CN102443056B - 表皮生长因子受体的外显子缺失变异体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表皮生长因子受体的外显子缺失变异体。具体地，本发明提供了一种新的表皮生长因子受体变异体-de4EGFR蛋白，编码de4EGFR蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种de4EGFR蛋白的方法。本发明还公开了编码这种de4EGFR蛋白的多核苷酸的用途。de4EGFR蛋白具有促进肿瘤细胞侵袭/迁移功能。

Description

表皮生长因子受体的外显子缺失变异体
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人表皮生长因子受体变异体de4EGFR(Epidermal growth factor receptor with Exon 4deletion，de4EGFR)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erb B的170千道尔顿(Kilodalton)膜糖蛋白产物。EGFR基因是最初在鸟类红细胞增多症病毒中识别的erb B致癌基因的细胞同系物(1)。已在各种人类肿瘤中观察到这种致癌基因通过基因放大的活化(2-8)。
已有文献表明，EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达(9)。这些肿瘤包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和***癌(9)。v-erbB致癌基因和正常EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌基因是正常受体截断氨基的变型；它们缺少大部分细胞质外结构域，但保留了跨膜和酪氨酸激酶结构域(10)。这导致了它不能结合表皮生长因子(EGF)，但仍可以磷酸化其它蛋白质(11，12)。
各种基因变化都可以发生于病毒性erb B致癌基因中，例如，基因的羧基末端中发生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失对于致癌作用尤为关键。氨基端缺失是大多v-erb B致癌基因的一个特征，包括由启动子的***或逆转录病毒转导引起的那些氨基端缺失。相反，羧基末端缺失似乎只与逆转录病毒转导引起的肿瘤有关，而且似乎决定于宿主范围和肿瘤类型的特异性。以氨基端缺失的鸟类c-erb B基因或人EGF受体的转染实验表明该缺失可以使细胞转化(13)。
EGFR基因的放大发生于40-50％的恶性人类神经胶质瘤中(14-16)，受体基因的重排在许多具有基因放大的肿瘤中较为明显。重排似乎更多地影响基因的氨基末端(17-20)。
迄今已发现至少有八种EGFR变体：1)EGFRvI缺少EGFR的大部分细胞外结构域。2)EGFRvII由EGFR的细胞外结构域中的83aa框内缺失组成。3)EGFRvIII由EGFR的细胞外结构域中的267aa框内缺失组成。4)EGFRvIV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。5)EGFRvV含有EGFR的细胞质结构域中的缺失。6)EGFR.TDM/2-7含有EGFR的细胞外结构域中的外显子2-7的重复。7)EGFR.TDM/18-26含有EGFR的细胞外结构域中的外显子18-26的重复。8)另外，存在第二种更为罕见的具有在外显子11和14之间的连接点引入新颖组氨酸残基的缺失的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ12-13)(21)(图1)。
EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子(EGF)受体最常见发生的变体(22)。在基因放大的过程中，在胞外区发生267个氨基酸缺失，产生新的连接点(甘氨酸)。已知EGFRvIII未表达于任何正常组织(22)。然而，EGFRvIII在许多肿瘤细胞中有表达，例如，78％的乳腺癌组织，50-70％神经胶质瘤，16％非小细胞肺癌以及73％卵巢癌表达EGFRvIII(22)；此外，发明者所在实验室在最近也发现了肝癌中有EGFRvIII的存在(23，24)。
然而，迄今为止，人们对于癌症侵袭和转移的原因和机理的了解还不够深入，因此本领域迫切需要开发与癌症侵袭和转移相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的、与癌症侵袭和转移密切相关的表皮生长因子受体变异体de4EGFR多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的、分离出的de4EGFR多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭和/或促进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽；
(c)与SEQ ID NO：2氨基酸序列有≥95％同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
