CN1671833A - 糖化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用高温糖化的谷物制备麦芽汁和啤酒的方法。

Description

糖化方法
发明领域
本发明涉及一种制备标准高质量的麦芽汁和制备同样高质量啤酒的经改进的糖化方法。
发明背景
传统的啤酒仅由大麦芽、啤酒花和水酿造而成。在许多国家，大麦芽依然是制备啤酒必不可少的。然而，通常部分大麦芽被辅料(adjunct)代替，所述辅料诸如玉米(corn)、稻(rice)、高粱(sorghum)、小麦(wheat)、精制淀粉，或者诸如糖或糖浆的易于发酵的碳水化合物。使用这些辅料主要是因为它们提供碳水化合物的成本比从大麦芽中获取要低。由于这些辅料没有或者没有足够酶活性来使淀粉转变成可发酵糖，所以大麦芽必须包含足够的内源性酶活性，以使大麦芽和辅料分解成为可发酵糖和游离氨基酸作为酵母菌的营养。因此，在常规的糖化方法中，所产生的麦芽汁的质量取决于所使用的大麦芽的酶活。但是，如果提供一种制备高质量麦芽汁和啤酒的糖化方法，其中所述质量不受大麦芽内源性酶活性的影响，那么在啤酒的制造中就可以使用更多种标准的大麦芽。本发明的目的即提供这样的方法。
发明概要
本发明的第一方面提供了一种制备麦芽汁的方法，包括，形成一种醪液，它包含5％到100％的大麦芽，在形成所述醪液之前、中间或者之后添加蛋白酶(E.C.3.4.)和纤维素酶(EC3.2.1.4)，在醪液形成15分钟内使初始温育温度达到至少70℃，接着，在至少70℃的温度保温所述醪液足够的时间，以达到80％的提取回收率，然后从酒糟中分离麦芽汁。
本发明的第二方面提供了一种制备啤酒的方法，包括，获得第一方面的麦芽汁，用酵母发酵上述麦芽汁，以及获得啤酒。
本发明的第三方面提供了一种制备啤酒的方法，包括，获得第一方面的麦芽汁，将上述麦芽汁同第二种麦芽汁混合，用酵母发酵混合的麦芽汁，获得啤酒。
本发明的第四方面提供了一种制备啤酒的方法，包括，获得第一方面的麦芽汁，用酵母发酵上述麦芽汁，将上述发酵了的麦芽汁同第二种发酵了的麦芽汁与混合，并获得啤酒。
本发明的第五方面和第六方面分别提供由本发明的方法制得的麦芽汁和啤酒。
发明的详细描述
本领域众所周知啤酒的酿造方法，其一般包括以下几个步骤：麦粒发芽(malting)、糖化(mashing)和发酵(fermentation)。在传统酿造方法中，麦粒发芽的目的是将不能溶解的淀粉转化为可溶解的淀粉，减少复合物蛋白质，产生带有颜色和口味(flavor)的化合物，为产生酵母菌发育所需的营养，以及酶的出现。麦粒发芽的三个主要步骤是：浸渍(steeping)、发芽(germination)和焙烤(kilning)。
浸渍包括用将大麦粒与水混合，提高湿润程度，激活休眠麦粒的新陈代谢过程。在接下来的步骤中，湿润的大麦保持在适宜的温度和湿度条件下发芽，直到例如淀粉分解和酶活化等适当的修饰发生。最后的步骤是在干燥炉中干燥绿麦芽。干燥炉中的温度情况决定大麦芽的颜色和保存下来用在糖化过程中的酶量。在有必要保持酶活性时，低温干燥更适合麦芽。高温焙烧的麦芽将没有或者只有很低的酶活性，却含很多产色化合物如焦糖和产味化合物。
糖化是将淀粉从粉碎的大麦芽和固体辅料转化为可发酵的和不可发酵的糖，从而产生具有所需组成的麦芽汁的过程。传统的糖化涉及以一定温度和容积，将水与粉碎的大麦芽和辅料混合，以继续在糖化过程中开始的生化变化。为了活化负责蛋白质和碳水化合物分解的内源性酶，糖化过程在一段时间内在各种温度进行。到目前为止，在糖化过程中最重要的变化是淀粉分子转变为可发酵糖。在传统糖化方法中，负责淀粉转化的主要酶是α和β-淀粉酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子***为许多能够被β-淀粉酶攻击的短链，而迅速减少不溶和可溶的淀粉。
传统的糖化方法是浸渍(infusion)方法，其中啤酒制造商可以在单一糖化温度制备并回收麦芽汁。这常与爱儿啤酒和浓烈黑啤酒的制备有关，并且许多大型啤酒制造商都成功地使用了这种方法。传统地，陈贮啤酒(lagerbeer)通常是用“分步浸渍法(step-infusion)”酿造的。该糖化过程包括在不同温度下的一系列的静置(rest)，每次静置都有利于一种必要内源性酶的活性。当今，双醪液浸渍***(double-mash infusion system)是工业制备啤酒尤其是陈贮啤酒，所最广泛使用的***。该***制备两种分离的醪液。它利用用于煮沸辅料的谷物煮机(cereal cooker)，以及用于良好修饰的、高度酶活性的麦芽的醪液发酵桶(mash tun)。由于传统的糖化方法利用大麦芽的内源性酶，因此温度控制在70℃以下，否则酶会失活。
在糖化以后，当所有的淀粉都被分解以后，就需要将液体提取物(麦芽汁)从固体(酒糟)中分离。麦芽汁的分离很重要，因为固体包含大量的蛋白质、修饰不充分的淀粉、脂肪物质、硅酸盐(酯)和多酚(鞣酸)。分离麦芽汁的目的包括：
产生澄清的麦芽汁
获得良好的提取回收率，以及
在可以接受的循环时间内操作
麦芽汁的澄清度、提取回收率以及整个循环时间在很大程度上受谷物的标准的影响，例如大麦芽和辅料种类，以及所应用的糖化方法。
在把麦芽汁从酒糟中分离之后，麦芽汁就可以用于啤酒酵母(brewersyeast)发酵制备啤酒了。
如需常规酿造过程的其它资料可以查阅柏林发酵和生物技术研究所(VLB)的沃尔夫冈·昆泽(Wolfgang Kunze)所著的《酿造和麦粒发芽方法)》，1999年第二修订版，ISBN 3-921690-39-0(″Technology Brewing and Malting″，Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，2nd revised Edition 1999，ISBN 3-921690-39-0)。
本发明提供使用在常规糖化方法中得不到质量合格产品这一标准的大麦芽，来制备高质量麦芽汁和高质量啤酒的方法。在本发明方法中应用高温保证了大麦芽或辅料中的多种内源性酶的活性被显著降低甚至除去。因此，在70℃到78℃的温度区间内，只有大麦芽α和β-淀粉酶有明显活性，在78℃以上的温度，内源性酶的活性可以忽略。在本发明的糖化方法中，加入的酶将构成大部分或全部酶活性。大麦芽的内源性酶，包括不需要的活性例如脂氧合酶，将在本发明中的高温步骤中被除去。而大麦芽的积极性质，例如颜色和口味成分以及蛋白质成分，都被保留下来。热稳定性酶的标准化混合物的应用确保了高提取量，蛋白酶活性的完全控制可以达到最佳的泡沫稳定性，而且含非常少量的β-葡聚糖成分可以促进麦芽汁的分离，从而即使用含较高百分比的未发芽大麦或修饰不完全的(undermodified)大麦也可缩短循环时间。本发明还提供允许制备其中的反式-2-壬烯醛(trans-2-nonenal)(T2N)和/或二甲硫(DMS)的量降低的麦芽汁和/或啤酒的方法，这两种化合物与制造啤酒中出现的两种主要异味相关。
不受理论限制，有人认为T2N的减少是由于在70℃以上时麦芽脂氧合酶和过氧化物酶失活。在常规方法中应用这样的温度是不可行的，因为在高温糖化过程中所需的内源性酶将失活。
从公开内容可见，本发明提供一种独特的可能性来在统一标准的麦芽汁质量方面控制糖化过程，进而产生标准质量的啤酒。
定义
在本说明书中，所使用的各个术语是该领域中的普通技术人员都能够理解的。但数个的术语有其独特的意思，其定义如下。
在这里所使用的术语“谷物(grist)”，是指含有制造啤酒所需含淀粉或糖的物质，例如，大麦芽和辅料。
术语“麦芽(malt)”，是指任何发芽的谷物，尤其是大麦。
术语“辅料(adjunct)”，是指非大麦芽的谷物部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物原料。
术语“醪液(mash)”，是指淀粉浆，其包含捣碎的大麦芽、其它含淀粉的原料或其组合物，所述淀粉浆浸渍在水中以制备麦芽汁。
术语“麦芽汁(wort)”，是指在糖化过程中从谷物中提取的未发酵的液体。
术语“酒糟(spent grains)”，是指谷物经提取，并分离麦芽汁以后的沥干的固体残留物。
术语“啤酒”，在这里是指发酵的麦芽汁，例如，由大麦芽、以及任意的辅料和啤酒花酿造的酒精饮料。
术语“糊化温度(gelatinization temperature)”，是指淀粉开始糊化的温度。淀粉在60℃到70℃之间开始糊化，提取温度取决于淀粉的具体种类。
