)的变化
外周血PLT(×109/L)的变化
结果发现：第1组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第2组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。第3组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了11天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。
从以上结果可以看出：联合使用枸杞AGPs和黄芪多糖，与二者单独使用组相比，既具有互补作用，使接受化疗后小鼠的WBC，PLT均提前恢复。且对WBC的恢复有增效作用。
实施例9
枸杞AGPs与G-CSF合用促进
化疗小鼠外周血象全面恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例1，用量为100mg/kg/d。第2组为G-CSF，(重组人粒细胞集落刺激因子.商品名：惠尔血.麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司)用量为3μg/kg/d。第3组为实施例1+G-CSF，用量为实施例1 100mg/kg/d，G-CSF 3μg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
1-4组小鼠在0天接受丝裂霉素C，尾静脉给药，给药量3.5mg/kg/d。连续用药3天。化疗当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药14天。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
外周血WBC(×109/L)的变化
外周血RBC(×1012/L)的变化
外周血PLT(×109/L)的变化
从以上结果可以看出：当枸杞AGPs和G-CSF合并用药，与单独使用G-CSF或枸杞AGPs比较，具有增效作用，白细胞、血小板的恢复都提前了3-4天，红细胞的恢复也提前了。
实施例10
枸杞AGPs诱导正常小鼠和环磷酰胺化疗小鼠脾细胞产生
IL-2、IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ
Balb/c雄性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组8只。第1、2组从第1天开始皮下注射实施例1，用量为100mg/kg/d，连续给药7天。第3组从第1天开始皮下注射猪苓多糖，用量为100mg/kg/d，连续给药7天，作为阳性对照。第4组从第1天开始皮下注射LBP，用量为100mg/kg/d，连续给药7天。第5、6组从第1天开始皮下注射等体积生理盐水，连续给药7天。1、3、4、5组第4天腹腔注射环磷酰胺200mg/kg，注射环磷酰胺后的第5天，处死所有小鼠，制备脾细胞悬液。用24孔细胞培养板，分别加入脾细胞悬液各1ml(细胞终浓度：5×106/ml)，ConA 1ml(终浓度为2.5μg/ml)或OVA 1ml((终浓度为200μg/ml)，5％CO2，37℃培养48小时，离心，取上清液，用ELASA法检测细胞因子的含量。结果见下表：
表1
| 培养介质 | OVA | ConA | ||||
| 分组 | IL-2(pg/ml)(均数) | IL-2(标准差) | IL-2(P值) | IL-3(pg/ml)(均数) | IL-3(标准差) | IL-3(P值) |
| 6 | 11.26 | 0.43 | 100.33 | 2.49 | ||
| 2 | 9.06 | 0.30 | 1061.22 | 19.24 | *＜0.01 | |
| 5 | 7.48 | 0.13 | 186.7 | 4.56 | ||
| 1 | 12.17 | 0.32 | **＜0.01 | 2487.09 | 1.3 | **＜0.01 |
| 3 | 10.04 | 0.16 | 903.24 | 6.59 | ||
| 4 | 8.00 | 0.24 | ***＜0.01 | 242.33 | 3.10 | ***＜0.01 |
备注：*表示第2组与第6组比较。**表示第1组与第5组比较。***表示第1组与第4组比较。
表2
| 培养介质 | ConA | ConA | ||||
| 分组 | IL-4(pg/ml)(均数) | IL-4(标准差) | IL-4(P值) | IFN-γ(pg/ml)(均数) | IFN-γ(标准差) | IFN-γ(P值) |
| 6 | 19.33 | 0.92 | 8534.60 | 110.64 | ||
| 2 | 328.62 | 8.35 | *＜0.01 | 11532.73 | 316.35 | *＜0.01 |
| 5 | 78.38 | 0.62 | 2402.98 | 44.31 | ||
| 1 | 446.13 | 19.84 | **＜0.01 | 4717.03 | 451.04 | **＜0.01 |
| 3 | 191.11 | 3.95 | 7788.60 | 230.09 | ||
| 4 | 98.45 | 4.15 | ***＜0.01 | 2899.21 | 340.12 | ***＜0.01 |
备注：*表示第2组与第6组比较。**表示第1组与第5组比较。***表示第1组与第4组比较。
表3
| 培养介质 | ConA | ||
| 分组 | IL-6(pg/ml)(均数) | IL-6(标准差) | IL-6(P值) |
| 6 | 608.76 | 7.14 | |
| 2 | 1051.98 | 16.14 | *＜0.01 |
| 5 | 109.62 | 0.58 | |
| 1 | 450.09 | 6.76 | **＜0.01 |
| 3 | 298.01 | 11.48 | |
| 4 | 179.09 | 9.28 | ***＜0.01 |
备注：*表示第2组与第6组比较。**表示第1组与第5组比较。***表示第1组与第4组比较。
从以上结果可以看出：枸杞AGPs可诱导正常小鼠产生IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ。枸杞AGPs还可诱导环磷酰胺化疗小鼠脾细胞产生IL-2、IL-4、IL-3、IL-6和IFN-γ。且生成量明显高于等剂量的LBP。