该de4EGFR突变体缺失了表皮生长因子受体的第四外显子并且在交界处(Junction)产生了一个新的氨基酸(甘氨酸)。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％(较佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少98％)相同性：(a)编码上述人de4EGFR多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-3495位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-3498位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。较佳地，所述的遗传工程化的宿主细胞含有所述的载体或染色体中整合有第二方面中所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人de4EGFR蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人de4EGFR蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人de4EGFR蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的人de4EGFR多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人de4EGFR多肽活性的化合物，以及抑制人de4EGFR多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人de4EGFR多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测(尤其是非诊断地体外检测)样品中是否存在de4EGFR蛋白的方法，它包括：将样品与de4EGFR蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在de4EGFR蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人de4EGFR多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性(如肿瘤易感性)的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人de4EGFR多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人de4EGFR多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人de4EGFR蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人de4EGFR多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗乳腺癌、脑胶质瘤等病症。
在另一优选例中，所述的拮抗剂是特异性结合于de4EGFR多肽且不结合于人表皮生长因子受体的抗体。
在本发明的第十一方面，提供了一种确定测试化合物是否是de4EGFR多肽的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组；并将体外培养的相同的肿瘤细胞作为对照组，
其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达本发明的de4EGFR多肽；
(b)观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移/侵袭程度，如果测试组的肿瘤细胞的迁移/侵袭程度大于对照组，则表示测试化合物是de4EGFR多肽的激动剂；如果测试组的肿瘤细胞的迁移/侵袭程度小于对照组，则表示测试化合物是de4EGFR多肽的拮抗剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞来自于人。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了野生型EGFR及其各种突变体，图中exon(s)表示外显子；C-tail表示C末端。
图2显示了de4-EGFR的电泳图，图中各泳道如下：1.7402；2.7405；3.7703；4.HepG3B；5.SKOV3；6.7404。
图3显示了部分卵巢癌组织中存在de4-EGFR。图中，泳道1-9为不同的卵巢癌组织。
图4显示了部分肝癌组织中存在de4-EGFR。
图5显示了部分脑胶质瘤组织中存在de4-EGFR。
图6显示了***组织中de4-EGFR的表达情况。图中，泳道1-11为不同的***癌组织标本。
图7显示了de4EGFR在不同的肿瘤细胞系中的表达情况。
图8显示了de4EGFR的长链扩增结果。各泳道如下：1.Hela；2肝癌组织K416。
图9显示了正常组织中EGFRwt mRNA水平的检测结果。各泳道如下：1：脑；2：结肠；3：肾；4：肝；5：肺；6：卵巢；7：胰腺；8：胎盘；9：脾；10：胃。
图10显示了通过Western Bl ot检测NIH3T3相关细胞模型的建立。图中泳道如下：1.NIH3T3GFP；2.NIH3T3EGFRwt；3.NIH3T3de4EGFR。
图11显示了通过Western Blot检测U87相关细胞模型的建立。图中泳道如下：1.U87MG GFP；2.U87MG EGFRwt；3.U87MG de4EGFR。
图12显示了EGFR及其突变体可促进细胞的增殖。
图13显示了EGFR及其突变体可促进细胞的迁移。
图14显示了EGFR及其突变体在体内可促进肿瘤细胞的增殖。
图15显示了EGFR及其突变体在体内可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。
图16显示了de4EGFR可促进肿瘤细胞在体内的多发转移。
图17显示了体外实验中，抗体CH12和C225对于U87MG de4EGFR细胞生长的抑制作用。
图18显示了体内实验中，抗体CH12和C225对于U87MG de4EGFR细胞生长的抑制作用。