术语在麦芽汁中的“提取回收率(extract recovery)”，是指从谷物(麦芽和辅料)中提取到的可溶解物质的总数，表达为基于干物质的百分比。
术语“温育(incubatinon)”，是指方法中从达到初始温育温度一直持续直到温度降低到终温育温度以下的部分。所述温育可以包含在不同温度的一个或者多个步骤，所有温度均至少为70℃。
术语“初始温育温度”，是指所述温育初始部分过程中的温度状态。
术语“终温育温度”，是指所述温育最后部分过程中的温度状态。
术语“热稳定性酶”，是指在本发明方法流程所用的温度状态和温育过程中所添加的酶，所述酶的量能够充分分解目的底物。
术语“麦芽糖生成酶”，指的是一种外部作用酶，它催化线性淀粉α-1-4连接的***，并限制糊精产生麦芽糖。麦芽糖生成酶的实例是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
反式-2-壬烯醇(T2N)发出不新鲜的异味，称为纸板味。T2N是一种氧化产品，是通过脂类的自动氧化(autooxidation)和/或酶催化氧化产生的。T2N的水平既受原材料的影响也受到糖化方法的影响。含低水平前体和低水平脂氧合酶的大麦品种受到关注。此外，已知最终产品中的低PH值有利于T2N的生成，而SO2量的增加则减少T2N的生成。
二甲硫(DMS)是最重要的硫味化合物，也是啤酒中的一种比较讨厌的味道。从煮玉米到煮蔬菜、尤其是煮玉米、芹菜、卷心菜或欧洲防风草(parsnip)，甚至大蒜，所发出的这种气味强度不同。在极端的情况下，它还可能让人感觉闻到了贝类或者煮虾水的味道。DMS通常是由S-甲基蛋氨酸(SMM)转变而来的。DMPS(P)代表着DMS前体的水平，例如S-甲基蛋氨酸(SMM)和二甲基亚砜(DMSO)。
在本文中术语“同源性”用于多肽或者DNA序列时，是指两个序列的同源程度，表明第一个序列与第二个序列之间的差异。同源性可以用本领域已知的计算机程序适当确定，所述程序如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Ge-neticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使用以下设置用于对比多肽序列：缺口产生罚分(GAP creationpenalty)为3.0和缺口延伸罚分(GAP extension penalty)为0.1。
与本发明第一部分对应，含淀粉浆液即醪液是通过将谷物与水混合获得的，所述谷物包含至少5％，或优选至少10％，或更优选至少15％，甚至更优选至少25％，或最优选至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，甚至100％(谷物w/w)的大麦芽。优选至少5％，或优选至少10％，更优选至少20％，甚至更优选至少50％，至少75％，甚至100％的大麦芽是修饰良好(well-modified)的大麦芽。本发明一个实施方案中，所述谷物包含除大麦芽以外的其它发芽谷物，使得至少10％，至少25％，优选至少35％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少90％(w/w)的谷物是其它发芽的谷物而不是大麦芽。
在形成醪液之前，发芽的和/或没发芽的谷物优选被粉碎，并最优选干燥粉碎。在一个优选实施方案中，在形成醪液前从已发芽的和/或未发芽的谷物去除外壳。可包含75℃以上的温度的糖化方案中进行去壳，所述温度例如在76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃以上的温度，或甚至86℃以上的温度。
根据本发明，糖化过程继续所需要的酶活性是由外源补给的，并可以在形成所述醪液之前，期间或者之后添加到醪液成分如水或者谷物中。优选在该过程开始时一次性加入所有的酶，但是，也可以在在本发明的方法之前、开始时或过程中间一次或多次加入一种或多种酶。以下的酶活性加入到了所述醪液中：蛋白酶(E.C.3.4.)和纤维素酶(E.C.3.2.1.4)。在尤其优选的实施方案中，还添加α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)和/或麦芽糖生成酶。所述麦芽糖生成酶优选β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)，或更优选产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
在更优选的实施方案中进一步添加酶，所述酶选自漆酶、脂酶、葡糖淀粉酶、含磷脂肪酶(phospholipolase)、肌醇六磷酸酶、植酸钙镁酯酶(phytinesterase)、普鲁兰酶(pullulanase)或木聚糖酶。
为使醪液在形成时所述醪液达到初始保温温度，水在加入到谷物之前最好先预热。如果形成醪液的温度低于初始保温温度，为达到初始保温温度最好另外加热。适宜的初始保温温度最好在醪液形成后的15分钟之内达到，更优选的则为10分钟之内，例如9、8、7、6、5、4、2或更优选1分钟之内达到，或者在形成醪液时达到初始温育温度则最佳。
适宜的初始温育温度是在至少70℃，优选至少71℃，更优选至少72℃，更优选至少73℃，或最优选至少74℃，例如至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃，例如至少82℃。本发明的糖化过程包括在至少70℃的初始温育温度下温育所述醪液，并将温度保持在至少70℃，优选指少71℃，更优选至少72℃，更优选至少73℃，或最优选至少74℃，例如至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃，至少82℃，至少83℃，至少84℃，或至少85℃，即在温育期间温度不得低于70℃。在温育期间，温度最好控制在100℃以下，例如99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、94℃、93℃、92℃和91℃以下，或者甚至90℃以下。
在温育期间温度宜恒定，或在温育第一部分基本恒温(初始温育温度)一段时间后，可以是缓慢逐渐升高温度，也可以在温育期间一次或多次阶梯式地增加。可选也可以在温育期间降低温度。一个实施方案是初始温育温度为至少70℃，然后在温育期间温度增长至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃，9℃，或优选至少10℃，更优选至少12℃，例如15℃。另一个实施方案是初始温育温度为至少75℃，或优选至少80℃，并且在温育期间温度降低至少5℃，或优选降低至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃，或优选降低至少10℃，或更优选降低至少15℃。一个具体实施方案中，所述温育包括将醪液保持在至少75℃，优选至少76℃，更优选至少77℃，甚至更优选78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃，或至少90℃的温度，持续至少1分钟，优选至少5分钟，更优选至少15分钟，甚至更优选至少20分钟，例如至少30分钟，至少40分钟，至少50分钟，至少60分钟，至少90分钟，或至少120分钟。另一具体实施方案是所述温育包括将醪液温度保持在至少75℃，优选至少76℃，更优选至少77℃，甚至更优选78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃，或至少90℃，持续至少总保温时间的1％，优选至少5％，更优选至少15％，更优选至少20％，或至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，例如总保温时间的100％。
温育时间至少为15分钟，一般在30分钟和2.5小时之间，例如至少45分钟，至少1小时，至少1.25小时，至少1.5小时，至少1.75小时，或者至少2小时。
