WO2009107876A1 - 酸化ストレスを測定するためのプローブ試薬 - Google Patents

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WO2009107876A1
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oxidative stress
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fluorescent
marker protein
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宮脇敦史
佐々木和樹
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独立行政法人理化学研究所
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent or luminescent probe reagent for measuring oxidative stress in cells or organisms.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the probe reagent, and a vector containing the nucleic acid.
  • the present invention further relates to a method for measuring oxidative stress in a cell or organism using the probe reagent or vector, or a screening method for an oxidative stress controlling substance.
  • the present invention further relates to a kit for oxidative stress measurement or oxidative stress control substance screening, comprising the probe reagent, nucleic acid, or vector.
  • oxidative stress has a harmful effect on the living body.
  • This oxidation reaction is caused by a molecular species called active oxygen, which has a strong oxidizing power in the cell.
  • active oxygen hydrogen peroxide,.
  • Singlet oxygen, hydroxyl radical, superoxide anion, etc. are known.
  • active oxygen is used for removing foreign substances and detoxification of harmful molecules in the immune system, and has useful aspects for living organisms.
  • the cells have an active oxygen scavenging system with molecules that have antioxidant capacity, and the excess active oxygen that is generated is quickly removed, so the adverse effects of this are suppressed.
  • Oxidative stress is said to damage DNA, proteins, lipids, and other molecules essential for normal cell activity, resulting in diseases such as cancer, arteriosclerosis, myocardial infarction, and diabetes, and aging. .
  • causes of oxidative stress include excessive exercise, lack of exercise, and bias Unhealthy lifestyle habits such as eating and smoking are cited, and oxidative stress is a problem closely related to modern life.
  • Non-Patent Document 1 Reactive oxygen is also attracting attention as a causative agent of reperfusion injury that occurs when blood flow resumes in organs that have been exposed to ischemia. Organs with lost blood flow are placed in anoxic state during that time, but a large amount of active oxygen is generated by rapid reoxygenation after reperfusion. This is thought to damage a wide range of cells and cause organ-level injury. The possibility of such injury makes rapid treatment of ischemic organs difficult (Non-Patent Document 1).
  • Isorminol is a method for measuring active oxygen that causes oxidative stress.
  • Non-patent Document 2 chemiluminescent reagents such as (i soluminol). This measures the luminescence phenomenon associated with the oxidation reaction of the reagent by active oxygen. This reaction is often used as a method for evaluating the immune activity of leukocytes in order to measure the active oxygen released when a foreign substance that has entered the body is attacked.
  • Non-patent Document 2 Isorminol has poor cell membrane permeability and can measure active oxygen released outside the cell, but is not suitable for measuring active oxygen generated inside cells.
  • the intensity of this luminescence is weak, and a large amount of cells are required for the measurement, and even a highly sensitive detector requires a long integration time, making it difficult to measure efficiently.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • These are non-fluorescent compounds, but their structure changes due to oxidation reaction with active oxygen and becomes fluorescent. That is, by measuring this fluorescence, the amount of active oxygen in the field can be measured.
  • These reagents can be introduced into cells through the cell membrane. However, it cannot be taken up selectively by specific organelles in the cell. Have difficulty.
  • the fluorescence emission of these dyes is irreversible, and once oxidized, the molecule no longer reacts with active oxygen and can no longer contribute to subsequent measurements.
  • probe reagents composed of proteins can also be handled as their genes. This gene can be used for measurement by incorporating it into cells in the form of a plasmid and expressing it as a probe reagent. In this method, the probe reagent can be expressed only in specific cells in the living body or in specific organelles in the cell, and the physiological activity can be measured in a more limited region. Oxidative stress probe reagents using fluorescent proteins have also been developed. Such a reagent has a structure in which a fluorescent protein is bound to a marker protein that detects active oxygen. A marker protein that changes its structure by reaction with active oxygen is used.
  • the change in the structure is designed to change the intensity and wavelength of the fluorescence emitted by the fluorescent protein.
  • a probe reagent called Hyper a protein that reacts specifically with hydrogen peroxide is used as a sensor protein, and this is combined with YFP, a fluorescent protein. Hydrogen peroxide acts on the sensor protein to change the fluorescence intensity of YFP (Non-patent Document 4).
  • YFP a fluorescent protein.
  • Hydrogen peroxide acts on the sensor protein to change the fluorescence intensity of YFP
  • Another example is the application of the phenomenon of fluorescence energy transfer.
  • This probe reagent has a structure in which two types of fluorescent proteins having different fluorescence wavelengths sandwich a sensor protein. The structural change caused by the reaction of sensor protein with active oxygen changes the distance between fluorescent proteins at both ends. This change has changed the efficiency of energy transfer.
  • Cells have proteins that are expressed as a protective response to oxidative stress when they are exposed. Oxidative stress on cells can also be detected by measuring the amount of protein increase. In cases where oxidative stress is measured in muscle, TNF a, pi Such proteins are measured as an index (Patent Document 2).
  • the target protein is measured by a biochemical method such as Western plotting. For this purpose, it is necessary to perform complicated operations such as disrupting cells, extracting internal proteins, and separating them, and quick and continuous measurement of active oxygen cannot be performed on living cells.
  • Patent Document 1 JP 2005-95171
  • Non-Patent Document 1 Droge, W., Phys iol. Rev., 82, 47-95, 2002
  • Non-Patent Document 2 Dahl gren, C. and Karlsson, A., J. Immunol. Meth., 232, 3-14,
  • Non-Patent Document 3 Munzel, T. et al., Arteriosc ler. Thromb. Vase. Biol., 22, 1761-1768, 2002
  • Non-Patent Document 4 Belousov, V. V. et al., Nature Methods, 3, 281-286, 2006
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring oxidative stress in a cell or an organism using the probe reagent or a vector containing DNA encoding the reagent, or an oxidative stress in a cell or an organism. For screening substances that inhibit or promote Is to provide.
  • Still another object of the present invention is to provide an oxidation stress-related measurement kit containing the probe reagent, the DNA or RNA, or the vector.
  • This probe reagent is composed of 2 to 4 elements, ie, a fusion protein containing at least a fluorescent or luminescent protein and a marker protein, optionally further comprising a regulatory sequence, or a cleavage sequence and a regulatory factor.
  • the increase or decrease in oxidative stress is caused by changes in fluorescence or luminescence intensity of the fluorescence or luminescent protein. Can be monitored.
  • the abundance of the probe reagent dynamically changes in response to changes in oxidative stress, so a large change in fluorescence intensity can be obtained.
  • the characteristic of the probe that enables such continuous monitoring is based on the reversible response to active oxygen.
  • the present invention includes the following features.
  • a fluorescent or luminescent probe reagent for measuring oxidative stress in cells or organisms comprising a fluorescent or luminescent protein, a marker protein, a cleavage sequence and a fusion protein containing a regulatory factor.
  • the marker protein enables detection of oxidative stress due to active oxygen and includes a regulatory factor binding site and a ubiquitin binding site, and the regulatory factor is capable of detecting the marker protein in response to active oxygen.
  • a protein capable of controlling degradation wherein the fluorescent or photoprotein and the single protein are adjacent to each other in any order to form a ligation, and the cleavage sequence is the ligation
  • the marker protein and the regulatory factor are human Nrf2 (Accession No. AAB32188) and human Keapl (Accession No. AAH21957), or a homologue or analog thereof, respectively (1) to (9)
  • the probe reagent according to any one of (9).
  • probe reagent according to any one of (1) to (10) above, wherein the probe reagent is encoded by DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the probe reagent described in any of (1) to (11) above or the vector described in (14) or (15) above is introduced into a cell or organism (excluding human), and Is a method for measuring oxidative stress in cells, comprising measuring oxidative stress based on fluorescence or luminescence intensity in an organism.
  • a marker protein for measuring oxidative stress in a cell or organism wherein the method is a marker protein whose degradation is controlled in accordance with the degree of oxidative stress in the cell or organism.
  • the marker protein comprises a regulator binding site and a ubiquitin binding site, and degradation of the conjugate is controlled by the regulator in response to active oxygen.
  • the method is controlled.
  • the exogenous regulatory factor is introduced into the cell or organism in the form of a vector containing DNA encoding the regulatory factor, according to any one of (18) to (20) above Method.
  • a fluorescent or luminescent probe reagent for measuring oxidative stress in a cell or an organism wherein the reagent includes a ligation containing a marker protein and a fluorescent or luminescent protein, wherein the marker The protein can detect oxidative stress due to active oxygen and includes a regulator binding site and a ubiquitin binding site, which can control the degradation of the marker protein in response to active oxygen Wherein the degradation of the marker protein is promoted or suppressed by binding or dissociation between the regulatory factor and the marker protein.
  • Probe reagent for measuring oxidative stress in a cell or an organism, wherein the reagent includes a ligation containing a marker protein and a fluorescent or luminescent protein, wherein the marker The protein can detect oxidative stress due to active oxygen and includes a regulator binding site and a ubiquitin binding site, which can control the degradation of the marker protein in response to active oxygen Wherein the degradation of the marker protein is promoted or suppressed by binding or dissociation between the regulatory factor and the marker protein.
  • a fluorescent or luminescent probe reagent for measuring oxidative stress in a cell or organism wherein the reagent comprises a ligation containing a marker protein and a fluorescent or luminescent protein, and a regulator.
  • the conjugate and the regulatory factor are bound via a linker, wherein the marker protein makes it possible to detect oxidative stress due to active oxygen and a regulatory factor binding site and a ubiquitin binding site.
  • the regulatory factor is a protein capable of controlling the degradation of the marker protein in response to active oxygen, and the degradation of the marker protein is caused by the binding or release of the regulatory factor and the marker protein.
  • the probe reagent which is promoted or suppressed.
  • FIG. 1 shows four possible structures of the fluorescent oxidative stress probe reagent of the present invention.
  • R and U in the marker protein represent a regulator binding site and a ubiquitin binding site, respectively.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of the DNA structure encoding the fluorescent oxidative stress probe of the present invention. Show.
  • Figure 3a shows the time course of the microscopic image after addition of DEM (jetyl maleate (oxidative stress inducer)) to the cells into which the fluorescent oxidative stress probe of the present invention has been introduced (hour: minute). )
  • DEM jetyl maleate (oxidative stress inducer)
  • Fig. 3b shows the fluorescence intensity after addition of IOO M DEM (black circle) or 0.1% ethanol (EtOH) (white circle) as a control to cells into which the fluorescent oxidative stress probe of the present invention has been introduced. It is a graph which shows the time change of. The horizontal axis represents time (h), and the vertical axis represents fluorescence intensity.
  • FIG. 4 a shows the time change (hour: minute) of the microscopic image after adding DEM to cells introduced with the fluorescent oxidative stress probe of the present invention so as to be ⁇ . After the addition of DME, to remove the DEM to medium exchange ( "W ash") after 15 hours.
  • FIG. 4b shows the change in fluorescence intensity with time after adding DEM to cells introduced with the fluorescent oxidative stress probe of the present invention so that the concentration becomes ⁇ .
  • the medium was changed (“wash”) 15 hours later to remove DEM.
  • the horizontal axis represents time (h.), And the vertical axis represents fluorescence intensity.
  • FIG. 5 a shows the time change (hour: minute) of the microscopic image after adding MG132 (proteasome inhibitor; Sigma) so that the cells into which the fluorescent oxidative stress probe of the present invention has been introduced become ⁇ .
  • MG132 proteasome inhibitor
  • Fig. 5b shows the change in fluorescence intensity over time after addition of 10 M MG132 (black circle) or 0.1% DMS0 (control; white circle) to cells into which the fluorescent oxidation stress probe of the present invention has been introduced. It is a graph to show. The horizontal axis represents time (h), and the vertical axis represents fluorescence intensity.
  • FIG. 6 shows that the cells introduced with the fluorescent oxidation stress probe of the present invention were applied with Q to 100; u M DEM, 0.1% Et0H, 10 x M MG132, or 0.1% DMS0 for 8 hours. The result of the western blotting using the anti- Nrf2 antibody after progress is shown.
  • probe reagent As described above, we developed a probe reagent (which may be simply referred to as “probe”) that overcomes the problems associated with conventional oxidative stress measurement methods.
  • This reagent is substantially made of a protein, and a nucleic acid encoding the protein (for example, gene, DNA, RNA, or a chemically modified product thereof) is introduced into the cell or organism, thereby allowing the cell or organism to enter the cell.
  • the abundance of the probe reagent dynamically changes in accordance with changes in oxidative stress, so that a large change in fluorescence or luminescence intensity can be obtained.
  • the response is reversible, and the increase or decrease in oxidative stress can be continuously monitored in living cells or organisms. The characteristics of this probe reagent are described below.
  • the first probe reagent includes a linked body containing a marker protein and a fluorescent or photoprotein.
  • this conjugate When this conjugate is introduced into cells or organisms (in this case, a vector containing a nucleic acid encoding the conjugate may be introduced into cells or organisms), it responds to active oxygen.
  • active oxygen When it is possible to measure the presence or level (or degree) of oxidative stress due to active oxygen through the interaction between the conjugate and a regulatory factor that controls the degradation of the marker protein.
  • the second probe reagent of the present invention comprises a fluorescent or luminescent protein that emits fluorescence or luminescence, a marker protein, a regulator that controls the degradation of the marker protein in response to active oxygen, and a cleavage sequence.
  • Figure 1 shows the structure.
  • the probe reagent of the present invention has four possible structures:
  • Fluorescent or photoprotein from the N-terminal side to the C-terminal side: (1) Fluorescent or photoprotein, marker protein, cleavage sequence and regulatory factor, (2) Marker protein, fluorescent or luminescent protein, cleavage sequence and regulatory factor, (3) Regulation.
  • the third probe reagent contains the above-mentioned conjugate and a regulatory factor, which are linked via a linker.
  • the linker should be long enough for the regulator to bind to the regulator binding site on the marker protein that constitutes the conjugate.
  • the linker is, for example, a peptide or polypeptide linker consisting of a natural amino acid or an unnatural amino acid or a mixture thereof, specifically, even a linker of about 18 amino acid, or 142 amino acid. Even with a moderate linker, the above-described effects of the present invention can be achieved.
  • the fluorescent or photoprotein and the marker protein are linked side by side. Either of them may be on the N-terminal side or C-terminal side. Further, a linker (for example, a linker consisting of one or several amino acids, for example, a peptide having 10 amino acids or less) may be included between the fluorescent or luminescent protein and the marker protein.
  • the marker protein has a site that binds a regulatory factor and a site that binds to a protein molecule called ubiquitin that exists in the cell and is involved in the degradation of the protein.
  • the cleavage sequence is between the fluorescent protein-marker protein conjugate and the regulator.
  • the fluorescent or photoprotein-marker protein conjugate and the regulatory factor may be on the N-terminal side or C-terminal side, with the cleavage sequence between them.
  • the probe reagent of the present invention may be directly introduced into a cell in the form of a protein, or expressed in a cell by introducing into the cell a vector that can express the DNA encoding the probe reagent. May be translated.
  • the second probe reagent is automatically cleaved with a cleavage sequence in the cell (after introduction or translation) to separate a fluorescent or photoprotein-marker protein conjugate and a regulatory factor.
  • the regulatory factor changes its structure by reacting with active oxygen, and promotes or suppresses the degradation of the marker protein by binding or dissociating with the protein. Allows qualitative or quantitative measurement of stress.
  • the fluorescent or luminescent protein and the marker protein are preferably linked so that when the marker protein is decomposed, the fluorescent or luminescent protein is also continuously decomposed so as not to emit fluorescence or luminescence.