图19显示了CH12和C225对于U87MG de4EGFR体内治疗后的瘤重及抑制率分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并分离了一种新的EGFR外显子缺失变异体(de4EGFR)，它有如下几个特征：1)在表皮生长因子受体的胞外区缺失了第四外显子，并在交界处产生了一个新的氨基酸(甘氨酸)。2)它在多种正常组织中不存在，但在某些肿瘤组织中存在。3)该变异体在体外能够明显促进肿瘤细胞的侵袭，迁移。4)该变异体在体内能够明显促进肿瘤细胞的迁移和转移。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“de4EGFR蛋白”、“de4EGFR多肽”或“表皮生长因子受体(缺失)变异体de4EGFR”可互换使用，都指具有人表皮生长因子受体变异体de4EGFR氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的表皮生长因子受体变异体de4EGFR。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的de4EGFR蛋白或多肽”是指de4EGFR多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化de4EGFR蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。de4EGFR多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人de4EGFR蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人de4EGFR蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人de4EGFR多肽”指具有人de4EGFR蛋白活性的SEQID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人de4EGFR蛋白相同功能的、SEQ IDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人de4EGFR蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人de4EGFR DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人de4EGFR多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人de4EGFR多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人de4EGFR多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人de4EGFR多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。应理解，本发明多肽的变异形式不包括本领域中已知的如图1中所示的野生型EGFR及其突变体。
发明还提供人de4EGFR蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人de4EGFR多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人de4EGFR蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
  最初的残基  代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)  Glu   Glu
  Cys(C)  Ser   Ser
  Gln(Q)  Asn   Asn
  Glu(E)  Asp   Asp
  Gly(G)  Pro；Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)  Ala   Ala
  Ser(S)  Thr   Thr
  Thr(T)  Ser   Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码de4EGFR蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的人de4EGFR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或de4EGFR蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的de4EGFR多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人de4EGFR多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人de4EGFR多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J BioChem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人de4EGFR编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人de4EGFR蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗de4EGFR蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人de4EGFR蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人de4EGFR蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人de4EGFR DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人de4EGFR基因产物或片段。