CN1657618B - 肝相关的抑癌基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝相关的抑癌基因LFIRE-1。LFIRE-1在人肝脏中特异表达、在人肝癌中低表达或不表达，对肝癌细胞生长和成瘤有抑制作用。本发明还涉及人LFIRE-1多核苷酸和多肽的制法和用途，尤其是用于肝癌诊断和治疗。本发明还公开相应的检测试剂盒和药物组合物。

Description

肝相关的抑癌基因及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种肝相关的抑癌基因LFIRE-1及其用途。LFIRE-1在人肝脏中特异表达、在人肝癌中低表达或不表达，对肝癌细胞生长和成瘤有抑制作用。本发明还涉及人LFIRE-1多核苷酸和多肽的用途和制法。

背景技术

肿瘤细胞区别于正常细胞的最基本特征是细胞生长失控和分化受阻。这种细胞生长失控和分化受阻是由于多种遗传性缺陷积累的结果，这主要表现在两个方面：一是癌基因的激活或过度表达，阻止细胞分化，促进细胞生长；另一方面是肿瘤抑制基因的失活。在正常情况下，肿瘤抑制基因能够抑制细胞的恶性转化，对正常细胞的增殖起负调节作用；当肿瘤抑制基因失活后，正常细胞增殖失控，转化成肿瘤细胞。这两方面的研究为最终揭开细胞分化和癌变的机理，实现肿瘤的预防和有效的基因治疗，具有重大的理论和现实意义。

肿瘤发生中的负调节因子的概念可以追溯到很早的年代，最早的文献记载是1902年由德国的细胞生物学家Theodor Boveri提出，他当时认为癌的发生受到正调节因子和负调节因子的影响。

而现代肿瘤抑制基因的概念的提出始于20多年前，并推测在肿瘤的发生中，有肿瘤抑制基因的存在。但真正认识肿瘤抑制基因，则是从1986年分离克隆到人类第一个肿瘤抑制基因开始，并随着许多肿瘤抑制基因的分离和克隆以及功能的研究，现代肿瘤抑制基因的概念得以确立。

肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes)，又称抗癌基因(anti-oncogene)或癌抑制基因(onco-suppressor genes)，它是指一类可抑制细胞生长、增殖，诱导细胞凋亡，并有抑制癌变潜能的基因。当它失活时，同时由于癌基因的充分发挥其作用而导致细胞恶性转化。又因其功能上是隐性的，所以一般只在纯合状态下才发挥作用，故又称之为隐性癌基因(recessive oncogenes)。

就目前已分离的肿瘤抑制基因来看，有与DNA结合直接作用于基因转录的，如p53、WT1；有间接调节基因转录的，如Rb、APC、可能BRCA1；有在细胞周期中起激酶抑制因子作用的，如p16；有细胞结构成分的，如VHL；有在信号通路中发挥主要作用的，如NF1、TGFβ，以及起调节DNA修复和基因组稳定性作用的MSH、MLH、p53等。

1993年日本T.Yamamoto报告[B.B.R.C.193(2)681-687]从一例肝癌分离到HFREP-1cDNA。HFREP-1cDNA 1231bp，编码312氨基酸的蛋白。Yamamoto仅仅比较了这一例临床肝癌标本，Northern杂交结果HFREP-1基因在这一肝癌中表达，而在癌旁肝组织中不表达。此外，Yamamoto在讨论中叙述“发现在高比例数的肝癌中有HFREP-1高表达”(在文中没有提供具体图和数据)。据此，Yamamoto认为HFREP-1是原癌基因。

研究已表明，抑癌基因及其编码蛋白与一些疾病相关，例如多种恶性肿瘤。因此，为治疗目的研究和开发人的抑癌基因及其编码蛋白有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的抑癌基因LFIRE-1蛋白、多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的LFIRE-1蛋白多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(i)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；(ii)由(i)的蛋白发生一个或多个(较佳地1-10个)氨基酸的置换、缺失或***而形成的且具有抑癌功能的蛋白。更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述人LFIRE-1蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸在5’端还含有SEQ ID NO：1中第67-127位所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的多核苷酸多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-1282位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中67-1080位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中145-1080位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种人LFIRE-1多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明上述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人LFIRE-1多肽。