  • the responsiveness of the probe reagent to oxidative stress can be made reversible.
  • a regulator that strongly promotes or suppresses the degradation of the marker protein with an amount of oxidative stress that the cell receives.
  • oxidative stress is a phenomenon in which an excessive oxidation reaction (that is, a state in which the balance of oxidation-antioxidant factors is inclined in the direction of oxidation) has a harmful effect on a living body.
  • the reaction is caused by a molecular species called active oxygen, which has a strong oxidizing power in the cell.
  • active oxygen hydrogen peroxide, singlet oxygen, hydroxyl radical, superoxide two-ion and the like are known.
  • excessive oxygen production that is, oxidative stress damages molecules essential for normal cell activity, resulting in cancer, arteriosclerosis, myocardial infarction, diabetes. Diseases such as aging are caused.
  • reactive oxygen is also known as a causative agent of reperfusion injury that occurs upon resumption of blood flow in ischemic or hypoxic organs.
  • the present invention is useful for detection and prevention management of such diseases affected by oxidative stress.
  • the protein in its native form may be used, or a part of the protein may be artificially modified to improve the ability of the probe reagent.
  • An example of artificial modification is deletion of the C-terminal site of the marker protein Nrf2.
  • the degree of deletion is preferably such that it does not impair the regulator binding site and ubiquitin binding site, and substantially retains the native conformation of the protein (conformation).
  • the ability of the probe reagent includes, for example, intracellular expression efficiency, the strength of binding between the marker protein and the regulatory factor, and the speed and magnitude of the response to the oxidative stress.
  • a proteolytic reaction by the ubiquitin-proteasome system possessed by the cell itself is used.
  • the protein to which ubiquitin is bound is degraded by the proteasome, a proteolytic enzyme complex. Since this degradation system is universally present in eukaryotic cells, all types of cells
  • animal cells including human cells, plant cells, yeast cells, fungal cells, etc.
  • eukaryotes mammals excluding humans, birds, amphibians, reptiles, fish, insects and other animals, plants, yeast, Fungi etc.
  • Fluorescent proteins such as jellyfish-derived GFP, EBFP, ECFP, EGFP, EYFP, etc., and those derived from these, coral-derived DsRed, HcRed, mCherry, etc. can be used. Without being limited thereto, any fluorescent protein can be used. These proteins emit light when returning to the ground state when excited by a laser or the like. Although different depending on the type of fluorescent protein, the excitation wavelength region is, for example, about 350 to 600 nm, and the emission wavelength region is, for example, about 500 to 600 nm. Alternatively, luciferase, which is an enzyme that catalyzes the bioluminescence reaction of fireflies etc., may be placed at the position of the fluorescent protein.
  • marker proteins and regulatory factors examples include human-derived Nrf2 (GenBank Accession No. AAB32188) and Keapl (GenBank Accession No. AAH21957), but other biological species (for example, A combination of homologous proteins having the same function derived from (animal species) may be used.
  • other biological species for example, A combination of homologous proteins having the same function derived from (animal species) may be used.
  • both the regulatory factor binding site and the ubiquitin binding site are included as the marker protein, only a part of the domain may be used and it can function as a probe reagent.
  • Nrf2 responds to oxidative stress in cells and acts as a transcription factor that induces the expression of antioxidant proteins that have a protective function against this. In the absence of oxidative stress in the cells, Nrf2 is present in the cytoplasm in a bound form with Keapl. At this time
  • Keapl also binds to the ubiquitin ligase complex to promote Nrf2 ubiquitination. Since ubiquitinated Nrf2 is degraded by the proteasome, a proteolytic enzyme complex, its increase is suppressed. On the other hand, when cells are exposed to oxidative stress, reactive oxygen reacts with Keapl and changes its structure. This structural change causes Keapl to solve the Nrf2 force and Chitinization is suppressed. As a result, Nrf2, whose degradation is suppressed, increases its intracellular level and functions as a transcription factor.
  • Nrf2 cystine transporter, gnorethion synthase, gu ⁇ / tathion-S-transferase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, peroxyredoxin, and thioredoxin have been reported. It controls the expression uniformly to protect the body from oxidative stress.
  • the factor that controls the activity of Nrf2 is Keapl. The mechanism of defense against oxidative stress via Nrf2 / Keapl is reviewed by Ken Ito, Biochemistry 78 (2) pp. 79-92 (2006) (Japan).
  • the marker protein that can be used in the present invention is a protein (for example, a transcription factor) that uniformly controls genes expressed to protect a living body from oxidative stress
  • the regulator is a protein that controls the activity of the marker protein.
  • Other combinations of such marker proteins and regulators include, for example, HIF1-human regulator of pVHL, a marker protein that detects hypoxia (M Ohh et al., Nat. Cell Biol. 2000, 2 : 423-427).
  • HIF1- ⁇ is a transcription factor abbreviated as hypoxia-inducible factor 1- ⁇ and is regulated by oxygen. In other words, it is known that it is proteolytically decomposed by the ubiquitin-proteasome pathway in the presence of constant oxygen, but functions in hypoxia (eg, angiogenesis, tumor formation, etc.).
  • pVHL is von
  • Hippel-Lindau tumor suppressor binds to HIF ⁇ in an oxygen-dependent manner to ubiquitinate HIF1- ⁇ .
  • the cleaved sequence includes a ligated product of a fluorescent or luminescent protein and a marker protein, and a sequence that can be cleaved and disposed between the regulatory factor, and the ligated product when the reagent is cleaved by the cleaved sequence. And regulators are separated.
  • a preferred example of such a cleavage sequence is a self-cleaving peptide such as self-cleaving 2 ⁇ peptides derived from viruses (AL Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 2004, 5: 589-594), specifically Is
  • T2A EGRGSLLTCGDVEENPGP; SEQ ID NO: 8
  • P2A Porcine teschovirus-1 2A peptide
  • ATNFSLLKQAGDVEENPGP ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 9
  • G terminal dalicin
  • P proline
  • self-cleaving peptide refers to a peptide sequence that undergoes hydrolysis during translation and divides into two proteins between G and P.
  • the probe reagent of the present invention is cleaved by the cleavage sequence in a cell or in an organism, so that the conjugate and the regulatory factor are present separately, and the separated regulatory factor is present.
  • the promotion or suppression of such marker protein degradation depends on the presence (or presence) and level (or amount or degree) of oxidative stress.
  • the marker protein when cells are not exposed to oxidative stress, the marker protein is promoted for ubiquitination by binding to the regulator, and is degraded by the proteasome, and at the same time, the fluorescent or photoprotein is also degraded. It does not emit fluorescence or luminescence.
  • the binding of the regulator to the marker protein is suppressed, so that ubiquitination of the marker protein is suppressed, resulting in fluorescence or luminescence. Become. At this time, a correlation can be recognized between the degree of oxidation resistance and fluorescence or emission intensity.
  • the response of the probe reagent of the present invention to oxidative stress is reversible. This means that when a cell or organism changes from a state with oxidative stress to a state without oxidative stress or with a suppressed state, the fluorescence or luminescence intensity continuously changes from a relatively high state to a relatively low state. It means changing or changing to the baseline level.
  • the marker protein is an Nrf2 protein, a homologue thereof or an analog thereof having an equivalent activity
  • the regulatory factor is a Keapl protein, a homologue thereof or an analogue thereof having an equivalent activity, fluorescence or
  • homolog refers to a protein from a different species that has equivalent activity and poor sex.
  • homologs of human Nrf2 include Nrf2 derived from biological species other than humans, such as mouse Nrf2.
  • Keto Keapl Homologs include non-human species such as mouse Keapl.
  • analog refers to a mutation having an amino acid sequence that includes deletion, substitution, addition or insertion of one or more (preferably one or several) amino acids in the amino acid sequence of a natural or wild-type protein.
  • chemically modified derivatives having a modifying group such as a sugar chain, an acyl group, an alkyl group, a phosphate group, or an ADP-ribosyl group.
  • a modifying group such as a sugar chain, an acyl group, an alkyl group, a phosphate group, or an ADP-ribosyl group.
  • a modifying group such as a sugar chain, an acyl group, an alkyl group, a phosphate group, or an ADP-ribosyl group.
  • 2 to 10 for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5
  • the analog is an amino acid having a sequence identity of 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more or 99% or more with the amino acid sequence of a natural or wild-type protein. It may be a mutant derivative having a sequence. Identity refers to the ratio (%) of the number of identical amino acids to the total number of amino acids, with or without gaps between two or more proteins. Comparison of identity between amino acid or nucleotide sequences (homology search, homology sequence search, etc.) can be performed using known algorithms such as BLAST. And FASTA (for example, SF Altschul et al., J Mol. Biol. 1990, 215 (3): 403-410 etc.).
  • NCBI GenBank
  • EMBL GeneNet
  • amino acid substitutions include conservative amino acid substitutions or non-conservative amino acid substitutions.
  • Conservative amino acids refer to amino acid groups with similar chemical or structural properties, such as polar amino acid groups (serine, threonine, asparagine, glutamine, cysteine, glycine, etc.), hydrophobic amino acid groups
  • amino acids (Alanine, leucine, isoloicin, valine, methionine, etc.), basic amino acid group (lysine, arginine, histidine), acidic amino acid group (glutamic acid, aspartic acid), branched amino acid group (valine, isoleucine, leucine, etc.), It can be divided into aromatic amino acid groups (phenylalanine, tyrosine, tritophan).
  • non-conservative amino acids refer to amino acids having different chemical or structural properties. A preferred substitution is a conservative amino acid substitution.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • Such a nucleic acid can have a base sequence encoding the protein homolog or analog amino acid sequence.
  • Nucleic acid analogs also include suddenly mutated nucleic acids such as single nucleotide polymorphisms, splice mutations, and silent mutations.
  • a more specific example of the probe reagent of the present invention is a fusion protein encoded by a DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 as described in the Examples below (FIG. 2).
  • the fusion protein is separated into a ligation product and a regulatory factor at the cleavage sequence, and an increase or decrease in fluorescence intensity is observed according to an increase or decrease in oxidative stress. ( Figures 3-5).
  • This probe makes it possible to measure the dynamics of oxidative stress in cells or organisms in real time.
  • the probe reagent of the present invention usually takes the form of a fusion protein, and therefore can be prepared using a gene recombination technique. Details of such a technique are described in “2. Nucleic acid encoding probe reagent” described later. However, DNA encoding the probe reagent is expressed in prokaryotic cells (eg, Escherichia coli, Bacillus bacteria, etc.) and Any eukaryotic cell is possible.
  • prokaryotic cells eg, Escherichia coli, Bacillus bacteria, etc.
  • the present invention also provides a nucleic acid (DNA or RNA corresponding to the DNA) comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of the probe reagent as defined and explained above.
  • RNA has a structure in which deoxyribose is replaced with ribose and thymidine (T) is replaced with uracil (U) in the base sequence of the DNA.
  • T thymidine
  • U uracil
  • Preferred RNA is mRNA corresponding to the DNA.
  • the DNA or RNA may further contain one or more restriction enzyme sites for facilitating recombination operations in addition to the base sequence encoding each of the four elements.
  • DNA The construction of such DNA involves the DNA chain corresponding to each element from the cDNA library derived from the appropriate tissue of the organism and the polymerase chain reaction using specific primers.
  • a cDNA library can be prepared from tissues such as the small intestine, liver, and heart where expression of these genes is observed in the cloning of human Nrf2 and Keapl, for example. All from these organizations A library can be prepared by a known method including RNA extraction, further mRNA extraction, and cDNA synthesis from this.
  • this method includes a denaturation step of double-stranded DNA into a single strand (eg, about 94-98 ° C, 30 seconds to 2 minutes), a primer annealing step (eg, about 55 ° C, And a DNA elongation step (for example, about 72 ° C., 30 seconds to several minutes) is defined as one cycle, and this is performed for about 20 to 40 cycles.
  • a denaturation step within the same temperature and time range may be included before this series of runs, and an extension step within the same temperature and time range may be included once after the run.
  • the primer used for PCR preferably has a sequence complementary to the sense strand or antisense strand of the truncated DNA, or a sequence that is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more. May be used, or a mixed primer prepared based on the partial amino acid sequence of the target protein may be used, or a random primer may be used.
  • the primer is preferably composed of a sense primer and an antisense primer, and their size is usually 15 to 50 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • PCR is performed in a Mg 2+ -containing PCR buffer in the presence of a thermostable polymerase such as Taq polymerase.
  • PCR For PCR, it is convenient to use a commercially available PCR device such as a thermal cycler (eg, Perkin-Elmer, Bio-Rad, Applied Biosystems, Takara Shuzo, etc.). Instrumentation of PCR method j-row [Tsolete ⁇ ; FM Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology ⁇ 2002), John Wiley & Sons, RA Siki et al., Science 1985, 230: 1350-1354, HA Erlich Et al., Science 1991, 252: 1643-1651.
  • a thermal cycler eg, Perkin-Elmer, Bio-Rad, Applied Biosystems, Takara Shuzo, etc.
  • a sequence whose sequence is complementary to a known nucleotide sequence of the target DNA, or whose sequence is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more is used.
  • Hybridization can be performed under stringent conditions using a probe with a length of 100 bases.
  • Stringent conditions are, for example, 2
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the first probe reagent or the second probe reagent, and a specific example thereof is a DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the present invention further provides a vector comprising the above DNA and a regulatory sequence that allows the DNA to be expressed.
  • Vectors include cells, especially eukaryotic cells, such as animal cells (mammalian cells including human cells, avian cells, fish cells, insect cells, etc.), plant cells (monocot plant cells, dicotyledon plant cells, etc.), yeast Vectors suitable for DNA expression in host cells such as cells and fungal cells (filamentous fungi, basidiomycetes, etc.) are preferred.
  • animal cells mammalian cells including human cells, avian cells, fish cells, insect cells, etc.
  • plant cells monocot plant cells, dicotyledon plant cells, etc.
  • yeast Vectors suitable for DNA expression in host cells such as cells and fungal cells (filamentous fungi, basidiomycetes, etc.) are preferred.
  • yeast Vectors suitable for DNA expression in host cells such as cells and fungal cells (filamentous fungi, basidiomycetes, etc.) are preferred.
  • plasmid vectors such as pUC, pBluescript, and pBR
  • virus vectors
  • Vectors can contain various regulatory sequences for the expression of DNA.
  • Control sequences can include, for example, a promoter, promoter / enhancer, ribosome binding sequence, terminator, and the like.
  • promoters include SV40, CMV, RSV, CaMV and other virus-derived promoters, enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphate kinase, pyruvate kinase, etc. And the promoters of glycolytic enzymes.
  • vectors include selection marker sequences for selection of recombinants, such as drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reductase, thymidine kinase, and adenosine deaminase.
  • drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reductase, thymidine kinase, and adenosine deaminase.
  • Dominant selection markers such as HIS3, LEU2, TRP1, and URA3 can also be included.
  • DNA encoding the probe reagent of the present invention When DNA encoding the probe reagent of the present invention is introduced into a cell, the DNA is expressed in the cell to produce the probe reagent.
  • DNA to cells in some cases, RNA
  • methods for introducing ribosome include, for example, ribosome methods such as ribofusion, electoporation method, microinjection method, calcium phosphate method, agrobatterium method, and gene bombardment method. These techniques are described, for example, in the translation by Matsuhashi Michio et al., Watson ⁇ Molecular DNA Biology Second Edition (1994), Maruzen, Tokyo, Japan.
