CN1646695A - Axl受体在诊断和治疗肾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定能够抑制人Axl受体活性的化合物的方法，其包含将Axl受体或表达Axl受体的细胞与化合物接触；在化合物的存在下测量Axl受体的活性；和在控制条件下将测量的活性与在缺乏化合物存在下测量的活性比较，其中降低将化合物鉴定为抑制活性。还描述了治疗和诊断应用。

Description

AXL受体在诊断和治疗肾病中的应用

本发明是部分继续申请并要求在2002年2月12日提出的美国临时申请号60/356,374的利益，该申请的内容由此通过参考结合于本申请中。

发明领域

本发明涉及其表达在各种肾病理学中变化的多核苷酸序列的鉴定和分离，和这些分离的多核苷酸在以下各项中的应用：作为诊断、筛选治疗方式的探针，和作为通常纤维变性，特别是肾纤维变性和肾小球硬化症的失活目标，肾纤维变性和肾小球硬化症是糖尿病性肾病的标记。

发明技术

胞外基质的累积和成纤维细胞的增殖是纤维变性的主要标志。由于细胞因子和生长因子，特别是转化生长因子β(TGF-β)的分泌，成纤维细胞的表型变化导致胞外基质蛋白沉积增加。重复损害引发基质金属蛋白酶的组织抑制剂的上调，其有利于胞外基质的累积(Br J Surg 2001 11：1429-1441)。已知纤维变性在许多组织(例如肾，肝，肺，心脏)中发生，其中损伤或其它特异性的刺激导致早期急性炎症，接着疤痕形成，通常以晚期疾病告终。

细胞因子对于无数基础体内稳态和病理生理学过程如发热、伤口愈合、炎症、组织修复和纤维变性是关键性的。它们在调节诸如增殖、迁移和基质合成的细胞功能中发挥重要作用。这些介质和它们的下游靶蛋白之间的复合体相互作用的平衡或净效应似乎在调节伤口和组织纤维变性的起始、进展和消退中发挥主要作用。

糖尿病性肾病

糖尿病性肾病(其标志为肾小球硬化症和肾纤维变性)是现代世界中晚期肾病单独的最普遍的原因，糖尿病患者构成最大的透析群体。该治疗成本高而远非最佳。移植提供更好的结果但遭受供体的严重短缺。未开发更多针对糖尿病性肾病的定向治疗(以及针对其它类型的肾病理学)，原因是构成这些病理学的基础的分子机制大多未知。鉴定在疾病中受调节和影响糖尿病性肾病后果严重性的关键性的功能靶基因具有诊断和治疗价值。

已知肾脏中许多病理学过程最终以类似或相同的形态学变化即肾小球硬化症和纤维变性而告终。这意味着不同类型的损害集中在相同的单个遗传程序，导致成纤维细胞的增殖和通过它们的各种***的蛋白质组分的超量生产-纤维变性的两个标志。另外，肾小球基底膜的增厚伴随着间质的纤维变性和最终导致肾小球硬化症。编码涉及肾纤维变性和肾小球硬化症的蛋白质的基因可以大概分为两组：

1.其表达导致这些变化触发的基因；这些可以是对不同病理学条件特异性的。

2.其表达负责“纤维变性或硬化程序”的执行的基因；这些可以是对于所有导致纤维变性和肾小球硬化症的肾病理学所共有的。

属于第二组的基因的鉴定将有助于理解伴随成纤维细胞和肾小球细胞增殖和分泌过多的分子机制，并且可以构成旨在预防肾衰竭的药物发展的遗传目标。预计这些药物的应用制止，延缓，阻滞，防止，抑制或减缓纤维变性和肾小球硬化症的进展。

清楚的是评估糖尿病性肾病发展的最好方法是在建立的疾病的动物模型中鉴定基因表达。这些模型的实例包括(i)fa/fa大鼠，瘦素(leptin)受体遗传缺陷的动物，其发展胰岛素抗性糖尿病(II型糖尿病)，进行性糖尿病性肾病，和(ii)GK大鼠，其被遗传操作，NIDDM表型大鼠。另一个肾纤维变性明显但无糖尿病背景的动物模型是单侧输尿管梗阻(UUO)，其中间质纤维变性迅速并且在梗阻后数日内发生。

研究的另外方面可以基于体外模型***，其涉及在模仿存在糖尿病性肾中的各种细胞微环境参数的条件下体外培养人成纤维细胞。这些包括用高浓度葡萄糖(模拟高血糖症)，低浓度葡萄糖，缺氧(两者模拟在纤维变性和肾小球硬化症后的肾脏中发展的局部缺血条件)和TGF-β(纤维变性中公认的致病因子之一)处理。该模型***可以在三个重要方面补充动物模型：

1.该***是成纤维细胞特异性的；没有任何在包含许多细胞类型的复杂组织中经常发现的干扰。

2.细胞是人源的(不同于动物模型)。

3.损害是特异性的和在各种浓度和持续时间下的，由此能够研究急性和慢性反应。

Axl受体

Axl是受体酪氨酸激酶亚家族的成员。它是质膜内在蛋白并具有独特的胞外区域和胞内区域结构，该胞外区域并列免疫球蛋白-λ(IgL)和FNIII结构域，该胞内区域包含胞内结构域，其部分是激酶结构域。它可以与维生素K-依赖性的蛋白质Gas6结合，从而将信号转导至细胞质中。可以切割Axl的胞外结构域并可以释放65kDa的可溶性胞外结构域。切割增强受体转换，产生部分活化的激酶(O’Bryan JP，Fridell YW，Koski R，VarnumB，Liu ET.(1995)J Biol Chem.270(2)：551-557)。然而，被切割的结构域的功能未知。

经与Gas6配体相互作用以后，Axl变得自身磷酸化，发生信号转导事件的级联。已知涉及该级联的是PI3K，AKT，src，Bad，14-3-3，PLC，ERK，S6K(促***原调节激酶)和STAT(这些中的每一个在不同细胞系和/或***中研究)。

Gas6，Axl的配体，具有富含γ-羧基谷氨酸的区域(GLA结构域)，这允许与膜磷脂的Ca⁺⁺-依赖性的结合。Gas6是弱的促***原，在受到TNF-诱导的细胞毒性胁迫或撤除生长因子的NIH3T3成纤维细胞中具有抗编程性细胞死亡的效果。在NIH3T3中Gas6与Axl的结合导致PI3K，AKT，src和Bad的活化。

在肾小球细胞中，发现Gas6具有促有丝***作用，由此证明在肾小球硬化症进展中的可能作用。此外，最近显示(Yanagita M.，Ishimoto Y.，AraiH.，Nagai K.，Ito T.，Nakano T.，Salant D.J.，Fukatsu A.，Doi T.和Kita T.(2002)The Journal of Clinical Investigation 110(2)239-246)，Gas6是肾小球细胞的自分泌生长因子，抗凝剂华法林(wafarin)与Axl的胞外结构域一起通过特异性地阻断Gas6-介导的途径抑制肾小球肾炎的肾小球增殖模型中肾小球细胞的增殖。

Gas6还促进内皮细胞的存活，并且在气囊(balloon)受损的大鼠颈动脉(动脉损伤的模型)中从6h-72h上调。

据显示血管紧张素II通过其AT1受体增加血管平滑肌细胞中的AxlmRNA和蛋白质受体(Melaragno MG，Wuthrich DA，Poppa V，Gill D，Lindner V，Berk BC，Corson MA.(1998)Circ Res.83(7)：697-704)。AT1受体拮抗剂氯沙坦阻断血管紧张素对Axl表达的刺激作用。在32D的骨髓细胞系中，Axl的表达允许细胞响应Gas6刺激而聚集。该响应不需要Axl激酶活性；因此，提示聚集是通过异型胞内机制介导的，由此细胞结合的Gas6与邻近细胞上的Axl受体相互作用。

在GM-CSF启动子下表达Axl受体的转基因小鼠显示与非胰岛素依赖性糖尿病mellitus(NIDDM)相关的表型特征，包括高血糖症和高胰岛素血症，严重胰岛素抗性，进行性肥胖症，肝脂沉积，和胰岛发育异常。这些小鼠显示表达高水平的TNF-α。Axl蛋白酶裂解产物(Axl的胞外结构域(ECD))在转基因小鼠中产生更严重的NIDDM表型(Augustine KA，Rossi RM，Van G，Housman J，Stark K，Danilenko D，Varnum B，Medlock E.(1999)J Cell Physiol.181(3)：433-447)。Axl已经显示涉及细胞粘附，细胞增殖和免疫***内的稳态调节(Lu Q和Lemke G(2001)Science 293(5528)：306-311)。在Axl激活后，已经观察到下列现象：编程性细胞死亡的抑制，成纤维细胞和内皮细胞的“正常”细胞(未转化的)存活率的增加，血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移(Axl激酶失活阻断迁移)，血管壁中新内膜形成增强(Melaragno MG，Fridell YW，Berk BC.(1999)Trends CardiovascMed.(Review)9(8)：250-253)并涉及损伤形成和动脉粥样硬化的进展。在敲除小鼠中缺少Gas6导致在急性刺激后减小的肾中毒性，提示作为GAS6主要配体的Axl可能涉及正常肾脏中的该过程。此外，GAS6对肾小球细胞的促有丝***作用可以通过经Axl的信号转导进行。

关于Axl基因已知的是：

Axl的同义词：UFO，ARK(小鼠中)

关于人Axl基因和基因产物的结构信息：

a.核苷酸序列：5015bp变体1gi：11863122

              4986bp变体2gi：11863124

b.可读框：894aa(461-3145bp)-变体1

          885aa(459-3113bp)-变体2

c.蛋白质序列：885aa mw 140kDa(人)gi：4502335

结构域：gi：4502335，通过SMART进行：

a.胞外区域：1-33aa：信号肽

            41-136和145-224aa：(Ig)

            225-318和334-415aa：2 FNIII结构域。

b.跨膜结构域：441-463aa

c.胞内结构域：SEQ ID NO：4的527-794aa

胞内结构域包含含有基序Lys-Trp-Ile-Ala-Ile-Glu-Ser：SEQ ID NO：6(存在所有Tyro3家族成员中)的酪氨酸激酶结构域。注意胞内结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO：5。

除了Axl以外还包括Tyro3(也称为Sky或RSE)和MER蛋白的Tyro3家族的受体酪氨酸激酶已经显示同源性。

组织分布：本发明的发明人发现在小鼠中，Axl在胚胎发生后期广泛范围的发育组织的不同结构中和在成人的细胞形成器官被膜和***结构中表达。

疾病相关模式(pattern)：Axl是慢性骨髓性白血病相关的癌基因并还与结肠癌和黑色素瘤相关。

在胚胎/胎发育期间的表达模式：Axl基因在脊椎动物物种之间在进化上是保守的，并且在间充质中发育期间表达。

肾小球细胞增殖似乎是肾小球硬化之前的重要病理学事件。肾小球细胞生成胞外基质，因此有助于糖尿病性肾中的纤维硬化变化。在实验性肾小球肾炎中发现Gas6通过Axl调节肾小球细胞增殖。抑制Gas6与Axl相互作用减少蛋白尿，肾小球细胞增殖，和恢复肾功能(Yanagita M等，(1999)J Am Soc Nephrol 10：2503-2509；Yanagita M等，(2001)Am J Pathol，158：1423-1432)。下列专利出版物也涉及Axl或其它酪氨酸激酶受体：美国专利5,468,634；美国专利6,087,144；美国专利5,538,861；美国专利5,968,508；美国专利6,211,142；美国专利6,235,769；WO 99/49894；WO 00/76309；WO01/16181和WO 01/32926。

在背景技术中任何地方都没有教导或提示Axl受体的调节对诊断和治疗肾病或更具体地，糖尿病性肾病有用。

发明概述

本发明的主要目的是鉴定和分离新的遗传目标，其可以用于开发治疗纤维变性的药物，而且可以用于发展诊断和预后应用。本发明另一目的是鉴定和分离新的遗传目标，其用于开发治疗肾病，更具体地治疗糖尿病性肾病的药物，并将该目标用作诊断和预后应用的工具。本发明还有一个目的是鉴定和分离新的遗传目标，其用于开发治疗糖尿病性肾病的标志，即肾小球硬化症和肾纤维变性的药物。