较佳地，指那些能与人de4EGFR基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人de4EGFR蛋白的分子，也包括那些并不影响人de4EGFR蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人de4EGFR基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人de4EGFR基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人de4EGFR蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人de4EGFR蛋白功能的抗体以及不影响人de4EGFR蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人de4EGFR基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人de4EGFR基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人de4EGFR蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人de4EGFR蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人de4EGFR蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人de4EGFR蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人de4EGFR蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人de4EGFR蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人de4EGFR蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与de4EGFR蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
抗本发明de4EGFR蛋白的抗体可用于疾病治疗，例如，用于抑制肿瘤细胞的侵袭或抑制肿瘤细胞的迁移。在使用本发明的抗体时，还可同时使用其他治疗剂，如抗肿瘤的化疗剂等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明de4EGFR多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的de4EGFR拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
抑制人de4EGFR mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与人de4EGFR蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人de4EGFR蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人de4EGFR蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人de4EGFR蛋白水平，可以用作解释人de4EGFR蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断de4EGFR蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在de4EGFR蛋白的方法是利用de4EGFR蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与de4EGFR蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在de4EGFR蛋白。
de4EGFR蛋白的多聚核苷酸可用于de4EGFR蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，de4EGFR蛋白的多聚核苷酸可用于检测de4EGFR蛋白的表达与否或在疾病状态下de4EGFR蛋白的异常表达。如de4EGFR DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断de4EGFR蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用de4EGFR蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测de4EGFR蛋白的转录产物。
