CN1639332A - 靶基因用多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种由靶基因的互补链核酸序列与元件序列构成的单链多核苷酸序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种对靶基因有特异性RNA功能抑制活性的单链多核苷酸序列及一种使用该多核苷酸序列的靶基因功能抑制方法。
背景技术
RNA干扰法(RNA interference)为基于下述现象的方法,所述现象为将与作为靶的基因(以下称为靶基因)具有相同序列的2条链RNA导入细胞内,由此破坏靶基因的转录产物(RNA),所述2条链RNA由2条互补的RNA构成,1条RNA具有相对于靶基因的有义序列,另一条RNA具有相对于靶基因的反义序列(Fire,A.,et al.,Nature,391,806-811(1998))。在本说明书中,将退火2条不同的互补分子的情况称为2条链,将不相区别地使用退火1条分子内互补部分或退火2条不同的互补分子的情况称为双链。已知其基因抑制效果及特异性高于反义法,有效浓度更低。对于无脊椎动物而言,已知对双链RNA的构造、特别是其长度没有限定,双链部分越长,有效度越高,使用超过30个碱基对的双链RNA时,也能够产生基因特异性的RNA干扰现象。另一方面,对于脊椎动物而言,已知导入具有超过30个碱基对的双链部分的长链双链RNA能够活化干涉体系,产生对靶基因以外的大范围基因的非特异性基因功能抑制(RNA的非特异性分解、mRNA的非特异性翻译抑制)及细胞死亡等结果,对于利用RNA干扰现象的基因功能抑制而言,仅能获得有限的效果。
已知将长链双链RNA在细胞内切成作为由约21个核苷酸长度的小型RNA构成的2条链RNA的小型干涉性RNA(small interferenceRNA(以下简称为siRNA),能够作为具有靶基因抑制活性的分子发挥作用,Tuschl等(Tuschl,T.)证明了通过将与靶基因具有相同性的siRNA导入哺乳类细胞内,能够在不使干涉体系活化的条件下产生RNA干扰效果(Elbashir,S.M.,et al.,Nature,411,494~498(2001))。上述siRNA与长链双链RNA不同,除了不活化干涉体系外,还具有能够更特异性地仅抑制在约20个核苷酸长度的部分具有互补性的特定基因的优点。该技术发现了哺乳类中有效的基因功能抑制体系,扩大了药物开发及基因药物的可能性。
本发明人等深入研究了经由上述siRNA产生的靶RNA分解的RNA基因功能抑制的药物靶基因筛选、利用基因剔除小鼠的药物靶基因的体内评价、对用于基因疾病的药物组合物(基因治疗剂)的更有效适用等内容。
为了实现上述目的,不仅合成RNA是重要的,具有由DNA质粒载体向siRNA转录的构造也是重要的,但是,通常认为表达2种不同的短链RNA和使其在细胞内退火、在靶细胞内发挥RNA干扰效果是困难的。
本发明人等深入研究的结果为发现代替小型2条链RNA,使用由在与靶基因互补的短链多核苷酸和与上述多核苷酸互补的短链多核苷酸之间具有任意元件的多核苷酸序列构成的单链多核苷酸,将该单链多核苷酸导入细胞内,研究靶基因活性,发现能够抑制该活性,从而完成了本发明。
本发明的目的为提供一种能够通过特异性分解由靶基因转录的RNA或选择性地抑制其翻译来抑制并控制作为目的的RNA或蛋白质功能表达的单链多核苷酸,以及一种利用该单链多核苷酸抑制并控制靶基因功能的方法。根据本发明,能够提供:一种简单的基因功能分析方法,含有药物靶基因的功能基因的筛选方法,使用基因剔除小鼠制作等的基因重组动物或基因重组病毒的药物靶基因的体内评价方法,用于包括基因疾病、感染病在内的疾病的药物组合物(基因治疗剂),使用基因剔除猪等的移植用器官产生动物。
附图说明
图1表示本发明靶基因用多核苷酸的RNA功能抑制效果。
图2表示Lamin A/C基因功能抑制载体的RNA功能抑制效果。
图3表示萤火虫荧光素酶基因功能抑制载体的RNA功能抑制效果。
发明内容
即,根据本发明,可以提供一种靶基因用多核苷酸序列,所述靶基因用多核苷酸序列是由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列,对与(I)或(III)元件中的任一种互补的RNA有RNA功能抑制活性,其中,元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的连续15~30个或18~25个碱基长度的多核苷酸序列,元件(II)为0碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列(其中,0碱基表示键)或非核苷酸序列,元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列,另外,上述由连续15~30或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包含DNA或RNA。
另外,根据本发明,可以提供一种靶基因用多核苷酸序列,其中,上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列及/或互补多核苷酸至少在一个末端或在互补序列内部缺失、取代、补加由1~数个U、T、G、C或A构成的序列。靶基因可以为编码含有mRNA的蛋白质的RNA、tRNA、rRNA、Xist、不编码包含腺病毒VA RNA的蛋白质的功能性RNA、病毒基因组RNA。
而且,根据本发明,可以提供一种靶基因用多核苷酸序列,上述多核苷酸序列是利用化学合成法或基因重组技术得到的单链多核苷酸序列,由序列号1或2的单链RNA构成。
另外,根据本发明,可以提供一种靶基因用序列,其中,由上述单链RNA构成的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)为核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种、或由它们组合而成的序列;一种靶基因用序列,其中,上述元件(II)的核苷酸序列由1个碱基或1个碱基以上的不足1万个碱基、1个碱基长度或1个碱基长度以上不足数百个碱基长度(例如,700个碱基、500个碱基或300个碱基)的核苷酸序列、1个碱基长度~数十个碱基长度(例如70个碱基、50个碱基、30个碱基)的核苷酸序列构成;一种由1个碱基长度~20个碱基长度的核苷酸序列或序列号3或4所示的元件(II)构成的靶基因用序列。另外,根据本发明,可以提供上述靶基因用序列,其中,所述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、细胞质转移序列、具有诱导(decoi)活性的序列、干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性、反义活性、核酶活性及转移RNA中任一种的序列或上述序列的组合构成。