通过体内和体外肾病，更具体地糖尿病性肾病和肾纤维变性模型中基于大规模微阵列的基因表达分析，本发明提供这些开发新的治疗和诊断工具的新目标。优选地，本发明鉴定用于基因治疗、诊断和疗法的正调节物或负调节物(反应者)基因，其在纤维变性肾病理学疾病及其相关病理学之间具有直接因果关系。更优选地，本发明鉴定在上述模型中作为上调基因的Axl基因。

本发明进一步提供在这里称为筛选测定的方法，其用于鉴定调节剂，即候选物或化合物或试剂，其包括但不限于中和抗体，肽，肽模拟物，小分子及其它药物，它们与Axl结合或对Axl表达或Axl活性具有抑制作用。

通过上述筛选测定发现的化合物或试剂将抑制通过Axl受体的信号转导，可以用于糖尿病性肾病以下调肾小球细胞增殖和减缓肾小球硬化症的速度，或抑制肾小球硬化症，或减少成纤维细胞的增殖，抑制胞外基质的累积和减少或限制肾中纤维变性区域的形成。优选地，本发明鉴定用于基因治疗、诊断和疗法的正调节物或负调节物(反应者)基因，其在疾病及其相关病理学之间具有直接因果关系。更优选地，本发明鉴定用于上述应用的Axl基因。

附图简述

图1.该图证明在各种细胞系中响应TGF-β的内源性Axl表达(蛋白质印迹分析)。泳道1：NRK 49F细胞；泳道2：NRK 49F细胞和TGF-β5ng/ml，24小时；泳道3：Rat1细胞；泳道4：Rat1细胞+TGF-β5ng/ml，24小时；泳道5：WI38细胞；泳道6：Hela细胞；泳道7：293细胞。

图2：该图证明Axl蛋白在响应TGF-β的rat1细胞中上调。将来自暴露于TGF-β刺激(5ng/l 15分钟，30分钟，60分钟和2小时)的Rat1细胞的总细胞裂解物跑胶并用抗Axl C20 Ab探测(蛋白质印迹分析)。第一和最后一个泳道中的样品是来自无TGF-β刺激的细胞。

图3.该图证明Axl的TGF-β依赖性的诱导伴随着磷酸化的Axl水平的增加。将暴露于TGF-β刺激(5ng/ml 15分钟，30分钟，60分钟和2小时)的Rat1细胞用于免疫沉淀。用抗Axl M-20免疫沉淀Axl。将抗磷酸酪氨酸抗体用于监视axl在TGF-β处理(5ng/ml 15分钟-2小时)后的磷酸化状态。第一和最后一个泳道中的样品是来自无TGF-β刺激的细胞。

图4.该图证明在大鼠中在UUO后Axl多肽的上调。在UUO模型后在正常SD大鼠肾中监视Axl蛋白的表达。泳道1：在对侧(cl)未处理的肾中Axl的表达；泳道2：在梗阻的肾(UUO，25天)中Axl的表达。

发明详述

按照本发明，公开了纯化的，分离的和克隆的核酸序列，特别是编码Axl受体的核酸序列，其与肾病和更具体地糖尿病性肾病和纤维变性及肾小球性硬化肾有关，并具有本文规定的序列或具有与其互补或等位基因序列的变体，。此外，还公开了纯化的，分离的和克隆的核酸序列，其与肾病有关并具有编码此处公开的SEQ ID NO：2和4的序列。数据库提供两种转录变体：

转录变体1：NM_021913 GI：11863122

转录变体2：NM_001699 GI：11863124

如本文所用，术语“Axl基因”定义为Axl基因的任何同系物，其与SEQ ID NO：1和NO：3的氨基酸编码区域，或在本领域公知(例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1988)，在1995和1998更新)的高度严谨杂交条件下与Axl基因结合的核酸序列具有优选90％同源性，更优选95％同源性，还更优选98％同源性。注意在SEQ ID NO：1和NO：3中ATG上游18个核苷酸不在氨基酸编码区域内，终止信号下游的许多核苷酸也不在氨基酸编码区域内。

如本文所用，术语“Axl”或“Axl多肽”或“Axl受体”定义为Axl多肽的任何同系物，与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，或与SEQ ID NO：5具有优选90％同源性，更优选95％同源性，和还更优选98％同源性，其为全长或其片段或结构域，由剪接的变体核苷酸序列编码的突变体或多肽，与其它多肽的嵌合体，条件是上述任一与Axl受体具有相同或实质上相同的生物学功能。Axl多肽，或Axl多肽同系物可以以不同形式存在，包括但不限于可溶性蛋白，膜结合(纯化的膜制剂或在细胞表面上)，珠结合，或其它任何呈递Axl蛋白或其片段或衍生多肽的形式。Axl多肽或Axl受体包含由SEQ ID NO：5表示的胞内结构域。

Axl多肽的具体片段分别包括SEQ ID NO：2和4的氨基酸1-50，51-100，101-150，151-200，201-250，251-300，301-350，351-400，401-450，451-500，501-550，551-600，601-650，651-700，701-750，751-800和801-850，SEQ IDNO：2和4的氨基酸851-894和851-885。另外的Axl多肽的具体片段分别包括SEQ ID NO：2和4的氨基酸25-74，75-124，125-174，175-224，225-274，275-324，325-374，375-424，425-474，475-524，525-574，575-624，625-674，675-724，725-774，775-824和825-874和SEQ ID NO：2和4的氨基酸875-894和875-885。

本发明还设想包括Tyro3，Axl和Mer的Tyro3家族的其它任何成员的抑制可以具有类似于抑制Axl所观察到的那些的治疗结果。

当序列是部分序列时，它们可以用作在纤维变性中上调的基因的标记/探针。通常称为“表达序列标签”(EST)的这些部分序列是体内实际上表达的基因的标记，并如本文实施例部分所述确定。通常，EST包含对应于核编码mRNA部分的DNA序列。EST具有允许聚合酶链式反应(PCR)的长度，并用作杂交探针，具有与其杂交(通常在足够严谨要求至少95％碱基配对的条件下)的基因的独特命名。对于EST和它们的功能实用性的详细描述和综述，参见WO 93/00353，其完整地结合于此作为参考。WO93/00353另外描述了如何使用EST序列来鉴定转录的基因。

如本文所用，“靶分子”本质上是Axl或Axl基因家族成员结合或相互作用或磷酸化或活化的分子；例如表达Axl的细胞表面上的分子，第二细胞表面上的分子，与细胞膜内表面相关的分子或胞质分子。Axl靶分子主要是促进来自Axl的胞外信号(例如通过Axl配体与膜结合的Axl分子结合产生的信号)转导通过细胞膜和进入细胞的信号转导途径成分。靶分子例如可以是介导Axl下游信号转导的第二胞间蛋白。

如本文所用，术语“化合物”定义为包含任何化学小分子，抗体，中和抗体，反义DNA或RNA分子，siRNA，蛋白质，多肽和肽，包括肽模拟物和显性失活，及表达载体。

在一个实施方案中，本发明提供用于筛选与Axl结合或调节Axl活性或调节Axl表达水平的候选物或化合物的测定。使用本领域已知的组合和非组合文库方法中多种方法的任何一种可以获得本发明的化合物，所述组合和非组合文库方法包括生物文库(蛋白质，肽等)，空间可寻址的平行固相或溶液相文库，合成文库方法，和天然产物文库。

Axl表达(转录或翻译)或多肽活性的调节剂可以特别是化学小分子，其通常具有小于2000道尔顿，更优选小于1000道尔顿，还更优选小于500道尔顿的分子量。其它调节剂可以是抗体，优选中和抗体或其片段，包括单链抗体，反义寡核苷酸，反义DNA或RNA分子，蛋白质，多肽和包括肽模拟物和显性失活肽，及表达载体。这些调节剂可以如下作用：小分子可以影响表达和/或活性；仅抗体活性；所有种类的反义将影响Axl表达；仅显性失活和肽模拟物活性；表达载体特别可以用于传递反义或显性失活。最近已经开发使用小分子的方法，这些小分子可以与蛋白质直接结合并可以用于改变蛋白质功能(关于综述参见B.R.Stockwell，(2000)NatureReviews/Genetics，1，116-125)。如上所述，低分子量有机化合物可以相对容易地渗透靶细胞的质膜，因此已经开发合成它们的方法。这些合成又产生包含许多蛋白质配体的文库。近来发展已经提供大大增加种类的创造性选择的，新的有机小分子，其将用作干扰生物***的有力工具。这些小分子可以用于激活或失活蛋白质家族的特定成员。

合成分子文库的方法实例可以在现有技术，例如在DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等(1994)，J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061中；和在Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233中发现。

化合物文库可以存在溶液中(Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)，或在珠粒(Lam(1991)Nature 354：82-84)，芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-556)，细菌(Ladner美国专利号5,223,409)，孢子(Ladner USP5,223,409)，质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390；Devlin(1990)Science 249：404-406；Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)。

按照本发明的另一个实施方案，测定是基于细胞的测定，其中用激酶活性的Axl构建体转染哺乳动物来源的细胞。将细胞与化合物接触；测定化合物抑制Axl活性的能力。

然而，在另一实施方案中，测定包含将过量表达活性Axl的细胞与优选Axl靶的第二分子温育以形成测定混合物。该测定混合物然后与按照本发明筛选方法中的任何一种鉴定的化合物温育，测定鉴定的化合物抑制Axl对其靶的活性的能力。

因此在该实施方案中，通过测量鉴定的化合物与Axl靶分子，即第二化合物相比优选与Axl结合的能力(即测量竞争性结合)测定鉴定的化合物与Axl相互作用的能力。

在另一实施方案中，测定是基于细胞的测定，其包含将表达Axl受体或其片段的细胞与化合物结合和测定化合物调节(即刺激或抑制)Axl活性的能力。例如通过测定Axl的酶活性可以完成测定化合物调节Axl活性的能力。后者可以通过以下各项直接完成：通过跟踪Axl下游的细胞蛋白质(或Axl靶分子)的酪氨酸磷酸化，或通过基于报道基因的测定，其基于测量例如用放射性的(³²P或³³P)磷酸盐代谢标记的表达Axl的细胞和跟踪Axl靶分子刺激的细胞的磷酸酪氨酸特异性免疫沉淀物中放射性的累积，或通过使用荧光偏振以检测Axl活性。

备选地，通过检测Axl的细胞第二信使和/或其下游效应物的诱导(即增加胞内游离Ca²⁺离子，二酰甘油的生产，IP₃的产生等)，使用适当的内源或外源底物检测靶的催化/酶活性，检测报道基因(包含可操作地与编码可检测标记，例如荧光素酶的核酸连接的Axl反应调节元件)的诱导，或检测细胞应答，例如细胞存活，细胞分化或细胞增殖，可以间接完成Axl活性的测定。

在还有另一实施方案中，测定是无细胞测定，其包含将重组Axl或其片段与化合物温育和测定化合物与Axl结合的能力。可以如上所述直接或间接测定化合物与Axl的结合。例如，测定包含将Axl与结合Axl的已知化合物或Axl靶分子温育以形成测定混合物。该测定混合物进一步与化合物温育，测量与已知化合物(或靶分子)相比化合物优选与Axl结合的能力。

还有，在本发明的另一实施方案中，测定是无细胞测定，其包含将Axl与化合物温育和测定化合物调节(例如刺激或抑制)Axl活性的能力。通过例如使用放射性标记(³²P或³³P)的ATP和测量磷酸化底物中放射性的累积，进行体外酪氨酸激酶测定或通过使用例如可商购的分子装置试剂盒使用荧光偏振，根据Axl的自身磷酸化或通过根据Axl底物的酪氨酸磷酸化，可以完成测定化合物调节Axl活性的能力。

本发明的无细胞测定与Axl的可溶性形式，膜结合形式或固定化形式的应用相符合。在包含膜结合形式的Axl的无细胞测定的情形中，期望可以使用加溶剂以使膜结合形式的Axl保持在溶液中。这些加溶剂的实例包括非离子型洗涤剂如正辛基葡糖苷，正十二烷基葡糖苷，正十二烷基麦芽糖苷，辛酰基-N-甲基葡糖酰胺，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，Triton^TM X-100，Triton^TMX-114，3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐(CHARS)，或3-[(3-胆酰氨基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHARSO)。