  • the present invention further includes introducing the probe reagent or the vector into a cell or eukaryote (excluding human), and measuring oxidative stress based on fluorescence or luminescence intensity in the cell or organism.
  • a method for measuring oxidative stress in the cell or organism is introducing the probe reagent or the vector into a cell or eukaryote (excluding human), and measuring oxidative stress based on fluorescence or luminescence intensity in the cell or organism.
  • the present invention relates to a method for measuring oxidative stress in a cell or organism (excluding human), wherein the method controls degradation according to the degree of oxidative stress in the cell or organism.
  • a marker protein and a fluorescent or luminescent protein conjugate or a vector containing a nucleic acid (eg, DNA) encoding the conjugate is introduced into the cell or organism, and the conjugate is introduced into a cell or organism.
  • the presence of oxidative stress in the cell or organism based on the degree to which the degradation of the conjugate is controlled by measuring the amount of fluorescence or luminescence derived from the fluorescence or luminescent protein. Determining a level thereof, wherein the marker protein comprises a regulator binding site and a ubiquitin binding site, and the degradation of the conjugate is regulated in response to active oxygen Characterized in that it is controlled by the child, it provides the above method.
  • the conjugate and the regulatory factor are expressed in the same cell.
  • the DNA encoding the conjugate and the DNA encoding the regulatory factor are inserted into separate vectors. In some cases, it can be introduced. Of course, when considering introduction efficiency, ease of expression control, etc., it is more preferable to introduce them by inserting them into a single vector.
  • the regulator may be not only exogenous as described above but also endogenous (or endogenous) to the cell (that is, what the cell originally has). It is. In addition, a combination of a regulatory factor and a marker protein can be induced if its interaction is adjusted according to the degree of oxidative stress.
  • the source may be any, but is preferably derived from the same organism.
  • the measurement can be performed in real time. At this time, if the regulator undergoes a reversible structural change upon reaction with active oxygen, the responsiveness of the probe reagent to oxidative stress is also reversible.
  • a combination of probe reagent and modulator that provides such an effect is the Nrf2-Keapl system as illustrated in the Examples. Since the above response is reversible, the fluorescence or luminescence intensity gradually increases when cells or organisms are subjected to oxidative stress, while the fluorescence or luminescence intensity decreases when oxidative stress is eliminated. Fluorescence or luminescence intensity can be measured in real time as the tres is increased or decreased ( Figures 4a and 4b).
  • cells that can be used in the present invention include vertebrate cells such as mammalian cells (including human cells), invertebrate cells such as insect cells, plant cells, cyanobacteria cells, fermentation mother cells, and fungal cells. Eukaryotic cells. These cells also include pluripotent cells such as oocytes, embryonic stem (ES) cells, spermatogonia, primordial germ cells, and induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • vertebrate cells such as mammalian cells (including human cells), invertebrate cells such as insect cells, plant cells, cyanobacteria cells, fermentation mother cells, and fungal cells.
  • Eukaryotic cells include pluripotent cells such as oocytes, embryonic stem (ES) cells, spermatogonia, primordial germ cells, and induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • Living organisms that can be used in the present invention include vertebrates including mammals, animals such as invertebrates, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, yeasts, fungi, and the like. These animals or plants also include transgenic animals (except humans) and transgenic plants.
  • the probe reagent of the present invention In order for the probe reagent of the present invention to function correctly, in principle, the probe reagent must be constantly expressed during the measurement. When performing long-term measurements, it is desirable to express the gene linked to a promoter that induces stable expression of the gene.
  • an autonomously replicable vector capable of expressing the DNA encoding the probe reagent is used as the vector, or an artificial chromosome (for example, HA BAC, YAC, etc.) incorporating the DNA, or A vector for integrating the DNA into the cell genome by homologous recombination can be used.
  • a cell that retains the gene and stably expresses the probe reagent may be prepared and used for measurement.
  • the probe reagent of the present invention changes in fluorescence or emission intensity depending on the strength of oxidation stress. Therefore, it is possible to measure oxidative stress not only at the cellular level but also at the individual level by preparing a transgenic organism into which a transgene containing DNA encoding this reagent is introduced. At that time, by connecting the transgene downstream of an appropriate promoter, it can be selectively expressed in the target organ or tissue and used for measurement.
  • transgenic animals for example, nuclear transfer, differentiation pluripotent cells such as ES cells and IPS cells can be used. These methods are briefly described below.
  • a transgene is introduced into the genome of a somatic cell such as a fibroblast, and then the nucleus removed from the cell is microinjected into an enucleated fertilized egg or an unfertilized egg. Return to the uterus or fallopian tube, and develop and give birth to a chimeric animal.
  • ES cells can be used by microinjection of transgenes, microcell fusion, electrofusion, etc. into the inner cell mass extracted from fertilized blastocysts or 8-cell embryos of animals (excluding humans).
  • This method involves introducing ES cells into another blastocyst to obtain a transplanted embryo, transplanting the embryo into a foster mother's uterus, giving birth, and obtaining a chimeric animal (for example, edited by Mitsuo Oshimura et al., Chromatin ⁇ Chromosome Experiment Protocol (2004) Yodosha, Tokyo, Japan).
  • the chimeric animal produced as described above is further mated with the wild type of the same species, and further homozygous offspring animals (excluding humans) are obtained by repeating mating of the obtained heterozygotes. Can do.
  • iPS cells can be obtained by introducing a transcription factor (eg, 0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc, etc.) or DNA encoding it (may be vector-mediated) into mammalian somatic cells and culturing. It is known to be a multipotent pluripotent cell that can contribute to the germ line (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cel 126: 663-676).
  • a transcription factor eg, 0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc, etc.
  • DNA encoding it may be vector-mediated
  • the transgene is, for example, a construct obtained by inserting the DNA sequence of the present invention (SEQ ID NO: 7) between about 2 to 7 kb of DNA sequence homologous to the 5′- and 3′-untranslated regions of the Nrf2 gene ( Vector).
  • the DNA sequence of the present invention or the Nrf2 gene is an artificial chromosome.
  • the construct or artificial chromosome is A drug resistance gene, promoter / enhancer, IRES, poly A sequence, terminator, etc. can be included as appropriate.
  • the vector containing the DNA of the present invention is introduced into tissues such as leaf pieces and stem pieces by the agrobacterium method, particle gun method, etc., and then callus is formed on the plant body. Includes how to play.
  • DNA that codes for luciferase an enzyme that catalyzes the bioluminescence reaction of fireflies, may be placed at the fluorescent protein position of the probe reagent.
  • excitation light is not required, and the reaction proceeds by giving a luminescent substrate such as luciferin to cells and organisms. Therefore, measurement can be performed even on samples that are difficult to irradiate with excitation light.
  • Another method for introducing a probe reagent into an animal cell is, for example, a method using a cationic liposome (for example, intravenous administration).
  • a method using a cationic liposome for example, intravenous administration.
  • the negative charge on the cell surface and the cationic ribosome attract each other to form a fusion, and the probe reagent enters the cell via internalization.
  • It also includes a method of producing a cell that retains the probe reagent DNA, stably expressing the probe reagent, and transplanting the cell into an animal.
  • a general fluorescence or luminescence measuring device can be used for the measurement using the probe reagent or DNA of the present invention.
  • an imaging device using a microscope can be used.
  • a macro imaging device using a basket can be used.
  • the present invention further introduces the probe reagent or the vector and a candidate substance into cells or organisms (excluding humans) loaded with oxidative stress, thereby reducing or increasing the fluorescence or luminescence intensity in the cells.
  • a method for screening an oxidative stress control substance comprising screening the substance.
  • the types of cells and organisms (transgenic organisms excluding humans) used in this method are as described above, and the production of transgenic organisms is also as described above.
  • Candidate substances include small molecules (organic molecules or inorganic substances), arbitrary substances such as proteins, peptides, saccharides, and lipids, and known pharmaceutical agents.
  • candidate substances When using cells, add candidate substances to the medium. On the other hand, when using organisms, ingest or administer candidate substances (oral, intravenous, rectal, subcutaneous, intramuscular, transmucosal administration, etc.).
  • the action effect of the candidate substance when oxidative stress is given to cells or organisms is judged by measuring the intensity of fluorescence emitted by excitation with light of a specific wavelength.
  • the fluorescence intensity is reduced or decreased to the baseline level by the candidate substance, it can be estimated that the candidate substance is an oxidative stress inhibitor.
  • the oxidative stress-inhibiting substance found by the method of the present invention is caused by oxidative stress caused by diseases such as cancer, arteriosclerosis, myocardial infarction, diabetes, aging, ischemia or hypoxia. It will be useful for the prevention and treatment of exposed organs.
  • the present invention further provides a kit for measuring oxidative stress or screening an oxidative stress control substance, comprising at least one selected from the group consisting of the probe reagent, the DNA or RNA, and the vector. .
  • Kits can include buffers, substrates, instructions for use, etc., in addition to each component housed or sealed in a separate container.
  • mK02 as a fluorescent protein
  • a probe reagent for oxidative stress using Nrf2 as a marker protein and Keapl as a regulator. This reagent increases oxidative stress, which suppresses the degradation of the probe reagent and increases its fluorescence intensity.
  • Nrf2 functions as a transcription factor that induces the expression of antioxidant proteins responsible for defense against oxidative stress in cells.
  • Nrf2 In the absence of oxidative stress in the cell, Nrf2 is present in the cytoplasm in association with Keapl. At this time, Keapl further binds to the ubiquitin ligase complex to promote ubiquitination of Nrf2. Since ubiquitinated Nrf2 is degraded by the proteasome, a proteolytic enzyme complex, its increase is suppressed.
  • reactive oxygen reacts with Keapl and changes its structure. Due to this structural change, Keapl dissociates from Nrf2, and ubiquitination of Nrf 2 is suppressed. As a result, Nrf2, whose degradation is suppressed, increases its intracellular level and functions as a transcription factor.
  • Figure 2 shows the structure of the probe reagent (mK02-Nrf2-100-T2A_Keapl). From the N-terminus, fluorescent protein mK02, Keapl binding site and Nrf2 domain containing ubiquitin binding site (amino acids from 1 to 100th from the N-terminus), self-cleaving peptide T2A, Keapl were linked in a row It has a structure.
  • mK02 derived from coral beetle, a type of coral was used as the fluorescent protein, but other fluorescent proteins may be used.
  • Fluorescent proteins include EBFP, ECFP, EGFP, and EYFP derived from jellyfish, those derived from these forces, and DsRed, HcRed, mCherry, etc. derived from corals and the like.
  • marker proteins and regulators human-derived Nrf2 and Keapl were used, respectively, but combinations of proteins derived from other species and having the same function may be used.
  • only a partial domain of Nrf2 was used as a marker protein, but if it contains both a regulator binding site and a ubiquitin binding site, it can function as a probe reagent.
  • the size of Nrf2 used here was optimized by evaluating the intracellular expression level of the probe reagent and the ability to respond to oxidative stress.
  • a probe reagent gene, cDNA was prepared by the method described below and incorporated into a plasmid for introduction into cells.
  • Nrf2 gene and Keapl gene were cloned from a single human heart cDNA library.
  • PCR to amplify Nrf2 1st to 100th amino acids using Nrf2 gene as a saddle and using sense primer (SEQ ID NO: 1), antisense primer (SEQ ID NO: 2) and PrimeSTAR enzyme (Takara Bio) Reaction was performed.
  • the sense primer contains the Xhol cleavage site
  • the antisense primer contains the T2A peptide gene sequence and the Hindlll cleavage site.
  • a PCR reaction was performed using the PrimeSTAR enzyme using the Keapl gene as a saddle and using a sense primer (SEQ ID NO: 3) and an antisense primer (SEQ ID NO: 4).
  • the sense primer contains a Hindlll cleavage site and the antisense primer contains an Xbal cleavage site.
  • Fluorescent protein mK02 was amplified by PCR using the sense primer (SEQ ID NO: 5) and antisense primer (SEQ ID NO: 6) (PCR conditions: denaturation 98 ° C, 10 seconds; annealing 55 ° C, 30 seconds; Elongation 72 ° C, 1 minute).
  • the sense primer contains an EcoRI cleavage site
  • the antisense primer contains an EcoRV cleavage site. Both ends of the PCR product were cleaved using the restriction enzymes EcoRI and EcoRV, and inserted into the EcoRI and EcoRV cleavage sites of pcDNA3 (Fig. 2).
  • the prepared cDNA was transferred to HeLa cells cultured in a glass bottom dish using FuGENE HD (manufactured by Kuchi-Shu Applied Science). After 12 hours, it was replaced with a new culture medium. After 24 hours, fluorescence observation was performed with an incubator microscope (Olympus, LCV 100). A cooled CCD camera is connected to this microscope, and fluorescence images of cells can be acquired over time. Prior to the experiment, only the fluorescence of the background light was observed even in the cells expressing the probe reagent. This indicates that in the steady state with no oxidative stress, almost all of the intracellular probe reagent is degraded.
  • the oxidative stress inducer diethylmaleate (DEM) was added to 100, and the fluorescence intensity of mK02 (ex; BP520- 540HQ, em; BP555-600HQ). After DEM addition, the fluorescence intensity of mK02 was observed to increase 10 times or more (Fig. 3). When ethanol, the solvent, was added to the control as 0.1%, the fluorescence intensity of mK02 did not increase. From these results, it was shown that this probe increases fluorescence intensity depending on oxidative stress. Furthermore, when the added DEM was washed away, the fluorescence intensity of mK02 decreased to the ground state (Fig. 4). This indicates that the probe reagent's response to oxidative stress is reversible.
  • DEM diethylmaleate
  • the present invention provides a probe reagent that can measure the dynamics of oxidative stress in a living cell or organism in real time. In order to produce a fluorescent or luminescent probe with good detection sensitivity, it is important to increase the response signal or decrease the non-response signal.
  • the probe reagent of the present invention includes a probe reagent containing a conjugate of a fluorescent or luminescent protein and a marker protein, or the conjugate and a regulatory factor that promotes degradation by the proteasome in the same probe.
  • the regulator can act on the marker protein by being cleaved and separated from the probe in the cell, or can act on the marker protein in a state where it is not separated from the probe.
  • a probe reagent that contains a conjugate and a regulatory factor in the probe and that can be separated from the conjugate and the regulatory factor is preferable.
  • the background light level can be suppressed.
  • an increase in the fluorescence signal at the time of response is shown dynamically compared to the conventional method, and a probe reagent with very good detection sensitivity can be obtained.
  • the ability to accurately detect even small changes in oxidative stress is effective when it is desired to detect the initial stage of oxidative stress generation.
  • This capability is also effective when measuring oxidative stress in the deep part of an animal individual where it is difficult to measure minute light intensity differences due to light scattering by the tissue.
  • the probe reagent of the present invention was shown to have a reversible response to oxidative stress. Therefore, it is possible to measure both conditions that promote oxidative stress and conversely suppress it. This makes it possible to screen for substances that cause oxidative stress and, conversely, to screen for substances that suppress oxidative stress with a single reagent.
  • the response is reversible, it is possible to change the type and amount of drug administered with a single biological sample. As a result, the number of biological samples used in the experiment can be reduced, and the same sample can be measured, so that the results can be compared easily and accurately.
  • the present invention is useful in the fields of medicine and industry, such as elucidation of oxidative stress-related diseases and aging mechanisms, and search for drugs that suppress these diseases.