实施例11
枸杞AGPs提高S-180荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，刺激S-180荷瘤
小鼠脾细胞产生白细胞介素2(IL-2)。
Balb/c雄性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组5只。1.正常对照组。2.S-180对照组。3.枸杞AGPs给药组。4.LBP给药组。5.猪苓多糖给药组(阳性对照)。第一天，除第1组外，各鼠腋下皮内注射1×106/ml S-180细胞0.2ml。次日第3组皮下注射枸杞AGPs、第4组皮下注射LBP、第5组皮下注射猪苓多糖，剂量均为100mg/kg/d，连续用药7天。第8天，处死所有小鼠，制备脾细胞悬液。
1.NK细胞的活性测定：用96孔细胞培养板，分别加入脾细胞悬液各100μl(细胞终浓度：5×105/ml)和3H-TdR标记的靶细胞100μl(细胞终浓度：5×105/ml)，只加3H-Tymidine标记的靶细胞200μl(细胞终浓度：5×105/ml)孔为空白对照。在5％CO2，37℃孵箱中孵育4小时，用细胞收集器收集，在γ液闪仪读取cpm值，计算特异性杀伤百分比。
0.白细胞介素2(IL-2)活性的测定：用24孔细胞培养板，分别加入脾细胞悬液各1ml(细胞终浓度：5×106/ml)，加入ConA 1ml(终浓度为2.5μg/ml)，5％CO2，37℃培养48小时，离心，取上清液，用ELASA法检测IL-2的含量。
结果见下表：
| 分组 | NK细胞特异性杀伤％ | IL-2活性 | ||||
| 均数 | 标准差 | P值 | 均数(pg/ml) | 标准差 | P值 | |
| 1 | 4.10 | 0.8 | 533.13 | 0.67 | ||
| 2 | 4.10 | 5.4 | 475.45 | 2.06 | ||
| 3 | 12.75 | 1.2 | *＜0.01 | 619.53 | 5.42 | *＜0.01 |
| 4 | 6.1 | 3.8 | **＜0.01 | 519.47 | 6.45 | **＜0.01 |
| 5 | 8.4 | 2.2 | 517.58 | 7.81 | ||
*表示第2组与第3组比较。**表示第3组与第4组比较。
从以上结果可以看出：枸杞AGPs提高了S-180荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，刺激S-180荷瘤小鼠脾细胞产生白细胞介素2(IL-2)。且作用明显高于等剂量的LBP。
根据以上结果可以将枸杞AGPs单独用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症和作为抗癌辅助药。或与黄芪多糖、当归多糖或G-CSF组合，以起到协同增效的作用。
Claims (12)
1.一种从宁夏枸杞子(Lycium barbarum L.)中提取、分离、纯化得到的***半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins)，简称枸杞AGPs。
2.权利要求1所述的枸杞AGPs的重均分子量为30,000-100,000道尔顿。
3.权利要求1和2所述的枸杞AGPs，其特征在于具备高等植物AGPs的化学特点：1.多糖：蛋白＝80-95％：5-20％。2.糖组成特点：主要含有***糖(Ara)和半乳糖(Gal)，两者的摩尔百分比之和＞50％。3.糖链：Ara主要为5-、2，5-和3，5-连接。Gal主要为6-和3，6-连接。4.氨基酸(AA)组成特点：羟脯氨酸(Hyp)：15-20％，丝氨酸(Ser)：10-20％，苏氨酸(Thr)：5-10％，谷氨酸(Glu)：5-10％，甘氨酸(Gly)：5-10％，天冬氨酸(Asp)：5-10％，丙氨酸(Ala)：5-10％。5.重均分子量：30,000-100,000道尔顿。6.溶解性：溶于水。
4.权利要求1至3所述的枸杞AGPs，含量＞80％。
5.权利要求1至4所述的枸杞AGPs的提取、分离、纯化方法，其特征在于包括以下步骤：枸杞子水提，30-45％乙醇沉淀，收集上清液，用截留分子量为10K的超滤膜超滤，保留液经过阳离子交换柱和阴离子交换柱，用pH5-6、30-50mM的缓冲液洗脱，收集流出液，流出液经过截留分子量为5K的超滤膜超滤，超滤后所得保留液经70％的乙醇沉淀两次，所得沉淀物即为所述的枸杞AGPs。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于在制备过程中所用的离子交换树脂为SP Sepharose和DEAE Sepharose离子交换树脂。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在经过2次70％醇沉过程制备得到枸杞AGPs沉淀后，加水将沉淀溶解，经喷雾或冷冻干燥得到精制的枸杞AGPs。
8.含有根据权利要求1-7中任一权利要求所述的枸杞AGPs注射剂，是由所述的枸杞AGPs加入一种或多种药学可以接受的辅料制成，每个注射剂量单位中至少含枸杞AGPs 30mg。
9.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的枸杞AGPs在制备治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症的药物和制备抗癌辅助药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的抗癌辅助药物为放、化疗辅助用药。
11.一种组合物，其中含有根据权利要求1-4所述的枸杞AGPs，及选自黄芪多糖、当归多糖中的任意一种，枸杞AGPs与所述植物多糖的重量配比为1∶0.5-2。
12.一种组合物，其中含有根据权利要求1-4所述的枸杞AGPs及G-CSF，枸杞AGPs与G-CSF的重量配比为1∶0.000010-0.000030。
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2004
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