在本发明的第五方面，提供了一种与本发明人LFIRE-1蛋白特异性结合的抗体，所述的LFIRE-1多肽选自下组：

(i)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；

(ii)由(i)的蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或***而形成的且具有抑癌功能的蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的LFIRE-1多肽或其编码序列以及药学上可接受的载体。

在本发明的第七方面，提供了一种检测肝细胞是否发生癌变的试剂盒，它包括特异性扩增LFIRE-1的引物对，或与人LFIRE-1蛋白特异性结合的抗体。

在另一优选例中，所述的引物对扩增出的扩增产物含有SEQ ID NO：1中第67-127位中15-61个连续核苷酸。

在本发明的第八方面，提供了一种体外检测肝细胞是否发生癌变或对个体的肝癌易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的LFIRE-1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的LFIRE-1基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患肝癌的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，检测的是LFIRE-1的基因或转录本，并与正常LFIRE-1核苷酸序列比较差异。更佳地，所述的差异是以下的突变：

第391位T→G；

第267和268位之间***了一个T；

第553位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于8EQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的差异是不表达LFIRE-1蛋白或LFIRE-1蛋白表达水平低于正常水平。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了LFIRE-1cDNA序列，其中下划线为外显子1。

图2显示了LFIRE-1蛋白的氨基酸序列。

图3显示了LFIRE-1基因在人多种组织中的表达分析(Norhern杂交)显示LFIRE-1在人肝脏中特异表达

图4显示了LFIRE-1基因在人肝癌与癌旁肝组织(A)和培养人肝癌细胞株(B)中的表达分析(Northern杂交)。结果显示LFIRE-1基因在多数肝癌组织和癌细胞株中低表达或不表达。

图5显示了LFIRE-1基因在人肝癌与癌旁肝组织(A)和培养人肝癌细胞株(B)中的表达分析(RT-PCR)。结果显示LFIRE-1基因在多数肝癌组织和癌细胞株中低表达或不表达。

图6显示了LFIRE-1基因在人肝癌与癌旁肝组织(A)和培养人肝癌细胞株(B)中的表达分析(Western免疫印迹)。结果显示LFIRE-1基因在多数肝癌组织和癌细胞株中低表达或不表达。

图7显示了LFIRE-1基因在人肝癌和癌旁肝组织中表达的免疫组化检测结果。其中，

A为正常肝，放大倍数×100；

B为癌旁肝组织(N)和高分化肝癌(WD)，放大倍数×100；

C为癌旁肝组织(N)和中等分化肝癌(MD)，放大倍数×100；

D为癌旁肝组织(N)和低分化肝癌(PD)，放大倍数×100；

右上角分别为正常肝和WD，MD，PD的高倍放大图，放大倍数×400；

结果显示，LFIRE-1基因在肝癌组织中的表达比正常肝和癌旁肝组织下降，且与癌的细胞分化程度有关。

图8显示了临床肝癌DNA中LFIRE-1基因突变情况。其中，

第7病例(Case No.7)：第83密码子T突变为G，导致氨基酸C突变为G(C83G)；

第46病例(CaseNo.46)：第42密码子***碱基T，导致读框的移码，产生剪短58个氨基酸的产物；

第53病例(Case No.53)：第137密码子T突变为C，导致氨基酸W突变为R(W137R)。

图9显示了LFIRE-1基因转杂和重表达抑制肝癌细胞的生长和成瘤性。

其中，a人肝癌细胞BEL-7402不表达LFIRE-1(V)。转染野生型LFIRE-1重组表达载体后的阳性克隆(L1、L2、L3)表达LFIRE-1。转染C83G突变和W137R突变LFIRE-1重组表达载体的阳性克隆C1、C2和W1、W2，表达LFIRE-1。