  • SEQ ID NO: 7 DNA sequence of mK02-Nrf2—100-T2A-Keapl

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Abstract

　この発明は、細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プローブ試薬であって、蛍光又は発光蛋白質及びマーカー蛋白質を含むか、蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質及び調節因子を含むか、あるいは蛍光又は発光蛋白質、マーカー蛋白質、切断配列及び調節因子を含み、ここで、マーカー蛋白質は、活性酸素による酸化ストレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びユビキチン結合部位を含み、調節因子は、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可能である蛋白質であるプローブ試薬、並びにこのプローブ試薬を用いて、細胞で酸化ストレスを測定する方法、或いは、細胞で酸化ストレス抑制又は促進物質をスクリーニングする方法に関する。

Description

明 細 書 酸化ス トレスを測定するためのプローブ試薬
技術分野
本発明は、 細胞又は生物において酸化ス トレスを測定するための蛍光又は発光 プローブ試薬に関する。
本発明はまた、 上記プローブ試薬をコードする核酸、 及び該核酸を含むベクタ 一に関する。
本発明はさらに、 上記プローブ試薬又はベクターを用いて、 細胞又は生物での 酸化ス トレスを測定する方法、 或いは、 酸化ス ト レス制御物質のスク リーニング 方法に関する。
本発明はさらに、 上記プローブ試薬、 核酸、 又はベクターを含む、 酸化ス ト レ ス測定用又は酸化ス ト レス制御物質スク リーニング用キッ トに関する。 背景技術
近年、 酸化ス トレスと呼ばれる細胞内で起こる過剰な酸化反応が、 生体に有害 な影響を及ぼすことがわかってきた。 この酸化反応は活性酸素と呼ばれる、 細胞 内で生じる酸化力が強い分子種によって引き起こされる。 活性酸素としては、 過 酸化水素, . 一重項酸素， ヒ ドロキシルラジカル， スーパーオキサイ ドァニオンな どが知られている。 本来、 活性酸素は免疫系での異物除去や有害分子の解毒作用 などにも使われ、 生体にとって有用な面も持つ。 また、 細胞には酵素ゃ抗酸化能 をもつ分子による活性酸素の消去系があり、 発生した過剰な活性酸素は速やかに 除去されるため、 これによる悪影響は抑えられている。
しかし、 活性酸素の生成と消去のバランスがくずれ、 活性酸素の生成が過剰と なることで、 生体に有害な影響を与えるようになる。 酸化ス ト レスにより、 DNA、 蛋白質、 脂質など、 細胞の正常な活動に不可欠な分子が損傷を受け、 その結果、 癌や動脈硬化、 心筋梗塞、 糖尿病といった疾患や老化が引き起こされるといわれ ている。 酸化ス トレスが生じる原因としては、 過度の運動や、 運動不足、 偏った 食事、 喫煙などといった不健康な生活習慣が挙げられており、 酸化ストレスは現 代の生活と密接に関係した問題となっている。
また、 活性酸素は、 虚血にさらされた臓器で、 血流め再開時に起こる再灌流傷 害の原因物質としても注目されている。 血流が途絶えた臓器はその間、 無酸素状 態に置かれるが、再灌流後の急激な再酸素化によって大量の活性酸素が発生する。 これが広範囲にわたる細胞に損傷を与え、 臓器レベルの傷害を引き起こすと考え られている。 このような傷害が生じるおそれが、 虚血臓器の迅速な治療を困難な ものにしている（非特許文献 1 )。
このように、 活性酸素に関わる種々の問題が挙げられている状況で、 生体内で 発生する活性酸素の分布や量の変化を測定することが、 疾患の発症や老化のメカ ニズムに関して重要な知見を与え、 さらには有効な予防法や治療法の開発に大き く寄与するものと期待される。 そのために、 生体内で効率よく活性酸素の挙動を 測定できる技術が要求されている。
酸化ス トレスの原因となる活性酸素を測定する手法として、 ィソルミノール
(i soluminol)などの化学発光試薬によるものがある。 これは、 活性酸素による試 薬の酸化反応にともなう発光現象を測定するものである。 この反応は、 白血球の 免疫活性の評価法として、 体内に侵入した異物を攻撃する際に放出する活性酸素 を測定するためによく使われている（非特許文献 2 )。 しかし、 イソルミノールは 細胞膜の透過性に乏しく、 細胞外に放出される活性酸素の測定は行えるが、 細胞 内で発生する活性酸素の測定には向かない。 また、 この発光の強度は弱く、 その 計測に大量の細胞を必要としたり、 高感度の検出器でも長時間の積算時間を要し たりするため、 効率のよい測定が困難である。
有機系の蛍光色素による測定も行われている。 色素としては、 2 '， 7 ' -ジクロ ロジヒ ドロフルォレセイン、 ジヒ ドロェチジゥム（dihydroethyidium)などがよく 使われている（非特許文献 3 )。 これらは、 非蛍光性の化合物であるが、 活性酸素 による酸化反応によりその構造が変化し蛍光性となる。 すなわち、 この蛍光を測 定することで、 その場の活性酸素の量を測定することできる。 これらの試薬は細 胞膜を通して細胞に導入することができる。 しかし、 細胞内の特定のオルガネラ に選択的に取り込ませることはできず、 特定の部位に限定した活性酸素の測定は 困難である。 さらに、 これらの色素の蛍光の発光は不可逆であり、 いったん酸化 された分子はもはや活性酸素に対する反応性を失い、 その後の測定に寄与できな くなる。
最近では、 ォワンクラゲなどから単離され、 その特性が改良された蛍光蛋白質 が、 細胞内の生理活性を測定するためのプローブ試薬としてよく使われるように なっている。 蛋白質により構成されるプローブ試薬は、 その遺伝子としても扱う ことができる。 この遺伝子をプラスミ ドという形で細胞に取り込ませ、 プローブ 試薬として発現させることで測定に使用することができる。 この手法では、 生体 内の特定の細胞や、 細胞内の特定のオルガネラのみに限定してプローブ試薬を発 現させることもでき、 より限定された領域での生理活性の測定が可能となる。 蛍光蛋白質を利用した酸化ス トレスプローブ試薬も開発されている。 このよう な試薬は、 活性酸素を検知するマーカ一蛋白質に、 蛍光蛋白質が結合された構造 になっている。 マーカー蛋白質としては、 活性酸素との反応でその構造を変化さ せるものが使われる。 その構造の変化が、 蛍光蛋白質が発する蛍光の強度や波長 を変化させるように設計されている。 例えば、 Hyper と呼ばれるプローブ試薬で は、 過酸化水素に特異的に反応する蛋白質がセンサ一蛋白質として使われ、 これ が蛍光蛋白質である YFPと結合した構造になっている。 過酸化水素がセンサー蛋 白質と作用することで YFPの蛍光強度を変化させる （非特許文献 4 )。別の例とし て、 蛍光エネルギー移動の現象を応用したものがある。 このプローブ試薬では、 2種類の蛍光波長が異なる蛍光蛋白質がセンサー蛋白質を挟み込んだ構造をとつ ている。 センサー蛋白質の活性酸素との反応で生じる構造の変化が、 両端にある 蛍光蛋白質間の距離を変化させる。 この変化がエネルギー移動の効率に変化を与 えている。 この試薬では、 蛍光スペク トルの変化から活性酸素をモニタすること ができる（特許文献 1 )。 しかし、 このようなセンサー蛋白質の構造変化に基づく 試薬の蛍光の変化は数倍程度と小さく、 特に活性酸素の発生量が少ないときには その検出が困難になる。
細胞には酸化ストレスにさらされると、 それに対する防御反応として発現され る蛋白質がある。 細胞に対する酸化ス トレスはこのような蛋白質の増加量を測定 することでも検出できる。 筋肉で酸化ス トレスが測定された例では、 TNF a , pi などの蛋白質がその指標として測定されている（特許文献 2 )。 この手法では、 目的とする蛋白質をウェスタンプロッティング法などの生化学的な手法で測定す る。 そのために、 細胞を破壊し内部の蛋白質を抽出し、 さらにこれらを分離する など煩雑な作業を要し、 生きた細胞で迅速かつ継続的な活性酸素の測定は行えな レ、。
特許文献 1 特開 2005- 95171
特許文献 2 特開 2006- 162346
非特許文献 1 Droge，W. , Phys iol . Rev. , 82， 47-95, 2002
非特許文献 2 Dahl gren, C. and Karlsson, A. , J. Immunol . Meth. , 232， 3-14,
1999
非特許文献 3 Munzel, T. et al . , Arteriosc ler. Thromb. Vase. Biol .， 22, 1761-1768, 2002
非特許文献 4 Belousov, V. V. et al. , Nature Methods, 3， 281-286, 2006
発明の開示
背景技術のなかで取りあげたように、 活性酸素に関わる種々の問題が挙げられ ている状況で、 生体内で発生する活性酸素の分布や量の変化を精確に測定するこ とが、 活性酸素が関係する種々の疾患の発症や老化のメカニズムに関して重要な 知見を与え、 さらには有効な予防法や治療法の開発に大きく寄与するものと期待 されている。 しかし、 現在使用されている又は提案されている酸化ス ト レスを引 き起こす活性酸素の測定法には、個々に、上記のような問題点が指摘されている。 そのために、 そのような問題点を克服して生体内で効率よく活性酸素の挙動を測 定できる技術が要望されている。
したがって、 本発明の目的は、 活性酸素に対する応答が可逆的であり、 それに よって細胞又は生物内で酸化ストレスを連続的にかつリアルタイムでモニタでき る蛍光又は発光プローブ試薬を提供することである。
本発明の別の目的は、 上記プローブ試薬又は該試薬をコードする DNAを含むベ クタ一を用いて、 細胞又は生物内で酸化ス トレスを測定する方法、 或いは、 細胞 又は生物内で酸化ス トレスを抑制又は促進させる物質をスクリ一ユングする方法 を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、 上記プローブ試薬、 上記 DNA もしくは RNA、 或い は上記ベクターを含む、 酸化ス ト レス関連測定用キッ トを提供することである。 上記課題を解決するために、 本発明者は、 今回、 生細胞で酸化ス トレスの動態 をモニタすることが可能である新規の蛍光プローブ試薬を見出した。 このプロ一 ブ試薬は、 2〜4種のエレメント、 すなわち、 少なく とも蛍光又は発光蛋白質及び マーカー蛋白質を含み、 場合により調節配列、 又は切断配列と調節因子、 をさら に含む融合蛋白質から構成されており、該プローブ試薬をコードする核酸（すなわ ち、 DNA又は RNA)を細胞又は生物に導入し細胞内で発現させることによって、 蛍 光又は発光蛋白質の蛍光又は発光強度の変化から酸化ストレスの増減をモニタす ることを可能にする。また、細胞自身がもつ蛋白質の分解反応を利用することで、 酸化ス トレスの変化に応じてプローブ試薬の存在量がダイナミックに変化するた め、 大きな蛍光強度の変化を得ることができる。 このような連続的なモニタリン グを可能にするプローブの特徴は、 活性酸素に対する応答が可逆的であることに 基く。
要約すると、 本発明は、 以下の特徴を包含する。
( 1 ) 細胞又は生物において酸化ス トレスを測定するための蛍光又は発光プロ ーブ試薬であって、 前記試薬が、 蛍光又は発光蛋白質、 マーカー蛋白質、 切断配 列及び調節因子を含む融合蛋白質からなり、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活 性酸素による酸化ス トレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及び ュビキチン結合部位を含み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白 質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、 前記蛍光又は発光蛋白質と 前記マ一力一蛋白質は、 任意の順序で互いに隣りあって連結体を形成しており、 前記切断配列は、 前記連結体と前記調節因子との間に配置されかつ切断可能な配 列を含み、 並びに、 前記試薬が細胞内において前記切断配列で切断されて、 前記 連結体と調節因子とが分離されて存在し、 及び、 調節因子とマーカー蛋白質との 結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解を促進又は抑制することを特徴とす る、 前記プローブ試薬。
( 2 ) N末端側から C末端側に向かって、 （i) 蛍光又は発光蛋白質、 マーカー 蛋白質、 切断配列及び調節因子、 （ii)マーカー蛋白質、 蛍光又は発光蛋白質、 切 断配列及び調節因子、 （iii) 調節因子、 切断配列、 蛍光又は発光蛋白質、 及びマ 一力一蛋白質、 或いは、 （iv) 調節因子、 切断配列、 マーカー蛋白質、 及び蛍光又 は発光蛋白質、 の順に配置されている、 上記 （1) に記載のプローブ試薬。
(3) 上記マーカー蛋白質が分解されるとき、 蛍光又は発光蛋白貧も分解され て蛍光又は発光を発しなくなる、 上記（1)又は（2)に記載のプローブ試薬。
(4) 上記調節因子の、 活性酸素応答による構造変化が可逆的である、 上記（1) 〜（3)のいずれかに記載のプローブ試薬。
(5) 上記マーカー蛋白質の分解が、 プロテアソームによるものである、 上記 (1)〜（4)のいずれかに記載のプローブ試薬。
(6) 上記酸化ス トレスがリアルタイムで測定可能である、 上記（1)〜（5)のい ずれかに記載のプローブ試薬。
(7)上記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質との間にリンカーを含む、 上記 （1) 〜 （6) のいずれかに記載のプローブ試薬。
(8) 上記蛍光又は発光蛋白質が、 サンゴ又はォワンクラゲ由来の蛍光蛋白質 である、 上記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のプローブ試薬。
(9) 上記蛍光又は発光蛋白質が、 ルシフェラーゼである、 上記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のプローブ試薬。
(1 0)上記マーカー蛋白質及び調節因子がそれぞれ、 ヒ ト Nrf2 (Accession No. AAB32188)及びヒ ト Keapl (Accession No. AAH21957)、 或いはそれらのホモログ又 はそれらのアナログである、 上記 （1)〜（9) のいずれかに記載のプローブ試薬。
(1 1) 前記プローブ試薬が配列番号 7に示される塩基配列を含む DNAによつ てコードされる、 上記 （1) 〜 （10) のいずれかに記載のプローブ試薬。
(1 2) 上記 （1) 〜 （11) のいずれかに記載のプローブ試薬をコードする DNA 又は RNA。
(1 3) 配列番号 7に示される塩基配列を含む、 上記 （12) に記載の DNA。
(1 4) 上記 （12) 又は （13) に記載の DNAを含むベクター。
(1 5) 上記 DNAの発現を可能にする制御配列をさらに含む、 上記 （14) に記 載のぺクタ一。 ( 1 6 ) 上記 （1) 〜 （11) のいずれかに記載のプローブ試薬或いは上記 （14) 又は （15) に記載のベクターを細胞又は生物 （ヒ トを除く） 内に導入し、 細胞又 は生物内の蛍光又は発光強度に基いて酸化ストレスを測定することを含む、 細胞 での酸化ス トレス測定方法。
( 1 7 ) 前記測定が、 リアルタイムで行われる、 上記 （16) に記載の方法。
( 1 8 ) 細胞又は生物 （ヒ トを除く） において酸化ス トレスを測定する方法で あって、 前記方法が、 前記細胞又は生物において酸化ス トレスの程度に応じて分 解が制御されるマーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、 あるいは該連 結体をコードする核酸を含むベクター、 を前記細胞又は生物内に導入して、 前記 連結体を細胞又は生物内に存在させる工程と、 前記蛍光又は発光蛋白質に由来す る蛍光又は発光量を測定することにより、 前記連結体の分解が制御される程度に 基いて前記細胞又は生物における酸化ストレスの存在又はそのレベルを決定する 工程と、 を含み、 ここで、 前記マーカー蛋白質は調節因子結合部位及びュビキチ ン結合部位を含み、 及び前記連結体の分解が、 活性酸素に応答して調節因子によ つて制御されることを特徴とする、 前記方法。