在上述测定方法中的一些实施方案中，期望可以固定Axl或其靶分子以促进一种或两种蛋白质的复合与非复合体形式的分离，以及容许测定的自动化。在化合物的存在和/或不存下化合物与Axl的结合，或Axl与靶分子的相互作用可以在适于包含反应物的任何容器中完成。这些容器的实例包括微量滴定板，试管，和微型离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其增加一个结构域以使蛋白质中的一种或两种与基质结合。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/Axl融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可以吸附到谷胱甘肽Sepharose珠粒或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板之上，其然后与化合物和未吸附的靶蛋白或Axl结合，混合物在适于复合体形成的条件下温育。在温育后，洗涤珠粒或微量滴定板的孔以去除任何未结合的组分，在珠粒的情形中固定基质，例如如上所述直接或间接测定复合体形成。备选地，复合体可以从基质上解离，使用标准技术测定Axl结合或活性水平。

在本发明的筛选测定中还可以使用用于将蛋白质固定在基质上的其它技术。例如，使用生物素和链霉抗生素蛋白的偶联可以固定Axl或其目标分子。使用本领域的公知技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)可以制备生物素化的Axl或靶分子，并固定在链霉抗生素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)的孔中。备选地，可以将与Axl或靶分子反应但不干涉Axl与其靶分子结合的抗体结合于板孔，并通过抗体偶联将游离靶或Axl捕获在孔中。除了上面关于GST-固定的复合体所述的那些以外，检测这些复合体的方法包括使用与Axl或靶分子反应的抗体免疫检测复合体，以及依赖于检测Axl或者与Axl或其靶分子有关的酶活性的酶联测定。

在另一实施方案中，在其中将细胞与化合物接触的方法中鉴定Axl表达的调节剂，并测定细胞样品中Axl mRNA或蛋白质的表达。在候选化合物存在下Axl mRNA或蛋白质的表达水平与候选化合物不存在下AxlmRNA或蛋白质的表达水平比较。然后基于该比较可以鉴定候选化合物为Axl表达的调节剂。例如，当Axl mRNA或蛋白质的表达在候选化合物存在时比其缺少时高，候选化合物鉴定为Axl mRNA或蛋白质的表达的刺激物。备选地，当Axl mRNA或蛋白质的表达在候选化合物存在时比其缺少时低，候选化合物鉴定为Axl mRNA或蛋白质的表达的抑制剂。通过本文关于检测Axl mRNA或蛋白质的所述方法可以测定细胞中Axl mRNA或蛋白质表达的水平。

本发明的优选实施方案提供鉴定能够抑制人Axl受体活性的化合物的方法，其包含以下步骤：

(i)将Axl受体或表达Axl受体的细胞与化合物接触；

(ii)在化合物的存在下测量Axl受体活性；和

(iii)将步骤(ii)中测量的活性与在控制条件下不存在化合物时测量的活性比较，其中降低将化合物鉴定为能够抑制活性。

在本发明的一个实施方案中，在上述方法中测量的活性是Axl受体底物的酪氨酸磷酸化或Axl受体的自身磷酸化。在另一实施方案中，与化合物接触的细胞是肾小球细胞，测量的活性是所述肾小球细胞的增殖，或者与化合物接触的细胞是肾成纤维细胞并且测量的活性是所述肾成纤维细胞的增殖。在另外的实施方案中，与化合物接触的细胞是肾成纤维细胞并且测量的活性是所述肾成纤维细胞的胞外基质中的胶原沉积。在另一实施方案中，与化合物接触的细胞是肾小管细胞并且测量的活性是所述肾小管细胞的增殖。然而，在另外的实施方案中，与化合物接触的细胞是肾小管细胞，测量的活性是转分化为肌成纤维细胞。

在本发明的另一实施方案中，在上述方法的接触步骤(i)中的细胞已经预先用Axl基因转染，瞬时或稳定转染。然而，在另一实施方案中，步骤(iii)的控制条件包含在接触缺乏活性Axl基因的细胞后测量。在另一实施方案中，步骤(ii)的控制条件包含经接触类似的缺少活性Axl基因的细胞或类似的具有突变失活形式的Axl基因的细胞后的比较。

在本发明的另一实施方案中，上述方法的Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中列出。在另一实施方案中，Axl受体包含生物活性的胞内结构域部分。

在本发明的另一实施方案中，按照上述方法中任何一种鉴定的化合物抑制Axl受体的活性比它抑制酪氨酸激酶受体FGFR1，VER4，KIN24，HGFr，met，EGFR，IGF-1r，InsR和Abl的活性更有效至少2倍，更优选5倍，更优选100倍和最优选200倍。

在本发明的另一实施方案中，按照以上方法鉴定的化合物可以用于制备治疗肾病的药物。

在本发明的另一实施方案中，在将Axl受体或表达Axl受体的细胞与化合物接触之前，Axl受体与已知与Axl结合的第二化合物接触。在另一实施方案中，将Axl受体或第二化合物固定。

本发明的一个实施方案提供鉴定能够降低Axl基因表达水平的化合物的方法，其包含以下步骤：

(i)将能够表达Axl受体的细胞与化合物接触；

(ii)在化合物的存在下测量Axl基因的表达水平；和

(iii)将步骤(ii)中测量的水平与在控制条件下不存在化合物时测量的水平比较，其中降低将化合物鉴定为能够抑制活性。

在另一实施方案中，在上述方法的接触步骤(i)中的细胞已经用Axl基因转染，瞬时或稳定转染。然而，在另一实施方案中，步骤(iii)的控制条件包含在缺少化合物下接触相同细胞后的比较。在另一实施方案中，步骤(ii)中的控制条件包含经接触类似的缺少活性Axl基因的细胞或类似的具有突变失活形式的Axl基因的细胞后的比较。在另一实施方案中，在步骤(ii)之前，步骤(i)的细胞暴露于至少一种有关肾病的损害。损害可以选自高血糖症，缺氧，低葡萄糖浓度，和TGF-。按照本发明，暴露于化合物的细胞可以选自肾小球细胞，肾成纤维细胞，和肾小管细胞。然而，在本发明的另一实施方案中，按照上述方法鉴定的化合物可以用于制备治疗肾病的药物。

本发明的主题是另外提供诊断患者肾病的方法，其包含在来自患者的样品中测定编码Axl受体的多核苷酸的水平，其中与无肾病的患者中的多核苷酸水平相比更高的多核苷酸水平是肾病的征兆。在一个实施方案中，诊断的肾病是糖尿病性肾病或肾纤维变性，并且样品取自肾组织。

该应用还涉及通过筛选多种化合物鉴定能够抑制人Axl受体活性的化合物的方法，其包含以下步骤：

(i)将Axl受体或表达Axl受体的细胞与多种化合物接触；

(ii)在多种化合物的存在下测量Axl受体活性；

(iii)将步骤(ii)中测量的活性与在控制条件下不存在多种化合物时测量的活性比较，其中降低将多种化合物鉴定为能够抑制活性；和

(iv)分别测定存在于多种化合物中的哪种或哪几种化合物抑制人Axl受体的活性。

在本发明还有的另一方面，Axl蛋白可以用作双杂交测定或三杂交测定(例如美国专利5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72：223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8：1693-1696；和Brent WO 94/10300)中的“诱饵(bait)蛋白”，以鉴定其它与Axl结合或相互作用(“结合Axl的蛋白质”)和调节Axl活性的蛋白质。这些结合Axl的蛋白质也可能作为例如Axl信号途径上游或下游元件涉及Axl信号的传送。

双杂交***是基于大多数转录因子的调节性质，这些转录因子由可分的DNA结合和激活区域组成。简短地，测定利用两种不同的DNA构建体。在第一种构建体中，编码Axl的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)的DNA结合区域的基因融合。在第二种构建体中，获自DNA序列文库的编码未鉴定蛋白质(“猎物(prey)”或“样品”)的DNA序列与编码已知转录因子的激活区域的基因融合。如果“诱饵”和“猎物”蛋白能够体内相互作用，形成依赖于Axl的复合体，转录因子的DNA结合和激活区域被带到紧邻。该邻近允许与相应转录因子的转录调节位点连接的报道基因(例如LacZ)转录。可以检测报道基因的表达，可以分离包含功能转录因子的细胞集落并用于获得编码与Axl相互作用的蛋白质的克隆基因。

本发明另外涉及通过上述筛选测定鉴定的新试剂及其在治疗肾病中和更具体地在治疗肾病特别是本文所述的糖尿病性肾病中的应用。

本发明另外提供鉴定能够降低Axl基因表达水平的化合物的方法，所述化合物对于治疗肾病有效。按照该方法，能够表达Axl受体的细胞与化合物接触，接着将细胞暴露于至少一种与肾病有关的损害或病理学参数。Axl基因的表达水平与对照获得的表达水平比较可以显示所述化合物对Axl活性的抑制作用。

本发明另外提供携带至少一个可表达基因，特别是通过本发明鉴定的编码Axl受体的转基因动物和细胞系。本发明另外提供敲除(knock-out)的真核生物，其中通过本发明探针鉴定的和如下所述制备的至少一种核酸序列被敲除。

本发明提供发现用于治疗需要该治疗的患者肾病的药物的方法。治疗有效量的这些药物将是如核酸序列编码的或如本文或通过本发明探针鉴定的氨基酸序列表示的至少一种蛋白质，特别是Axl受体的拮抗剂。尽管这些药物优选针对治疗肾纤维变性，它们也可以用于治疗其它纤维变性疾病，如肝，肺和心脏。这些药物也可以用于治疗或防止再狭窄，即防止或减少平滑肌细胞的增殖。这些药物也可以用作治疗癌症和其它期望防止或减少内皮细胞增殖的症状的抗血管生成药物。

按照本发明的筛选测定中的任何一种可以包括鉴定化合物的步骤(如上所述)，其在测定中测试阳性，也可以包括另外的生产如此鉴定的药物的步骤。它还可以包括在将改进的化合物结合到药物中之前改善化合物以提高其期望活性的步骤。认为包含这些化合物的药物是本发明的一部分。

本发明另外提供制备组合物的方法，其包含：

(i)通过至少一种上述方法鉴定抑制人Axl受体活性的化合物；和

(ii)将所述化合物与载体混合。

在本发明的一个实施方案中，上述方法的载体是药物有效载体，与载体混合的化合物以药物有效量存在。

另外，本发明提供调节需要该治疗的患者中纤维变性相关病理的方法，其特征在于向患者施用治疗有效量的至少一种针对核酸序列的反义(AS)寡核苷酸或针对Axl序列或Axl蛋白的显性失活肽。

如本文所用，“显性失活肽”是指编码蛋白质一部分，即肽的部分cDNA序列(Herskowitz I.(1987)Nature(综述)329(6136)：219-222)。该肽可以具有不同于衍生它的蛋白质的功能。它可以与野生型靶蛋白相互作用和抑制其活性，或者它可以与其它蛋白质相互作用和抑制它们响应野生型靶蛋白的活性。特别地，显性失活是指肽抑制在细胞中正常发现的天然蛋白质活性以便调节细胞表型，即使细胞对杀死更具有抗性或敏感性的能力。对于治疗干预，肽本身被作为药物组合物的活性成分传递或者可以使用与关于AS传递相同的方法将cDNA传递至细胞。

如此下所述在药用载体中剂量给药和传递拮抗剂/调节剂/活性成分。如本文所用，以其最广泛的含义理解术语“拮抗剂或拮抗”。拮抗作用可以包括导致抑制，失活，阻止或减小基因活性或基因产物的任何机制或治疗。应当注意基因或基因产物的抑制可以提供基因或基因产物调节的相应功能的增加。拮抗步骤可以包括阻断基因产物的细胞受体，和可以包括如下所述的AS治疗。