除了大麦芽以外，所述谷物可优选包含辅料，例如未发芽的大麦或其它发芽的或未发芽的的谷物，如小麦、黑麦(rye)、燕麦(oat)、玉米(corn)、稻(rice)、买罗高梁(milo)、粟(millet)和/或高粱属(sorghum)，或未加工的和/或精制的淀粉和/或含糖的物质，所述含糖物质源于小麦(wheat)、黑麦(rye)、燕麦(oat)、玉米(corn)、稻(rice)、买罗高梁(milo)、粟(millet)、高梁属植物(sorghum)、马铃薯(potato)、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、木薯粉(tapioca)、西米(sago)、香蕉、糖用甜菜(sugar beet)和/或甘蔗(sugar cane)等。对于本发明，辅料可以来源于块茎、根、茎、叶、豆类(legume)、谷类(cereal)和/或整个谷物(whole grain)。添加到本发明醪液中的辅料的糊化温度等于或低于加工温度。如果在本发明的方法中使用辅料如稻或玉米，或其它有类似高糊化温度的辅料，它们优选分别煮熟，以保证在添加到本发明的醪液中时已经糊化。或者通过添加适当的酶可将糊化辅料淀粉和本发明的醪液分别糖化，来保证辅料在添加到本发明的醪液之前的糖化。在该方法中，酿造辅料所用的糊化和糖化方法是本领域众所周知的。辅料包含易于发酵的碳水化合物，如糖或糖浆，所述辅料可以在本发明的糖化过程前、中间或者之后添加到大麦芽醪液中去；但优选在糖化过程之后。在添加到本发明的醪液前，部分辅料最好用蛋白酶和/或β-葡聚糖酶处理。在糖化过程中，从谷物中提取的淀粉逐渐水解成为可发酵糖和较小的糊精。在提取麦芽汁之前，所述醪液的淀粉碘测试最好呈阴性。
通常，从醪液中获得麦芽汁包括从酒糟(即不可溶解的谷物和谷物的壳类物质形成部分)中过滤麦芽汁。可以使热水流经酒糟，冲洗掉或喷掉任何残留在谷物上的提取物。在本发明过程中应用的热稳定的纤维素酶可以有效的降低β-葡聚糖水平，促进麦芽汁的过滤，从而保证缩短循环时间和较高的提取回收率。优选提取回收率至少80％，优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，或最优选至少84％，例如至少85％，或至少86％。
在将外壳从谷物中包含的发芽的和/或未发芽谷类(grain)的谷物中除去的这个实施方案中，麦芽汁的分离可以包含离心步骤。
根据本发明的第二部分，由本发明第一部分所制备的麦芽汁可以用来发酵制造啤酒。麦芽汁的发酵包括向麦芽汁中加入含新鲜酵母的酵母浆，即在本发明没有使用过的酵母或是可再循环的酵母。所使用的酵母可以是任何适合于啤酒酿造的的酵母，尤其是从酵母属(Sacchromyces spp.)中所得的酵母，如酿酒酵母和葡萄汁酵母(S.uvarum)，包括这些有机体的天然或人工产生的变体。本领域的普通技术人员熟知制备啤酒时麦芽汁的发酵方法。
根据本发明的第三部分，为了制备啤酒，本发明第一部分的方法产生的麦芽汁可以在发酵之前与第二份麦芽汁混合。
根据本发明的第四部分，为了制备啤酒，本发明的第二部分或者第三部分的方法产生的啤酒可以与发酵的第二份麦芽汁混合。
在第三和第四部分中的第二份麦芽汁可以是本发明方法的产品，或者是常规方法的产品。一个优选实施方案中，所述第二份麦芽汁为在至少70℃的温度进行的糖化过程的产物。优选所述第二份麦芽汁从含至少10％，至少25％，至少50％，至少75％，或至少90％的未发芽大麦的谷物中制得的。优选所述第二份麦芽汁从没有添加蛋白酶的醪液中制备。优选所述第二份麦芽汁从添加β-葡聚糖酶和/或α-淀粉酶的醪液中制备。
在第二、三和四部分的方法中包括向发酵的麦芽汁中加入硅凝胶，以增加啤酒的胶体稳定性。该方法还包括向发酵的麦芽汁中加入硅藻土(kieselguhr)并过滤，以使啤酒色泽较亮。
在本发明的第二、三和四部分过程中制备的啤酒可以是任何类型的啤酒。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ales)、烈***儿啤酒(strong ales)、烈性啤酒(stouts)、英国黑啤(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦啤酒(bitters)、出口啤酒(export beers)、麦芽液(malt liquors)、发泡酒(happoushu)、高酒精度数啤酒(high-alcohol beer)、低酒精度数啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
本发明过程中所应用的标准化酶组合物以及高温具有减少重要的生异味化合物浓度的作用。相对于标准欧啤协糖化法(standard Congress mashingprocedure)所制备的麦芽汁或啤酒而言，优选所述麦芽汁和/或啤酒中DMS的浓度降低，例如相对于标准欧啤协糖化法所制备的麦芽汁或啤酒降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。相对于标准欧啤协法的糖化方法所制备的麦芽汁或啤酒水平而言，麦芽汁或啤酒中的T2N浓度也优选降低，例如下降至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
酶
本发明中所应用的酶的选择应根据它们在较高温度下，如在本发明方法的加工温度下，保持足够活性的稳定性，还应根据它们在醪液中适度酸性pH条件下保持足够活性的能力来选择，并且应添加有效量。酶可以来自任何来源，优选来自植物或藻类，更优选来源于微生物，例如细菌或真菌。
蛋白酶
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌类和细菌类蛋白酶。较佳的蛋白酶为酸性蛋白酶，即在PH值低于7的酸性条件具有水解蛋白质的能力的蛋白酶。
理想的酸性真菌类蛋白酶包括从曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)和SclerotiumandTorulopsis衍生的真菌蛋白酶。还涉及以下来自以下真菌的蛋白酶：黑曲霉(参见Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Jepan，28，216)、斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、盛泡曲霉(AspergillusAwamori)(Hayashida etal.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘胞曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)，或米曲霉(Aspergillus oryzae)，例如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
还涉及中性或者碱性蛋白酶，例如来自芽孢杆菌菌株的蛋白酶。本发明中的具体蛋白酶是从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中得到的，其序列可以由 Swissprot登录号P06832得到。还涉及这样的蛋白酶，其与 Swissprot登录号P06832的氨基酸序列有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性。
还涉及这样的蛋白酶，其与在丹麦专利申请PA 2001 01821和PA2002 00005中SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性。
还涉及木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(asclepain)，EC 3.4.22.14(actinidain)，EC 3.4.22.15(组织蛋白酶(cathepsin)L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶(glycyl endopeptidase))和EC3.4.22.30(caricain)。
蛋白酶可使醪液中的高分子量蛋白的总长减少成低分子量蛋白。低分子量蛋白是酵母营养的必需成分，而高分子量蛋白保证泡沫的稳定性。本领域的普通技术人员已知加入的蛋白酶必须是一个平衡的量，在保证酵母拥有充足的自由氨基酸的同时，保留足够的高分子量蛋白来稳定泡沫。加入的蛋白酶的量可以是0.1-1000AU/kg dm，更优选则为1-100AU/kg dm，最优选为5-25AU/kg dm。
纤维素酶(E.C.3.2.1.4)