b转染野生型LFIRE-1重组表达载体的L1、L2、L3克隆细胞生长速度明显低于亲本BEL-7402细胞和C1、C2、W1、W2细胞。

c转染野生型LFIRE-1重组表达载体的L1、L2、L3克隆细胞在软琼脂中形成很少集落，亲本BEL-7402细胞和C1、C2、W1、W2细胞形成大量细胞集落。

d转染野生型LFIRE-1重组表达载体的L1、L2、L3克隆细胞在裸鼠体内成瘤能力被明显抑制，亲本BEL-7402细胞和C1、C2、W1、W2细胞在裸鼠体内不同程度形成巨大的移植性肿瘤。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次证实了一种新的肝相关的抑癌基因LFIRE-1。实验表明，LFIRE-1不仅在肝癌组织中因表达下降或发生突变而活性下降，而且LFIRE-1可以逆转癌变过程，因此是一种有效的抑癌基因。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“LFIRE-1蛋白”、“LFIRE-1多肽”或“本发明的抑癌蛋白”可互换使用，都指具有人LFIRE-1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的LFIRE-1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的LFIRE-1蛋白或多肽”是指LFIRE-1蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LFIRE-1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人LFIRE-1蛋白的片段、衍生物和类似物.如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人LFIRE-1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽.本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列).根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围.

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区(145-1080位)序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码LFIRE-1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码LFIRE-1蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因.这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定LFIRE-1蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物.上述方法可单用，也可多种方法联合应用.

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测LFIRE-1蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或LFIRE-1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的LFIRE-1蛋白多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人LFIRE-1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人LFIRE-1蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee andNathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人LFIRE-1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989).所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成.这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人LFIRE-1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗LFIRE-1蛋白功能低下或丧失所致的疾病如肝癌，和用于筛选促进或对抗LFIRE-1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人LFIRE-1蛋白的功能。用表达的重组人LFIRE-1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人LFIRE-1蛋白功能的多肽分子。

本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人LFIRE-1蛋白的药剂的方法.例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人LFIRE-1蛋白的膜制剂与标记的人LFIRE-1蛋白一起培养.然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力.

人LFIRE-1蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。

在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将LFIRE-1蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响LFIRE-1蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如肝癌。本发明的多肽还可以用于其他肝病的治疗，包括肝硬化、肝损伤、肝再生、肝炎等。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。这些抗体可以用于对肝癌和其他肝病的诊断和治疗。

可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。LFIRE-1蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的LFIRE-1蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

人LFIRE-1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于LFIRE-1蛋白的无表达或异常/无活性的LFIRE-1蛋白的表达所致的细胞增殖、分化发育，代谢异常或癌变。重组的基因治疗载体可用于治疗LFIRE-1蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将LFIRE-1蛋白基因转移至细胞内。构建携带LFIRE-1蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人LFIRE-1蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还提供了针对人LFIRE-1蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

抗人LFIRE-1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人LFIRE-1蛋白。

多克隆抗体的生产可用人LFIRE-1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

人LFIRE-1蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人LFIRE-1蛋白的单链抗体。

能与人LFIRE-1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人LFIRE-1蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人LFIRE-1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人LFIRE-1蛋白水平，可以用作解释人LFIRE-1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断LFIRE-1蛋白起作用的疾病。

LFIRE-1蛋白的多聚核苷酸可用于LFIRE-1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，LFIRE-1蛋白的多聚核苷酸可用于检测LFIRE-1蛋白的表达与否或在疾病状态下LFIRE-1蛋白的异常表达。如LFIRE-1蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断LFIRE-1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用LFIRE-1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测LFIRE-1蛋白的转录产物。

检测LFIRE-1蛋白基因的突变也可用于诊断LFIRE-1蛋白相关的疾病。LFIRE-1蛋白突变的形式包括与正常野生型LFIRE-1蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从正常肝组织的cDNA文库中分离出的。它包含的多核苷酸序列全长为1282个碱基，其开放读框位于145-1080位，编码312个氨基酸的人LFIRE-1蛋白(SEQ ID NO：2)，分子量为34Kd。一系列实验证明；LFIRE-1具有以下特性：①在正常肝细胞中表达，在肝癌细胞中不表达或低表达；②在正常肝细胞中基因结构正常，在部分肝癌细胞中基因有缺失、突变；③将正常的LFIRE-1导入肝癌细胞，可以使肝癌细胞恶性表型部分逆转。因此，LFIRE-1基因是肝细胞的一种抑癌基因。