许多综述已经包括AS技术及其巨大治疗潜力的主要方面(Anazodo等(1995)Gene 166(2)：227-232)。具有关于这种快速发展技术的化学(CrookeST(1995)Hematol Pathol.(综述)9(2)：59-72；Uhlmann等(2000)MethodsEnzymol.313：268-284.)，细胞(Wagner RW(1994)Nature(综述)372(6504)：333-335)，和治疗(Hanania等(1995)Am J Med.(综述)99(5)：537-552；Scanlon等(1995)FASEB J.(综述)9(13)：1288-1296；Gewirtz AM(1993)Leuk Lymphoma.1993；11 Suppl 1：131-137)方面的综述。在较短的时间内，关于培养的原代细胞和细胞系中AS核苷酸序列的体外使用，以及体内给药该核苷酸序列以瞬时抑制特异过程和改变身体功能已经积累丰富的信息。通过使用合成的AS寡核苷酸序列(关于近来的报道参见Lefebvre-d′Hellencourt等(1995)Eur Cytokine Netw.(综述)6(1)：7-19；Agrawal S(1996)Trends Biotechnol.(综述)14(10)：376-387；Lev-Lehman等(1997)Blood 89(10)：3644-3653)可以实现AS干预特异基因的表达。可以使用核酶代替如本文以上所述的AS序列。这在AS治疗受化学计量考虑限制的情形中是特别需要的(Sarver等(1990)Gene Regulation and Aids，第305-325页)。于是可以使用靶向相同序列的核酶。核酶是具有RNA催化活性的RNA分子(参见Cech TR(1993)Gene(综述)135(1-2)：33-36)，并在靶RNA分子中切割特异位点。

用于本发明的核酶类型选自本领域已知的。发夹核酶现在处于临床试验中并且是优选类型。通常核酶长度为30-100个核苷酸。

可以引入核苷酸的修饰或类似物以改善核苷酸的治疗性能。改善的性能包括提高的核酸酶抗性和/或提高的渗透细胞膜的能力。

当需要时，通过本领域已知的不妨碍使用和传递方法所需的AS寡脱氧核苷酸，cDNA和/或核酶的生物活性的任何方法提供核酸酶抗性(Eckstein F(1985)Annu Rev Biochem.(综述)54：367-402；Spitzer S和Eckstein F(1988)Nucleic Acids Res.16(24)：11691-11704；Woolf等(1990)Nucleic Acids Res.18(7)：1763-1769)。可以对寡核苷酸进行增强核酸酶抗性的修饰包括修饰磷酸酯主链中的磷或氧杂原子。这些包括制备磷酸甲酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯和吗啉代寡聚物。一个实施方案提供在4-6个3’-末端核苷酸碱基之间连接的硫代磷酸酯键。备选地，硫代磷酸酯键连接所有的核苷酸碱基。当保留生物活性但对核酸酶的稳定性显著提高时，可以使用其它文献中已知的修饰。

本发明还包括所有本发明多核苷酸或寡核苷酸的类似物或变体，其基本上不影响多核苷酸或寡核苷酸的功能。核苷酸可以选自天然存在或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸的修饰碱基包括黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基-，2-丙基-和其它烷基-腺嘌呤，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫尿嘧啶(thiuracil)，8-卤代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-巯基腺嘌呤，8-巯基烷基腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-卤代鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，8-巯基鸟嘌呤，8-硫代烷基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤，其它氮杂和脱氮腺嘌呤，其它氮杂和脱氮鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-氟胞嘧啶。

另外，可以制备核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构从根本上改变和更合适作为治疗或试验试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链被类似于肽中发现的聚酰胺主链代替。PNA类似物已经显示抗酶降解，延长体内和体外寿命。另外，PNA已经显示与互补DNA序列结合比DNA分子更强烈。该观察归因于PNA链和DNA链之间缺乏电荷排斥。其它可以对寡核苷酸进行的修饰包括聚合物主链，环状主链，或无环主链。

药物组合物的活性成分可以包括实施本发明所需的核酸酶抗性的寡核苷酸，或其显示具有靶向适当序列的相同作用的片段和/或核酶。可以使用本发明公开的活性成分的组合，包括AS序列的组合。

通过本领域关于核糖核酸或脱氧核糖核酸核苷酸已知的任何方法可以合成本发明的AS寡核苷酸(和/或核酶)和cDNA。例如，可以使用AppliedBiosystems 380B DNA合成仪。当使用片段时，可以合成两个或多个这样的序列并连接在一起用于本发明。

可以直接或用病毒或非病毒载体传递本发明的核苷酸序列。当直接传递时，通常使序列抗核酸酶。备选地，序列可以结合到表达盒或构建体中以便如本文以下所述序列在细胞中表达。通常构建体包含适当的调节序列或启动子以使序列在靶细胞中表达。

可以重组生产本发明的多肽(通常参见Marshak等，1996“Strategiesfor Protein Purification and Characterization.A laboratory course manual.”Plainview，N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)，通过翻译后加工可以生产类似物。糖基化的差异可以提供多肽类似物。

如本文所用，除了多肽以外，术语“多肽”是指肽和完整的蛋白质以及其一个片段或多个片段。

如本文所用，“功能相关”是指分子的生物学性能，在本文是指体内效应物或抗原功能或活性，其通过天然存在的多肽或核酸分子直接或间接实施。效应物功能包括但不限于受体结合，任何酶活性或酶调节活性，任何载体结合活性，任何激素活性，任何促进或抑制细胞与胞外基质或细胞表面分子粘附的活性，或任何结构作用，以及含有编码功能蛋白质和可表达的核酸序列。抗原功能实质上是指具有能够与针对天然存在的蛋白质产生的抗体交叉反应的表位或抗原位点。生物活性的类似物共有天然多肽的效应物功能，该天然多肽可以但不需要另外具有抗原功能。

在诊断中，从体液或从组织，优选肾组织提取样品；体液选自由血液，淋巴液，腹水，浆液，胸腔积液，痰，脑脊液，泪液，滑液，唾液，粪便，***和尿组成的流体，优选血液或尿。通过选自免疫组织化学，蛋白质印迹法，ELISA，抗体微阵列杂交和靶分子成像的方法可以测定Axl多肽水平的测量。这些方法在本领域是公知的，尤其例如对于免疫组织化学：M.A.Hayat(2002)Microscopy，Immunohistochemistry and Antigen RetrievalMethods：For Light and Electron Microscopy，Kluwer Academic Publishers；Brown C(1998)：“Antigen retrieval methods for immunohistochemistry”，Toxicol Pathol；26(6)：830-1)；对于蛋白质印迹法：Laemmeli UK(1970)：“Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of abacteriophage T4”，Nature；227：680-685；和Egger & Bienz(1994)“Protein(western)blotting”，Mol Biotechnol；1(3)：289-305)；对于ELISA：Onorato等(1998)“Immunohistochemical and ELISA assays for biomarkers of oxidativestress in aging and disease”，Ann NY Acad Sci 20；854：277-90)；对于抗体微阵列杂交：Huang(2001)“Detection of multiple proteins in an antibody-basedprotein microarray system，Immunol Methods 1；255(1-2)：1-13)；和对于靶分子成像：Thomas(2001).Targeted Molecular Imaging in Oncology，Kim等(Eds).，Springer Verlag。

通过选自RT-PCR分析，原位杂交，多核苷酸微阵列和RNA印迹法的方法可以测定Axl多核苷酸水平的测量。这些方法在本领域是公知的，尤其例如对于原位杂交Andreeff & Pinkel(编辑)(1999)，“Introduction toFluorescence In Situ Hybridization：Principles and Clinical Applications”，John Wiley & Sons Inc.；和关于RNA印迹法Trayhurn(1996)“Northernblotting”，Proc Nutr Soc；55(1B)：583-9和Shifman & Stein(1995)“A reliableand sensitive method for non-radioactive Northern blot analysis of nervegrowth factor mRNA from brain tissues”，Journal of Neuroscience Methods；59：205-208。

该应用还涉及诊断受试者的肾病，优选糖尿病性肾病或肾纤维变性的方法，其包含测定来自受试者的样品中Axl受体多肽的水平，其中与无肾病受试者中的水平相比较高的多肽水平是肾病的征兆。在优选实施方案中，Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中列出。样品取自体液，优选血液或尿。

上述讨论为本发明序列在鉴定肾病调节基因和提供诊断探针中的应用提供事实根据。本发明所用方法和效用通过下列非限制性的实施例证明。

                           方法

分子生物学通用方法

本领域已知的和未特别描述的标准分子生物学技术通常根据Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)，和Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons，NewYork(1988)，和Watson等，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York和Birren等(eds)Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，卷1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)和在美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057所阐明的方法，并结合于此作为参考。通常如PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications，Academic Press，San Diego，CA(1990)进行聚合酶链式反应(PCR)。结合流式细胞仪的原位(细胞内)PCR可以用于检测包含特异性DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，1996，Blood 87：3822.)

免疫学通用方法

在本领域已知和未特别描述的免疫学标准方法通常根据Stites等(eds)，Basic and Clinical Immunology(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)和Mishell与Shiigi(eds)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。

免疫测定

当合适时通常ELISA是一类用来评估样品的免疫测定。ELISA测定对本领域那些技术人员是公知的。在测定中可以使用多克隆和单克隆抗体。如本领域那些技术人员所知道的，当合适时可以使用其它免疫测定，如放射免疫测定(RIA)。可用免疫测定在专利和科学文献中广泛描述。参见例如美国专利3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521以及Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Springs Harbor，New York，1989。

抗体生产

如本文定义，术语“抗体”包括单克隆抗体(Mab)，多克隆抗体，还有抗体片段，如具有抗体功能活性和可以从抗体制备的片段，包括通过本领域那些技术人员已知的方法制备的Fab，F(ab’)₂，Fv和scFv(Bird等(1988)Science 242：423-426)。抗体可以是单克隆，多克隆或重组的。

便利地，可以针对免疫原或其部分，例如基于序列的合成肽制备抗体，或通过克隆技术重组制备，或者可以分离天然基因产物和/或其部分并用作免疫原。通过本领域那些技术人员公知的标准抗体生产技术，免疫原可以用于生产抗体，如通常在Harlow和Lane(1988)，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，和Borrebaeck(1992)，Antibody Engineering-A Practical Guide，W.H.Freemanand Co.，NY中所述。通过本领域那些技术人员已知的方法，还可以从抗体制备抗体片段并包括Fab，F(ab’)₂，和Fv。

为了生产多克隆抗体，用免疫原或免疫原片段免疫宿主如兔子或山羊，该免疫原或免疫原片段通常与佐剂一起，并且如果需要与载体偶联；从血清中收集免疫原的抗体。另外，可以吸附多克隆抗体以使它为单特异性的；即可以将血清吸附有关免疫原以便没有交叉反应性抗体剩余在血清中，使其单特异性。

为了生产单克隆抗体，技术涉及用免疫原超免疫适当供体，通常小鼠，和分离生产抗体的脾细胞。这些细胞与无限增殖细胞如骨髓瘤细胞融合以提供无限增殖和分泌所需抗体的融合细胞杂种。然后大批培养细胞，从培养基中收获使用的单克隆抗体。

为了生产重组抗体(通常参见Huston等(1991)“Protein engineering ofsingle-chain Fv analogs and fusion proteins”Methods in Enzymology(JJLangone，ed.，Academic Press，New York，NY)203：46-88；Johnson和Bird(1991)“Construction of single-chain Fvb derivatives of monoclonal antibodiesand their production in Escherichia coli in Methods in Enzymology(JJLangone，ed.；Academic Press，New York，NY)203：88-99；Mernaugh和Mernaugh(1995)“An overview of phage-displayed recombinant antibodies”Molecular Methods In Plant Pathology(RP Singh和US Singh，eds.；CRCPress Inc.，Boca Raton，FL：359-365)，将动物生产抗体的B-淋巴细胞或杂交瘤的信使RNA逆转录以获得互补DNA(cDNA)。扩增全长或部分长度的抗体cDNA并克隆到噬菌体或质粒中。cDNA可以是部分长度的重链和轻链cDNA，通过接头分离或连接。使用合适的表达***来表达抗体或抗体片段以获得重组抗体。通过筛选相关表达文库也可以获得抗体cDNA。