根据本发明,能够提供上述靶基因用序列以及将该靶基因用序列***重组载体得到的重组载体、该重组载体的制备方法。
另外,根据本发明,提供一种使用上述靶基因用序列筛选药物靶基因或具有有用功能的基因的方法。
而且,根据本发明,能够提供一种以上述靶基因用序列或重组载体为有效成分的药物组合物或由药物组合物构成的基因治疗剂。
另外,根据本发明,提供一种靶基因用核苷酸的合成方法,所述方法包含下述步骤:(i)制作由元件(I)及(II)构成的单链核苷酸,使元件(II)3’末端的数个核苷酸与元件(I)或(II)的数个核苷酸互补的步骤;
(ii)使用由该元件(I)及(II)构成的单链核苷酸,利用核苷酸合成酶活性,合成元件(III)的步骤,或使用由该元件(I)及(II)构成的单链核苷酸,导入细胞内,利用存在于细胞内的上述核苷酸合成酶活性,合成元件(III)的步骤。
另外,根据本发明,可以提供一种利用上述方法得到的随机化靶基因用核苷酸,其中,元件(I)及(III)为随机寡核苷酸。
根据本发明,能够提供一种基因功能的抑制方法,在细胞或组织中,将由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入该细胞或组织内,利用其具有的对具有与上述(I)或(III)元件中的任一个互补的序列的RNA的RNA功能抑制活性,抑制靶基因的功能;其中,元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的连续15~30个或18~25个碱基长度的多核苷酸序列,元件(II)为1碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列或非核苷酸序列,元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列,另外,上述由连续15~30个或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包含DNA或RNA。
另外,根据本发明,能够提供一种靶基因功能的抑制方法,其中,上述(I)或(III)元件中的任一种序列为至少在任一个末端或在内部缺失、取代、补加1~数个U、T、G、C或A碱基的靶基因用多核苷酸序列。
而且,根据本发明,能够提供一种靶基因功能的抑制方法,上述多核苷酸序列为利用化学合成法或基因重组技术得到的单链多核苷酸序列,是由序列号1或2的单链RNA构成的靶基因用多核苷酸序列。
另外,根据本发明,提供上述靶基因功能的抑制方法,上述方法中使用的由单链RNA构成的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)使用由核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种、或它们的组合构成的靶基因用序列,上述元件(II)的核苷酸序列由1个碱基或1个碱基以上不足1万个碱基、1个碱基长度或1个碱基长度以上不足数百个碱基长度(例如,700个碱基、500个碱基或300个碱基)的核苷酸序列、1个碱基长度~数十个碱基长度(例如70个碱基、50个碱基、30个碱基)的核苷酸序列构成的靶基因用序列,由1个碱基长度~20个碱基长度的核苷酸序列或用序列号3或4表示的元件(II)构成的靶基因用序列。
另外,根据本发明,能够提供一种靶基因功能的抑制方法,其中,所述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列使用由PNA、细胞质转移序列、具有诱导活性的序列、干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性、反义活性、核酶活性、转移RNA的序列中的任一种或它们的组合构成的上述靶基因用序列。靶基因可以为编码含有mRNA的蛋白质的RNA、tRNA、rRNA、Xist、不编码含有腺病毒VA RNA的蛋白质的功能性RNA、病毒基因组RNA。
而且,根据本发明,能够提供一种靶基因功能的抑制方法,其中,由上述元件(III)的由连续15~30个或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包括DNA或RNA;一种靶基因功能的抑制方法,其中,所述元件(I)或(III)的序列至少在任一个末端具有或在内部缺失、取代或补加1个至数个碱基的U、T、G、C或A;一种靶基因功能的抑制方法,其中,上述多核苷酸序列是利用化学合成法或基因重组技术得到的。
另外,根据本发明,提供一种使用序列号1或2的单链RNA的靶基因功能抑制方法。
而且,根据本发明,提供一种上述靶基因功能的抑制方法,在所述方法中,靶基因用序列的元件(II)由核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种或由它们的组合构成,该元件(II)的核苷酸序列为由1个碱基或1个碱基以上不足1万个碱基、1个碱基长度至数百个碱基长度的核苷酸序列、1个碱基长度至数十个碱基长度的核苷酸序列构成的靶基因用序列、1个碱基长度至20个碱基长度的核苷酸序列或用序列号3或4表示的元件(II)构成的靶基因用序列。
另外,根据本发明,提供一种靶基因功能的抑制方法,其中,上述元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列使用由PNA、细胞质转移序列、具有诱导活性的序列、干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性的序列、具有反义活性的序列、具有核酶活性的序列及具有转移RNA活性中任一种的序列或由它们的组合构成的上述靶基因用序列。