LFIRE-1基因具有重要生物学意义和应用价值，其中包括(但并不限于)：①LFIRE-1基因的正常功能可维持肝细胞的正常生物学特性；②LFIRE-1基因的缺失，突变造成的LFIRE-1基因功能丢失或缺陷将导致肝细胞的恶性转化和癌细胞生物学特性；③LFIRE-1基因的结构与功能是肝癌发生、发展和肝癌生物学特性的鉴定标志；④LFIRE-1基因在肝癌诊断中具重要价值；⑤LFIRE-1基因在肝癌治疗中具有重要价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.LFIRE-1cDNA克隆

在人正常肝组织和肝癌组织mRNA差异显示分析中，发现的一个在正常肝组织中表达而在肝癌中不表达的cDNA片段，回收此cDNA片段，作探针筛选人肝cDNA库(购自BRL公司)，得到阳性克隆，用USB公司的测序试剂盒，以SP6和T7引物作双脱氧链末端终止法测序。通过对cDNA的核苷酸序列和开放阅读框氨基酸序列分析，表明已克隆到一个全长cDNA，命名为LFIRE-1。

LFIRE-1基因cDNA序列(SEQ ID NO：1)和编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)如图1和2所示，cDNA全长1282bp，包含开放阅读框为第145-1080位，共936bp，编码312氨基酸。LFIRE-1蛋白的N端含有一个潜在的25个氨基酸的信号肽序列。LFIRE-1蛋白的C端含有血纤蛋白原(Fibrinogen)β和γ链C端的特征结构域的氨基酸序列。

另外，与HFREP-1相比，本发明LFIRE-1的cDNA序列在5’端的第一外显子的结构明显不同。

实施例2用RT-PCR方法克隆人LFIRE-1编码序列

用肝细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagen的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增：正向引物F15’-cccacgcgtccgagaagtca-3’(SEQ ID NO：3)，；反向引物R1：5’-aacacagtct acatttattt-3’(SEQ ID NO：4)。扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/LKCl，10mmol/L Tris-HCl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，25pmol引物，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PE9600型DNA热循环仪上按下列条件反应25个周期：94℃30秒；55℃，30秒；72℃2分钟。在RT-PCR时同时设β-肌动蛋白为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物QIAGEN试剂盒纯化后，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen)，并测定DNA序列。结果PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1的1-1282bp完全相同。

实施例3LFIRE-1细菌中表达、纯化

用实施例2中获得的PCR产物为模板，用上游引物5’-GCGGATCCGCAAAGGTGTTCAGTTTC-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-GCGCAAGCTTAAATTACATTTGGAAT-3’(SEQ ID NO：6)经PCR，产物克隆到pGEX-5X-2载体中，经IPTG诱导表达产生LF1RE-1-GST融合蛋白。表达蛋白样品上Glutathione-Sepharose 4B)柱(Amersham)纯化，用15％SDS-PAGE电泳鉴定。

结果表明，LF1RE-1-GST融合蛋白的分子量约为60Kda，与预计值相符。将纯化的LFIRE-1-GST融合蛋白存于-70℃备用。

实施例4抗LFIRE-1单抗制备

将实施例3中制备的纯化的LFIRE-1-GST蛋白20μg与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)混合，免疫6-8周令Balb/c 2鼠，第三周后用30μg抗原和弗氏不完全佐剂(Sigma)混合加强免疫，共三次，最后用10μg抗原，尾静脉注射加强免疫，三天后取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合。在HAT选择性培基中37℃，5％CO₂培养箱中培养筛选阳性克隆，再经有限稀释法进行亚克隆，挑选连续三次阳性的单克隆进行扩大培养。

培养的单克隆杂交瘤细胞5×10⁵/0.2ml腹腔注射Balb/c小鼠，7-9天后获取腹水，用重组G蛋白琼脂糖柱(购自L1FE TECHNOLOGIES公司)纯化，获得单抗。

实施例5抗LFIRE-1多抗制备

将实施例3中制备的纯化的LFIRE-1-GST 2mg和等体积弗氏完全佐剂(Sigma)混合，皮下多点注射免疫新西兰兔，四周后加强免疫一次.然后，每两周加强免疫一次，共三次.末次免疫后一周获取免血清，用重组G蛋白琼脂糖柱(购自L1FE TECHNOLOGIES公司)纯化，获得多抗。