检测de4EGFR基因的突变也可用于诊断de4EGFR蛋白相关的疾病。de4EGFR蛋白突变的形式包括与正常野生型de4EGFR DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明de4EGFR蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色***置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3498个碱基，其开放读框位于1-3495位，编码全长为1165个氨基酸的人de4EGFR蛋白(SEQ ID NO：2)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1：采用PCR方法获得de4EGFR的序列及其表达情况
实验材料
肝癌细胞系HepG2Hep3B购自ATCC；Huh7，7402，7405，7703，7404，7721购自中科院，；人类单核肿瘤细胞系U937购自ATCC；***细胞系C33A，Hela购自ATCC；乳腺癌细胞系MCF-7，，SK-BR-3购自ATCC；卵巢癌细胞系Skov3，CaoV3购自ATCC，OMC685从遵义医学院获得，肺癌细胞系A549，H460，H1299购自ATCC，spcA1购自中科院。
19对肝癌及癌旁组织来源：江苏启东肝癌研究所
10例卵巢癌组织来源：上海第九人民医院
18例***组织来源：上海长海医院
10种正常组织RNA购自Clontech公司
RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司
逆转录酶及逆转录试剂盒购自Promega公司
PCR短链扩增所用Tag聚合酶购自申能***公司，长链扩增所用LA Taq购自TAKARA公司
所有引物均由Invitrogen公司合成。
所有组织标本的获得都有知情同意书。这些研究都经过相关伦理委员会的许可。
实验方法
细胞或组织经由Trizol抽提得到总RNA后，逆转录制备cDNA。用巢氏PCR的方法对EGFR及其isoform的部分特异序列和全长进行扩增。所用引物序列如下：
对de4EGFR基因序列的短链扩增：
外侧引物(5’至3’)
EJC-V3P1：GTATTGATCGGGAGAGCCG(SEQ ID NO：3)
EJC-V3P2：GTGGAGATCGCCACTGATG(SEQ ID NO：4)
扩增条件：1个循环：94℃5min
28个循环：94℃1min；58℃1min；72℃1min
1个循环：72℃10min
内侧引物
de4EGFR sf：CCCATGAGAAATTTACAGGGC(SEQ ID NO：5)
EGFR QR2：GTGGTGGGGTTGTAGAGCATG(SEQ ID NO：6)
扩增条件：1个循环：94℃5min
28个循环：94℃30sec；60℃30sec；72℃30sec；
1个循环：72℃10min
对de4基因序列的长链扩增：
外侧引物
上游：EJC-V3P1：GTATTGATCGGGAGAGCCG(SEQ ID NO：7)
下游：ER-28wtR1：TGACTTGATACAGTACCGATCCGG(SEQ ID NO：8)
扩增条件：1个循环：94℃ 5min
28个循环：94℃ 1min；58℃ 2min；72℃ 4min
1个循环：72℃  10min
内侧引物
上游：de4EGFR sf：CCCATGAGAAATTTACAGGGC(SEQ ID NO：9)
下游：ER-28wtR1：TGACTTGATACAGTACCGATCCGG(SEQ ID NO：10)
或ERi so26R2：CAACAGAGGTACAGCAAACAACCAG(SEQ ID NO：11)
扩增条件：1个循环：94℃ 5min
30个循环：94℃1min；60℃ 2min；72℃ 4min
1个循环：72℃ 10min
对EGFRwt基因序列的短链扩增：
外侧引物
EJC-V3P1：GTATTGATCGGGAGAGCCG(SEQ ID NO：12)
EJC-V3P2：GTGGAGATCGCCACTGATG(SEQ ID NO：13)
扩增条件：1个循环：94℃5min
28个循环：94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 1min
1个循环：72℃  10min
内侧引物
上游：ERE4F：CATCCAGTGGCGGGACATAG(SEQ ID NO：14)
下游：EGFR QR2：GTGGTGGGGTTGTAGAGCATG(SEQ ID NO：15)
扩增条件：1个循环：94℃ 5min
28个循环：94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 30sec；
1个循环：72℃ 10min
对EGFRwt基因序列的全序列扩增：
外侧引物
上游：EJC-V3P1：GTATTGATCGGGAGAGCCG(SEQ ID NO：16)
下游：ER-28wtR1：TGACTTGATACAGTACCGATCCGG(SEQ ID NO：17)
扩增条件：1个循环：94℃5min
28个循环：94℃1min；58℃2min；72℃4min
1个循环：72℃10min
内侧引物
上游：V3F：ATGCGACCCTCCGGGACG(SEQ ID NO：18)
下游：ERwt28R2：GGAATCAAGCATCCTCTGGAAGAC(SEQ ID NO：19)
扩增条件：1个循环：94℃5min
30个循环：94℃ 1min；60℃ 2min；72℃ 4min
1个循环：72℃  10min
实验结果：
最初，在SKOV3细胞系中用RT-PCR方法(引物：EJC-V3P1/EGFR QR2)检测到比野生型EGFR略小的扩增条带(图2)。测序分析证实，与野生型EGFR相比，缺失完整的第四外显子，缺失片段大小为158bp，由此我们为其命名为de4EGFR。
随后，设计并合成了特异性针对de4EGFR的引物对组织标本进行了RT-PCR扩增(引物：de4EGFR sf/EGFR QR2)。在9例卵巢癌组织中检测到有3例有de4EGFR的表达(图3)。