纤维素酶可以来自微生物，例如来源于丝状真菌菌株(如曲霉属、木霉属、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium))。具体的纤维素酶包括从H.insolens得到的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶I)，其由WO 91/17244图14中的氨基酸序列定义，而43kD H.insolens内切葡聚糖酶在WO 91/17243中有所描述。
在本发明方法中使用的纤维素酶是内切葡聚糖酶，例如内切-l，4-β-葡聚糖酶。所述具体β-葡聚糖酶与丹麦专利申请PA2002 00130 SEQ ID NO：1中公开的氨基酸序列有着至少90％同源性，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性。
商业上可用的纤维酶制剂包括赛路克雷斯(CELLUCLAST)、纤维素酶(CELLUZYME)、赛沸路(CEREFLO)和ULTRAFLO(购自诺维信公司)，LAMINEXTM和SPEZYME CP(购自Genencor公司)，以及ROHAMENT7069W(购自德国Rhm公司)。
加入的β-葡聚糖酶的量可以是1.0-10000 BGU/kg dm，优选则为10-5000BGU/kg dm，优选50-1000BGU/kg dm，更优选100-500BGU/kg dm。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)
在本发明方法中所使用的具体α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶。尤其是与在 WO96/23874的SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有高度同源性的真菌α-淀粉酶，即有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％，甚至至少90％的同源性。加入的真菌α-淀粉酶的量可以是1-1000AFAU/kg DM，更优选的为2-500AFAU/kgDM，最优选的为20-100.AFAU/kg DM。
在本发明方法中使用的另一种α-淀粉酶可以是芽孢杆菌α-淀粉酶。熟知的芽孢杆菌α-淀粉酶包括从地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌菌株中得到的α-淀粉酶。其它的芽孢杆菌α-淀粉酶包括从芽孢杆菌NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375(所述菌株均详见 WO95/26397)的菌株中得到的α-淀粉酶，以及在Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research communications，151(1988)，25-31页中描述的α-淀粉酶。在本发明涉及的芽孢杆菌α-淀粉酶是在 WO99/19467第3页18行到第6页27行中定义的α-淀粉酶。优选α-淀粉酶具有的氨基酸序列与 WO99/19467的SEQ ID NO：4有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性。最优选的产麦芽糖α-淀粉酶变体包含在 WO99/43794中所公开的变体。所述变体和杂合体在 WO96/23874、 WO97/41213和 WO99/19467中描述。尤其涉及重组嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶变体，其具有突变I181*+G182*+N193F。可加入的芽孢杆菌α-淀粉酶的量宜为1.0-1000NU/kg dm，优选的为2.0-500NU/kg dm，优选为10-200NU/kg dm。
产麦芽糖α-淀粉酶
在本发明中所使用的一种具体的酶是产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(maltohydrolase))可以将支链淀粉和直链胶淀粉水解为α构型的麦芽糖。此外，产麦芽糖α-淀粉酶还能够水解麦芽三糖和环糊精。具体涉及的产麦芽糖α-淀粉酶来源于芽胞杆菌(Bacillus sp.)，优选来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)，更优选来源于如 EP 120.693中所描述的嗜热脂肪芽胞杆菌C599。这种具体的产麦芽糖α-淀粉酶的氨基酸序列如在 US 6,162,628中SEQ ID NO：1的氨基酸1-686所示。优选产麦芽糖α-淀粉酶的氨基酸序列与US 6,162,628中SEQ ID NO：1的氨基酸1-686有着至少90％的同源性，优选至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性。最优选的产麦芽糖α-淀粉酶变体包含 WO99/43794中公开的变体。
加入的产麦芽糖α-淀粉酶的量可以是0.1-1000MANU/kg dm，优选为1-100MANU/kg dm，优选为5-25MANU/kg dm。
β-淀粉酶
在本发明方法使用的另一种具体的酶是β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。
β-淀粉酶可以从各种植物和微生物中分离出来(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特点是最适宜的温度范围为40℃到65℃且最适宜的PH值范围为4.5到7.0。具体涉及的β-淀粉酶包括Genencor公司的SPEZYME BBA1500、SPEZYME DBA、OPTIMALTTM ME和OPTIMALTTM BBAβ-淀粉酶，和诺维信公司(Novozymes A/S)的β-淀粉酶NOVOZYMTM WBA。本领域技术人员知道β-淀粉酶的添加量宜为有效量。
其它酶
在本发明过程中进一步用到的另一具体酶是微生物或者植物来源的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。优选源自真菌或者细菌的葡糖淀粉酶，其选自以下酶：曲霉属葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或者其变体，如在WO92/00381和WO00/04136中所公开的；盛泡曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或者其变体或片段。
其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括用来增强耐热性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Engng.9，499-505)、D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8，575-582)、N182(Chen等(1994)，Bio-chem.J.301，275-281)、二硫键(disulfide bond)，A246C(Fierobe等(1996)，Bio-chem.J.，35，8698-8704；以及将Pro残基导入位置A435和S436(Li等(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括Talaromyces葡糖淀粉酶，尤其是从Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利Re. 32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(美国专利4,587,215)中衍生的葡糖淀粉酶。涉及的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，尤其是来自C.thermoamylolyticum(EP135,138)和热硫化氢热厌氧杆菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)中的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶包括从米曲霉中得到的葡糖淀粉酶，例如与在WO00/04136中的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有着至少90％、至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％的同源性的葡糖淀粉酶。还涉及商品AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300(来自Genencor公司)、AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900(来自Enzyme Bio-Systems公司)以及G-ZYMETM G990 ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。本领域的普通技术人员知道葡糖淀粉酶的添加量宜为有效量。