实施例6LFIRE-1在人组织中的表达

将用常规方法制备的正常人多种组织(脑、结肠、心、肾、肝、肺、骨髓肌、胎盘、小肠、脾、胃、睾丸)PolyA⁺RNA各2μg，在甲醛变性agarose凝胶中分离，转移至硝酸纤维素薄膜上，与³²P标记的LFIRE-1cDNA探针(对应于SEQ IDNO：1中67-127位)杂交，经X光片曝光显影。

结果如图3所示，表明LFIRE-1基因在人肝脏中特异表达。

实施例7LFIRE-1在临床肝癌与癌旁肝组织和肝癌细胞株中表达改变(Northern杂交)

取临床手术切除肝癌与癌旁肝组织和培养的肝癌细胞株细胞，用常规方法分别制备总RNA。将RNA各20μg在甲醛变性anarose凝胶中分离，转移至硝酸纤维素薄膜上，与³²p标记的LFIRE-1cDNA探针(对应于SEQ ID NO：1中67-127位)杂交，经X光片曝光和显影。

结果如图4a和4b所示，LFIRE-1基因在肝癌组织中的表达明显低于相应的癌旁肝组织(图4a)，有58.3％的病人(28/48)存在LFIRE-1表达下调。此外，LFIRE-1基因在肝癌细胞株HepG2，Hep31B中有表达，在BEL-7402，BEL-7404，QGY-7703，Huh-7，SMMC-7721中不表达(图4b)。

实施例8LFIRE-1在临床肝部与癌旁肝组织和肝癌细胞株中表达改变(RT-PCR)

取临床手术切除肝癌与癌旁肝组织和培养肝癌细胞株细胞，用常规方法分别制备总RNA。将2μg总RNA分别用M-MLV反转录酶和随机引物(LifeTechnologies)制备cDNA，然后用LFIRE-1特异上游引物5’-AGTCTGCTTCTGCTACTTGG-3’(SEQ ID NO：7)，下游引物5’-ACTGGACTTCATTCTCCTGC-3’(SEQ ID NO：8)作PCR扩增。PCR产物用agarose电泳分离，EB显色。

结果如图5a和5b所示，LFIRE-1基因在肝癌组织中的表达明显低于相应的癌旁肝组织(图5a)；LFIRE-1基因在肝癌细胞株HepG2，Hep3B中有表达，在BEL-7402，BEL-7404，QGY-7703，Huh-7，SMMC-7721中不表达(图5b)。

实施例9LFIRE-1在临床肝癌与癌旁肝组织和肝癌细胞株中表达改变(WesTern免疫印迹)

将临床手术切除肝癌与癌旁组织在冰冷生理盐水中剪成碎块，洗去血水。后用细胞裂介液(50mm HEPES，PH 7.5，150mm NaCl，1mm EDTA，1μg/ml aprotinin，0.5mmPMSF，10％甘油，1％Triton X-100)在玻璃匀浆器中磨成匀浆。培养肝癌细胞株细胞用生理盐水洗后，加细胞裂介液，轻轻摇动制成细胞裂介匀浆。细胞匀浆10,000转/分离心15分钟后，上清液用15％SDS-PAGE分离后电转移到PVDF膜(Amersham公司)，用实施例4或5制备的抗LFIRE-1抗体，作免疫印迹检测，用ECL法显示。

结果如图6a和6b所示。LFIRE-1蛋白产物在肝癌组织中明显低于相应的癌旁组织(图6a)；LFIRE-1蛋白在肝癌细胞株HepG2，Hep3B中有表达，在BEL-7402，BEL-7404，QGY-7703，Huh-7，SMMC-7721中不表达(图7b)。