在20对肝癌及癌旁组织中检测到有7例癌组织，3例癌旁组织存在de4EGFR的表达(图4)。在14例脑胶质瘤组织中也有一例表达de4EGFR。(图5)
在7例非癌性的***组织中，没有检测到de4EGFR的表达，而在11例***癌组织中，检测到有3例表达de4EGFR(图6)。
此外，还在多种细胞系中检测到de4EGFR的存在：表皮癌细胞系A431；***细胞系Hela；乳腺癌细胞系MDA-MB-468，MCF-7，，SK-BR-3；卵巢癌细胞系OMC685，肺癌细胞系A549，H460，H1299，SPCA1以及肝癌细胞系7721等(图7)。
上述结果表明，de4EGFR的表达存在一定普遍性。这在以往的文献中还没有被报道过。
众所周知，EGFR在各种肿瘤细胞和组织中存在多种形式的缺失突变或点突变。为了检测de4EGFR长链与wt EGFR相比是否还存在其他核苷酸序列的不同，本发明人决定扩增de4EGFR的长链，并进行测序分析。根据GeneBank中人类的EGFR的序列设计引物，以细胞和组织cDNA为模版，在Hela细胞和1例肝癌组织中都有扩增到de4EGFR的长链序列(图8)。
测序结果表明，与野生型EGFR相比，de4EGFR缺少了整个第4外显子序列。
此外，本发明人还检测了在正常组织de4EGFR的表达状况。对10种人正常组织(Clontech)的EGFRwt和de4EGFR的mRNA水平检测结果表明：在10例正常组织中，mRNA水平上，EGFRwt都有不同程度的表达(图9)。与之相反，发现在正常组织中并不存在de4EGFR的形式。
实施例2EGFR及其突变体表达细胞系的建立。
实验材料：
细胞系：293T细胞购自中科院，NIH-3T3细胞购自ATCC，U87MG细胞系购自ATCC。
质粒：pWPT-GFP，psPAX2，pMD2G慢病毒载体可购自ADDGENE INC.(USA)。
分别扩增获得EGFRwt和de4EGFR序列。测序后***pWPT-GFP并替换掉GFP，从而产生pWPT-EGFRwt和pWPT-de4EGFR。将pWPT-EGFRwt或pWPT-de4EGFR分别与包装质粒psPAX2及G-protein of vesicular stomatitisvirus(VSV-G)胞膜质粒pMD2.G(可购自Addgene公司)磷酸钙共转染到293T细胞(中国科学院，上海，中国)。用病毒感染NIH/3T3细胞及U87MG细胞(1×105)，感染时添加6μg/mL Polybrene(Sigma Chemical，USA)。Western blot鉴定混合克隆后，取100个细胞铺板，各挑取6个单克隆，再次进行Western blot鉴定，挑取表达丰度一致的克隆进行下一步实验。
实验方法：
慢病毒包装：20μg Transfer vector，6ug Envelope plasmid pMD2G，15μg Packaging plasmid psPAX2经磷酸钙转染至病毒包装细胞293T，由此产生的病毒颗粒再感染NIH-3T3，U87及293细胞。
实验结果：
分别在小鼠成纤维细胞NIH3T3、和胶质瘤细胞U87MG中建立了EGFR及其突变体的高表达细胞系，并得到了Western blot鉴定的验证(图10-11)。
实施例3EGFR及其突变体促进细胞的增殖和迁移(体外实验)
实验材料：
3T3细胞系购自ATCC，CCK-8试剂盒购自Dojindo Laboratories
Transwell小室(孔径：8.0μm)及基质胶均购自BD Bioscience公司。
实验方法：
(a)细胞生长曲线：细胞消化后计数，种96孔板，300细胞/孔。同时种五个复孔，每隔24h采用CCK-8试剂盒测450nm吸光度，连续测7天。
(b)Transwell迁移实验(Transwell migration assay)：为了更精确地检测de4EGFR对细胞迁移能力的作用，进行了Trasnwell迁移实验。将5×104个细胞，重悬于200μl无血清培基，加入Transwell上层小室，下层加入600μl含10％FBS的培基，培养12h(NIH3T3GFP，NIH3T3EGFRwt，NIH3T3de4EGFR)或24h(U87MG GFP，U87MG EGFRwt，U87MG de4EGFR)后，4％多聚甲醛固定1h，用棉签拭去Transwell上层小室内未迁移的细胞，0.1％结晶紫染色30分钟，显微镜下拍照(放大100倍)，计数。
(c)Transwell细胞侵袭实验(Transwell invasion assay)：为了检测de4EGFR对细胞侵袭能力的作用，进行了细胞侵袭实验。在Transwell上层小室平铺稀释为1μg/μl的Matrigel 100μl，37℃孵育4h，用无血清培养基轻洗Matrigel两次。计数1×105的细胞，重悬于200μl无血清培基，加入已铺好Matrigel的Transwell上层小室，下层加入600μl含10％FBS的培基，培养24h后，4％多聚甲醛固定1h，用棉签擦去Transwell上层小室内的细胞，0.1％结晶紫染色30分钟，显微镜下拍照(放大100倍)，计数。
实验结果：
生长曲线如图12所示。结果表明，EGFR及其突变体明显促进细胞的增殖。从第6天开始，相对于对照U87MG GFP细胞，过表达EGFR-WT和de4EGFR的U87MG细胞均显示了更强的细胞增殖能力(p＜0.01)。而U87MG EGFR-WT和U87MG de4EGFR细胞两者之间的增殖的能力无明显差异(p＞0.05)。NIH/3T3系列细胞也显示了类似的结果。
Transwell迁移实验和侵袭实验显示了更明显的结果，无论是在小鼠成纤维细胞系NIH3T3还是在人脑胶质瘤细胞系U87MG，de4EGFR均具有比EGFR-WT更强的促进细胞迁移和侵袭的能力(图13)。