而且,根据本发明,能够提供一种通过特异性地分解由靶基因转录的RNA或作为靶基因的RNA、或选择性地抑制其翻译来抑制作为靶的RNA或蛋白质功能表达的方法,一种特异性地分解靶基因的方法来抑制靶基因表达的方法,一种利用上述任一种方法产生培养基因剔除细胞、组织、非人类动物或植物。另外,根据本发明,能够提供一种靶基因功能的试验方法,在细胞、组织、非人类动物或植物中,将由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入该细胞、该组织、该非人类动物或该植物内,利用其对具有与上述(I)或(III)元件中的任一种互补的序列的RNA具有的RNA功能抑制活性,试验靶基因的功能;一种检测候选化合物的方法,在将待检化合物与细胞或组织一同培养后,在该细胞或组织中导入由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列,与对照组比较对与上述(I)或(III)元件中的任一种互补的RNA的RNA功能抑制活性,检测出促进靶基因的功能抑制的候选化合物(其中,元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的连续15~30个或18~25个碱基长度的多核苷酸序列,元件(II)为1碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列或非核苷酸序列,元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列,另外,上述由连续15~30个或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
另外,根据本发明,能够提供一种靶基因的功能相互作用物的筛选方法,在细胞、组织、非人类动物或植物中,将由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入该细胞、该组织、该非人类动物或该植物中,利用其对与上述(I)或(III)元件中的任一种互补的RNA具有的RNA功能抑制活性,进行筛选(其中,元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的连续15~30个或18~25个碱基长度的多核苷酸序列,元件(II)为1碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列或非核苷酸序列,元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列,另外,上述由连续15~30个或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
根据本发明,能够提供一种筛选方法,所述筛选方法为在细胞、组织、非人类动物或植物中,将由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入该细胞、该组织、该非人类动物或该植物中,利用其对与上述(I)或(III)元件中的任一种互补的RNA具有的RNA功能抑制活性,确定刺激或抑制与靶基因相关功能的化合物;所述筛选方法包括选自下述方法的方法:
(a)利用直接或间接结合在该候选化合物上的标记,测定候选化合物与由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物(或携带由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的细胞或其膜)或其融合蛋白质的结合的方法;
(b)在标记竞争物质的存在下,测定候选化合物与导入了该单链多核苷酸序列的细胞(或携带该单链多核苷酸序列的细胞或其膜)或其融合物的结合的方法;
(c)使用适用于携带所述多肽或靶基因表达产物的细胞或细胞膜的检测体系,确定是否形成由候选化合物利用该单链多核苷酸序列活化或抑制由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或该靶基因表达产物而产生的信号的方法;
(d)将候选化合物、与含有由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的溶液同时混合,调制混合物,测定该混合物中该多肽或该靶基因表达产物的活性,将该混合物的活性与标准进行比较的方法;以及
(e)检测候选化合物对编码由细胞内的该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的mRNA及产生由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的效果的方法(其中,元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的连续15~30个或18~25个碱基长度的多核苷酸序列,元件(II)为1碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列或非核苷酸序列,元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列,另外,上述由连续15~30个或18~25个多核苷酸构成的核苷酸序列包含DNA或RNA)。
以下本说明书中用氨基酸、肽、碱基序列、核酸等的省略符号的表示沿用IUPAC-IUB规定(IUPAC-IUB Communication onBiological Nomenclature,Eur.J.Biochem.,138:9(1984))、“用于制作含有碱基序列或氨基酸序列的说明书等的指南”(日本专利局编)及该领域内的惯用符号。另外,DNA合成、含有外源性基因的载体(表达载体)制备、利用该载体进行形质转换而成的宿主细胞及宿主细胞分泌的表达蛋白的制备方法等可以利用通常的基因工程方法容易地制备、取得(参见Molecular Cloning 2d Ed,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989);续生化学实验讲座“基因研究法I、II、III”,日本生化学会编(1986)等)。
作为本发明基因的一个具体例,可以举出由下述实施例中示出的命名为“uGL3.12RNA”及“uGL3.7RNA”的靶基因用多核苷酸序列演绎而来的基因。其碱基序列如序列号:1及2所示。
该多核苷酸序列为序列号1:所示的52个碱基长度的多核苷酸序列的新型靶基因用多核苷酸序列,元件(I)由19个寡核苷酸序列构成,元件(II)由12个寡核苷酸序列构成,元件(III)由21个寡核苷酸序列构成。或序列号:2表示的45个碱基长度的多核苷酸序列的新型靶基因用多核苷酸序列,元件(I)由19个寡核苷酸序列构成,元件(II)由7个寡核苷酸序列构成,元件(III)由21个寡核苷酸序列构成。