如本领域所公知，抗体可以与固体载体基质结合或与可检测部分偶联或可以结合且偶联。(关于荧光或酶促部分的偶联的通常讨论，参见Johnstone & Thorpe(1982.)，Immunochemistry in Practice，BlackwellScientific Publications，Oxford)。抗体与固体载体基质的结合在本领域也是公知的(关于通常讨论，参见Harlow & Lane(1988)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Publications，New York；和Borrebaeck(1992)，Antibody Engineering-A Practical Guide，W.H.Freemanand Co.)。本发明考虑的可检测部分可以包括但不限于荧光，金属，酶促和放射性标记，如生物素，金，铁蛋白，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，过氧化物酶，脲酶，荧光素，罗丹明，氚，¹⁴C和碘化作用。

重组蛋白质纯化

关于标准纯化，参见Marshak等(1996)，“Strategies for ProteinPurification and Characterization.A laboratory course manual.”CSHL出版社。用于生产Axl蛋白的具体纯化方案在实施例部分描述。

转基因和敲除方法

本发明提供转基因和多态基因动物和细胞(细胞系)模型，以及敲除模型。使用本领域已知的标准方法构建这些模型，如以下各项所阐明：美国专利5,487,992；5,464,764；5,387,742；5,360,735；5,347,075；5,298,422；5,288,846；5,221,778；5,175,385；5,175,384；5,175,383；4,736,866；以及Burke和Olson(1991)“Preparation of Clone Libraries in YeastArtificial-Chromosome Vectors”Methods in Enzymology，194，“Guide toYeast Genetics and Molecular Biology”，eds.C.Guthrie和G.Fink，AcademicPress，Inc.，Chap.17：251-270；Capecchi(1989)“Altering the genome byhomologous recombination”，Science，244：1288-1292；Davies等(1992)“Targeted alterations in yeast artificial chromosomes for inter-species genetransfer”，Nucleic Acids Research，20(11)：2693-2698；Dickinson等(1993)“High frequency gene targeting using insertional vectors”，Human MolecularGenetics，2(8)：1299-1302；Duff和Lincoln(1995)“Insertion of a pathogenicmutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP geneand expression in ES cells”，Research Advances in Alzheimer′s Disease andRelated Disorders Khalid Iqbal(编辑)，James A.Mortimer(编辑)，BengtWinblad(编辑)，Henry M.Wisniewski(编辑)；Huxley等(1991)“The humanHPRT gene on a yeast artificial chromosome is functional when transferred tomouse cells by cell fusion”，Genomics，9：742-750；Jakobovits等(1993)“Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificialchromosome”， Nature，362：255-261；Lamb等(1993)“Introduction andexpression of the 400 kilobase precursor amyloid protein gene in transgenicmice”，Nature Genetics，5：22-29；Pearson和Choi(1993)Expression of thehuman b-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome intransgenic mice.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，90：10578-10582；Rothstein，(1991)“Targeting，disruption，replacement，and allele rescue：integrative DNAtransformation in yeast”Methods in Enzymology，194，“Guide to YeastGenetics and Molecular Biology”，eds.C.Guthrie和G.Fink，Academic Press，Inc.，NY，19章：281-301；Schedl等(1993)“A yeast artificial chromosomecovering the tyrosinase gene confers copy number-dependent expression intransgenic mice”，Nature，362：258-261；Strauss等(1993)“Germ linetransmission of a yeast artificial chromosome spanning the murine a1(I)collagen locus”，Science，259：1904-1907。另外，PCT专利申请WO 94/23049，WO 93/14200，WO 94/06908，WO 94/28123也提供信息。

另外一种亲系可以含有同源的内源基因而不是携带直接的人转基因，所述内源基因通过基因寻靶修饰以使它近似转基因。即内源基因已经“人源化”和/或突变(Reaume等(1996)J Biol Chem.271(38)：23380-23388.)。应当理解如果动物和人序列基本上同源，不需要“人源化的”基因。转基因亲代也可以携带过表达序列，根据需要非突变体或突变序列，人源化或非人源化。这里，术语“转基因”因而用来指所有这些可能性。

另外，如本领域所已知，从携带来自每个转基因亲代的转基因和用于建立原代细胞培养物或细胞系的子代分离细胞。

当合适时，亲系对于转基因是纯合的。另外，当合适时与转基因同源的基因组中的内源非转基因是不表达的。这里，术语“不表达的”是指内源基因将不表达，和该不表达在子代中是可遗传的。例如，通过本领域的已知方法可以“敲除”内源同源基因。备选地，接收一个转基因的亲系可以在内源同源基因中携带使其不表达的突变。

基因治疗

本文所用的“基因治疗”是指将所关心的遗传材料(例如DNA或RNA)转移到宿主中以治疗或预防遗传或后天性疾病或病症表型。所关心的遗传材料编码产物(例如蛋白质，多肽，肽，功能RNA，AS)，在体内需要其生产。特别是，按照本发明的抗纤维变性方面可以使用反义分子(反-Axl多核苷酸)在基因治疗中的应用。

本发明的基因治疗可以体内或体外进行。体外基因治疗要求分离和纯化患者细胞，引入治疗基因和引入遗传改变的细胞回到患者中。复制缺陷病毒如修饰的逆转录病毒可以用于将治疗基因引入这些细胞。例如，小鼠莫洛尼氏白血病毒(MMLV)在基因治疗临床试验中公知的载体。参见例如Boris-Lauerie等，Curr.Opin.Genet.Dev.，3，102-109(1993)。

相比之下，体内基因治疗不要求分离和纯化患者的细胞。治疗基因典型地被“包装”以向患者给药，如在脂质体中或在复制缺陷病毒中，所述病毒如Berkner，K.L.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)所述的腺病毒，或在如Muzyczka，N.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利5,252,479所述的腺伴随病毒(AAV)载体中。在备选的实施方案中，如果宿主基因是缺陷的，基因在原位修复(Culver(1998)“Site-Directed recombination for repair of mutations in the human ADAgene”(摘要)Antisense DNA & RNA based therapeutics，Coronado，CA.)。另一种方法是施用“裸DNA”，其中治疗基因直接注射到血液或肌肉组织中，例如其中通过使用包被DNA的金粒的微粒轰击将治疗基因导入靶组织中。通过本领域已知的方法，例如静脉内注射，局部给药(参见美国专利5,328,470)或通过定向注射(参见例如Chen等(1994) PNAS 91：3054-3057)可以将基因治疗载体传递到患者，通常如以下各项所述：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Chang等，Somatic GeneTherapy，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)；Vega等，Gene Targeting，CRCPress，Ann Arbor，MI(1995)；Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectorsand Their Uses，Butterworths，Boston MA(1988)；和Gilboa，E等(1986)Transfer and expression of cloned genes using retroviral vectors.BioTechniques 4(6)：504-512；这些载体可以包括例如稳定或瞬时转染，脂转染，电穿孔和用重组病毒载体传染。另外，关于涉及中枢神经***的载体参见美国专利4,866,042，关于阳性-阴性选择方法还参见美国专利5,464,764和5,487,992。

基因治疗载体的药物制剂可以包括可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含其中嵌入基因传递载体的缓释基质。备选地，当完整的基因传递载体例如逆转录病毒载体可以从重组细胞完好的生产时，药物制剂可以包括一种或多种生产基因传递***的细胞。

用于本发明基因治疗的细胞类型包括淋巴细胞，肝细胞，成肌细胞，成纤维细胞，和任何眼细胞如视网膜细胞，上皮细胞和内皮细胞。优选细胞为从治疗患者中提取的T淋巴细胞，肝细胞，任何眼细胞或呼吸道或肺上皮细胞。肺上皮细胞的转染可以通过吸入雾化的脂质体，DNA-蛋白质复合体或复制缺陷病毒中的DNA载体制剂发生。参见例如美国专利5,240,846。关于基因治疗主题的综述，通常参见原文“基因治疗”，August等Advances in Pharmacology 40，Academic Press，1997。

基因产物/治疗剂(化合物)的传递

按照良好医疗实践，考虑个体患者的临床症状，给药位点和方法，给药时间表，患者年龄，性别，体重和其它医师知道的因素施用和剂量给药本发明的化合物。为了本文目的药物“有效量”因此通过本领域已知的这些考虑测定。该量必须有效实现改善，其包括但不限于提高存活率或更快的康复，或改善或消除症状及其它本领域技术人员选择的作为适当量度的指标。

在本发明的方法中，本发明的化合物可以以各种途径施用。应当理解它可以作为化合物或作为药用盐施用，并可以单独或结合药用载体，稀释剂，佐剂和赋形剂作为活性成分施用。化合物可以口服，皮下或肠胃外给药，包括静脉内，动脉内，肌内，腹膜内和鼻内给药，以及鞘内和输注技术。化合物的移植也有效。治疗的患者是温血动物，特别是包括人类的哺乳动物。药用载体，稀释剂，佐剂和赋形剂以及移植载体通常是指惰性，无毒固体或液体填料，稀释剂或包封材料，其不与本发明的活性成分反应。

应当理解人的治疗通常长于本文例举的小鼠或其它实验动物，其治疗长度与病程长度和药效成比例。剂量可以是数日时期内的单剂量或多剂量，但优选单剂量。

当肠胃外施用本发明的化合物时，通常将它以单位剂量的可注射形式(例如溶液，混悬剂，乳剂)配制。适用于注射的药物制剂包括无菌水溶液或分散剂和用于重建无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。载体可以是包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇)，其适当混合物和植物油的溶剂或分散介质。

例如通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散剂的情形中保持所需粒径和通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。非水性载体如棉籽油，芝麻油，橄榄油，大豆油，玉米油，向日葵油，或花生油和酯类如肉豆蔻酸异丙酯也可以用作化合物组合物的溶剂***。另外，可以加入提高组合物稳定性，无菌性，和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂，抗氧化剂，螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌和抗真菌试剂，例如对羟基苯甲酸酯类，氯代丁醇，苯酚和山梨酸可以确保防止微生物作用。在许多情形中，期望包括等渗剂，例如糖类，氯化钠等。通过使用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶可以致使可注射药物形式的延长吸收。然而按照本发明，所用的任何载体，稀释剂或添加剂必须与化合物相容。

通过将用于实施本发明的化合物根据需要与其它各种成分结合到所需量的适当溶剂中，可以制备无菌可注射溶液。

本发明的药物制剂可以以可注射制剂的形式施用于患者，所述可注射制剂包含任何相容载体，如各种赋形剂，佐剂，添加剂，和稀释剂；或者用于本发明的化合物可以以缓释皮下移植物或定向传递***如单克隆抗体，载体传递，离子渗透，聚合物基质，脂质体和微球粒的形式肠胃外施用于患者。用于本发明的传递***的实例包括在以下各项中提供的那些：美国专利5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196。其它这些移植物，传递***和模块对于本领域那些技术人员是公知的。

用于本发明的化合物的药物制剂可以口服施用于患者。可以使用常规方法如以片剂，混悬剂，溶液，乳剂，胶囊，粉剂，糖浆等施用化合物。优选口服或静脉内传递化合物并保留生物学活性的已知技术。

在一个实施方案中，本发明的化合物可以最初通过静脉内注射施用以将血液水平带到适当水平。然后通过口服剂量形式保持患者的血液水平，尽管取决于患者症状和如上所述可以使用其它给药形式。施用的量将随治疗的患者而变化，在每日约100ng/kg体重至100mg/kg体重的范围内变化，优选10g/kg至10mg/kg。

贯穿本申请，通过作者和年引用各种出版物，通过号引用专利，包括美国专利。这些出版物和专利它们完整的公开内容在此通过参考结合到本申请中以便更充分地描述本发明有关现有技术的状态。

已经以举例说明的方式描述了本发明，应当理解所用术语意欲被认为是描述而不是限制的性质。

明显地，按照以上教导本发明的许多改进和变化是可能的。因此应当理解在所述本发明的范围内，可以与具体描述不同来实施本发明。

                         实施例1

            通过微阵列杂交研究鉴定Axl过量表达

按照本发明，使用微阵列杂交方法以便发现在糖尿病性肾病和肾纤维变性中差异调节的基因。

基因表达的基于微阵列的分析是基于人成纤维细胞的分析，该人成纤维细胞经受选择的导致胞外胶原累积和增殖-纤维变性标志变化的刺激。按照本发明，首先制备特异性的“纤维变性”DNA芯片，接着用19种不同类型的探针进行微阵列杂交实验。通过专有算法进行结果分析，通过使用生物信息学和科学文献进行所选基因组的分析。