实施例4EGFR及其突变体促进细胞的增殖(体内实验)
实验方法：
取6-8周龄裸鼠，分为3组，每组5只。以1×106细胞/只的接种量对三组小鼠右侧肋下注射U87MG GFP、U87MG EGFRwt以及U87MG de4EGFR细胞系。26天后进行瘤积的测量和瘤重的测量。数据处理软件选用SPSS 11.0，先通过lenvene检验证明各组之间方差齐性，接着用方差检验验证各组之间总体上是否存在显著性差异，最后用LSD检验在组间进行两两比较。
实验结果：
观察到从瘤积和瘤重(图14)的角度判断，U87MG EGFRwt(P＝0.027(瘤积)，P＝0.029(瘤重))和U87MG de4EGFR(P＝0.036(瘤积)，P＝0.048(瘤重))相较于对照细胞均具有更强的成瘤能力。另一方面，U87MG EGFRwt和U87MG de4EGFR的成瘤能力没有明显差异(P＞0.05)。
实施例5EGFR及其突变体促进细胞的迁移(体内实验)
实验方法：
取6-8周龄裸鼠，分为3组，每组8只。以1×106细胞/只的接种量对三组小鼠右侧肋下注射U87MG GFP、U87MG EGFRwt以及U87MG de4EGFR细胞系。如果肿瘤具有较强的转移能力，则会在原发灶(右肋下)以外的脏器中(如肺部)出现转移灶。8周后进行解剖，取肺脏称重，并对组织进行组化检测。数据处理软件选用SPSS 11.0，先通过lenvene检验证明各组之间方差齐性，接着用方差检验验证各组之间总体上是否存在显著性差异，最后用LSD检验在组间进行两两比较。
实验结果：
如图15所示，可见de4EGFR有较之野生型EGFR更强的促进肿瘤转移的能力。这体现在小鼠的肺重差异中。U87MG GFP和U87MG EGFRwt接种的小鼠肺部偶有结节，但基本维持了肺脏的基本形态。而U87MG de4EGFR接种的小鼠肺部出现了相当多的肺部结节。de4EGFR-WT接种组小鼠的肺重明显超过U87MG GFP组(P＝0.001)和U87MG EGFRwt组(P＝0.012)，通过观察比较以及组化鉴定，发现各组小鼠肺部肿瘤侵润的程度由低到高依次是：GFP对照组、EGFRwt接种组和de4EGFR接种组。
更为重要的是，在de4EGFR接种组内8只小鼠中的两只出现了肺外的远端转移，转移灶位于肝脏、膈肌和结肠(图16)。GFP以及EGFRwt组中均未观察到肺外远端转移的情况。
以上结果都有力地表明：de4EGFR突变体比野生型EGFR具有更强的促进肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。
实施例6：识别de4EGFR或EGFRwt的单克隆抗体制备
分别合成EGFRwt胞内区和de4EGFR胞外区的多肽CSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(EGFRwt)(SEQ ID NO：20)和NLQGQKC(de4EGFR)(SEQ ID NO：21)。然后将多肽与铜蓝蛋白(KLH)以1∶1的质量比交联。将100ug peptide-KLH与弗氏完全佐剂以1∶1混合，免疫小鼠，4周后用100μg多肽-KLH与弗氏不完全佐剂1∶1混合，免疫小鼠，2周后再重复免疫1次。单克隆抗体采用传统的杂交瘤技术进行筛选，用EGFRwt和de4EGFR稳定表达的细胞系鉴定其特异性。这些抗体可以用于EGFRwt和de4EGFR的ELISA，WesternBlot(WB)，immunofluorescence(IF)and immunohistochemistry(IHC)检测。
结果，获得了能特异识别de4EGFR的单抗1F8，能特异识别EGFRwt的单抗1C5。
实施例7de4EGFR蛋白重组表达和纯化
挑NIH3T3-de4EGFR阳性克隆扩大培养，用pH7.4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次，加入缓冲液A(2％Triton X-100100mM NaCl，50mM Hepes，1mMEGTA，0.5ug/ml Leupeptin，20uM pmsf pH＝7.4)，溶液冰浴15min，刮下单层细胞，4℃10000g 5min离心，收集上清。上清用0.22mm滤膜过滤后，过CNBr活化的Sepharose 4B抗de4EGFR抗体1F8亲和层析柱，经缓冲液B(0.5％TritonX-100100mM NaCl，50mM Hepes，20uM pmsf，1mM EGTA，pH＝7.4)充分洗涤后，加入缓冲液C(0.5％Triton X-100 100mM NaCl，100mM Citrate，20uM pmsf，1mM EGTA，pH＝3.0)洗脱，收集洗脱液，加入1/10体积1M Tris Hcl(pH9.6)溶液中和，即得到人de4EGFR蛋白。
实施例8抗de4EGFR蛋白抗体的产生
将实施例7中获得的重组人de4EGFR蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人de4EGFR蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
实施例9筛选de4EGFR多肽的拮抗剂
按实施例3中所述的Transwell迁移实验方法，将以下两组物质施用于U87-de4EGFR细胞系，然后观察对细胞迁移的影响：(a)候选物质；(b)空白对照。
如果组(a)的细胞迁移在统计学上显著低于组(b)的细胞迁移，则表明该候选物质是de4EGFR多肽的拮抗剂；如果显著高于组(b)，则表明该候选物质是de4EGFR多肽的激动剂。
类似地，按实施例8所述的Transwell细胞侵袭实验方法，将以下两组物质施用于MDA-MB-468细胞(表达de4EGFR)，然后观察对细胞侵袭能力的影响：(a)候选物质；(b)空白对照。