需要说明的是本发明中,基因的含义不仅为2条链DNA,还包括构成2条链DNA的称为有义链及反义链的各单链DNA、或2条链及单链RNA,另外,对其长度也无任何限定。因此,若无特别说明,本发明的基因包括含有人基因组DNA的2条链DNA及含有cDNA的单链DNA(有义链)以及具有与该有义链互补的序列的单链DNA(反义链)、及含有病毒基因组的RNA及其片段中的任一种。
在本发明中,基因包括前导序列、编码区域、外显子、内含子。多核苷酸可以举出RNA、DNA、PNA(肽核酸)等。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA;RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、UsnRNA(富含尿苷的小核RNA)、病毒基因组、病毒mRNA、5sRNA、转移RNA、核酶及上述PNA、或能够与天然核苷酸结合的多胺等,具有特定氨基酸序列的多肽包括其片段、同族体、衍生体、变异体。
变异体是指天然存在的等位变异体、非天然存在的变异体、经缺欠、取代、补加及***得到的变异体等实质上没有改变被编码的多肽功能的多核苷酸序列。
需要说明的是上述氨基酸序列的改变(变异等)也包括天然地利用例如突变或翻译后的修饰等而产生的变异,也可以利用来自天然的基因(例如本发明的具体例中的基因)进行人为变异。
上述多肽至少含有90%、优选为95%、更优选为98%、进一步优选为99%相同的等位变异体、同系物、天然变异体。
本发明的靶基因用多核苷酸序列被定义为由具有由3种元件构成的核苷酸或非核苷酸序列的单链构成的序列,该元件是由连续地按照元件(I)+元件(II)+元件(III)的顺序连接的单链构成的多核苷酸序列。
由上述3种元件构成的单链构成的多核苷酸序列可以在独立制作各元件后进行接合,或者也可以作为一个构成要件进行制作。上述靶基因用多核苷酸序列可以经化学合成,也可以采用基因重组技术进行制作。上述技术为该领域通常使用的方法,只要是本领域普通技术人员,就能够充分地获得作为目的的靶基因用多核苷酸序列,得到经分离或纯化的单链多核苷酸序列。上述DNA合成可以为利用亚磷酰胺法或三酯法的化学合成,也可以使用市售的自动寡核苷酸合成装置进行。另外,可以通过扩增本发明的靶基因用多核苷酸序列的长度、或为了进入表达载体而将必要的2条链片段合成互补链、在适当条件下使该链一同进行退火、或使用DNA聚合酶使其与适当的引物序列一同补加互补链,从而得到化学合成的单链产物。
合成后的RNA或DNA可以用PAGE或阴离子交换HPLC等进行纯化。
另外,RNA合成由于在2’位具有羟基,因此与DNA合成相比更难以合成,合成中,2’位需要保护基,因生成后的脱盐、脱保护过程而大幅度降低收量,或影响链的稳定性,但是,通过使用邻位酯(2’-ACE)来保护2’位,能够进行稳定的RNA合成,该方法可以在用Dharmacon公司的2’-ACE合成RNA寡核苷酸保护2’位后,通过在使用时使用挥发性缓冲剂,能够容易地进行脱盐、脱保护(http://dharmacon.com/sirna.html)。另外,RNA的合成也可以根据亚磷酰胺法、与市售的Applied Biosystems公司制备ABI 3900高通量DNA合成器等同时,使用RNA合成用试剂来进行合成。
而且,作为目的的多核苷酸合成优选例如采用被保护核糖核苷酸·亚磷酰胺法,使用上述2’-ACE法及优选的脱氧核糖核酸/RNA合成机,进行化学合成。上述多核苷酸的合成使用市售的脱氧核糖核酸/RNA合成机、并按照该机器附带的使用说明书的顺序进行自身合成,或委托受理此种多核苷酸合成的公司或部门进行合成,在该领域也是比较容易的。上述可委托方例如有Dharmacom Research公司(Lafayette,CO,USA)、Genset Oligos(Genset Oligos公司:http://www.gensetoligos.com/)、Ambion公司、Xeragon(http://www.xeragon.com)、Peribio Science公司(http://perbio.com/)、ChemGenes公司(http://www.chemgenes.com)等,可以委托上述公司合成脱氧核糖核酸/RNA。
上述本发明的靶基因用多核苷酸序列的获取方法可以举出“Methods in Enzymology,154,350,367~382(1987);同100,468(1983);Nucleic Acids Res.,12,9441(1984);续生化学实验讲座1“基因研究法II”,日本生化学会编,p105(1986)”等基因工程方法,磷酸三酯法或亚磷酰胺法等化学合成方法(J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967);同91,3350(1969);Science,150,178(1968);Tetrahedron Lett.,22,1859(1981);同24,245(1983))及上述方法的组合方法等。
另外,本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(I)或(III)只要部分或全部与作为靶的基因的RNA互补即可,作为靶的RNA可以以mRNA、tRNA、rRNA、病毒基因组、病毒mRNA、XistRNA等包括哺乳动物的细胞内存在的全部RNA为对象。由此,包含与靶基因RNA互补部分的元件(III)可以为连续15~30个碱基长度的多核苷酸序列,优选为18~25个碱基长度的多核苷酸序列,更优选为19~21个碱基长度的多核苷酸序列。另外,以元件(III)部分或全部互补为靶进行选择的基因区域优选从编码该基因的起始密码子开始50至100个碱基的下游外显子部位,优选避开5’及3’UTRs。更优选靶基因的互补部位序列的特异性高的情况。另外,作为被选择的区域,可以举出以在该区域中含有50%左右G或C的称为AA(N19)TT的序列区域作为与被选择的元件(III)的部分或全部互补的区域。在未发现上述序列的情况下,也可以用末端部位为AA(N21)或CA(N21)的序列代替。
另外,上述元件(III)可以为RNA,也可以为DNA。
上述本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(III)中与靶基因互补区域的确定可以利用NCBI的blast查询来实施、确定。另外,也可以使用合成为任意序列的元件(III),选择抑制靶基因功能的多核苷酸序列,用于本发明的用途。