( 1 9 )前記調節因子と前記マーカー蛋白質とが同種の生物由来のものである、 上記 （18) に記載の方法。
( 2 0 ) 前記調節因子が、 外因性又は内因性のいずれかである、 上記 （18) 又 は （19) に記載の方法。
( 2 1 ) 前記外因性の調節因子が、 該調節因子をコードする DNAを含むベクタ 一の形態で前記細胞又は生物内に導入される、 上記 （18) 〜 （20) のいずれかに 記載の方法。
( 2 2 ) 細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プ ローブ試薬であって、 前記試薬が、 マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含 む連結体を含み、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活性酸素による酸化ス トレス を検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びュビキチン結合部位を含み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可 能である蛋白質であり、 前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離に よってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、 前記プロ ーブ試薬。
( 2 3 ) 上記 （22) に記載のプローブ試薬をコードする DNA又は RNA。
( 2 4 ) 上記 （23) に記載の DNAを含むベクター。
( 2 5 ) 細胞又は生物において酸化ストレスを測定するための蛍光又は発光プ ローブ試薬であって、 前記試薬が、 マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含 む連結体と、 調節因子とを含み、 前記連結体と前記調節因子とがリンカ一を介し て結合されており、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活性酸素による酸化ス トレ スを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びュビキチン結合部位を含 み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御すること が可能である蛋白質であり、 前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解 離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、 前記 プローブ試薬。
( 2 6 ) 酸化ストレスが負荷された細胞又は生物 （ヒ トを除く） 内に、 上記 （1) 〜（11)、 (22) 及び （25) のいずれかに記載のプローブ試薬或いは上記（14)、 (15) 又は（24)に記載のベクター及び候補物質を導入し、 細胞内の蛍光又は発光強度を 低下又は増大させる物質をスクリ一ユングすることを含む、 酸化ストレス制御物 質のスクリ一二ング方法。
( 2 7 ) 上記（1)〜（11)、 （22)及び（25)のいずれかに記載のプローブ試薬、 上記 (12)、 （13)又は（23)に記載の DNA又は RNA、 及び上記（14)、 (15)又は（24)に記載 のベクターからなる群から選択される少なくとも 1つを含む、 酸化ストレス測定 用又は酸化ス ト レス制御物質スク リーニング用キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008-049895号の明細書 および または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の蛍光酸化ストレスプローブ試薬が取り うる 4つの構造を示す。 マーカー蛋白質内の R及び Uはそれぞれ、 調節因子結合部位、 ュビキチン結合部 位を示す。
図 2は、 本発明の蛍光酸化ストレスプローブをコードする DNA構造の模式図を 示す。
図 3 aは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に ΙΟΟ μ Μになる よう DEM (マレイン酸ジェチル （酸化ストレス誘導剤）） を添加した後の顕微鏡画 像の時間変化 （時：分） を示す。
図 3 bは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に I OO M DEM (黒 丸） 又はコントロールとしての 0. 1%エタノール（EtOH) (白丸） になるよう添加し た後の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。 横軸は時間 （h )、 縦軸は蛍光強 度を表す。
図 4 aは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に ΙΟΟ μ Μになる よう DEMを添加した後の顕微鏡画像の時間変化 （時：分） を示す。 DMEを添加し た後、 15時間後に培地交換（ 「Wash」 ）し DEMを除去した。
図 4 bは、本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に ΙΟΟ μ Μになる よう DEMを添加した後の蛍光強度の時間変化を示す。 DEMを添加した後、 15時間 後に培地交換（ 「wash」 ）し DEMを除去した。 横軸は時間 （h.)、 縦軸は蛍光強度を 表す。
図 5 aは、 本発明の蛍光酸化ストレスプローブを導入した細胞に ΙΟ Μになる よう MG132 (プロテアソーム阻害剤； Sigma社） を添加した後の顕微鏡画像の時間 変化 （時：分） を示す。
図 5 bは、 本発明の蛍光酸化ス トレスプローブを導入した細胞に 10 M MG132 (黒丸）、 又は 0. 1% DMS0 (コントロール； 白丸） になるよう添加した後の蛍光強 度の時間変化を示すグラフである。 横軸は時間 （h )、 縦軸は蛍光強度を表す。 図 6は、本発明の蛍光酸化ス トレスプローブを導入した細胞に 100 ;u M DEM、0. 1% Et0H、 10 x M MG132,又は 0. 1%DMS0になるよう添力 Qし、 8時間経過した後の抗 Nrf2 抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果を示す。 *は、 mK02_Nrf2 を示し、 **は、 T2Aで分かれていない mK02- Nrf2- T2A_Keaplを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明をさらに詳細に説明する。
1 . 新規プローブ試薬 上で述べたような、 従来の酸化ストレス測定法の問題点を克服したプローブ試 薬'（単に、 「プローブ」 と称してもよい） を開発した。 この試薬は実質的に蛋白質 で作られており、 その蛋白質をコードする核酸 （例えば、 遺伝子、 DNA、 RNA、 又 はそれらの化学修飾体） を細胞又は生物に導入することで、 細胞又は生物内に発 現させ機能させることができる。 構造の一部として蛍光又は発光蛋白質および酸 化ストレスを検知するマーカー蛋白質を含み、 蛍光又は発光蛋白質の蛍光又は発 光強度の変化から酸化ストレスの増減をモニタする。 細胞自身がもつ蛋白質の分 解反応を利用することで、 酸化ス トレスの変化に応じてプローブ試薬の存在量が ダイナミックに変化するため、 大きな蛍光又は発光強度の変化を得ることができ る。 またその応答は可逆的であり、 酸化ス トレスの増減を生細胞又は生物で連続 的にモニタすることができる。 以下に、 このプローブ試薬の特徴を述べる。
本発明においては、 関連した次のプローブ試薬が提供される。
第 1のプローブ試薬は、 マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質を含む連結体を 含むものである。 この連結体が細胞内又は生物内に導入されると （この場合、 該 連結体をコードする核酸を発現可能に含むベクターを細胞内又は生物内に導入し てもよい）、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御する調節因子と該連 結体との相互作用を介して、 活性酸素による酸化ス トレスの存在又はレベル （も しくは程度） を測定することを可能にする。
本発明の第 2のプローブ試薬は、 蛍光又は発光を発する蛍光又は発光蛋白質、 マーカー蛋白質、活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御する調節因子、 および切断配列を含み、 これらのエレメントを 1本のァミノ酸鎖として連結した 融合蛋白質である。 その構造を図 1に示す。
図 1に示すように、 本発明のプローブ試薬は、 4つの可能な構造：すなわち、
N末端側から C末端側に向かって、 （1) 蛍光又は発光蛋白質、 マーカー蛋白質、 切断配列及び調節因子、 （2)マーカー蛋白質、 蛍光又は発光蛋白質、 切断配列及び 調節因子、 （3) 調節.因子、切断配列、蛍光又は発光蛋白質、及びマーカー蛋白質、 或いは、 （4) 調節因子、 切断配列、 マーカー蛋白質、 及び蛍光又は発光蛋白質、 の 1揮に配置された構造を含むことができる。
第 3のプローブ試薬は、 上記連結体と調節因子を含み、 これらがリンカ一を介 して結合されているプローブである。 リンカ一は、 調節因子が、 連結体を構成す るマーカー蛋白質上の調節因子結合部位に結合可能な程度の長さを有しているべ きである。 リンカ一は、 例えば、 天然アミノ酸又は非天然アミノ酸又はこれらの ミックスからなるぺプチド性又はポリべプチド性リンカーであり、具体的には 18 ァミノ酸程度のリンカ一であっても、 又は 142ァミノ酸程度のリンカーであって も、 本発明の上記効果を達成しうる。
本発明のプローブ試薬では、 蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質は隣り合つ て連結されている。配列としてそのどちらが N末端側、 C末端側にあってもよレ、。 また、 蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質の間にリ ンカ一 （例えば 1又は数個 のァミノ酸からなるリンカー、例えば 10ァミノ酸以下のぺプチド） が含まれても よい。 マーカー蛋白質には、 調節因子を結合する部位と、 細胞内に存在し蛋白質 の分解に関与するュビキチンと呼ばれる蛋白質分子が結合する部位がある。
切断配列は、蛍光蛋白質-マーカー蛋白質の連結体と調節因子の間にある。蛍光 又は発光蛋白質-マーカー蛋白質の連結体と調節因子は、切断配列をはさんで、そ のどちらが N末端側、 C末端側にあってもよい。
本発明のプローブ試薬は、 蛋白質の形態で細胞内に直接導入してもよいし、 或 いは該プローブ試薬をコードする DNAを発現可能に含むベクターを細胞内に導入 することによって細胞内で発現、 翻訳されてもよい。 プローブ試薬のうち上記第 2のプローブ試薬は、 細胞内で （導入後又は翻訳後に） 自動的に切断配列で切断 されて、 蛍光又は発光蛋白質-マーカー蛋白質の連結体と調節因子が分離される。 本発明によれば、 調節因子は、 活性酸素との反応によりその構造を変化させ、 マ 一力一蛋白質に結合または解離することでマーカー蛋白質の分解を促進または抑 制するため、 このことが酸化ストレスの定性的又は定量的測定を可能にする。 蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質は、 好ましくは、 マーカー蛋白質が分解 されたときに蛍光又は発光蛋白質も続けて分解され、 蛍光又は発光を発しなくな るように連結した形となっている。
調節因子として、 活性酸素との反応での構造変化が可逆的に起こるものを選択 することで、 プローブ試薬の酸化ストレスに対する応答性を可逆的にすることが できる。酸化ス トレスの変化をより大きな蛍光又は発光の変化として示すために、 調節因子としては、 細胞が受ける程度の酸化ストレス量でマーカー蛋白質の分解 を強く促進、 あるいは抑制するものを使うことが望ましい。
酸化ストレスは、上述したように、細胞内で起こる過剰な酸化反応（すなわち、 酸化ー抗酸化因子のバランスが酸化の方向に傾いた状態） が生体に有害な影響を 及ぼすことであり、 この酸化反応は活性酸素と呼ばれる、 細胞内で生じる酸化力 が強い分子種によって引き起こされる。 活性酸素としては、 過酸化水素、 一重項 酸素、ヒ ドロキシルラジカル、スーパーォキサイ ドア二オンなどが知られている。 また、 前述したように、 活性酸素の生成が過剰となること、 すなわち酸化ス トレ スにより、 細胞の正常な活動に不可欠な分子が損傷を受け、 その結果、 癌、 動脈 硬化、 心筋梗塞、 糖尿病などの疾患、 老化が引き起こされる。 さらにまた、 活性 酸素は、 虚血又は低酸素状態にさらされた臓器で、 血流の再開時に起こる再灌流 傷害の原因物質としても知られている。 本発明は、 酸化ス トレスが影響するこの ような疾患の検出や予防管理のために有用である。
マーカー蛋白質と調節因子は、 生体に存在するそのままの形態の蛋白質を使用 してもよいし、 プローブ試薬の能力を向上させるために、 その一部を人工的に改 変したものを使用してもよい。人工的改変の例は、マーカー蛋白質 Nrf2の C末端 部位欠損である。 欠損の程度は、 調節因子結合部位及びュビキチン結合部位を損 なわないで、 かつ、 蛋白質のネイティブの立体構造 （コンフオメーシヨン） を実 質的に保持するような程度であることが望ましい。 プローブ試薬の能力とは、 例 えば細胞内での発現効率、 マーカー蛋白質と調節因子との結合の強さ、 酸化スト レスに対する応答の速さや大きさなどである。
本発明のプローブ試薬の酸化ス トレスに応じた分解には、 細胞自身がもつュビ キチン-プロテアソーム系による蛋白質分解反応を利用する。ュビキチンが結合し た蛋白質は、 蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解される。 この分解系は真核細胞に普遍的に存在するものであるため、 あらゆる種類の細胞
(例えばヒ ト細胞を含む動物細胞、 植物細胞、 酵母細胞、 菌類細胞など）、 及び真 核生物 （ヒ トを除く哺乳動物、 鳥類、 両生類、 爬虫類、 魚類、 昆虫などの動物、 植物、 酵母、 菌類など） を測定対象とすることができる。
以下に、 本発明のプローブ試薬を構成するエレメントの具体例を挙げるが、 そ れらに限定されないものとする。
蛍光蛋白質としては、 ォワンクラゲ由来の GFP, EBFP, ECFP, EGFP, EYFPなど やこれらから派生したもの、 またサンゴ由来の DsRed, HcRed, mCherryなどやこ れらから派生したものなどを使用することができるが、 これらに限定せずに、 蛍 光蛋白質であれば任意のものを使用できる。 これらの蛋白質は、 レーザー等によ り励起されると、 基底状態に戻るときに発光する。 蛍光蛋白質の種類によって異 なるが、 励起波長域は例えば約 350〜600nmであり、 発光波長域は例えば約 500〜 600nm である。 或いは、 蛍光蛋白質の位置にホタルなどがもつ生物発光反応を触 媒する酵素であるルシフェラーゼを配置してもよい。 蛍光蛋白質を発光させるた めには、 外部から励起光を照射させる必要がある。 そのため、 自家蛍光が強い試 料や光照射が生理活性に影響を与える試料の場合には測定が困難になる。 発光法 では励起光が不要で、 ルシフェリンなどの発光基質を細胞に与えることで反応が 進むため、 励起光の照射が困難な試料に対しても測定が行えるようになるという 利点を有する。上記のような蛍光又は発光蛋白質は、 Clontech、Roche Diagnost ics などから市販されている。
マーカー蛋白質及び調節因子の組み合せとしては、 ヒ ト由来の Nrf2 (GenBank Access ion No. AAB32188)及び Keapl (GenBank Access ion No. AAH21957)をそれぞ れ例示することができるが、 他の生物種 （例えば動物種） に由来する同機能をも つホモログ蛋白質の組み合わせを使用してもよい。 また、 マーカー蛋白質として は、 調節因子結合部位とュビキチン結合部位をともに含んでいれば、 その一部の ドメインのみを使用してもよくプローブ試薬として機能することができる。