实施例10LFIRE-1在临床肝癌与癌旁肝组织中表达的免疫组织化学检测

临床手术切除肝癌与其癌旁组织标本在10％中性福乐马林中固定，酒精逐级脱水，包埋在石蜡中，蜡块中的标本切片(4-6um)，经微波处理5’以复苏抗原，标本子室温在3％H₂O₂-甲醇溶液中处理12’以封闭内源性过氧化物酶活性，再加10％羊血清处理以降低非特异性反应。然后标本和抗LFIRE-1抗体，生物素标记羊抗免IgG和链亲和素-生物素复合物反应，用3，3’-diaminobenidinetetiahydrochloride，H₂O₂，50mmTris.HCl(pH 7.4)显色，在光学显微镜下观察，照相。

结果如图7A-D所示，显示癌旁肝组织呈强阳性LFIRE-1蛋白染色，而相应同一组织块的肝癌部分LFIRE-1蛋白染色明显降低，且与肝癌的分化状态密切相关，即分化越低(PD)，LFIRE-1蛋白染色越低。

实施例11LFIRE-1基因在人肝癌中的实变分析

采用PCR-SSCP方法检测人肝癌DNA中LFIRE-1基因的突变。常规分离临床DNA为模板，用LFIRE-1基因8个外显子特异的引物：

外显子	引物序列	SEQ ID NO：
			1αF	5′-CTTCTCTTTTAGCTTTCTTTCAG-3′	9
1αR	5′-ATTAGCATTATTACAAGCATGTC-3′	10
			1βF	5′-GACATGCTTGTAATAATGCTAAT-3′，	11
1βR	5′-AGCTTTAGAATAATTCCTGAGAA-3′	12
			2F	5′-GGCTGCATCCGACTTCCTG-3′，	13
2R	5′-GGCCTCCCCTGCAAAAATGT-3′	14
			3F	5′-CGCTCGAGGACTGTGCCC-3′，	15
3R	5′-CATACTGCCTCTTGCTTCCA-3′	16
			4F	5′-GGGGGAGACAAAGACACATAAT-3′，	17
4R	5′-GTCTAATTAATAGGCTTCAGGA-3′	18
			5F	5′-TTTGCTCTAATCGGCTTCCACTT-3′，	19
5R	5′-TTTAGGCAGCCACATTTTACATTT-3′	20

外显子	引物序列	SEQ ID NO：
			6F	5′-AACCGCAGTAGTCCGTGTCAT-3′，	21
6R	5′-TCTGCTGTCAGTGGAGTTCCT-3′	22
			7F	5′-CACTGACAGCAGAAATGCCC-3′，	23
7R	5′-CATCAACTCCATTACAACTATG-3′	24
			8F	5′-TTCCAGTCTGATTGTTGTTTTCTT-3′，	25
8R	5′-ATGATTGCGCATGGATATGTTC-3′	26

PCR在25μl反应液中进行(含100μgDNA)，95℃，5分钟，后94℃，1分钟，55-62℃，1分钟，72℃，10分钟。PCR产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，回收异常产物带，再扩增、纯化，后作序列分析。

结果如图8所示，显示三例肝癌DNA中存在LFIRE-1基因突变。分别是SEQID NO：1第391位T→G(造成氨基酸C→G)；第267和268位之间***了一个T(造成移码突变，并导致翻译的蛋白质少了55个氨基酸)；和第553位T→C(造成氨基酸W→R)。

实施例12LFIRE-1重组表达质粒转染肝癌细胞抑制肝癌细胞生长和成瘤活性

LFIRE-1cDNA***市售的pCDNA3载体中，制备重组表达质粒pCDNA3-LFIRE-1，转染不表达LFIRE-1的肝癌细胞株BEL-7402，在G418(400μg/ml)培液中筛选三周，挑出抗性克隆细胞，扩增培养，获转染LFIRE-1基因表达质粒的单克隆细胞L1、L2、L3。转染细胞和亲本BEL-7402细胞制备细胞裂介液进行Western免疫印迹分析(方法同实施例9)。