另外,本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(I)为与元件(III)序列互补的序列,或与元件(III)序列的50%超互补序列,也可以在选择为靶的基因区域内与元件(III)的序列同样地互补。而且,本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(III)比元件(I)的序列长度长1个或数个碱基长度左右,例如,可以补加2个碱基的尿嘧啶(U)。另外,上述靶基因用多核苷酸序列的元件(I)或元件(III)在该序列中的任一个均至少在一个末端具有或在内部缺失、取代或补加1个至数个碱基的U、T、G、C或A。
本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)可以为核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种,或它们的组合。对于该核苷酸序列而言,例如可以举出核苷酸序列由1个碱基或1个碱基以上、不足1万个碱基的核苷酸序列组成,优选1个碱基长度至数百个碱基长度的核苷酸序列、1个碱基长度至数十个碱基长度的核苷酸序列、1个碱基长度至20个碱基长度的核苷酸序列、利用剪接等细胞内具有的机制在细胞质内产生上述长度的核苷酸的元件(II)或由本发明的下述实施例所示的用序列号3或4表示的序列构成的核苷酸序列。另外,该核苷酸序列可以包含元件(I)或(III)的互补序列。另外,作为本发明的靶基因用多核苷酸序列的元件(II)的非核苷酸序列,可以举出具有聚酰胺骨架的类似核酸的化学合成同系物PNA(肽核酸)。而且,作为构成元件(II)的核苷酸序列,可以为聚A、tRNA、UsnRNA、来源于逆转录酶病毒的CTE序列等细胞质转移序列、NF-kappaβ结合序列、E2F结合序列、SSRE、NF-AT等具有诱导活性的序列、腺病毒的VA1或VA2 RNA等干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性、反义活性、核酶活性的序列、用于确定转移RNA或表达部位的标记序列、用于检测的大肠菌中的选择标记序列等中的任一种,或它们的组合序列。诱导活性等必须部分双链的功能序列可以利用含有互补核苷酸的序列制作。而且,在元件(II)的内部具有含有内含子的供体序列、受体序列的剪接所必需的序列,由此,可以在具有剪接机制的细胞内将元件(II)的一部分切处进行再次连接。利用上述元件(II)的构成,可以获得进一步增加所希望的RNA功能抑制效果或作为靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的稳定性。
另外,本发明的靶基因用多核苷酸序列也可以使用基因重组技术进行制备。例如,在化学合成上述由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的单链多核苷酸序列后,基于能够补加在该序列的两个末端或其外侧的任意序列(包括启动子序列、终止子序列)制作PCR用引物,利用PCR使该序列成为2条链DNA后,可以进行长度扩增。如上所述,各元件可以全部采用化学合成,也可以将各元件在化学合成后进行连接。另外,对于上述启动子而言,可以与转录起始点相对应地在体内转录或大肠菌中适当地配置T7启动子、在真核细胞中适当地配置CMV启动子、在真核细胞PolIII体系内适当地配置U6启动子、H1启动子等;终止子除了转录终止序列外,也可以利用自身切断型核酶等在相同部位切断转录后产物。或利用能够补加在其末端的限制酶识别位点,将扩增长度后的2条链DNA限制酶性地连接在载体上,进行长度扩增,可以制备并获得作为目的的靶基因用多核苷酸序列。在该领域内,就目前的技术水平而言,将其组合在各种质粒载体中并不困难。
而且,本发明的靶基因用多核苷酸序列可以采用基因重组技术,利用元件(I)及(III)具有互补性的特点进行制作。例如,采用化学合成方法或基因重组技术制作元件(I)及元件(III)的互补序列,使元件(II)3’末端的数个核苷酸(元件(I)的部分序列)与元件(III)的数个核苷酸互补。利用形成了由数个碱基对构成的互补双链的元件(I)的核苷酸3’末端及元件(III)的核苷酸3’末端,使用包含含有DNA聚合酶或RNA聚合酶等核苷酸合成酶的酶,可以合成由元件(I)、(II)、(III)构成的2条链多核苷酸,由此可以合成本发明的靶基因用多核苷酸序列。
元件(III)可以采用化学合成法或基因重组技术单独合成,利用与元件(I)的互补性进行筛选,将由元件(I)及(II)构成的分子的3’末端与元件(III)的5’末端化学性连接或使用连接酶等酶进行连接。
例如采用化学合成法或基因重组技术制作元件(I)及(II),使元件(II)3’末端的数个核苷酸与元件(I)或(II)的数个核苷酸互补。将由元件(I)及(II)构成的分子导入细胞内,利用细胞内存在的上述多核苷酸合成酶活性,可以合成元件(III)。核苷酸合成酶也可以利用基因重组或病毒感染等导入细胞内。即,仅由元件(I)及(II)构成的分子也包括在本靶基因用多核苷酸内。
表达由上述元件(I)及(II)构成的靶基因用多核苷酸或由元件(I)、(II)及(III)构成的靶基因用多核苷酸的载体可以基于上述载体化方法进行合成。
而且,可以将能够抑制各分子不同的靶基因功能的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表达载体导入培养细胞等内,由此可以选择引起所希望的表达型变化的细胞等,可以分离导入该细胞内的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表达载体,利用NCBI的blast查询等检索与靶基因用多核苷酸序列或靶基因用多核苷酸序列表达载体的元件(I)或(III)具有互补性的基因序列,由此能够确定引起所希望表达型变化的靶基因。为了实现上述目的,采用上述互补合成法、互补连接合成法或细胞内互补链合成法,由此可以制作所谓的随机化靶基因用多核苷酸。即,采用在相当于元件(I)的各核苷酸部位随机导入A、T、G、C或U中的任一种核苷酸的合成方式合成元件(I),利用上述方法制作互补的元件(III)。由此可以制作随机化基因靶载体,由此可以确定引起所希望的表达型变化的靶基因。
由此,能够容易地制作将本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列***载体及该重组载体得到的重组载体。