Nrf2は細胞内において酸化ス トレスに応答して、 これに対する防御機能を担う 抗酸化蛋白質の発現を誘導する転写因子として働いている。 細胞に酸化ストレス がない状態では、 Nrf2は Keapl と結合した形で細胞質に存在している。 このとき
Keaplはさらにュビキチンリガーゼ複合体と結合して、 Nrf2のュビキチン化を促 進している。ュビキチン化された Nrf2は蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソ ームによって分解を受けるため、 その増加が抑えられている状態にある。 一方、 細胞が酸化ス トレスにさらされると、 活性酸素が Keapl と反応し、 その構造に変 化を与える。 この構造変化により Keaplが Nrf2力、ら解儺することで Nrf2のュビ キチン化が抑えられる。 これにより分解が抑制された Nrf2は、細胞内での量を増 加させ、転写因子としての機能を発揮するようになる。 Nrf2の標的遺伝子として、 シスチントランスポーター、 グノレタチオンシンターゼ、 グ^/タチオン- S-トランス フェラーゼ、 グルタチオンレダクターゼ、 グルタチオンペルォキシダーゼ、 ペル ォキシレドキシン、 チォレドキシンなどが報告されており、 Nrf2はこれらの遺伝 子発現を統一的に制御して生体を酸化ストレスから防御している。 Nrf2の活性を 制御する因子が、 Keaplである。 Nrf2/Keaplを介した酸化ス ト レス防御機構につ いては、 伊東健、 生化学（Biochemistry) 78 (2) pp. 79-92 (2006) (日本）に総説さ れている。
このように、 好ましくは、 本発明で使用可能なマーカー蛋白質は、 生体を酸化 ストレスから防御するために発現される遺伝子類を統一的に制御するような蛋白 質 （例えば転写因子） であり、 また、 調節因子は、 マーカー蛋白質の活性を制御 する蛋白質である。 このようなマーカー蛋白質と調節因子の他の組み合わせは、 例えば低酸素検出するマーカー蛋白質である HIF1-ひとその調節因子である pVHL を挙げることができる （M Ohh ら、 Nat. Cell Biol. 2000, 2 : 423-427)。 HIF1- αは低酸素応答性因子（hypoxia- inducible factor) 1- αと略称される転写因子で あり、 酸素により制御されている。 すなわち、 定常時の酸素の存在下ではュビキ チン一プロテアソ一ム経路によって蛋白質分解されているが、一方、低酸素時（例 えば血管新生、 腫瘍形成など） に機能することが知られている。 pVHL は von
Hippel-Lindau tumor suppressorとして知られ、 酸素依存的に HIFト αと結合し て HIF1- αをュビキチン化する。
切断配列は、 蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋白質との連結体と、 調節因子と の間に配置されかつ切断可能な配列を含み、 並びに、 前記試薬が前記切断配列で 切断されると、 上記連結体と調節因子とが分離される。 このような切断配列の好 ましい例は、 自己切断型ペプチドであり、 例えばウィルス由来の自己切断型 2Α ペプチド類（AL Szymczak ら、 Nat. Biotechnol. 2004， 5 : 589-594)、 具体的には
Thosea as igna v irus 2Aぺプチド（T2A) (EGRGSLLTCGDVEENPGP；配列番号 8)、 Porcine teschovirus-1 2Aぺプチド（P2A) (ATNFSLLKQAGDVEENPGP；配列番号 9)を含み、 こ れらのぺプチドの切断部位は C末端側のダリシン（G)とプロリン（P)の間である。 本明細書で使用する 「自己切断型ペプチド」 とは、 翻訳時に加水分解を受け、 G と Pの間で 2つの蛋白質に分かれるぺプチド配列のことをいう。
好適実施形態によれば、 本発明のプローブ試薬は、 上記のとおり、 細胞内又は 生物内において上記切断配列で切断されて、 上記連結体と調節因子とが分離して 存在し、 分離した調節因子は、 活性酸素との反応によりその構造を変化させて、 マーカー蛋白質との結合又は解離によってそれぞれ、 マーカー蛋白質の分解を促 進又は抑制する。 このようなマーカー蛋白質の分解の促進又は抑制は、 酸化スト レスの存在 （又は有無） やそのレベル （又は量又は程度） に依存する。
すなわち、 細胞が酸化ス トレスにさらされていない場合、 マーカー蛋白質は、 それに調節因子が結合することによってュビキチン化が促進され、 プロテアソー ムにより分解され、 同時に蛍光又は発光蛋白質も分解され、 これによつて蛍光又 は発光を発しない。 これに対して、 細胞が酸化ス トレスにさらされている場合、 マーカー蛋白質への調節因子の結合が抑制されるためマーカー蛋白質のュビキチ ン化が抑制され、 その結果、 蛍光又は発光が生じるようになる。 このとき、 酸化 ス 卜レスの程度と蛍光又は発光強度との間には相関を認めることができる。
また、 酸化ス トレスに対する本発明のプローブ試薬の応答は可逆的である。 こ のことは、 細胞又は生物において酸化ストレスがある状態から酸化ストレスがな い又は抑制された状態に変化するときには、 蛍光又は発光強度が、 比較的高い状 態から比較的低い状態に連続的に変化する、 或いは、 基線レベルまで変化するこ とを意味する。
本発明のプローブ試薬の具体例では、マーカー蛋白質が Nrf2蛋白質、 そのホモ ログ又は同等活性をもつそのアナログであり、 調節因子が Keapl蛋白質、 そのホ モログ又は同等活性をもつそのアナログであり、 蛍光又は発光蛋白質が任意の蛋 白質であり、 並びに、 切断配列が自己切断される任意の配列 （例えば上記の T2A ペプチド） である、 プローブ試薬である。 これら 4つのエレメントの配置は、 図 1に示す 4つの態様のいずれかである。
本明細書で使用するホモログなる用語は、 同等の活性及び性貧を有するが異な る生物種由来の蛋白質を意味する。例えばヒ ト Nrf2のホモログは、 ヒ ト以外の生 物種由来の Nrf2、 例えばマウス Nrf2などを含む。 同様に、 例えばヒ ト Keaplの ホモログには、 マウス Keaplなどのヒ ト以外の生物種の Keaplが含まれる。
本明細書で使用するアナログなる用語は、 天然又は野生型蛋白質のアミノ酸配 列において 1又は複数 （好ましくは 1又は数個） のアミノ酸の欠失、 置換、 付加 又は挿入を含むアミノ酸配列を有する変異型誘導体、 或いは、 糖鎖、 ァシル基、 アルキル基、リン酸基、 ADP-リボシル基などの修飾基を有する化学修飾型誘導体、 などを含む。 ここで、数個とは、 2〜10の整数、例えば 2〜8、 2〜6、 2〜5、
2〜4、 2〜 3などの整数を意味する。
あるいは、上記アナログは、天然又は野生型蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上、 好ましくは 93%以上、 より好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 98%以上又 は 99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する変異型誘導体であって もよい。 同一性は、 2 つ以上の蛋白質間でギャップを導入するか或いはギャップ を導入しないで整列を行い、 総アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合 （％) を意味する。 アミノ酸又は塩基配列の配列間の同一性の比較 （ホモロジ一検索、 相同配列検索など） は、 BLAST.、 FASTAなどの公知のアルゴリズムを利用して実施 することができる（例えば、 SF Altschul ら， J. Mol. Biol. 1990, 215 (3)： 403- 410 など）。 検索は、 NCBI (GenBank)、 EMBL などの公知のデータベースにアクセスし、 例えば高木利久及び金久實編、 「ゲノムネッ トのデータベース利用法」 共立出版、 東京、 日本 （1998年） に記載されるような手順で実施することができる。
上記のアナログにおいて、 アミノ酸の置換は、 保存的アミノ酸間の置換、 或い は非保存的アミノ酸間の置換を含む。 保存的アミノ酸は、 化学的性質又は構造的 性質の類似したアミノ酸群を指し、 例えば、 極性アミノ酸群 （セリン、 トレオニ ン、 ァスパラギン、 グルタミン、 システィン、 グリシンなど）、 疎水性アミノ酸群
(ァラニン、 ロイシン、 ィソロイシン、 バリン、 メチォニンなど）、 塩基性アミノ 酸群 （リシン、 アルギニン、 ヒスチジン）、 酸性アミノ酸群 （グルタミン酸、 ァス パラギン酸）、 分岐アミノ酸群 （バリン、 イソロイシン、 ロイシンなど）、 芳香族 アミノ酸群 （フエ二ルァラニン、 チロシン、 トリブトファン） などに分けること ができる。 一方、 非保存的アミノ酸は、 互いに化学的又は構造的性質の異なるァ ミノ酸を指す。 好ましい置換は、 保存的アミノ酸置換である。
上記のホモログ及びアナログでは、 蛋白質について説明したが、 同择のことは 核酸 （DNA又は RNA) にも適用される。 このような核酸は、 上記蛋白質ホモログ又 はアナログのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有することができる。 また、 核酸アナログには、 一塩基多型、 スプライス変異、 サイレント変異などの突然変 異核酸も含まれる。
本発明のプロ一ブ試薬のより具体的な例は、 後述の実施例に記載されるような 配列番号 7に示される塩基配列を含む DNAによってコードされる融合蛋白質であ る （図 2 )。 この DNAが細胞又は生物内に発現可能に導入されると、 該融合蛋白質 は、 切断配列にて連結体と調節因子とに分離され、 酸化ス トレスの増減に応じた 蛍光強度の増減が認められる （図 3〜図 5 )。 このプローブは、 細胞又は生物内で の酸化ストレスの動態をリアルタイムで測定することを可能にする。
本発明のプローブ試薬は、 上で説明したように、 通常、 融合蛋白質の形態をと つており、 従って、 遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。 このよう な技法の詳細は、 後述の 「2 . プローブ試薬をコードする核酸」 に記載している が、 ただし、 プローブ試薬をコードする DNAの発現は原核細胞 （例えば大腸菌、 バチルス属細菌など） 及び真核細胞のいずれでも可能である。
2 . プローブ試薬をコードする核酸
本発明はまた、 上で定義し説明したプローブ試薬のアミノ酸配列をコードする 塩基配列を含む核酸 （DNA又は該 DNAに対応する RNA) を提供する。 ここで、 RNA は、 該 DNA の塩基配列中、 デォキシリボースをリボースに、 かつ、 チミジン（T) をゥラシル（U)に置き換えた構造を有している。好ましい RNAは、該 DNAに対応す る mRNAである。 上記 DNA又は RNAはさらに、上記 4つのエレメントのそれぞれを コードする塩基配列の他に、 組換え操作を容易にするための 1又は複数の制限酵 素サイ トを含んでもよい。
このような DNAの構築は、 各エレメントに対応する DNAを、 生物の適当な組織 由来の cDNA ライブラリーから、 特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)、特異的プローブによるストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーショ ン、 クローニング法などによって調製することができる。 cDNA ライブラリ一は、 例えばヒ ト Nrf2及び Keaplのクローニングの場合、これらの遺伝子の発現が認め られる、 小腸、 肝臓、 心臓などの組織から調製可能である。 これらの組織から全 RNAを抽出し、 さらに mRNAを取出し、 これを铸型にして cDNAを合成することを 含む公知の方法にてライブラリーを調製することができる。
PCR法について、 この方法は、二本鎖 DNAの一本鎖への変性ステップ（例えば、 約 94〜98°C、 30秒〜 2分）、プライマ一のアニーリングステップ（例えば、約 55°C、 30秒〜 1分）、 及び DNAの伸長ステップ （例えば、 約 72°C、 30秒〜数分） からな る操作を 1サイクルとし、 これを約 20〜40サイクル実施することを含む。 この一 連の実施の前に同様の温度及び時間範囲内での変性ステップ、 また、 その実施の 後に同様の温度及び時間範囲内での伸長ステップを 1 回ずつ含んでもよい。 PCR に使用するプライマーは、 好ましくは、 铸型 DNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖 に相補的な配列、 又はそれと 90%以上、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98%以上同一性の配列を有するものを使用してもよいし、 或いは目的蛋白質の部 分アミノ酸配列に基づいて作製されたミックスプライマーを使用してもよいし、 或いはランダムプライマーを使用してもよい。 プライマーは、 好ましくはセンス プライマーとアンチセンスプライマーからなり、 それらのサイズは、 通常 15〜50 塩基、 好ましくは 20〜30塩基である。 PCRは、 Taqポリメラーゼなどの耐熱性ポ リメラーゼの存在下、 Mg2+含有 PCRバッファ一中で実施する。 PCRの実施にあたつ ては、サーマルサイクラーなどの市販の PCR装置（例えば、 Perkin-Elmer, Bio-Rad, Appl ied Biosystems, 宝酒造など） を用いて行うと便利である。 PCR の手法の具 体 j列【こつレヽて^;、 F. M. Ausubel ら、 Short Protocol s in Molecular Biology ^2002) , John Wiley & Sons , RA Siki ら， Science 1985, 230 : 1350—1354、 HA Erl ich ら， Science 1991, 252 : 1643- 1651などを参照することができる。
ハイブリダィゼーション法については、 配列が公知の目的 DNAの塩基配列に相 補的な配列、 又はそれと 90%以上、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98% 以上同一性の配列を有するものをプローブとし、 20塩基以上、 好ましくは 30塩 基以上、 より好ましくは 50塩基以上、 例えば 60〜200塩基、 60〜150塩基、 60〜
100 塩基などの長さのプローブを使用し、 ストリンジェントな条件にてハイブリ ダイゼーシヨンを実施することができる。 ス トリンジェン卜な条件は、 例えば 2
〜6 X SSC (塩化ナトリ ゥム /タエン酸ナトリウム） で、 40〜50°Cでのハイブリダイ ゼーシヨンのあと、 0. 1〜0. 2 X SSC、 0. 1 %SDSで、 50〜65°Cで 1回又は複数回の 洗浄からなる条件を含むことができる。 ハイプリダイゼーションの手法の具体例 は、 F. M. Ausubel ら （上記） に記載されている。
本発明の DNAは、 上記第 1のプローブ試薬又は第 2のプローブ試薬をコードす る DNAであり、その具体例は、配列番号 7に示される塩基配列を含む DNAである。 本発明はさらに、 上記 DNAと、 該 DNAを発現可能にする制御配列とを含むべク ターを提供する。
ベクターは、 細胞、 特に真核細胞、 例えば動物細胞 （ヒ ト細胞を含む哺乳動物 細胞、 鳥類細胞、 魚類細胞、 昆虫細胞など）、 植物細胞 （単子葉植物細胞、 双子葉 植物細胞など）、 酵母細胞、 菌類細胞 （糸状菌、 担子菌など） などの宿主細胞での DNA 発現に好適なベクターが好ましい。 このようなベクターとしては、 市販され ているもの力 或いは文献記載のものを使用することができる。ベクターの例は、 pUC系、 pBluescript系、 pBR系などのプラスミ ドベクター、 アデノウイノレス、 ァ デノ随伴ウィルス、 レトロウィルスなどのウィルスベクターを挙げることができ る。 植物細胞で使用可能なベクターの例は、 T-DNA領域の左側及び右側ボーダー (LB及び RB) を含むバイナリーベクター （例えば pBI系プラスミ ド）、 Tiプラス ミ ドなどである。