特异性“纤维变性”DNA芯片的制备

按照受让人的SDGI方法(PCT申请公开号WO 01/75180)从生长停滞的人成纤维细胞制备专用的人“纤维变性”DNA芯片。通过以下表1提供的处理施加生长停滞：

     表1.“纤维变性”芯片制备的生物材料

	处理
		1	G1停滞血清缺乏的l.p.HFs*
2	在8Gyγ-照射36小时和48小时后l.p.HFs*
		3	在加入H2O2 200μM 5天后l.p.HFs*
4	在UV(生长停滞剂量)后l.p.HFs*
		5	在博来霉素处理50ng/ml 48小时后l.p.HFs*
6	在依托泊甙处理400ng/ml 48小时后l.p.HFs*
		7	在阿霉素处理50ng/ml 48小时后l.p.HFs*
8	来自正常个体的衰老的HF
		9	来自成人早老症个体的衰老的HF
10	来自儿童早老症个体的衰老的HF

l.p.HFs^*-低传代人成纤维细胞

除非另外指出，所有人成纤维细胞(HF)在处理前位于第15代。制备来自所有处理的HF的RNA，合并和用于通过受让人专有的SDGI方法的文库制备。该芯片还包含编码已知在编程性细胞死亡，细胞毒性和重复性细胞老化中发挥作用的基因的人EST。

成纤维细胞培养

培养正常人胎儿肺成纤维细胞(WI-38，Coriell Cell Repositories)并在补充有10％失活胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM中培养和继代培养。在25cm²组织烧瓶中将成纤维细胞培养至汇合，在胰蛋白酶化(在Hank平衡液中0.5％胰蛋白酶-EDTA，不含Ca²⁺和Mg²⁺)后在37℃在5％CO₂的气氛中传代培养。将2ml胰蛋白酶加入每个摇瓶并温育5分钟；然后离心(5min，1000rpm)培养物，将新鲜培养基加入沉淀物。***条件为1∶4-1∶6。

因为纤维变性病的标志是成纤维细胞扩增和/或胞外基质成分(主要是胶原)的合成增加，使用不同处理方案和检查处理的体外培养的成纤维细胞的增殖和胶原合成速率。

成纤维细胞扩增测定

通过用中性红(BioRad)染色评估分会合的成纤维细胞的增殖速率。将成纤维细胞接种于96-孑平板(6×10³/孔)中200μl补充的DMEM/10％FBS中。在过夜培养后，用补充的DMEM/2％FBS洗涤孔两次。然后将浓度为100mM的TGF-β(2-20ng/ml)或甲磺酸去铁胺(DFO，其导致化学缺氧的症状)加入200μl补充的DMEM/2％FBS中16小时，24小时，72小时或5天。

在葡萄糖处理的情形中，在过夜培养后，用补充的不含葡萄糖的DMEM/2％FBS洗涤含有细胞的孔两次。通过将贮液(110mM)溶解在补充的不含葡萄糖/2％FBS的DMEM中制备葡萄糖的工作浓度(5.5mM，15mM，27.5mM，或55mM)。将制备的葡萄糖溶液加入成纤维细胞培养物24或72小时。

在完成温育后，用100μl 1％中性红将细胞染色2小时。在用冷PBS洗涤后，用200μl乙醇-Sorenson缓冲液溶液(1∶1)固定成纤维细胞单层10分钟。用自动分光光度计测量光学密度(λ＝540nm)。

胶原生产测定

通过[³H]-脯氨酸掺入到胶原蛋白中评估汇合成纤维细胞单层的胶原生产。将成纤维细胞接种于24-孔组织培养板中(2×10⁴/孔)，并在1ml补充的DMEM/10％FBS中培养直至汇合。

将汇合的成纤维细胞培养物与制备溶液温育24或48小时。然后加入[³H]-脯氨酸(10μCi/孔)并将培养物温育另外24小时。在温育结束时，滗析培养基并与或不与胶原酶温育18小时，接着用50％和10％TCA沉淀。作为不与胶原酶温育的样品和在胶原酶消化后剩余的那些中含有[³H]-脯氨酸的总蛋白的差异，测定胶原的生产。为了测定每孔中的细胞数，在实验最后一天通过胰蛋白酶化脱离成纤维细胞，并在血细胞计数器中计数。

用于微阵列杂交的探针来源于这些处理的成纤维细胞。按照本发明，使用与糖尿病性肾病发展有关的处理，如葡萄糖缺乏或缺氧(模拟在纤维变性肾中发展的局部缺血症状)；高葡萄糖(模拟糖尿病性高血糖症)和TGF-β诱导(模拟特征为生长因子和细胞因子不平衡的纤维变性症状)。

更具体地，如下处理人成纤维细胞：

1. 4种浓度(5.5，15，27.5，或55mM)的葡萄糖24小时和72小时

2. 2-20ng/ml的TGF-β，24小时或72小时

3.浓度为100mM的DFO去铁胺，溶解在0.5ml DMEM中，包含5％FCS，50μg/ml β-氨基丙腈，和50μg/ml抗坏血酸(改进的DMEM)。24，48和72小时。

这些培养的成纤维细胞的增殖速率分析显示，与对照培养物相比在无葡萄糖的培养基中和在55mM葡萄糖中培养成纤维细胞24小时分别导致它们增殖速率降低20％和30％。与对照相比，不同浓度(5.5mM-27.5mM)的葡萄糖的加入几乎未影响成纤维细胞的增殖。在加入DFO后观察到成纤维细胞增殖的显著降低(从16小时温育后的20％降低至处理5天后80％降低)。以2和20ng/ml加入TGF-β导致成纤维细胞增殖速率在24小时处理后增加～60％。

关于胶原合成速率，所有的处理(除了55mM葡萄糖)导致成纤维细胞增加的胶原生产。最显著的作用是在加入浓度为2-20ng/ml的TGF-β后观察到的，提供胶原生产增加110-180％。

在下一步骤中，从这些处理的成纤维细胞中提取RNA并用于制备微阵列杂交的探针。杂交方案在下面表示：

                              表2.杂交方案

探针名称	染料	探针1	探针名称	染料	探针2
						FG1A	Cy3	未处理的人成纤维细胞共有的标准化探针	FG1B	Cys5	l.p.未处理的HF*
FG19A	FG19B	l.p.未处理的HF*
			FG18A	FG18B	l.p.HF*w/o葡萄糖72小时
FG17A	FG17B	l.p.HF*TGF-β20ng/μl72小时
			FG16A	FG16B	l.p.HF*TGF-β20ng/μl24小时
FG15A	FG15B	l.p.HF*w/o葡萄糖24小时
			FG14A	FG14B	l.p.HF*TGF-β2ng/μl72小时
FG13A	FG13B	l.p.HF*TGF-β2ng/μl24小时
			FG12A	FG12B	l.p.HF*5.5mM葡萄糖72小时
FG11A	FG11B	l.p.HF*5.5mM葡萄糖24小时
			FG10A	FG10B	l.p.HF*缺氧5天
FG9A	FG9B	l.p.HF*55mM葡萄糖72小时
			FG8A	FG8B	l.p.HF*55mM葡萄糖24小时
FG7A	FG7B	l.p.HF*缺氧3天
			FG6A	FG6B	l.p.HF*27.5mM葡萄糖72小时
FG5A	FG5B	l.p.HF*27.5mM葡萄糖24小时
			FG4A	FG4B	l.p.HF*缺氧16小时
FG3A	FG3B	l.p.HF*15mM葡萄糖72小时
			FG2A	FG2B	l.p.HF*15mM葡萄糖24小时

l.p.HFs^*-低传代人成纤维细胞

在所有杂交实验中探针1是相同的，并用从未处理的人成纤维细胞(15代)中提取的RNA制备。该探针用作生物对照和作为共有的标准化探针，允许比较获自不同杂交实验的结果。

按照本发明，进行总共19次杂交实验。在双杂交实验(FG1和FG19)中，共有的标准化探针(所有杂交实验中的探针1)与其自身杂交(即探针1与探针2相同)。通常，进行这些杂交实验以便测定标记质量和评估共有标准化探针检测印迹在芯片上的大部分cDNA克隆的能力。

基因表达结果的生物信息学分析

受让人专有的微阵列杂交结果的统计学分析是基于假设即基因表达的变化与不同生理和病例症状相关，并且在许多情形中构成它们的基础。因此，在一组给定的实验中，特定的治疗方案/条件与特定的基因表达图谱相关。另外，我们假设在不同(病)生理症状/治疗之间存在一些层次，即一些比另外一些更类似。

该分析的最终目标是通过比较每种表示其某些方面的大范围条件下的基因表达模式，阐明构成复合体生物现象基础的特异性和普通机制。更具体地，在按照本发明产生的杂交结果组中，我们期望观察它们的表达对于不同类型的糖尿病性肾病相关症状(缺氧，高葡萄糖，TGF-β)共有或独特的基因组，其中对外加处理的应答是急性或慢性的。

杂交结果分析

按照本发明，在体外差异处理的人成纤维细胞中，鉴定一组46个基因，通过不同类型的外加处理其活性显著上调。

鉴定的基因产物属于9种不同的功能组：

1.胞外基质蛋白和胞外基质蛋白的受体；

2.分泌的生长因子相互作用蛋白和潜在的生长因子受体；

3.信号转导转接(adaptor)蛋白；

4.细胞骨架蛋白(大部分涉及激动蛋白细胞骨架功能)；

5.Ca²⁺-结合蛋白质；

6.ER-居留(resident)蛋白；

7.核输入介质；

8.涉及RNA和蛋白质合成与加工的蛋白质；

9.新基因；

鉴定的46个上调基因划分如下：

(a)11个是具有已知功能的已知基因，认为涉及纤维变性(胶原类型III和I(α1和α2)，纤连蛋白，核心蛋白聚糖，β-ig-h3，整合蛋白，TIMP3，CD44，平滑肌肌动蛋白，和Arp2/3(Arc34))；

(b)28个是具有已知功能的已知基因，但先前不知道涉及纤维变性。本发明主题Axl属于该类；

(c)2个是编码具有未知功能并且不知道涉及纤维变性的基因，和

(d)5个是新基因。

使用微阵列杂交技术，发现Axl的表达被人成纤维细胞的TGF-β处理诱导至少2倍。

                        实施例2

通过体外实验证实Axl是TGF-β诱导的基因(表达和磷酸化状态)

为了证实芯片杂交结果，通过蛋白质印迹分析监视内源Axl表达对TGF-β刺激的反应。从各种细胞系中提取总细胞蛋白，(其中也用TGF-β(5ng/ml 24小时)刺激Rat1细胞系)，通过蛋白质印迹分析来分析Axl的表达。在8％SDS凝胶上跑样三十(30)μg总细胞裂解物。

结果显示在Rat1细胞中在TGF-β刺激后稍微上调(在图1中显示)。

对缺乏血清24小时然后用5ng/ml TGF-β刺激指定时间(15分钟至2小时)的Ratl细胞进行另外的实验。

结果显示在TGF-β处理15分钟后TGF-β确实诱导Axl蛋白水平(图2)。还观察到其磷酸化的增加(图3)，提示响应于TGF-β，Axl蛋白被诱导和功能活化。

                        实施例3

通过形态学，免疫染色法和原位杂交评估肾纤维变性体内模型的

形态学

为了评估普通形态学，通过苏木精-曙红(HE)将肾石蜡切片染色。Sirius Red(SR)染色法被用于显示切片中的胶原。

免疫染色法

间质肌成纤维细胞的累积被认为是肾纤维变性过程的发展中一个重要的初始步骤。为了显示肌成纤维细胞，α-平滑肌肌动蛋白特异性的单克隆抗体(克隆1A4)被用于肾石蜡切片的过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)免疫染色。单克隆抗体PC-10被用于增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫染色。为了实现足够的PCNA免疫染色，在进行PAP染色之前将脱石蜡的切片进行抗原恢复(retrieval)步骤。

原位杂交

合成³⁵S-标记的核糖探针并按照标准方案与肾石蜡切片杂交。在杂交后的洗涤步骤以后，将切片风干，通过将切片曝露于X-射线胶片过夜来进行宏观-放射自显影。对于微观-放射自显影，将切片浸入核示踪乳胶中并黑暗保存在4℃中。在2-3周后将曝光的切片显影，用HE将切片轻微复染并覆盖滑动用于显微镜检查。