上述重组载体及***了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的重组载体制备可以基于由本发明提供的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的序列信息,根据如上所述的作为常规方法的基因重组技术(例如,参见Science,224,1431(1984);Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,80,5990(1983)等)进行调制。另外,只要是本领域普通技术人员,就能够容易地获取、纯化由如上所述地制备的重组体表达载体产生的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列。
另外,将导入了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的载体分成2条的情况下,必须经过由各启动子转录而成的寡RNA在作为非常广大的空间的细胞内(寡RNA的1013倍空间)随机结合、退火、形成双链的过程,由于其效率非常低,因此推测分成2条的类型的功能弱;但是,由于含有本发明靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列等与靶基因序列互补的序列的元件(III)和作为与元件(III)的序列互补的序列的元件(I)的序列为单链,因此作为导入细胞内的序列具有互补性的分子必须位于一侧,形成非常有效地破坏RNA的双链,就这一点而言,制作本发明载体的意义非常深远。
而且,通过形成单链,与2条链相比,其结果为保护露出末端一侧(本发明中为元件(I)的3’末端侧),由于露出末端通常容易受到核苷酸的攻击,因此从这一点考虑,能够提高导入了本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的载体的稳定性。但是,对于脊椎动物而言,双链部分超过30个碱基对的单链无法特异性地诱导基因功能抑制,在上述优点之前,有用性低。
另外,根据本发明,能够提供一种使用本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列抑制细胞、组织、非人类动物或植物中的靶基因的功能的方法。作为该方法的一个具体例,如下述实施例所示,使用本发明中用序列号1及2表示的靶基因用多核苷酸序列,对HeLa细胞给予靶基因,对荧光素酶基因给予靶基因用多核苷酸序列,结果利用该基因RNA的RNA功能抑制效果,能够表现出作为靶基因的荧光素酶基因的荧光素酶活性抑制效果。
更具体而言,基于作为靶的基因的基因序列信息,利用NCBI的blast查询等,选择位于与靶基因的编码区域的起始启动子相距50~100个碱基的下游、含有50%左右G或C的AA(N19)TT序列区域作为与元件(I)部分或全部互补的区域。该区域更优选为具有作为靶的基因特异性序列的区域。未发现上述序列的情况下,将末端部位设定为AA(N21)或CA,与元件(III)区域互补,例如,碱基定位为在19个寡核苷酸序列的3’末端补加2个碱基的尿嘧啶得到的21个寡核苷酸序列,然后,将与元件(III)的19个寡核苷酸序列区域互补的序列碱基定位为元件(I)的构成序列。然后,作为元件(II),确定为由任意7个或12个碱基的RNA序列构成的寡核苷酸序列,组合上述序列,使用市售的自动合成机,化学合成由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的单链多核苷酸序列,经脱盐、纯化后,为了用于RNA转染,将RNA溶解于蒸馏水中,调制缓冲液(100mM乙酸钾,调制成pH7.4的30mM HEPES-KOH,2mM乙酸镁)的混合液,用PBS或该缓冲液稀释成各稀释倍率的溶液。
然后,制作具有靶基因的调制成的基因表达载体,添加上述调制成的各RNA,例如制作在50μl的OPTI-MEM无血清培养基内加入了靶基因表达载体与合成后的本发明靶基因用多核苷酸的反应溶液,此时,如果在上述培养基中使用例如Lipofectamine2000等聚阳离子脂质体系的转染试剂,则能够提高导入效率。添加上述试剂后,例如使分株后的动物细胞HeLa3细胞处于融合状态后,使用DMEM/10培养基(使用添加了DMEM/10∶10%胎牛血清的D-MEM培养基,在5%CO2、37℃下进行预培养后,用PBS洗涤细胞,然后,将HeLa 3细胞按每孔0.5ml添加于24孔板的各孔内,在5%CO2、37℃下培养24小时后,将上述制成的转染用复合体添加于各孔之中,然后,再在5%CO2、37℃下培养24小时后,例如作为靶的基因为荧光素酶基因的情况下,使用双荧光素酶报道基因检测***(Dual-LuciferaseReporter Assay System:#E1910 Promega公司制备),用发光计测定荧光素酶活性测定的化学发光。将添加或不添加本发明的靶基因用寡核苷酸序列时或添加非特异性寡核苷酸序列时该发光测定值的变化与对照组进行比较,利用这一结果,例如,与对照组相比,其抑制程度以50%、70%、80%、90%、95%、99%、100%等值为基准,研究对靶基因的RNA、对本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的靶基因的特异性RNA功能抑制及基因功能抑制效果。由此,能够提供一种靶基因功能的抑制方法,利用上述方法,在本发明的细胞或组织中,将具有连续的(I)+(II)+(III)元件的分离或纯化后的单链多核苷酸序列导入该细胞或该组织内,利用其对与上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补基因的RNA具有的RNA功能抑制活性,抑制靶基因的功能。另外,在本方法的实施中,抑制靶基因的RNA功能的结果为抑制基因表达或抑制由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质表达,由此发现细胞、组织中的该基因功能发生变化,因此,根据本发明,在细胞或组织内,将具有连续的(I)+(II)+(III)元件的分离或纯化后的单链多核苷酸序列导入该细胞或该组织内,利用其对与上述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补基因的RNA具有的RNA功能抑制活性,抑制靶基因的功能,利用上述方法,能够提供一种该靶基因功能表达的抑制方法,以及一种抑制由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质表达的方法。上述方法中,如上所述,本发明的靶基因用寡核苷酸序列通过改变、修饰各种元件(II)的核苷酸序列或补加非核苷酸,也能够进一步提高包括RNA功能抑制活性或细胞质移行活性在内的功能。