ベクターは、 DNA の発現のための種々の制御配列を含むことができる。 制御配 列には、例えばプロモーター、プロモーター/ェンハンサー、リボソーム結合配列、 ターミネータ一などを含むことができる。 プロモーターの例は、 SV40、 CMV、 RSV、 CaMV などのウィルス由来のプロモーター、 エノラーゼ、 グリセルアルデヒ ド- 3- リン酸デヒ ドロゲナーゼ、 へキソキナーゼ、 ピルビン酸デカルボキシラーゼ、 ホ スホフルク トキナーゼ、 ピルビン酸キナーゼなどの解糖系酵素のプロモーターな どを挙げることができる。 また、 ベクターは、 組換え体の選択のための選択マー カー配列、 例えばアンピシリ ン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 ネオマイ シン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸レダクターゼ、 チミジンキ ナーゼ、 アデノシンデアミナーゼなどの優性選択マーカー、 HIS3、 LEU2、 TRP1、 URA3などの栄養要求性相補選択マーカーなどを含むこともできる。
本発明のプローブ試薬をコードする DNAを細胞に導入するときには、 細胞内で 該 DNAが発現されて該プローブ試薬が生じる。 細胞への DNA (場合により、 RNA) を導入する方法の例としては、 例えばリボフヱクシヨンなどのリボソーム法、 ェ レク ト口ポーレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、 ァグロバタテリ ゥム法、 ジーンボンバートメント法などを挙げることができる。 これらの手法は、 例えば松橋通生ら監訳、 ワ トソン ·組換え DNAの分子生物学第 2版（1994年）、 丸善、 東京、 日本などに記載されている。
3 . 酸化ストレスの測定
本発明はさらに、上記プローブ試薬或いは上記ベクターを細胞又は真核生物（ヒ トを除く） 内に導入し、 該細胞又は生物内の蛍光又は発光強度に基いて酸化ス ト レスを測定することを含む、 該細胞又は生物での酸化ス トレス測定方法を提供す る。
あるいは、 本発明は、 細胞又は生物 （ヒ トを除く） において酸化ス トレスを測 定する方法であって、 該方法が、 該細胞又は生物において酸化ス トレスの程度に 応じて分解が制御されるマーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、 ある いは該連結体をコードする核酸 （例えば、 DNA) を含むベクター、 を該細胞又は生 物内に導入して、 該連結体を細胞又は生物内に存在させる工程と、 該蛍光又は発 光蛋白質に由来する蛍光又は発光量を測定することにより、 該連結体の分解が制 御される程度に基いて該細胞又は生物における酸化ストレスの存在又はそのレべ ルを決定する工程と、 を含み、 ここで、 該マーカ一蛋白質は調節因子結合部位及 びュビキチン結合部位を含み、 及び該連結体の分解が、 活性酸素に応答して調節 因子によって制御されることを特徴とする、 上記方法を提供する。
本発明の方法では、 連結体と調節因子とは少なく とも同じ細胞内で発現される 状態にあればよく、 例えば連結体をコードする DNA と調節因子をコードする DNA とを別々のベクターに挿入して導入することも場合によっては可能である。 もち ろん、 導入効率、 発現制御の容易さ、 などを考慮した場合は、 これらを単一のベ クタ一に挿入して導入することがより好ましい。
なお、 前記調節因子は、 上記のように外因性のものだけでなく、 前記細胞に内 在性 （もしくは、 内因性） のもの （すなわち、 細胞が元々持っているもの） を用 いることも可能である。 また、 調節因子とマーカー蛋白質との組み合わせは、 酸 化ストレスの程度に応じてその相互作用が調整されるものであれば、 それらの起 源はいずれのものでもよいが、 好ましくは同種の生物由来のものである。
本発明の測定法の特徴の 1つは、 該測定をリアルタイムで行うことができるこ とであ 。 このとき、 活性酸素との反応での構造変化が可逆的に起こる調節因子 であれば、 酸化ス トレスに対するプローブ試薬の応答性も可逆的となる。 このよ うな効果を提供するプローブ試薬一調節因子の組み合わせは、 実施例で例証され るような Nrf2-Keapl系である。上記応答が可逆的であるために、細胞又は生物が 酸化ストレスを受けると蛍光又は発光強度が徐々に増大する一方、 酸化ストレス が解消されると蛍光又は発光強度が減衰するというように、 酸化ス トレスの増減 に応じて蛍光又は発光強度をリアルタイムに測定することができる（図 4a及び図 4b)。
本発明で使用可能な細胞は、 上記のとおり、 哺乳動物細胞 （ヒ ト細胞を含む） などの脊椎動物細胞、 昆虫細胞などの無脊椎動物細胞、 植物細胞、 藍藻細胞、 酵 母細胞、菌類細胞などの真核細胞である。 これらの細胞は、卵母細胞、胚性幹（ES) 細胞、 精原細胞、 始原生殖細胞、 人工多能性幹（iPS)細胞などの分化多能性細胞も 含む。
本発明で使用可能な生物 （ヒ トを除く） は、 哺乳動物を含む脊椎動物、 無脊椎 動物などの動物、 単子葉植物、 双子葉植物などの植物、 酵母、 菌類などを含む。 これらの動物又は植物には、 トランスジエニック動物- (ヒ トを除く） やトランス ジエニック植物も包含され.る。
本発明のプローブ試薬が正しく機能するためには、 その原理上、 プローブ試薬 が測定の間、 常に発現され続けている必要がある。 長期の測定を行う際には、 そ の遺伝子の安定した発現を誘導するプロモータと連結させて発現させることが望 ましい。 そのためには、 ベクターとして、 プローブ試薬をコードする DNAを発現 可能な自律複製可能ベクターを使用するか、 該 DNAを組み込んだ人工染色体 （例 えば、 HA BAC、 YACなど） を使用する力、、 或いは、 該 DNAを細胞ゲノムに相同 組換え法で組み込むためのベクターを使用することができる。 また上記のように プローブ試薬を一過性に細胞に発現させる手法に加え、 その遺伝子を保持し、 プ ローブ試薬を安定して発現させる細胞を作製して測定に用いてもよい。
本発明のプローブ試薬は酸化ス トレスの強さに応じて蛍光又は発光強度が変化 するため、 この試薬をコードする DNAを含むトランスジーンを導入したトランス ジエニック生物を作製することで、 細胞レベルだけでなく個体レベルでの酸化ス トレスの測定も行うことができる。 その際に、 トランスジーンを適当なプロモー タの下流に連結することで、 目的とする臓器、 組織に選択的に発現させて測定に 用いることも可能である。
トランスジエニック動物（ヒ トを除く）の作製には、例えば核移植法や ES細胞、 IPS 細胞などの分化多能性細胞を利用することができる。 これらの方法を以下に 簡単に説明する。
核移植法は、 例えば線維芽細胞などの体細胞のゲノムにトランスジーンを導入 したのち、 該細胞から取出した核を、 除核した受精卵又は未受精卵にマイクロイ ンジェタ トし、 これを仮親の子宮又は卵管に戻し、 発生、 出産させてキメラ動物 を得ることを含む。
ES細胞を利用する方法は、 動物 （ヒ トを除く） の受精後の胚盤胞又は 8細胞期 胚から取出した内部細胞塊にトランスジーンをマイクロインジェクション、 マイ クロセル融合法、 電気融合法などの手法によって導入したのち、 ES細胞を別の胚 盤胞に注入し移植胚を得、 この胚を仮親の子宮に移植し、 出産させてキメラ動物 を得ることを含む （例えば、 押村光雄ら編、 クロマチン ·染色体実験プロ トコ一 ル （2004年） 羊土社、 東京、 日本）。
上記のように作製されたキメラ動物はさらに、同種の野生型と交配し、さらに、 得られたヘテロ接合体同士の交配を繰り返すことによってホモ接合性の子孫動物 (ヒ トを除く） を得ることができる。
iPS細胞は、 哺乳動物の体細胞に転写因子（例えば 0ct4, Sox2, Klf4, c- Mycな ど）又はそれをコードする DNA (ベクター仲介でもよい）を導入し、培養することに よって得ることができる分化多能性細胞であり、 生殖系列への寄与が可能である ことが知られている (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cel l 126： 663- 676)。
トランスジーンは、 例えば Nrf2遺伝子の 5 ' -及び 3 ' -非翻訳領域に相同な長 さ約 2〜7kbの DNA配列間に本発明の DNA配列 （配列番号 7) を挿入してなる構築 体 （ベクター） である。 或いは、 本発明の DNA配列又は Nrf2遺伝子は人工染色体
(HAC, YAC, BAC など） に組み込んでもよい。 構築体又は人工染色体はさらに、 薬 剤耐性遺伝子、 プロモーター/ェンハンサー、 IRES、 ポリ A配列、 ターミネータ一 などを適宜含むことができる。
なお、 トランスジエニック植物の作製については、 本発明の DNAを含むベクタ ーをァグロバタテリ ゥム法、 パーティクルガン法などで葉片、 茎片などの組織に 導入したのち、 カルスを形成し、 植物体に再生する方法が含まれる。
トランスジーンでは、 プロ一ブ試薬の蛍光蛋白質の位置にホタルなどがもつ生 物発光反応を触媒する酵素であるルシフェラーゼをコ一ドする DNAを配置しても よい。 蛍光蛋白質を発光させるためには、 外部から励起光を照射させる必要があ る。 そのため、 自家蛍光が強い試料や光照射が生理活性に影響を与える試料の場 合には測定が困難になる。 発光法では励起光が不要で、 ルシフェリンなどの発光 基質を細胞や生物に与えることで反応が進むため、 励起光の照射が困難な試料に 対しても測定が行えるようになる。
プローブ試薬を動物の細胞内に導入する別の方法には、 例えばカチオン性リポ ソームを利用する方法 （例えば静脈内投与など） がある。 この方法では、 細胞表 面の負電荷とカチオン性リボソームとが互いに誘引して融合体を形成しィンター ナリゼーションを介して細胞内にプローブ試薬が入る。
なお、 プローブ試薬の DNAを保持し、 プローブ試薬を安定して発現させる細胞 を作製して、 その細胞を動物に移植する方法も含む。
本発明のプローブ試薬や DNAを用いた測定には、 一般的な蛍光または発光測定 装置が使用可能である。 単一細胞レベルでの測定を行うためには、 顕微鏡を用い たイメージング装置が使用できる。 一方、 個体レベルあるいはマイクロプレート での測定を行うためには、 喑箱を用いたマクロ用のイメージング装置が使用でき る。 タイムラプスイメージングの機能を装備した装置を用いることで、 生きた試 料で酸化ストレスの変動をリアルタイムで測定することができる。
4 . 酸化ス トレス制御物質のスク リー^ング
本発明はさらに、酸化ス トレスが負荷された細胞又は生物（ヒ トを除く）内に、 上記プローブ試薬或いは上記ベクターと候補物質とを導入し、 細胞内の蛍光又は 発光強度を低下又は増大させる物質をスクリーニングすることを含む、 酸化スト レス制御物質のスクリーユング方法を提供する。 この方法で使用される細胞や生物 （ヒ トを除く トランスジエニック生物） の種 類は、 上記例示のとおりであり、 トランスジエニック生物の作製についても上で 説明したとおりである。
候補物質は、 低分子 （有機分子又は無機物質）、 タンパク質、 ペプチド、 糖類、 脂質などの任意の物質、 公知の医薬剤などを含む。
細胞を使用するときは、 培地に候補物質を添加する。 一方、 生物を使用すると きは、 候補物質を摂取又は投与 （経口、 静脈内、 直腸内、 皮下、 筋肉内、 経粘膜 投与など） する。
細胞又は生物に酸化ス トレスを与えた時の候補物質の作用効果を、 特定波長の 光で励起することによって発光した蛍光の強度を測定することによって判断する。 候補物質によって蛍光強度が減少又は基線レベルまで低下するとき、候補物質は、 酸化ストレス抑制物質であると推定できる。
本発明の方法によって見出された酸化ス トレス抑制物質は、 酸化ス トレスが原 因となって引き起こされる例えば癌、 動脈硬化、 心筋梗塞、 糖尿病などの疾患、 老化、 虚血又は低酸素状態にさらされた臓器などの予防及び治療のために役立つ だろう。
5 . キッ 卜
本発明はさらに、 上記プローブ試薬、 上記 DNA又は RNA、 及び上記ベクターか らなる群から選択される少なく とも 1つを含む、 酸化ストレス測定用又は酸化ス トレス制御物質スクリーユング用キッ トを提供する。
キットは、 各構成成分を別個の容器に収容又は密封したものに加えて、 バッフ ァー、 基質、 使用説明書などを含むことができる。 実施例
以下に本発明を実施例によって説明するが、 本発明の範囲は、 それらの実施例 に つて制限されないものとする。
実施例 1
プローブ試薬の設計
上に示した特長をもつプローブ試薬の一例として、 蛍光蛋白質として mK02を、 またマーカー蛋白質として Nrf2、調節因子として Keapl という蛋白質を使った酸 化ストレスのプローブ試薬を作製した。 この試薬では酸化ストレスが増加するこ とで、 プローブ試薬の分解が抑制され、 その蛍光強度が増加する。
まず Nrf2 と Keapl の本来の細胞内での動態を説明する。 Nrf2は細胞内におい て酸化ストレスに応答して、 これに対する防御機能を担う抗酸化蛋白質の発現を 誘導する転写因子として働いている。 細胞に酸化ス トレスがない状態では、 Nrf2 は Keapl と結合した形で細胞質に存在している。 このとき Keaplはさらにュビキ チンリガーゼ複合体と結合して、 Nrf2のュビキチン化を促進している。 ュビキチ ン化された Nrf2 は蛋白質分解酵素複合体であるプロテアソームによって分解を 受けるため、 その増加が抑えられている状態にある。 一方、 細胞が酸化ス トレス にさらされると、 活性酸素が Keapl と反応し、 その構造に変化を与える。 この構 造変化により Keaplが Nrf2から解離することで Nrf 2のュビキチン化が抑えられ る。 これにより分解が抑制された Nrf2は、 細胞内での量を増加させ、 転写因子と しての機能を発揮するようになる。
作製したプローブ試薬（mK02-Nrf2— 100-T2A_Keapl)の構造を図 2に示す。 N末端 から、蛍光蛋白質 mK02、 Keapl結合部位とュビキチン結合部位を含む Nrf2のドメ イン（N末端から 1〜100番目までのァミノ酸）、自己切断べプチドである T2A、Keapl がー列に連結した構造となっている。 ここでは蛍光蛋白質として、 サンゴの 1種 であるクサビライシ由来の mK02を使用したが、他の蛍光蛋白質を使用してもよレ、。 蛍光蛋白質としてはォワンクラゲ由来の EBFP、 ECFP、 EGFP、 EYFPなどやこれら力、 ら派生したもの、 またサンゴ由来の DsRed、 HcRed、 mCherryなどやこれらから派 生したものなどがある。 マーカー蛋白質、 調節因子としては、 ヒ ト由来の Nrf2 および Keaplをそれぞれ使用したが、 他の生物種に由来する同機能をもつ蛋白質 の組み合わせを使用してもよい。 ここではマーカー蛋白質として、 Nrf2の一部の ドメインのみを使用したが、 調節因子結合部位とュビキチン結合部位をともに含 んでいればプローブ試薬として機能させることができる。ここで用いた Nrf2のサ ィズは、 プローブ試薬の細胞内での発現量や、 酸化ス トレスに対する応答能など を評価することで最適化されたものである。
実施例 2 cDNAの作製
以下に示す方法でプローブ試薬の遺伝子である cDNAを作製し、これを細胞に導 入するためのプラスミ ドに組み込んだ。
ヒ ト心臓の cDNAライブラリ一から Nrf2遺伝子と Keapl遺伝子をクローニング した。 Nrf2遺伝子を铸型としてセンスプライマー （配列番号 1 ) とアンチセンス プライマー （配列番号 2 ) および PrimeSTAR酵素（タカラバイオ社製）を用いて、 Nrf2の 1〜100番目のァミノ酸を増幅するための PCR反応を行った。 センスプラ イマ一には Xhol切断部位、アンチセンスプライマーには T2Aぺプチドの遺伝子配 列および Hindll l切断部位が含まれている。 また、 Keapl遺伝子を铸型としてセ ンスプライマー （配列番号 3) とアンチセンスプライマー （配列番号 4) を用レ、、 PrimeSTAR酵素を用いて PCR反応を行った。 センスプライマーには Hindlll切断 部位が含まれ、 アンチセンスプライマーには Xbal切断部位が含まれている。
Nrf2を铸型として用いた PCR産物の両端を制限酵素 Xholおよび Hindlllを使 用して切断し、 Keapl を铸型として用いた PCR産物の両端を制限酵素 Hindlllお よび Xbal を使用して切断し、 細胞に発現させるためのプラスミ ドである pcDNA3 (Invitrogen製） の Xho Iおよび Xbal切断部位に挿入した。