结果如下：

转染LFIRE-1基因表达质粒后的L1、L2、L3克隆细胞表达LFIRE-1蛋白(图9a)。

转染细胞和亲本BEL-7402细胞在体外培养下生长速率不同，L1、L2、L3克隆细胞生长速率明显低于BEL-7402细胞(图9b)。

转染细胞和亲本BEL-7402细胞在软琼脂中贴壁不依赖性生长活力不同，L1、L2、L3克隆细胞在软琼脂中不能或很少形成集落(图9c)。

转染细胞和亲本BEL-7402细胞接种裸鼠BALB/C nu/nu体内，肿瘤形成率明显不同，L1、L2、L3克隆细胞在裸鼠皮下生长缓慢，只能触及很小的结节，而是亲本细胞在裸鼠皮下生长成巨大肿瘤(图9d)。

突变型LFIRE-1cDNA采用同样方法在pCDNA3载体中扩建成表达载体，转染BEL-7402细胞，经筛选获得LFIRE-1C83G突变转染细胞克隆C1和C2和LFIRE-1W137R突变转染细胞克隆W1、W2。

结果显示突变LFIRE-1基因转染细胞，虽然表达LFIRE-1产物，但失去野生型LFIRE-1抑制肝癌细胞生长的活性。

实施例13

肝癌易感性检测试剂盒

如上所述，LFIRE-1的表达下调或突变与肝癌密切相关。因此，可基于LFIRE-1基因设计LFIRE-1基因特异性引物，以病人血液、活检肝组织等的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将肝癌检测试剂盒中的PCR引物稀释到1umol/ul，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行定量PCR反应和检测。或者PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM 377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读。

检测结果，LFIRE-1表达下调的检测对象的肝癌易感性明显高于正常人群。

实施例14

含LFIRE-1的药物组合物

制备一种LFIRE-1的药物组合物，配方如下：

每单元口服剂：10毫克LFIRE-1蛋白，50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>肝相关的抑癌基因及用途

<130>000275

<160>26

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1282

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

cccacgcgtc cgagaagtca ggttgactag caaggagtct gcttctgcta cttggagaag    60

agatttagaa ttatgtatct tttgttacag atatacagat atacaaatat acagatatac   120

aaataagttt tttcaagggg gaacatggca aaggtgttca gtttcatcct tgttaccacc   180

gctctgataa tgggcaggga aatttcggcg ctcgaggact gtgcccagga gcagatgcgg   240

ctcagagccc aggtgcgcct gcttgagacc cgggtcaaac agcaacaggt caagatcaag   300

cagcttttgc aggagaatga agtccagttc cttgataaag gagatgagaa tactgtcgtt   360

gatcttggaa gcaagaggca gtatgcagat tgttcagaga ttttcaatga tgggtataag   420

ctcagtggat tttacaaaat caaacctctc cagagcccag cagaattttc tgtttattgt   480

gacatgtccg atggaggagg atggactgta attcagagac gatctgatgg cagtgaaaac   540

tttaacagag gatggaaaga ctatgaaaat ggctttggaa attttgtcca aaaacatggt   600

gaatattggc tgggcaataa aaatcttcac ttcttgacca ctcaagaaga ctacacttta   660

aaaatcgacc ttgcagattt tgaaaaaaat agccgttatg cacaatataa gaatttcaaa   720

gttggagatg aaaagaattt ctacgagttg aatattgggg aatattctgg aacagctgga   780

gattcccttg cggggaattt tcatcctgag gtgcagtggt gggctagtca ccaaagaatg   840

aaattcagca cgtgggacag agatcatgac aactatgaag ggaactgcgc agaagaagat   900

cagtctggct ggtggtttaa caggtgtcac tctgcaaacc tgaatggtgt atactacagc   960

ggcccctaca cggctaaaac agacaatggg attgtctggt acacctggca tgggtggtgg  1020

tattctctga aatctgtggt tatgaaaatt aggccaaatg attttattcc aaatgtaatt  1080

taattgctgc tgttgggctt tcgtttctgc aattcagctt tgtttaaagt gatttgaaaa  1140

atactcattc tgaacatatc catgcgcaat catgataact gttgtgagta gtgcttttca  1200

ttcttctcac ttgcctttgt tacttaatgt gctttcagta cagcagatat gcaatattca  1260

ccaaataaat gtagactgtg tt                                           1282

<210>2

<211>312

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ala Lys Val Phe Ser Phe Ile Leu Val Thr Thr Ala Leu Ile Met