如果组(a)的细胞侵袭能力在统计学上显著低于组(b)的细胞侵袭能力，则表明该候选物质是de4EGFR多肽的拮抗剂。如果显著高于组(b)，则表明该候选物质是de4EGFR多肽的激动剂。
结果：
测试了多种候选物质，其中包括抗体C225(Erbitux，西妥希单抗)(购自德国Merck公司)和CH12抗体(制法参见中国专利申请No200810038848.8，PCT专利申请号：PCT/CN2009/074090)。结果表明，CH12抗体有明显的抑制de4EGFR迁移和侵袭的能力。
实施例10体外和体内治疗实验
实验材料：
CCK-8试剂盒购自Dojindo Laboratories。
实验用抗体C225(Erbitux，西妥希单抗)产自德国Merck公司；CH12抗体由本发明人制备，方法参见中国专利申请No 200810038848.8。
实验选用裸鼠均为6周龄雌小鼠，由上海市肿瘤研究所实验病理部提供。
实验方法：
体外抗体治疗实验：
U87MG de4EGFR细胞消化后计数，种96孔板。4X104细胞/孔，同时种五个复孔，待细胞长到约40％密度时，分别以0、2、20、40、100、250μg/ml的抗体终浓度加药。72h后采用CCK-8试剂盒测450nm吸光度。
抑制率计算公式：
抑制率＝[(OD450(未加药孔均值)-OD450(特定加药浓度孔均值))/OD450(未加药孔均值)]×100％
体内抗体治疗实验：
取6-8周龄裸鼠，分为3组，每组7只。以5×105细胞/只的接种量对三组小鼠右侧肋下注射U87MG de4EGFR细胞系。5天后开始治疗。分别用C225和CH12抗体以0.5mg/小鼠/次的剂量腹腔给药，PBS作为对照。隔天给药并测量肿瘤体积，给药6次后疗程终止。继续观察2周后终止实验，处死小鼠，取肿瘤组织称重并记录。
抑制率计算公式：
抑制率＝[(PBS治疗组平均瘤重-抗体治疗组平均瘤重)/PBS治疗组平均瘤重]×100％
实验结果
1、体外抗体治疗实验：
结果如图17所示，在抗体浓度高于100μg/ml时，CH12抗体对U87MG de4EGFR细胞生长的抑制明显优于C225抗体。CH12的的抑制率达到了30％-40％，相比之下，C225没有观测到任何治疗效果。而当抗体浓度低于40μg/ml，两者对于细胞生长都没有明显的抑制作用。
2、体内抗体治疗实验：
如图18所示，从体内肿瘤体积的变化上来看，细胞接种21天后，不同CH12抗体治疗组和PBS对照组相比，开始表现出较为明显的治疗效果(*：P＜0.05)；相比而言，C225对于U87de4EGFR细胞在小鼠体内的生长没有抑制作用。
图19的瘤重记录也反应了类似的趋势：从瘤重上看，CH12相对于PBS对照组具有46.48％的肿瘤生长抑制率，而C225没有表现出抑制作用，甚至对该肿瘤细胞还有微弱的生长刺激作用。
以上结果表明：在体外和体内水平上，相对于C225抗体，抗体CH12对于过表达de4EGFR的U87MG细胞具有更好的抑瘤效果。
讨论
本发明的de4EGFR是一种新的EGFR变异体，它缺失了第四外显子，但在交界处产生了一个新的氨基酸(甘氨酸)。由于该变异体主要存在于肿瘤组织或癌旁组织，而不存在于正常组织，而且该变异体具有很强的促进肿瘤生长和转移的作用，所以本发明为肿瘤提供了一个新的治疗靶标及诊断标志物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (9)

1.一种分离的人表皮生长因子受体变异体de4 EGFR多肽，其特征在于，该多肽为如SEQ ID NO:2氨基酸序列所示的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：
(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组：
(i)SEQ ID NO:1中1-3495位的序列；
(ii)SEQ ID NO:1中1-3498位的序列。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体或染色体中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出人de4 EGFR多肽。
7.一种能与权利要求1所述的人de4 EGFR多肽特异性结合且不结合于人表皮生长因子受体的抗体，其特征在于，所述的抗体根据de4 EGFR胞外区的多肽NLQGQKC(SEQ ID NO:21)，然后将多肽与铜蓝蛋白(KLH)以1:1的质量比交联后，将100ug肽-KLH与弗氏完全佐剂以1:1混合，免疫小鼠，4周后用100μg多肽-KLH与弗氏不完全佐剂1:1混合，免疫小鼠，2周后再重复免疫1次，并对单克隆抗体采用传统的杂交瘤技术进行筛选，用EGFRwt和de4 EGFR稳定表达的细胞系鉴定其特异性，从而获得了能特异识别de4 EGFR的单抗。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。
9.一种确定测试化合物是否是de4 EGFR多肽的拮抗剂或激动剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组；并将体外培养的相同的肿瘤细胞作为对照组，
其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物，并且表达权利要求1所述的de4 EGFR多肽；
(b)观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移/侵袭程度，如果测试组的肿瘤细胞的迁移/侵袭程度大于对照组，则表示测试化合物是de4 EGFR多肽的激动剂；如果测试组的肿瘤细胞的迁移/侵袭程度小于对照组，则表示测试化合物是de4EGFR多肽的拮抗剂。
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