在方法中将会使用的另外一种酶是去分支酶(debranching enzyme)，例如异淀粉酶(isoamylase)(E.C.3.2.1.68)或普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶能水解支链淀粉和β-限制糊精(β-limit dextrin)中的α-1，6-D-葡萄糖苷分支连接，并其与普鲁兰酶相区分可以通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰，以及对α-限制糊精的限制性作用。本领域技术人员知道去分支酶的添加量宜为有效量。
材料和方法
酶
一种蛋白酶( EC 3.4.24.28)，其源于解淀粉芽孢杆菌，并具有Swissprot登录号P06832中公开的序列。
一种蛋白酶，它具有丹麦专利申请PA 2001 01821和PA 2002 00005的SEQ ID NO：2的氨基酸1-177所公开的氨基酸序列。
一种纤维素酶(E.C.3.2.1.4)，其为β-葡聚糖酶，并具有丹麦专利申请PA2002 00130中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
一种源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilus)的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，它具有WO99/19467的SEQ ID NO：4公开的氨基酸序列，并具有突变：I181*+G182*+N193F。
一种产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)，它具有专利申请WO 1016340中SEQ ID NO：1的氨基酸序列1-686。
大麦芽
所使用的大麦芽应具有如下特性。
对实施例1到5中所使用的大麦芽的分析
(Analytica-EBC方法)
                         修饰的修饰良好的麦
 麦芽 芽
湿度                ％提取物干重(extract dry)       ％糖化                分钟可溶N               ％库尔巴哈指数(kolbach Index)     ％糖化活性(diastatic activity)WKβ-葡聚糖           mg/l修饰(modification)     ％  4.181.9100.694032113598  4.482.74100.61373248298
方法
蛋白水解活性(AU)
蛋白水解活性可以用变性血红蛋白作为底物来确定。在Anson-Hemoglobin蛋白水解活性确定法中，变性血红蛋白被消化，未被消化的血红蛋白与三氯醋酸(TCA)一起沉淀。TCA可溶产物的量由苯酚试剂测定，该试剂在遇酪氨酸和色氨酸时变蓝。
一个安森单位(Anson Unit/AU)定义为在标准条件下(即25℃、PH值7.5以及10分钟的反应时间)以初始速率消化血红蛋白的酶的量，所述酶量使得每分钟释放的TCA可溶物质的量与苯酚试剂反应所产生的颜色与一个毫当量的酪氨酸相当。
诺和诺德公司(Novo Nodisk A/S，Denmark)已将该分析方法的细节描述收集于档案AF4/5中以便查阅。该档案包含在参考文件之列。
α-淀粉酶活性(NU)
淀粉分解的活性可以用马铃薯淀粉作为底物来确定。这种方法是基于酶对修饰后马铃薯淀粉的分解。在该反应之后，将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初，将会呈现一种带黑的蓝色，但是在淀粉分解过程中，蓝色会变浅，并逐渐变成红棕色，将该颜色与有色玻璃标准品比较。
1000Novo α-淀粉酶单位(KNU)相当于1000NU。1KNU是指在标准条件(即37℃+/-0.05，0.0003M Ca2+和PH值5.6)下糊化5.26克淀粉干物质Merk Amylum solubile的酶的量。
诺和诺德公司已将该分析方法的细节描述收集于档案AF9/6中以便查阅。该档案包含在参考文件之列。
产麦芽糖α-淀粉酶活力(MANU)
1个麦芽糖淀粉酶Novo单位(MANU)定义为标准条件下每分钟裂解1微摩尔的麦芽三糖所需要的酶的量。标准条件是10mg/ml麦芽三糖，37℃，pH值5.0以及30分钟的反应时间。通过NADH的生成，用葡萄糖脱氢酶(GlucDH，Merck)将所形成的葡萄糖修饰为葡糖酸内酯，其通过光度计在340nm测定。可从诺维信公司获得该分析法的细节(档案代号EAL-SM-0203.01)。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃、PH值4.3，每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
使用Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid试剂盒，通过随后改良的方法(档案代号AEL-SM-0131，可自诺维信公司获得)以AGU/ml为单位测定所述活性。标准品(Standard)：AMG-标准品(Standard)，批号7-1195，195AGU/ml。375微升底物(50mM乙酸钠中含有1％的麦芽糖，pH值4.3)在37℃保温5分钟。然后加入用乙酸钠稀释的25微升的酶。10分钟后通过加入100微升0.25M的NaOH来停止反应。将20微升反应物转移到96孔板，并加入200微升GOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。在室温30分钟之后，在650nm测定吸光率，并由AMG-标准品以AGU/ml为单位计算活性。有关该分析法(档案代号AEL-SM-0131)的详尽描述可自诺维信公司获得。
β-淀粉酶活(DP°)
SPEZYME BBA1500的活性用糖化力程度(Degree of Diastatic Power)(DP°)来表示。这是指在0.1ml 5％的样品酶制剂溶液中含有的酶量，所述酶可产生足够的还原型糖，其在当所述样品与100ml的底物在20℃保温1小时的情况下可还原5ml的菲令氏(Fehling)溶液。
β-葡聚糖酶活性(BGU)
溶细胞活性可以测定为β-葡聚糖酶单位(BGU)。β-葡聚糖酶与β-葡聚糖反应生成葡萄糖或者还原型碳水化合物(通过Somogyi-Nelson氏法确定为还原型糖)。1个β-葡聚糖酶单位(BGU)是指在标准条件下，释放的葡萄糖或还原型碳水化合物的还原能力相当于1μmol葡萄糖每分钟的酶量。标准条件是0.5％的β-葡聚糖作为底物，在pH值7.5、30℃，反应时间为30分钟。可向诺维信公司咨询该分析法(档案代号EB-SM-0070.02/01)的细节。
标准欧啤协糖化法(Standard Congress mashing process)
标准欧啤协糖化法依照EBC：4.5.1 Extract of Malt：Congress Mash中的步骤进行。温度范围为初始温育温度45℃、持续30分钟，然后以1.0℃/分钟的速度增加到70℃并持续25分钟，最后在70℃持续65分钟，总保温期为2个小时。
其它方法
粗产品、麦芽汁、啤酒等的分析方法可以在欧洲啤酒工业大会(EBC)分析委员会制定的《Analytica-EBC》标准(1998)(Analytica-EBC，Analysiscommittee of EBC，the European Brewing Convention(1998)，Verlag HansCarl Geranke-Fachverlag)中找到。就本发明而言，用于测定下列参数的方法如下：
柏拉图度折射计.