另外,上述各试验中使用的细胞、组织、细胞溶解液、器官等材料,使用本发明的靶基因用多核苷酸序列,利用对靶基因的RNA的RNA功能抑制活性,表现出对该基因的RNA功能抑制效果或基因的功能变化,所使用的靶基因的获取例如可以基于已知基因的具体例的序列信息,采用通常的基因工程方法,容易地制备、获得(参见Molecular Cloning 2d Ed,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989);续生化学讲座“基因研究法I、II、III”,日本生化学会编(1986)等)。具体而言,可以如下实施:利用靶基因表达的适当起源,根据常规方法,调制cDNA基因文库,利用该基因文库,对本发明基因使用特有的适当探针或抗体,选择所希望的克隆基因(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981);Science,222,778(1983)等)。
如上所述,作为cDNA的起源,可以举出表达靶基因的各种细胞、组织、细胞溶解液或由此它们产生的培养细胞等。另外,可以根据常规方法实施来源于人体液、血液或组织的上述cDNA中全部RNA的分离、mRNA的分离或纯化、cDNA的获取及其筛选等处理的任一种。另外,cDNA基因文库可以为市售的基因文库,本发明中,该cDNA基因文库也可以使用例如Clontech公司(Clontech Lab.Inc.)等市售的各种cDNA基因文库等。或者也可以使用保藏或市售的小鼠纤维芽细胞NIH3T3、猴的COS7细胞、HeLa细胞、人胚性肾细胞的293细胞的树立细胞株。
如上所述,本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体具有抑制靶基因的RNA功能的活性,利用该活性能够提供一种抑制基因功能的基因功能抑制方法,因此,例如通过抑制基因的RNA表达或抑制由基因编码的氨基酸的蛋白质表达,能够抑制该基因或蛋白质的功能,从而,通过抑制具有由与各种疾病相关的过度表达基因或基因变异产生的有害功能的基因或来源于病毒的基因的表达,上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体能够提供一种以靶基因用序列或靶基因用多核苷酸序列、或上述序列组合而成的重组载体为有效成分的药物组合物及由该药物组合物构成的基因治疗剂。
由此,根据本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体,能够抑制靶基因的功能,因此,以本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体为有效成分的药物组合物对下述疾病的治疗是有效的,所述疾病包括作为对象的各种疾病被判断为与具有由基因高表达或基因变异而产生的有害功能的基因或来源于病毒的基因相关的基因相关疾病,例如,与c-erbB、erb基因等相关的乳癌,与hst-1、src、fps、abl、myc、jun、myb等癌相关基因、白血病病毒、乳癌病毒、肉瘤病毒等RNA肿瘤病毒、HBV、HCV等肝炎病毒、与NPY基因、ANGPTL3基因相关的肥胖等已被判明了是否与基因相关的疾病。
而且,在异种间或同种间进行的器官或细胞移植中,通过使用本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体,能够抑制引起排斥反应的基因功能,可以用于治疗包括干细胞移植在内的各种器官疾病、神经疾病。
因此,本发明提供一种以本发明的药物组合物或含有药物组合物的基因治疗用载体及利用该载体导入了本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的细胞为有效成分的药物。
即,根据本发明能够提供一种基因治疗剂,所述基因治疗剂以含有本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的药物组合物或基因治疗用导入用载体及利用该载体导入了本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的细胞、及该基因治疗用导入用载体及利用该载体导入了本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的细胞为有效成分。
而且,根据本发明,能够提供一种药物,所述药物含有作为有效成分的含有上述本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的基因治疗用导入用病毒载体,特别是在用于抑制由疾病相关基因的高表达产生的活性的处置等过程中使用,对于与c-erbB、erb基因等相关的乳癌,与hst-1、src、fps、abl、myc、jun、myb等癌相关基因、白血病病毒、乳癌病毒、肉瘤病毒等RNA肿瘤病毒而言,所述药物作为抗癌剂使用;对于HBV、HCV等肝炎病毒,所述药物作为抗肝炎治疗剂使用;对于与NPY基因、ANGPTL3基因、MGAT基因、DGAT基因相关的肥胖等,所述药物作为抗肥胖剂使用。
下面,详细说明上述基因治疗。需要说明的是若无特别说明,则可以使用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学及免疫学的惯用方法。所述方法例如记载于Maniatis(Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning:A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1982))、Sambrook(Sambrook,J.,et al.,Molecular cloning:A laboratory manual,2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York(1981))、Ausbel(Ausbel,F.M.,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,New York,(1992))、Glover(Glover,D.,DNA Cloning,I andII(Oxford Press)(1985))、Anand(Anand,Techniques for the Analysis ofComplex Genomes,(Academic Press(1992))、Guthrie(Guthrie,G.,et al.,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,(AcademicPress)(1991))以及Fink(Fink et al.,Hum.Gene Ther.,3,11~19(1992))发表的文章中。