原位杂交的探针

用作核糖探针合成模板的cDNA是大鼠骨桥蛋白cDNA，小鼠转化生长因子β1 cDNA，小鼠前胶原α1(I)cDNA和小鼠血小板反应蛋白1cDNA。结果：

ZDF大鼠

9月大的ZDF大鼠(zucker糖尿病性肥胖大鼠)的样品提供肾盂积水的肾，具有膨胀的肾盏。用显微镜这些样品提供肾小球硬化症和肾小管间质纤维变性的图像。按照这些形态学变化，当与正常肾相比时，通过与原位杂交测量的标记基因(骨桥蛋白(OPN)，转化生长因子I(TGF-β1)和前胶原α1(I)(Col1))的表达显著改变。在皮层和髓部在所有管状结构中可检测强烈的OPN表达。TGF-β1表达广泛分布于整个***中。一些上皮细胞也显示TGF-β1表达。在大多数髓部内的***中通过原位杂交可以检测Col1表达，而皮层表达是“聚焦的(focal)”。

年老的fa/fa(肥胖zucker)大鼠

12个月大的fa/fa大鼠的样品显示强烈的肾小球硬化症和在整个皮层和髓部的扩散管间质纤维变性。标记基因的表达模式对应于形态学变化。OPN通过皮层和髓部中的管状结构表达。多种***表达TGF-β1。显著地，多焦点和单***在皮层和髓部中都显示强烈的Col1表达以致表达Col1的细胞的数量似乎在fa/fa样品中比在ZDF样品中多。

有趣地，尽管胶原显著累积，在ZDF或fa/fa大鼠的肾小球中未检测到Col1表达，如通过Sirius Red染色法所显示。这提示在肾小球细胞中Col1 mRNA的低稳定态水平。

年老的SD(正常)大鼠

年老的SD大鼠的样品显示在肾小球和间质空间中胶原的累积增加，和标记基因表达的增加。显著地，纤维变性变化的强度在样品中变化，结果所研究四个样品中之一与年轻的动物相比显示极小的变化；另一样品中的纤维变性变化局限于“极性”区域，两个样品显示在整个切片中胶原的均匀累积和标记基因的提高表达。

Goto Kakizaki(GK)/Wistar(正常)48周龄大鼠

GK和Wistar 48周龄大鼠的样品显示在肾小球和间质空间中的胶原累积。该累积在GK样品中更显著。两个样品用于mRNA分离：C9和GK9。两者都与IGFBP4特异性的探针杂交。原位杂交结果显示GK样品证明该基因提高的表达。

永久的UUO

一个纤维变性的已知模型是使用单侧输尿管梗阻(UUO)。将尿道之一梗阻(见下面)，在梗阻后1，5，10，15，20和25天杀死动物。

永久的UUO导致皮层和髓部中***的胶原合成的快速(UUO5天)激活。在UUO的20-25天左右，大量的间质胶原沉积在间质空间中，而肾小球的胶原累积局限于外膜。因此，永久UUO样品提供急性管间质肾纤维变性的模型，其无显著的肾小球硬化变化。

上述模型可以用作测试抑制剂的治疗功效的模型***，所述抑制剂通过所述任何筛选***鉴定。

                        实施例4

            永久单侧输尿管梗阻(UUO)的方案

测试***

品系：雄性Sprague-Dawley大鼠(9周龄)

组大小：手术的大鼠n＝5；假手术的大鼠n＝3

组数：假手术组和手术组都为6(即手术后或假手术后1天，5天，10天，15天，20天和25天)

步骤

用***/甲苯噻嗪麻醉大鼠，并打开腹腔。在暴露后，右肾的输尿管用其上的缝线结扎(UUO)。在假手术大鼠中，暴露输尿管但不结扎。

研究终止

研究被终止在UUO步骤后或假手术后24小时，5天，10天，15天，20天和25天。在这个时间点，为收集右肾在CO₂窒息下用放血法处死大鼠。在外膜被剥落后，将肾横切。将一半固定在10％***缓冲液中，另一半立即转移至eppendorf管并冰冻在液氮中用作RNA分析。

                        实施例5

         Axl基因在正常和纤维变性的人肾中的表达分析

通过原位杂交，用人肾组织样品切片研究Axl的表达模式。此次实验性的研究的样品包括：

1.正常人肾(32岁女性)；

2.糖尿病人肾，其表现出肾小球硬化症和小管间质性纤维变性的症状(62岁男性)；

3.肾硬化，其伴随大面积扩散的纤维变性(56岁女性)；

4.排斥的肾移植物，其表现出血管硬化，淋巴细胞浸润，肾小球硬化症和疤痕形成纤维变性(44岁女性；移植术后两年)。

所有样品的代表性切片进行与延长因子1α mRNA特异性探针的试验性杂交以便确保可杂交的mRNA的存在和确定杂交前处理的最佳疗法。

结果显示正常肾脏中Axl的表达非常低。另一方面在纤维变性的肾脏中，在肾内纤维变性区域的管状上皮细胞中观察到显示较高Axl基因水平的染色。

因此，这些涉及与人纤维变性样品原位杂交的实验表明Axl基因涉及肾内纤维变性区域的管状上皮细胞的增殖。

                        实施例6

     在正常和纤维变性大鼠肾脏样品中Axl基因的表达分析

小鼠EST克隆(登记号：BG293435 gi：4502194)被用作制备与啮齿动物Axl互补的核糖探针的模板。将放射性标记的探针与下列切片杂交：

1.永久UUO多模块(multiblock)，其由假手术后25天固定的对照样品；和UUO24小时，5天，10天和25天固定的样品(每个时间点一个样品)组成；

2.大鼠慢性肾衰竭样品：2年，7个月大鼠的肾；

3.ZDF样品：4.5(非纤维变性)和9个月大的(严重纤维变性)的ZDF肾的样品；

4.Fa/fa样品：3，6(非纤维变性)和12个月大(严重纤维变性)的fa/fa肾的样品；

5.多模块大鼠组织。

原位杂交的结果分析证明在非纤维变性样品(假手术UUO样品和年幼的ZDF及fa/fa样品)中Axl低水平表达。在这些样品中，肾小球和单个间质/血管周细胞区域有微弱杂交信号。有趣地，在ZDF和fa/fa肾脏的年幼样品中观察到管状上皮细胞中小的表达焦点。这些焦点与浸润淋巴细胞和/或***的少量积累相关。后面的这些细胞类型也表现出杂交信号。

输尿管梗阻导致Axl杂交信号的强度和模式的显著变化，以致UUO24小时后杂交信号可以在外髓质中髓袢厚上行肢的上皮层和收集管的上面观测到。杂交信号还扩散至皮层，其中收集管，收集小管和末端小管显示显著的杂交信号。此种表达模式表明作为对梗阻的反应，Axl转录在肾单位的远端部分迅速激活。这种上皮表达模式在稍后的UUO时间点保持。除上皮信号外，从UUO 5天后开始在间隙细胞中可以看到一些表达细胞的累积。这些***中的至少一些可以鉴定为内皮细胞。

表示慢性纤维变性模型的样品也表现出在Axl表达模式上的显著变化。因此，老的fa/fa样品表现出遍及切片的多焦点强Axl表达。从形态上看，这些焦点表现出小管间质性纤维变性的显著信号，例如，***的聚集和管状上皮细胞的增殖。上皮细胞和间隙细胞都显示杂交信号。老的ZDF样品表现出相似的模式。值得注意的是，小管间质表达的多个焦点包含有清晰萎缩信号的管状轮廓。萎缩的细胞显示出Axl杂交信号。老的ZDF样品因炎性浸润区域的出现而突出。一些浸润细胞表现出Axl杂交信号。在7个人的纤维变性肾样品中的4个观察到了Axl的这一特性。在慢性肾衰竭样品切片(2年7个月的大鼠)中，Axl-特异性杂交信号广泛分布。与在剩余的纤维变性样品中一样，表达结构包含萎缩的和“增殖的”，间质和炎性细胞。

因此，大鼠肾样品的Axl基因的原位杂交研究结果证明了非纤维变性肾组织中的低水平表达。病理样品显示了这个基因在管状上皮细胞和一些间质，血管，炎性细胞中的表达。病理表达模式与之前在人的纤维变性肾脏中发现的相似。这表明Axl基因产物参与到人和大鼠肾纤维变性中共同的病理机制中。显著地，动物研究结果清晰地证明Axl基因紧随前纤维变性损害(UUO)迅速激活，并在过程更高级的阶段中持续。这说明，针对Axl基因产物的治疗方法可能被应用于慢性肾衰竭的任一阶段。此外，响应UUO的Axl表达的快速激活暗示Axl参与到急性肾衰竭中(这个暗示可以容易地通过对从急性肾衰竭患者得到的样品原位杂交研究得以检验)。如果这样的话，Axl-定向治疗可能会对急性肾衰竭有益。

多模块分析显示遍及大鼠组织的相当广泛的杂交信号。在从食管到结肠的肠道的所有隔室的固有层中，杂交信号清晰可见。从形态上看，阳性细胞可辨认为成纤维细胞和组织细胞/巨噬细胞。

同样的两种细胞类型似乎在其它器官(皮肤，唾液腺，心脏，***，肝入口导管)的切片中存在的***中显示杂交信号。

在脾脏的红髓中观察到显著的杂交信号。信号主要位于巨噬细胞和一些淋巴细胞。在大***的hillary区域中的窦中也发现相似的表达模式(淋巴细胞和巨噬细胞)。淋巴***的另一组成部分，胸腺，也包含阳性淋巴细胞。多数阳性淋巴细胞集中在髓质，而分散的皮层包含单个阳性细胞。在肺切片中可发现显示强杂交信号的分散细胞。阳性细胞的形态显示，Axl基因在肺中的表达局限在巨噬细胞的亚型和肺上皮(I型)细胞。可以在肺泡壁和肺泡中以及支气管腔中发现两类细胞的表达。这种肺细胞表达的模式说明Axl表达在这些细胞类型“脱落(shedding)”之前。

除上述入口管细胞外，肝窦状小管细胞的亚型(上皮细胞，星状细胞和枯否细胞)也表现出Axl的表达。在睾丸中发现弱的杂交信号。这个信号位于一些支持细胞和一些在***发生上皮的基底层中的生殖细胞。

Axl-特异性探针也与正常大鼠脑的垂直切片杂交。这个杂交的结果显示了在大鼠中枢神经中更低水平的表达。在小脑中发现了唯一一个“集中”表达的突出位点。这里弱的杂交信号位于处在分子层和颗粒层间边界上的那层细胞中。与染有抗-MAP2(神经元标志)和抗-GFAP(星状胶质细胞标志)的平行切片的比较暗示在这个区域Axl表达的神经胶质特异性。在脑组织的其它区域分散的单个内皮和可能的胶质细胞中发现微弱的杂交信号。

因此，原位杂交研究说明Axl在大鼠组织中的相当广泛的分布。在许多器官中，间质和***为表达位点。每个细胞的组成型表达水平似乎比UUO后的纤维变性肾组织小管间质组分或慢性模型中所发现的更低。

                        实施例7

          Axl活性的证实和与细胞纤维变性的相关性

为了检测Axl的体外功能，使用几种方法：

1.EGFR-Axl嵌合体在EGFR缺陷的细胞(NIH3T3-克隆2.2)中过量表达。用EGF刺激过量表达物。检查与纤维变性有关的细胞应答(例如胶原合成，纤连蛋白表达)。

2.含有Axl全长可读框的表达载体(Pires-Axl)被用于获得Axl在NIH3T3细胞中的过量表达。这些细胞另外用于分析Axl过量表达对细胞纤维变性反应的作用。检查细胞反应(例如胶原合成，纤连蛋白表达)。

3.也将Axl转染至NRK-49F和NRK-52E细胞。获得的过量表达的细胞用于胶原测定，通过FACS测量整合蛋白的表达。这些测定在TGF-β或GAS-6刺激之后(分别在NRK-F和NRKE中)进行。