(Plato)：
可通化的氮：基于EBC：8.10，但使用TNBS(2，4，6三硝基苯磺酸)代替(水合)茚三酮作为试剂。TNBS在游离氨基或氨基酸和肽的溶液中发生化学反应，产生黄颜色的复合物，在340nm用分光光度计测定。
β-葡聚糖：EBC：8.13.2(麦芽汁中含有的高分子量β-葡聚糖：荧光测定法)。
颜色：EBC：4.7.2
修饰度：EBC：4.14，麦芽汁的修饰和均匀程度，钙剂法(calcoflour Method)
过滤性：滤出液体积(ml)测定：根据EBC：4.5.1(Extract ofMalt：Congress Mash)，8.2.小节进行。过滤：在有凹槽的、直径为320mm的滤纸过滤1小时后读出滤出液的体积。使用Schleicher and Schüll公司的No.597，Machery，Nagel and Co.，漏斗中，直径200mm，置于500ml的烧瓶中。
pH值：EBC：8.17(麦芽汁的pH值)。
库尔巴哈指数：EBC：4.9.1(麦芽汁中的可溶性氮：分光光度分析法)以及EBC：3.3.1(大麦中氮的总含量：凯氏(Kjeldahl)法(RM))。
T2N：利用质谱检测(GC-MS)进行气相色谱分析。
DMS(P)和基于Hysert，D.W等(1979)的方法：啤酒中硫酸二
DMS：甲酯的前体生化物质，J.ASBC 37/4，169-174和Mundy，A.P(1991)：用顶空气相色谱分析法测定啤酒中的硫酸二甲酯——日本酿酒协会协作调研97，45-46(Hysert，D.W etal(1979)：Dimethyl sulphide precursor in beer，J.ASBC37/4，169-174 and Mundy，A.P.(1991)：Thedetermination of Dimethyl Sulphide in Beer byHeadspace Gas Chromatography-a Collaborativeinvestigation of Precession.J.Inst.Brew.，97，45-46).
提取回收率：EBC：4.5.1(Extract of Malt：Congress Mash，Extract in dry)。术语麦芽汁提取回收率被定义为从谷物(麦芽和辅料)中提取的可溶性物质的总和(葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，麦芽三糖，糊精，蛋白质，胶质(gum)，无机物，其它物质)，表达为基于干物质的百分比。剩下的不可溶部分被定义为酒糟。
a ) E 1 = P ( M + 800 ) 100 - P
b ) E 2 = E 1 · 100 100 - M
其中
E1＝样品的提取物含量，以％的形式(m/m)表示
E2＝干谷物的提取物含量，以％的形式(m/m)表示
P＝麦芽汁中提取物的含量，以％柏拉图度(Plato)表示
M＝谷物的湿物质含量，以％的形式(m/m)表示
800＝在100克谷物的醪液中加入蒸馏水的量。
DMS及反式-2-壬烯醛的鉴定和定量
动态顶空技术(Dynamic headspace)作为一种分离方法使用，其中通过含有麦芽汁的玻璃烧瓶封闭***以及上方带弯管的清洁头(purge head)添加氮。按如下过程执行收集：在含200克麦芽汁的500ml烧瓶中加入1ml的4-甲基-1-戊醇(用作内部标准(IS))。将烧瓶放置在30℃的水浴中，并以大约210转/分钟进行电磁搅拌。使用流量计(flow-meter)(J & W ADM1000，J&Wscientific)来控制流过玻璃***氮。
根据挥发性的不同，用温和氮流以50ml/min持续15分钟来收集和鉴定DMS，用上述氮流以300ml/min持续60分钟的氮流来收集和鉴定t-2-n。DMS非常容易挥发，相对于t-2-n来说需要用低速的气流在短时间内收集。DMS和t-2-n的保留时间(retention time)分别为2.2-2.3分和23.5-23.8分。流动时间(flow time)和方法概述如下所列。
香味成分 麦芽汁(g)  流速(ml/分)  时间(分)  MS方法
二甲硫T2N 200         50           15      扫描模式200         300          60      扫描模式
分离和鉴定以氦作为运载气体，利用带有J&W Scientific DB-WAX柱(30m×0.25mm，0.25μm宽)的Hewlett-Packard，G1800A GCD操作***(GC-MS)进行。柱流速(column flow)是1ml/min，恒压为kPa，温度为53℃，分离喷射比率(split injection ratio)为1∶10。喷射器(injector)温度控制在250℃，温度图谱为：45℃持续10分钟，然后以6℃/min的速度增加到250℃，并持续10分钟。与GC设备相连的自动热解吸附装置(AutomatedThermal Desorper)Perkin Elmer ATD 400利用芳香成分从Tenax-GR弯管(traps)的解吸附。鉴定是基于从GC-MS收集所得质谱与G 1035 A Wiley PBM文库(Hewlett-Packard)中发现的质谱的比较进行的。检测器的质量范围为20-425mhz。
量化是按照已制备的二甲硫标准曲线和t-2-n标准曲线来进行的。DMS标准曲线包含0-150ppb的浓度，而t-2-n标准曲线包含0-5ppb的浓度。
醪液的制备
除非另作说明，糖化过程按下面步骤进行。醪液按照EBC：4.5.1，使用根据EBC：1.1的麦芽来制备。糖化试验在有盖子的500ml的容器中进行，每个容器中盛有含50克谷物的醪液，并用温预热到初始温育温度+1℃的水调节总重量为450±0.2g。在糖化过程中，将所述容器置于水浴中保温并搅拌。
实施例
实施例1
加入各种酶，所述酶即100NU芽孢杆菌α-淀粉酶和10MANU产麦芽糖α-淀粉酶每千克醪液干物质，以及根据表1的蛋白酶和β-葡聚糖酶，并且将所述容器在恒定80℃温育2个小时。表1中的结果是2次重复实验的平均值。
表1恒定80℃进行糖化2小时。蛋白酶和β-葡聚糖酶水平的效果。
212BGU/kg dmβ-葡聚糖酶112.5AU/kg dm蛋白酶 424mg/kg dmβ-葡聚糖酶125AU/kg dm蛋白酶 530BGU/kg dmβ-葡聚糖酶140AU/kg dm蛋白酶  636mg/kg dmβ-葡聚糖酶150AU/kg dm蛋白酶
柏拉图度(Plato)％提取回收率％pH库尔巴哈指数可同化N，％β-葡聚糖，mg/l 8.5879.535.94310.1432.1 8.3777.45.91310.1423.0 9.1585.345.84340.1421.6 9.2586.37N.a.350.1420.9
N.a.：未分析
实施例2
酶组成为每千克醪液的干物质12.5AU蛋白酶，212BGU β-葡聚糖酶，100NU芽孢杆菌α-淀粉酶和10MANU产麦芽糖α-淀粉酶。温度图谱为在初始温育温度70℃持续60分钟，接着以1.33℃/min的速度升高温度15分钟，最后停在90℃进行45分钟，总温育期为2个小时。表2中的结果为4次重复实验的平均值。
表2在70-90℃下浸渍糖化(infusion mashing)，温育期2小时
柏拉图度(Plato)％提取回收率％pH颜色库尔巴哈指数可同化N，％β-葡聚糖，mg/l     9.386.75.84.247.80.2＜20
实施例3
本发明的2种高温糖化法与没有添加其它酶的标准欧啤协糖化法的比较，上述两种方法的温育期分别为2个小时和1.5个小时，其中的酶组合包含每kg dm 212 BGUβ-葡聚糖酶、100NU芽孢杆菌α-淀粉酶、10MANU产麦芽糖α-淀粉酶和12.5AU蛋白酶。
分析生成的麦芽汁的提取回收率、可利用氮、颜色和β-葡聚糖含量(表3)，以及各种芳香化合物(表4)。所示数据是2次重复实验的平均值。