1               5                   10                  15

Gly Arg Glu Ile Ser Ala Leu Glu Asp Cys Ala Gln Glu Gln Met Arg

            20                  25                  30

Leu Arg Ala Gln Val Arg Leu Leu Glu Thr Arg Val Lys Gln Gln Gln

        35                  40                  45

Val Lys Ile Lys Gln Leu Leu Gln Glu Asn Glu Val Gln Phe Leu Asp

    50                  55                  60

Lys Gly Asp Glu Asn Thr Val Val Asp Leu Gly Ser Lys Arg Gln Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Asp Cys Ser Glu Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Phe

                85                  90                  95

Tyr Lys Ile Lys Pro Leu Gln Ser Pro Ala Glu Phe Ser Val Tyr Cys

            100                 105                 110

Asp Met Ser Asp Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Ser Asp

        115                 120                 125

Gly Ser Glu Asn Phe Asn Arg Gly Trp Lys Asp Tyr Glu Asn Gly Phe

    130                 135                 140

Gly Asn Phe Val Gln Lys His Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Lys Asn

145                 150                 155                 160

Leu His Phe Leu Thr Thr Gln Glu Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Leu

                165                 170                 175

Ala Asp Phe Glu Lys Asn Ser Arg Tyr Ala Gln Tyr Lys Asn Phe Lys

            180                 185                 190

Val Gly Asp Glu Lys Asn Phe Tyr Glu Leu Asn Ile Gly Glu Tyr Ser

        195                 200                 205

Gly Thr Ala Gly Asp Ser Leu Ala Gly Asn Phe His Pro Glu Val Gln

    210                 215                 220

Trp Trp Ala Ser His Gln Arg Met Lys Phe Ser Thr Trp Asp Arg Asp

225                 230                 235                 240

His Asp Asn Tyr Glu Gly Asn Cys Ala Glu Glu Asp Gln Ser Gly Trp

                245                 250                 255

Trp Phe Asn Arg Cys His Ser Ala Asn Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Ser

            260                 265                 270

Gly Pro Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Asn Gly Ile Val Trp Tyr Thr Trp

        275                 280                 285

His Gly Trp Trp Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val Met Lys Ile Arg Pro

    290                 295                 300

Asn Asp Phe Ile Pro Asn Val Ile

305                 310

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

cccacgcgtc cgagaagtca                                        20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

aacacagtct acatttattt                                        20

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>5

gcggatccgc aaaggtgttc agtttc                   26

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

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gcgcaagctt aaattacatt tggaat                   26

<210>7

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<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

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<210>9

<211>23

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<210>10

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<212>DNA

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attagcatta ttacaagcat gtc                      23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

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<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

<400>12

agctttagaa taattcctga gaa                      23

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

ggctgcatcc gacttcctg                           19

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

ggcctcccct gcaaaaatgt                          20

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

cgctcgagga ctgtgccc                          18

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

catactgcct cttgcttcca                        20

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

gggggagaca aagacacata at                     22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

gtctaattaa taggcttcag ga                     22

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

tttgctctaa tcggcttcca ctt                       23

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

tttaggcagc cacattttac attt                      24

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

aaccgcagta gtccgtgtca t                         21

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

tctgctgtca gtggagttcc t                         21

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

cactgacagc agaaatgccc                           20

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

catcaactcc attacaacta tg                          22

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>25

ttccagtctg attgttgttt tctt                        24

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>26

atgattgcgc atggatatgt tc                          22

Claims (4)

1.一种LFIRE-1多肽或LFIRE-1编码序列的用途，其特征在于，用于制备检测肝癌分化程度的试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LFIRE-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该LFIRE-1编码序列选自下组：

(a)SEQ ID NO：1中1-1282位的核苷酸序列；

(b)SEQ ID NO：1中67-1080位的核苷酸序列；或

(c)SEQ ID NO：1中145-1080位的核苷酸序列。

4.一种检测肝细胞是否发生癌变的试剂盒，其特征在于，包括特异性扩增LFIRE-1的引物对，或与人LFIRE-1蛋白特异性结合的抗体；

并且，所述的试剂盒用于检测选自下组的突变：

第391位T→G；

第267和268位之间***了一个T；

第553位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

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