                        实施例8

                  “概念证明”的体内模型

为了确定Axl在肾纤维变性和肾小球硬化症中的体内功能作用，使用其中Axl基因被破坏的小鼠。这些小鼠由哥伦比亚大学的Goff教授产生并获得用于Axl的功能证实。使用这些小鼠以便根据不同的肾纤维变性和肾小球硬化症模型(例如UUO)，与暴露于相同治疗的它们的正常对应物相比评估肾功能。随后，评估肾形态学，平滑肌肌动蛋白表达和胶原表达作为肾功能的度量。

                        实施例9

             用抗-AXL抗体免疫染色大鼠肾样品

按照我们建立的方案(参见方法部分)，UUO多模块(包括假手术对照，UUO24小时，5天，10天，20天和25天)和慢性肾衰竭(2年7个月大的大鼠)的切片被抗AXL抗体免疫染色。

在对照(假手术)样品中未观察到免疫染色。UUO样品在24小时-25天显示阳性免疫染色。在管状上皮细胞的顶部观察到大多数显著的染色。从UUO5天开始，在***中也观察到免疫染色。慢性肾衰竭的样品也显示显著的管间质免疫染色。

                        实施例10

                        筛选测定

A.无初级细胞体外测定

基于Axl蛋白激酶结构域(hCytoAxl)的无细胞测定

对于化学文库的HTS开发了基于荧光偏振(FP)的测定以鉴定Axl酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂。测定基于检测作为底物酪氨酸磷酸化结果出现的荧光偏振(FP)的变化。在该测定中，通过Axl(竞争物)磷酸化的底物与磷酸酪氨酸特异性抗体(pY-Ab)竞争结合荧光标记的磷酸肽(示踪物)。未结合的示踪物显示低偏振，而其与磷酸酪氨酸特异性抗体的复合体由于限制的荧光团旋转而显示高偏振值。因此向示踪物-Ab复合体加入竞争物导致荧光偏振的降低，其可以检测。在HTS荧光偏振技术的优势中有对化学文库组分的自身荧光或它们的淬灭效应导致的荧光强度的变化相对不敏感。另外，FP是均相技术，在测量前不要求分离测定组分。

在昆虫细胞(SF9细胞)中生产重组hCytoAxl(受体酪氨酸激酶的胞质结构域，aa 495-894)。为了纯化使用NiNTA基质。在测定中作为潜在的axl底物测试3种不同的底物：

肽1-Biot-PDEILYVNMDE(主要的Axl自身磷酸化位点)

肽2-Biot-LSKKIYNGDYYR(Axl活化环肽)

PGT-聚(Glu∶Tyr)(4∶1)-普遍的，常规使用的酪氨酸激酶底物

来自昆虫细胞的hCytoAxl固定在珠粒上。使用聚(Glu∶Tyr)作为底物，珠粒结合的蛋白质进行体外基于荧光偏振的酪氨酸激酶测定，并进行荧光偏振的测量。测定固定蛋白质的活性。研究肽1和肽2的使用。也检查可溶性纯化蛋白质的活性。

作为从昆虫细胞生产Axl蛋白的备选方案，还可以从表达该蛋白质的细菌中生产Axl。克隆重组hCytoAxl(受体酪氨酸激酶的胞质结构域，aa495-894)。为此，制备3种构建体：

GST-cyto Axl

GST-cyto Axl-His

GST cyto Axl K567R(“激酶失活”)-作为对照

所有构建体显示在细菌中高表达。将谷胱甘肽亲和树脂，或Ni NTA亲和树脂接着谷胱甘肽亲和树脂用于纯化以确保hCytoAxl制剂的特异性(缺少其它激酶)。来自细菌的纯化蛋白用于体外测定，其使用以上关于昆虫细胞来源的Axl蛋白所述的相同底物和方案。

基于全长hAxl蛋白的无细胞测定

在无细胞测定中使用DELFIA方法(Wallac/PerkinElmer)筛选hAxl抑制剂，该方法基于增强时间分辨荧光测定和实现广泛动态范围内高灵敏度的分离。它基于底物肽通过hAxl的酪氨酸磷酸化。

建立方法。所用肽为生物素-KKIYNGDYYRQGR(来源于Axl激活环)。hAxl-c-Myc蛋白(含有c-末端myc标签的全长hAxl)在293细胞中表达。在细胞裂解后用9B11(抗-c-Myc标签抗体)和蛋白质G-Sepharose免疫沉淀细胞裂解物hAxl-c-Myc。免疫复合体用于激酶测定缓冲液中的体外激酶反应，200uM ATP和0.5uM生物素化的肽。通过加入EDTA终止激酶反应(1小时)，并进行Delphia分析。我们的结果证明在该测定中固定的hAxl-c-Myc对其底物的高活性。分析来自293细胞的可溶性蛋白的活性。

B.次级基于细胞的测定

为了评估细胞***中在抑制剂的存在下Axl的活性，采用几种方法。

第一种基于EGFR-hAxl嵌合体(EGFR胞外结构域代替Axl的胞外结构域)，使用瞬时方法和STAT3用于报告基因测定(STAT3是Axl的下游目标)。测定的读出是发光(Dual Luciferase Stop & Glo kit-Promega)。

所用细胞系是NIH/3T3(2.2)(缺少内源性EGFR表达)和293T。

这些共转染：EGFR-hAxl嵌合体，STAT3-萤火虫荧光素酶报道基因(pSTAT3-TAluc-Stratagene)作为Axl活性诱导的报道基因(用作对照的TA-Luc载体)和Renilla荧光素酶(pRL-TK-Promega)以确保STAT3产生信号的特异性。用EGFR-hAxl激酶失活(KD)突变嵌合体，pSTAT3-TAluc-Stratagene和pRL-TK-Promega转染的细胞用作特异性对照。

转染后24小时用“饥饿”培养基(含有0.5％BSA的DMEM)代替培养基另外24小时。使用血清缺乏方案以便最小化血清中EGF的存在可能导致EGFR-hAxl嵌合体聚集，导致其激活的可能性。细胞用EGF(100ng/ml)活化3小时(在无血清培养基中)，然后裂解。来自细胞裂解物的样品与萤火虫荧光素酶底物温育，然后Renilla荧光素酶底物(Stop & Glo dualLuciferase assay/Promega)。

结果显示瞬时转染的EGFR-hAxl嵌合体显示自身磷酸化，而EGFR-hAxl嵌合激酶失活(KD)突变嵌合体转染的细胞未表明Axl在EGFR-hAxl嵌合体中有活性。通过使用不同缺乏血清的方案和优化转染参数优化EGF可诱导的Axl激活。在优化后将使用STAT3-荧光素酶报道基因***的EGFR-hAxl嵌合体的瞬时转染方案用于基于细胞的测定，该测定之前用EGF激活axl活性。

一种备选的基于细胞测定的方法也依赖于基于STAT3报告基因的测定，但不同于第一种方法，使用稳定转染的EGFR-hAxl嵌合细胞克隆，其显示自身磷酸化和EGF可诱导的应答。293和NIH3T3细胞都用于生产稳定的EGFR-hAxl嵌合体的克隆，STAT3-萤火虫报告基因***用于瞬时方法。将用EGFR-hAxl激酶失活(KD)突变嵌合体稳定转染的293和NIH3T3细胞用作特异性对照。如上所述也评估这些在基于STAT3报告基因的测定中axl的活性。

基于EGFR-hAxl嵌合生物测定(使用EGF刺激)的第三种备选方法，评估使用GAS6刺激的全长hAXL的生物测定。

转染NIH/3T3(2.2)，产生表达hAXL和hAXL失活激酶突变体的稳定克隆。这些未显示组成型的Axl酪氨酸磷酸化。

在该测定中，用STAT3-萤火虫荧光素酶报告基因(pSTAT3-TAluc-Stratagene)和Renilla荧光素酶(pRL-TK-Promega)瞬时转染稳定的克隆。在转染后，将GAS6用于刺激Axl活性，其通过发光测量(DualLuciferase Stop & Glo kit-Promega)。

Claims (35)

1.一种鉴定能够抑制人Axl受体活性的化合物的方法，其包含以下步骤：

(i)将Axl受体或表达Axl受体的细胞与化合物接触；

(ii)在所述化合物的存在下测量Axl受体活性；和

(iii)将步骤(ii)中测量的活性与在控制条件下不存在所述化合物时测量的活性比较，其中降低将化合物鉴定为能够抑制活性。

2.权利要求1的方法，其中所述测量的活性是Axl受体底物的酪氨酸磷酸化。

3.权利要求1的方法，其中所述测量的活性是Axl受体的自身磷酸化。

4.权利要求1的方法，其中所述细胞与所述化合物接触。

5.权利要求4的方法，其中与所述化合物接触的细胞是肾小球细胞并且测量的活性是所述肾小球细胞的增殖。

6.权利要求4的方法，其中与所述化合物接触的细胞是肾成纤维细胞并且测量的活性是所述肾成纤维细胞的增殖。

7.权利要求4的方法，其中与所述化合物接触的细胞是肾成纤维细胞并且测量的活性是在所述肾成纤维细胞的胞外基质中的胶原沉积。

8.权利要求4的方法，其中与所述化合物接触的细胞是肾小管细胞并且测量的活性是所述肾小管细胞的增殖。

9.权利要求4的方法，其中与所述化合物接触的细胞是肾小管细胞并且测量的活性是转分化为肌成纤维细胞。

10.权利要求4的方法，其中在接触步骤(i)中的细胞已经预先用Axl基因转染。

11.权利要求10的方法，其中所述转染的细胞是瞬时或稳定转染。

12.权利要求4的方法，其中在步骤(iii)中的控制条件包含经接触缺少活性Axl基因的细胞后的测量。

13.权利要求12的方法，其中所述细胞含有突变失活形式的Axl基因。

14.权利要求1的方法，其中所述Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：5中阐明。

15.权利要求14的方法，其中所述Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中阐明。

16.权利要求14的方法，其中所述Axl受体包含生物活性的胞内结构域部分。

17.权利要求1的方法，其中所述化合物抑制Axl受体的活性比它抑制酪氨酸激酶受体FGFR1的活性更有效至少2倍。

18.权利要求1的方法，其中所述化合物抑制Axl受体的活性比它抑制由以下各项组成的酪氨酸激酶受体组中的一种或多种的活性更有效至少2倍：VER4，KIN24，HGFr，met，EGFR，IGF-1r，InsR和Abl。

19.权利要求17的方法，其中所述抑制是更有效至少100倍。

20.按照权利要求1的方法鉴定的化合物在制备治疗肾病的药物中的应用。

21.权利要求1的方法，其中所述受体与所述化合物接触。

22.权利要求21的方法，其中将Axl受体固定。

23.权利要求21的方法，其中在步骤(i)之前将Axl受体和已知与Axl结合的第二化合物接触。

24.权利要求23的方法，其中将Axl受体或第二化合物固定。

25.一种制备组合物的方法，其包含：

(iii)使用权利要求1的方法鉴定抑制人Axl受体活性的化合物；和

(iv)将所述化合物与载体混合。

26.权利要求25的方法，其中所述载体是药物有效的载体。

27.权利要求26的方法，其中所述与载体混合的化合物是以药物有效量存在。

28.一种诊断受试者肾病的方法，其包含测定来自受试者的样品中Axl受体多肽的水平，其中与无肾病的受试者中的水平相比更高的多肽水平是肾病的征兆。

29.权利要求28的方法，其中所述Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：5中阐明。

30.权利要求29的方法，其中所述Axl受体包含连续的氨基酸，其序列在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中阐明。

31.权利要求29的方法，其中所述肾病是糖尿病性肾病。

32.权利要求31的方法，其中所述肾病是肾纤维变性。

33.权利要求28的方法，其中所述样品取自体液。

34.权利要求33的方法，其中所述体液是血液或尿液。

35.一种通过筛选多种化合物鉴定能够抑制人Axl受体活性的化合物的方法，其包含以下步骤：

(i)将Axl受体或表达Axl受体的细胞与多种化合物接触；

(ii)在所述多种化合物的存在下测量Axl受体活性；

(iii)将步骤(ii)中测量的活性与在控制条件下不存在多种化合物时测量的活性比较，其中降低将多种化合物鉴定为能够抑制活性；和

(iv)分别测定存在于多种化合物中的哪种或哪几种化合物抑制人Axl受体的活性。

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