温度图谱为：
高温2个小时    在初始温育温度70℃持续60分钟，然后以
               1.33℃/min在15分钟内增加到90℃，最后在
               90℃持续45分钟，总温育期为2个小时。
高温1.5小时    在初始温育温度70℃持续40分钟，然后以
               1.33℃/min在15分钟内增加到90℃，最后在
               90℃持续35分钟，总温育期为1.5个小时。
表3本发明的高温糖化过程A和B与标准欧啤协糖化法C的比较，所述A和B利用上述酶组合在70-90℃分别进行2小时和1.5小时。
  高温2小时     高温1.5小时     标准欧啤协法2小时
提取回收率(％)库尔巴哈指数(％)可同化N(％)颜色β-葡聚糖，(mg/l)   84.244.50.193.5＜20     83.745.50.1 74.05＜20     82.6400.182.9152
表4与标准欧啤协糖化相比，本发明的两种方法制备的麦芽汁的香味分析结果，本发明的两种方法是利用上文中所述的酶组合在70-90℃进行的。
香味成分ppb  高温2小时 高温1.5小时 标准欧啤协法2小时
二甲硫(P)反式-2-壬烯醛2-甲基-丁醛己醛3-甲基-丁醇己醇 1550.203.542.11.05 1850.259.6103.21.55 3800.5020283111
实施例4
本发明高温糖化法中制备的麦芽汁和发酵麦芽汁与不添加酶的标准欧啤协糖化法所得的类似产品的比较，本发明采用1.75小时的温育期，以及含每kg dm 212BGU β-葡聚糖酶、100NU芽孢杆菌α-淀粉酶、10MANU产麦芽糖α-淀粉酶和12.5AU蛋白酶的酶组合。
温度图谱包括初始温育温度70℃持续40分钟，然后以1.33℃/分钟在15分钟内增加到90℃，最后在90℃持续35分钟，总温育期为1.75个小时。所示的数据是2次重复实验的平均值。
表5麦芽汁分析。本发明高温糖化法与标准欧啤协糖化法的对比，本发明的方法有上文所述温度图谱和酶组合。
  高温     标准欧啤协法
pH柏拉图度(Plato)％提取回收率％总氮％可同化N％淀粉反应(Windisch)颜色钙mg/l锌mg/lβ-葡聚糖mg/l反式-2-壬烯醛ppb   5.88.7080.80.780.16阴性4.41 81.17＜200.5     5.98.5983.00.710.16阴性3.5200.221302.0
用高温糖化法和欧啤协糖化法得到的麦芽汁将被转移到2升的试管中，加入2.5克酵母每升，并在14℃下发酵7天。在发酵的过程中，在第0、1、2、3、4和7天，取样品来测定柏拉图度、pH值和酵母生长情况。
发酵以后，取样品做反式-2-壬烯醛和DMS分析。
表6分析发酵中的麦芽汁。在0天加入酵母。
  柏拉图度％   pH值 酵母g/l
第0天  标准欧啤协法   8.6  5.45  2.95
第1天第3天第4天第7天 高温标准欧啤协法高温标准欧啤协法高温标准欧啤协法高温标准欧啤协法高温  8.86.956.851.451.601.301.601.401.65     5.254.604.604.104.004.104.004.154.10     3.107.206.7516.1015.2011.7010.503.902.70
表7已经发酵的麦芽汁的分析。
香味成分(ppb) 标准欧啤协法 高温法
反式-2-壬烯醛DMS   0.02539.0  0.01522.5
实施例五
本发明的数个高温糖化过程均在2升容器进行中，使用的谷物包含未发芽的大麦、修饰不完全的大麦芽(β-葡聚糖200mg/l)、修饰的大麦芽(β-葡聚糖135mg/l)，修饰良好的大麦芽(β-葡聚糖82mg/l)或不同比例的大麦芽和未发芽的大麦(谷物与水的比率为1∶8以上)。在表8中的数据是3次重复实验的平均值，而表9到12中的是2次重复实验的平均值。
表8在以下温度图谱进行糖化的结果：70℃持续40分钟，15分钟内增加到90℃，最后在90℃持续65分钟(总共2小时)。使用的酶是400BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢杆菌α-淀粉酶。
100％未发芽的大麦有酶  10％修饰的麦芽/90％未发芽的大麦有酶       无酶
柏拉图度％pH提取回收率％可滤性(ml)β-葡聚糖(mg/l)  8.256.2384.0345294   8.336.2384.3340224     7.626.3976.5902160
表9在以下温度图谱糖化的结果：75℃持续15分钟，15分钟内增加到90℃，最后在90℃持续30分钟(总共1小时)。使用的酶是400BGU/kg dmβ-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢杆菌α-淀粉酶。
100％修饰良好的麦芽 10％修饰良好的麦芽/90％大麦 100％修饰不完全的麦芽
柏拉图度％pH提取回收率％可滤性(ml)β-葡聚糖(mg/l) 有酶9.16.2684.832530  无酶8.96.3182.5305170  有酶8.16.4281.2320771   无酶7.46.4573.6551870  有酶9.06.2583.330531
表10在75℃持续1小时的温度图谱进行糖化的结果。使用的酶是400BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢杆菌α-淀粉酶。
100％修饰良好的麦芽 10％修饰良好的麦芽/90％大麦 100％修饰不完全的麦芽
柏拉图度％pH提取量％可滤性(ml)β-葡聚糖(mg/l)  有酶9.26.2186.133513  无酶9.16.2384.8325141 有酶8.36.3883.9315145  无酶7.66.4276.61251804 有酶9.16.1984.832019
表11在82℃持续1小时的温度图谱进行糖化的结果。使用的酶是333BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢杆菌α-淀粉酶，10MANU/kg dm产麦芽糖α-淀粉酶。
10％修饰良好的麦芽/90％大麦有酶 100％修饰良好的麦芽有酶       无酶   100％修饰不完全的麦芽有酶
柏拉图度％pH提取回收率％可滤性(ml)β-葡聚糖(mg/l)  8.06.2480.4225710  9.14.5384.833037     8.96.0682.8260112     9.06.0283.527554
实施例六
高度修饰不完全的麦芽用以下方法糖化：不添加酶的标准欧啤协法(表12)，添加酶的标准欧啤协糖化法(表13)，和添加酶的高温糖化法(表14)。表12标准欧啤协糖化(无添加酶)制备的高度未修饰麦芽的表征，n＝4。
品质参数 参考(无酶)
β-葡聚糖，mg/l平均OD，nm＝700平均柏拉图度提取物E2，干麦芽提取物，％(m/m)平均粘性(mPa*s，cP)  18580.0448.6582.171.83
表13加酶标准欧啤协糖化法制备的高度未修饰麦芽的结果概述。
 对照(无酶) β-葡聚糖酶α-淀粉酶蛋白酶5 α-淀粉酶木聚糖酶(1x std.剂量)6 α-淀粉酶木聚糖酶(2x std.剂量)7
β-葡聚糖1平均OD2提取物3平均粘性4  18500.04582.461.86  140.08088.161.56  17210.04283.831.73  18320.04183.591.71
1β-葡聚糖，mg/l n＝4；2700nm的平均OD，n＝2；3提取物E2，n＝4干麦芽中，％(m/m)；4平均粘性n＝8(mPa*s)；520mg EP1/kg dm，100KNU/kg dm，10AU/kg dm；6100KNU/kg dm，300FXU/kg dm；7100KNU/kg dm，600FXU/kg dm.