センスプライマー （配列番号 5) とアンチセンスプライマー （配列番号 6) を用 いて蛍光タンパク質 mK02を PCRで増幅した （PCR条件：変性 98°C, 10秒；ァニ 一リング 55°C， 30秒；伸長 72°C， 1分）。センスプライマーには EcoRI切断部位、 アンチセンスプライマーには EcoRV切断部位が含まれている。 PCR産物の両端を、 制限酵素 EcoRIおよび EcoRVを使用して切断し、 pcDNA3の EcoRIおよび EcoRV切 断部位に挿入した（図 2)。
配列番号 1 ：
GGCCTCGAGATGATGGACTTGGAGCTGCCG
配列番号 2：
GGT
配列番号 3 ：
CCGTAAGCTTATGCAGCCAGATCCCAGG 配列番号 4 ：
GCTCTAGATTAACAGGTACAGTTCTG
配列番号 5：
GGGGAATTCGCCACCATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAG
配列番号 6：
ATGGATATCCGCCCTGGGAAGGCAACATTGAGTAATGAGCTACTGCATCTTCTAC
実施例 3
細胞のイメージングによるプロ一ブ試薬の評価
ガラスボトムディッシュで培養した HeLa細胞に、 FuGENE HD (口シュ ·アプライ ド .サイエンス製）を用いて、 作製した cDNAをトランスフエクシヨンし、 12時間 後、 新しい培養液に置き換えた。 その 24時間後に、 インキュベーター顕微鏡（ォ リンパス社、 LCV 100)にて蛍光観察を行った。 この顕微鏡には冷却型 CCDカメラが 接続されており、経時的に細胞の蛍光画像を取得することができる。実験前では、 プローブ試薬を発現させた細胞でも、 背景光程度の蛍光しか観察されなかった。 このことは、 酸化ス トレスが負荷されていない定常状態では、 細胞内のプローブ 試薬のほとんどすべてが分解されていることを示している。
作製したプローブ試薬の酸化ス トレスに正しく応答するかどうかを確認するた めに、酸化ストレス誘導剤である d i ethylma leate (DEM)を 100 になるよう添加 し、 mK02の蛍光強度（ex ; BP520- 540HQ、 em ; BP555-600HQ)を測定した。 DEM添カ卩 後、 10倍以上の mK02の蛍光強度の増大が観察された（図 3)。 コントローノレとして 溶媒であるエタノールを 0. 1%になるよう添加したときは、 mK02の蛍光強度は増大 しなかった。 以上のことからこのプローブは酸化ストレス依存的に蛍光強度を增 大することが示された。 さらに、 添加した DEMを洗い流すと、 mK02の蛍光強度は 基底状態まで減少した（図 4)。 このことから、 このプローブ試薬の酸化ス トレス に対する応答は可逆性であることが示された。
このプローブ試薬が、 酸化ス トレスにさらされていない状態では、 細胞内でプ 口テアソームによる分解を受けていることを確認するために、 プロテアソーム阻 害剤である MG132を用いて実験を行った。 MG132を 10 // Mになるよう添加した場 合は、 その後の mK02の蛍光強度の増大が観察された。 一方、 コントロールとして 溶媒であるジメチルスルホキシド（DMS0)を 0. 1%になるよう添加した後では、 mK02 の蛍光強度は増大しなかった（図 5)。 以上のことからこのプローブ試薬は酸化ス トレスにさらされていないときには、 プロテアソームによって分解されているこ とが示された。
実施例 4
ウェスタンブロッティングによるプローブ試薬の評価
このプロ一ブ試薬が、 設計どおりに細胞内で修飾を受けていることを確認する ために、 ウェスタンブロッティングによる実験を行った。
まず、 このプローブ試薬が細胞内で T2Aぺプチドによって mK02- Nrf2連結体と Keaplに分離されていることを確認するために、 以下に示す実験を行った。 35隨 ディッシュに培養した HeLa細胞に、 FuGENE (登録商標） HD (ロシュアプライ ド サイエンス社） を用いて作製した cDNAをトランスフエクシヨンし、 12時間後、 新しい培養液に置き換えた。 その 12時間後に DEMを 100 Mになるよう、 また、 コントローノレとしてエタノールを 0. 1°/。になるよう添力！]し、さらに 8時間培養した。 その後、抗 Nrf2抗体（サンタクルズ社）を用いてウェスタンブロッテイングを行つ た。 DEMを加えたもの、 エタノールを加えたものでともに mK02-Nrf2連結体のバ ンドが検出されたが、 これに Keaplが繋がっているプローブ試薬のバンドはほと んど観察されなかった。 この結果から、 このプローブ試薬は細胞内で T2Aぺプチ ドにより、 mK02_Nrf2連結体と Keapl に分かれていることが示された。 また DEM を加えたものでは、 エタノールを加えたものと比べてバンドが濃く検出されたこ とは、 DEM による酸化ス トレスによりプローブ試薬の量が増大していることを示 している（図 6)。
次に、 このプローブ試薬が、 細胞内でプロテアソームによる分解を受けている ことを、 ウェスタンブロッテイングでも確認した。 同様に培養した HeLa細胞にプ 口テアソーム阻害剤、 MG132 を 10 μ Mになるよう添加した。 またコントロールの 細胞には DMS0を 0. 1%になるよう添加した。 MG132を添加したものでは、 DMS0を 添加したものと比較して濃いバンドが検出され、 細胞内のプローブ試薬の量が増 大していることが示された。 この結果は、 酸化ス トレスにさらされていない状態 では、 このプローブ試薬はプロテアソームによる分解を受けていることを示して いる。 （図 6)。 産業上の利用可能性
本発明は、 生細胞又は生物内で酸化ストレスの動態をリアルタイムで測定でき るプローブ試薬を提供する。 検出感度のよい蛍光又は発光プローブを作製するた めには、 応答時のシグナルを大きくするかもしくは非応答時のシグナルを下げる ことが重要である。 本発明のプローブ試薬は、 蛍光又は発光蛋白質とマーカー蛋 白質との連結体を含むプローブ試薬、 あるいは、 該連結体と、 これのプロテアソ ームによる分解を促進する調節因子とを同一プローブ内に含めたプローブ試薬の いずれかである。 後者の場合、 調節因子は、 細胞内でプローブから切断分離され てマーカー蛋白質に作用するか、 又はプローブから分離されない状態でマーカー 蛋白質に作用することができる。
本発明では、 連結体と調節因子をプローブ内に含みかつ連結体と調節因子が切 断分離されうるようなプローブ試薬が好ましく、 このプローブ試薬を使用するこ とによって、非応答時の蛍光シグナルを背景光レベルにまで抑えることができる。 そのため、 応答時の蛍光シグナルの増加が従来法と比べダイナミックに示される ようになり、 非常に検出感度のよいプローブ試薬とすることができる。 このよう に、 微小な酸化ス ト レスの変化でも精確に検出できる能力は、 酸化ス ト レス発生 の初期段階を検出したい場合などに有効である。 またこの能力は、 組織による光 散乱等により、 微小な光量差の計測が困難な動物個体の深部での酸化ス トレスを 測定する場合にも有効である。
本発明のプローブ試薬では、 酸化ス トレスに対する応答が可逆的であることが 示された。 そのため、 酸化ス トレスを促進するような条件、 逆に抑制するような 条件の両面の測定が可能になる。 これにより、 酸化ス トレスの原因となる物質の スクリーニング、 また逆に酸化ストレスを抑制する物質のスクリ一ユングを 1つ の試薬で行うことができる。 また、 応答が可逆的であることで、 1 個の生体試料 で投与する薬剤の種類や量を変えた測定も可能となる。 これにより、 実験に使わ れる生体試料を減らすことができるとともに、 同じ試料で測定できることで、 結 果の比較が容易かつ精確に行えるようになる。 本発明は、 酸化ス トレスによる疾患や老化のメカニズムの解明、 またこれらを 抑える薬剤の探索など、 医学、 産業の分野で有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキス ト
配列番号 7 ： mK02- Nrf2— 100- T2A- Keaplの DNA配列

Claims

請求の範囲
1 . 細胞又は生物において酸化ス トレスを測定するための蛍光又は発光プロ ーブ試薬であって、 前記試薬が、 蛍光又は発光蛋白質、 マーカー蛋白質、 切断配 列及び調節因子を含む融合蛋白質からなり、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活 性酸素による酸化ス トレスを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及び ュビキチン結合部位を含み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白 質の分解を制御することが可能である蛋白質であり、 前記蛍光又は発光蛋白質と 前記マーカー蛋白質は、 任意の順序で互いに隣りあって連結体を形成しており、 前記切断配列は、 前記連結体と前記調節因子との間に配置されかつ切断可能な配 列を含み、 並びに、 前記試薬が細胞又は生物内において前記切断配列で切断され て、 前記連結体と調節因子とが分離されて存在し、 及び、 調節因子とマーカー蛋 白質との結合又は解離によってマーカー蛋白質の分解を促進又は抑制することを 特徴とする、 前記プローブ試薬。
2 . N末端側から C末端側に向かって、 （1) 蛍光又は発光蛋白質、 マーカー 蛋白質、 切断配列及び調節因子、 （2)マーカー蛋白質、 蛍光又は発光蛋白質、 切断 配列及び調節因子、 （3) 調節因子、 切断配列、 蛍光又は発光蛋白質、 及びマーカ 一蛋白質、 或いは、 （4) 調節因子、 切断配列、 マーカー蛋白質、 及び蛍光又は発 光蛋白質、 の順に配置されている、 請求項 1に記載のプローブ試薬。
3 . 前記マーカー蛋白質が分解されるとき、 蛍光又は発光蛋白質も分解され て蛍光又は発光を発しなくなる、 請求項 1又は 2に記載のプローブ試薬。
4 . 前記調節因子の、 活性酸素応答による構造変化が可逆的である、 請求項 ：!〜 3のいずれか 1項に記載のプローブ試薬。 .
5 . 前記マーカー蛋白質の分解が、 プロテアソームによるものである、 請求 項 1〜 4のいずれか 1項に記載のプローブ試薬。
6 . 前記酸化ス トレスがリアルタイムで測定可能である、 請求項 1〜5のい ずれか 1項に記載のプローブ試薬。
7 . 前記蛍光又は発光蛋白質と前記マーカー蛋白質との間にリンカーを含む、 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のプローブ試薬。
8 . 前記蛍光又は発光蛋白質が、 サンゴ又はォワンクラゲ由来の蛍光蛋白質 である、 請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載のプローブ試薬。
9 . 前記蛍光又は発光蛋白質が、 ルシフェラーゼである、 請求項 1 〜 7のい ずれか 1項に記載のプローブ試薬。
1 0 . 前記マーカー蛋白質及び調節因子がそれぞれ、ヒ ト Nrf2 (Access ion No. AAB32188)及びヒ ト Keapl (Access ion No. AAH21957)、 或いはそれらのホモログま たはそれらのアナログである、 請求項 1 〜 9のいずれか 1項に記載のプローブ試 薬。
1 1 . 前記プローブ試薬が配列番号 7に示される塩基配列を含む DNAによつ てコードされる、 請求項 1 〜 1 0のいずれか 1項に記載のプローブ試薬。
1 2 . 請求項 1 〜 1 1のいずれか 1項に記載のプローブ試薬をコードする DNA又は RNA。
1 3 . 配列番号 7に示される塩基配列を含む、 請求項 1 2に記載の DNA。
1 4 . 請求項 1 2又は 1 3に記載の DNAを含むベクター。
1 5 . 前記 D N Aの発現を可能にする制御配列をさらに含む、 請求項 1 4に 記載のベクター。
1 6 . 請求項 1 〜 1 1のいずれか 1項に記載のプローブ試薬或いは請求項 1 4又は 1 5に記載のベクターを細胞又は生物 （ヒ トを除く） 内に導入し、 細胞内 の蛍光又は発光強度に基いて酸化ス ト レスを測定することを含む、 細胞での酸化 ストレス測定方法。
1 7 . 前記測定が、 リアルタイムで行われる、 請求項 1 6に記載の方法。
1 8 . 細胞又は生物 （ヒ トを除く） において酸化ス ト レスを測定する方法で あって、 前記方法が、
前記細胞又は生物において酸化ストレスの程度に応じて分解が制御されるマー カー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質との連結体、 あるいは該連結体をコードする核 酸を含むベクター、 を前記細胞又は生物内に導入して、 前記連結体を細胞又は生 物内に存在させる工程と、
前記蛍光又は発光蛋白質に由来する蛍光又は発光量を測定することにより、 前 記連結体の分解が制御される程度に基いて前記細胞又は生物における酸化ス トレ スの存在又はそのレベルを決定する工程と、
を含み、 ここで、 前記マーカー蛋白質は調節因子結合部位及びュビキチン結合部 位を含み、 及び前記連結体の分解が、 活性酸素に応答して調節因子によって制御 されることを特徴とする、 前記方法。
1 9 . 前記調節因子と前記マーカー蛋白質とが同種の生物由来のものである、 請求項 1 8に記載の方法。
2 0 . 前記調節因子が、 外因性又は内因性のいずれかである、 請求項 1 8又 は 1 9に記載の方法。
2 1 . 前記外因性の調節因子が、 該調節因子をコードする DNAを含むベクタ 一の形態で前記細胞又は生物内に導入される、 請求項 1 8〜2 0のいずれか 1項 に記載の方法。
2 2 . 細胞又は生物において酸化ス ト レスを測定するための蛍光又は発光プ ローブ試薬であって、 前記試薬が、 マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含 む連結体を含み、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活性酸素による酸化ス ト レス を検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びュビキチン結合部位を含み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御することが可 能である蛋白質であり、 前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解離に よってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、 前記プロ ーブ試薬。
2 3 . 請求項 2 2に記載のプローブ試薬をコードする DNA又は RNA。
2 4 . 請求項 2 3に記載の DNAを含むベクター。
2 5 . 細胞又は生物において酸化ス ト レスを測定するための蛍光又は発光プ ローブ試薬であって、 前記試薬が、 マーカー蛋白質と蛍光又は発光蛋白質とを含 む連結体と、 調節因子とを含み、 前記連結体と前記調節因子とがリンカ一を介し て結合されており、 ここで、 前記マーカー蛋白質は、 活性酸素による酸化ス トレ スを検知することを可能にしかつ調節因子結合部位及びュビキチン結合部位を含 み、 前記調節因子は、 活性酸素に応答してマーカー蛋白質の分解を制御すること が可能である蛋白質であり、 前記調節因子と前記マーカー蛋白質との結合又は解 離によってマーカー蛋白質の分解が促進又は抑制されることを特徴とする、 前記 プローブ試薬。
2 6 . 酸化ス トレスが負荷された細胞又は生物 （ヒ トを除く） 内に、 請求項 ：!〜 1 1、 2 2及び 2 5のいずれか 1項に記載のプローブ試薬或いは請求項 1 4、 1 5又は 2 4に記載のベクター及び候補物質を導入し、 細胞又は生物内の蛍光又 は発光強度を低下又は増大させる物質をスクリーニングすることを含む、 酸化ス トレス制御物質のスクリ一二ング方法。
2 7 . 請求項 1〜1 1、2 2及び 2 5のいずれか 1項に記載のプローブ試薬、 請求項 1 2、 1 3又は 2 3に記載の DNA又は RNA、 及び請求項 1 4、 1 5又は 2 4に記載のベクターからなる群から選択される少なく とも 1つを含む、 酸化スト レス測定用又は酸化ス トレス制御物質スク リ一ユング用キッ ト。
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