表14高度未修饰麦芽在70-90℃高温糖化1小时的结果概述。
   对照(无酶)   β-葡聚糖酶α-淀粉酶蛋白酶木聚糖酶   α-淀粉酶蛋白酶木聚糖酶   5x std.剂量的常规过滤酶(filtrationenzyme)
β-葡聚糖1平均OD2提取物3平均粘性4   28980.14681.026.99   1750.13784.961.39   10340.11985.641.52   18840.16582.881.74
1β-葡聚糖，mg/l n＝4；2700nm的平均OD n＝2；3提取物E2，n＝4干麦芽中，％(m/m)；4平均粘性n＝8(mPa*s)；522.5mg EP/kg dm，100KNU/kgdm，12.5AU/kg dm 300 FXU/kg dm；6100KNU/kg dm，12.5AU/kg dm，300 FXU/kg dm；75x std.剂量的UltrafloL(1000 ppm).
1(mg EP/kg dm)表示每千克干物质(dm)中纯酶蛋白的mg数。

Claims (27)

1.一种制备麦芽汁的方法，包括：
a)形成含5％到100％的大麦芽(谷物的w/w)的醪液；
b)在a)之前，期间或者之后添加纤维素酶(E.C.3.2.1.4)；
c)在a)的15分钟内达到至少70℃的初始温育温度；
d)c)之后，在至少70℃温育所述醪液一段时间，所述时间获得至少80％的提取物回收率；和，
e)将麦芽汁从酒糟中分离。
2.权利要求1的方法，其中进一步添加蛋白酶(E.C.3.4.)。
3.前述任一权利要求的方法，其中进一步添加α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
4.前述任一权利要求的方法，其中进一步添加麦芽糖生成酶。
5.一种制备啤酒的方法，包括获得权利要求1到4任一方法制备的麦芽汁，用酵母发酵上述麦芽汁，并得到啤酒。
6.一种制备啤酒的方法，包括获得权利要求1到4任一方法制备的麦芽汁，将所述麦芽汁与第二份麦芽汁混合，用酵母发酵所述混合麦芽汁，并得到啤酒。
7.一种制备啤酒的方法，包括取得权利要求1到4任一方法制备的麦芽汁，用酵母发酵所述麦芽汁，将经过发酵的麦芽汁与第二份经过发酵的麦芽汁混合，并得到啤酒。
8.前述任一权利要求的方法，其中权利要求1所述麦芽汁谷物中至少10％，或更优选至少15％.更优选至少25％，或最有选至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，或甚至100％(w/w)为大麦芽。
9.前述任一权利要求的方法，其中所述起始温育温度是在醪液形成后14分钟内达到，或更优选在13分钟内，例如在12，11，10，9，8，7，6，5，4，3或2分钟内达到，或者甚至更优选在1分钟之内达到，或最优选在所述醪液形成时达到。
10.前述任一权利要求的方法，其中所述起始温育温度是至少71℃，优选至少72℃，更优选至少73℃，甚至更优选至少74℃，或最优选至少75℃，例如至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃或至少82℃。
11.前述任一权利要求的方法，其中所述温度在温育过程中增加和/或降低至少1℃，2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，或优选降低10℃，或更优选降低12℃，例如至少15℃。
12.前述任一权利要求的方法，其中步骤d)的温育包括将醪液的温度在至少75℃，优选指少76℃，更优选至少77℃，甚至更优选至少78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，或至少90℃保持至少1分钟，优选至少5分钟，更优选至少15分钟，甚至更优选至少20分钟，例如至少30分钟，至少40分钟，至少50分钟，至少60分钟，至少90分钟或至少110分钟。
13.前述任一权利要求的方法，其中所述保温的时间在15分钟到2.5小时，例如至少30分钟，至少45分钟，至少1小时，至少1.25小时，至少1.5小时，至少1.75小时，或至少2小时。
14.前述任一权利要求的方法，其中所述温育期时间在15分钟到2.5小时，例如至少30分钟，至少45分钟，至少1小时，至少1.25小时，至少1.5小时，至少1.75小时或至少2小时。
15.权利要求5-14之一的方法，其中所述啤酒是爱儿啤酒、烈***儿啤酒、苦啤酒、浓烈黑啤酒、英国黑啤、陈贮啤酒、出口啤酒、麦芽液、大麦酒、发泡酒、高酒精度数啤酒、低酒精度数啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。
16.前述任一权利要求的方法，其中所述麦芽汁或啤酒与按照标准欧啤协糖化法制备的麦芽汁或者啤酒相比，二甲硫的含量降低，例如降低1％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
17.前述任一权利要求的方法，其中所述麦芽汁或啤酒与按照标准欧啤协糖化法制备的麦芽汁或者啤酒相比，所含的反式-2-壬烯醛的浓度减少，例如减少至少1％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
18.权利要求3-17之一的方法，其中所述α-淀粉酶来自芽孢杆菌。
19.权利要求3-18之一的方法，其中所述芽孢杆菌α-淀粉酶具有与WO99/19467中的SEQ ID NO：4具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性的氨基酸序列。
20.权利要求4-19之一的方法，其中所述麦芽糖生成酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或产麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
21.权利要求4-20之一的方法，其中所述麦芽糖α淀粉酶来自芽孢杆菌，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。
22.权利要求4-21之一的方法，其中所述麦芽糖α淀粉酶与US6,162,628中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
23.前述权利要求任一的方法，其中所述蛋白酶来自解淀粉芽孢杆菌，并与Swissprot登录号P06832的氨基酸序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
24.前述权利要求任一的方法，其中所述蛋白酶与丹麦专利申请PA2001 01821和PA 2002 00005中SEQ ID NO：2的氨基酸序列1-177所公开的序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
25.前述权利要求任一的方法，其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶，例如内切-1，4-β-葡聚糖酶，且所述纤维素酶与丹麦专利申请PA 2001 00130中SEQ ID NO：2的氨基酸序列1-177所公开的序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
26.权利要求1-25任一方法制备的麦芽汁。
27.权利要求5-25任一方法制备的啤酒。
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