在基因治疗或经由基因功能抑制的移植治疗中,本发明提供一种基因治疗法,是在上述疾病相关基因表达的细胞中提供具有与细胞内的RNA互补的序列的核苷酸,通过抑制该RNA的功能来抑制翻译或RNA的功能、抑制上述疾病相关基因表达,通过提供用于具有上述作用的基因功能抑制药物,抑制或惰化促进上述疾病的病态发展的活性。该治疗方法为通过使本发明的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体抑制具有上述疾病相关基因的细胞本身的RNA功能,影响转录或翻译过程,从而抑制靶基因表达。可以提供一种等位特异性功能抑制方法,在本方法中,利用核苷酸互补性的特异性,仅抑制异常RNA的功能,不抑制正常功能。因此,能够提供一种制备含有与基因的RNA互补的本发明元件(III)的单链多核苷酸、将该单链多核苷酸供给靶细胞的方法。
只要提供抑制该疾病相关基因的功能表达作用,就能够抑制受体细胞/靶细胞中基因功能的活性。可以使用该靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体或质粒,维持在染色体外,或者也可以使用逆转录病毒载体,***染色体内,进行维持,可以导入靶细胞内。
利用使用上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、或上述序列组合而成的重组载体的癌基因治疗,在来源于逆转录病毒、腺病毒、AAV的载体中组装该靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列,使其被靶基因功能活性表达细胞感染,抑制靶基因的RNA功能,由此能够获得所希望的抗癌效果。
用于导入用于重组及染色体外维持两者的所希望基因的载体为该领域内已知的载体,本发明中可以使用已知的任一种载体。例如,可以举出包含连接表达抑制元件的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的拷贝、并且在靶细胞内能够表达该靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的病毒载体或质粒载体。作为该载体,通常可以利用上述表达用载体,优选例如作为起源载体,可以举出使用美国专利第5252479号说明书及PCT国际公开WO93/07282号说明书中公开的载体(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21及/或pRSVL等)或pRC/CMW(Invitrogen公司制备)等调制而成的载体。更优选下述的各种病毒·载体。
需要说明的是作为基因导入治疗中使用的载体中使用的启动子,可以优选利用作为各种疾病治疗对象的患部组织固有的物质。
作为其具体例,例如,对于肝脏而言,可以举出白蛋白、α-胎儿蛋白、α1-抗胰蛋白酶、运铁蛋白、甲状腺素运载蛋白等。对于结肠而言,可以举出羧酸脱氢酶I、癌胚抗原的抗原等。对于子宫及胎盘而言,可以举出***、芳香化酶P450、胆固醇侧链裂解酶P450、17α羟化酶P450等。
对于***而言,可以举出***抗原、gp91-phox基因、***特异性激肽释放酶等。对于***而言,可以举出erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳浆蛋白等。对于肺而言,可以举出活性剂蛋白质C尿球蛋白等。对于皮肤而言,可以举出K-14-角蛋白、人角蛋白1或6、喹啉等。
对于脑而言,可以举出神经胶纤维质酸性蛋白质、成熟星状特异蛋白质、髓磷脂、酪氨酸脱氢酶胰绒毛蛋白、胰高血糖素、胰岛淀粉样多肽等。对于甲状腺而言,可以举出甲状腺球蛋白、降钙素等。对于骨而言,可以举出α1胶原、骨钙蛋白、骨唾液酸糖蛋白等。对于肾脏而言,可以举出肾素、肝脏/骨/肾脏碱性磷酸酶、***等;对于胰而言,可以举出淀粉酶、PAP1等。
而且,需要说明的是作为可以在基因导入治疗中使用的载体中使用的启动子,可以使用已知表达不编码蛋白质的短RNA的U6snRNA、7SK、tRNA等Pol III类启动子。另外,也可以使用pol III类经人工改变的启动子。
需要说明的是在靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列导入用载体的制备中,被导入的靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列可以基于靶基因的碱基序列信息,利用如上所述的普通基因工程方法容易地制备、获取。
将该靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入用载体导入细胞内的操作可以根据例如以电转法、磷酸钙共沉淀法、病毒形质导入、HVJ包膜法等代表性方法将RNA或DNA导入细胞内的、该领域内已知的各种方法进行。需要说明的是由靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列经形质转换而成的细胞能够以其自身分离状态用于抑制由基因表达的功能活性的药物或作为用于治疗研究的模型体系使用。
在基因治疗中,上述靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入用载体可以通过局部或全身注射给予患者的作为对象的组织部位,由此将其导入患者的靶细胞内。此时,通过全身给予,能够使其到达其他部位、甚至能够表达癌基因或肿瘤病毒的靶基因RNA的任一种细胞。形质导入后的基因没有恒久地组装在各靶细胞的染色体内时,通过定期反复进行给予能够实现。也可以使用逆转录病毒等进行恒久性地导入。
本发明的基因治疗方法包括以下两种方法:将上述靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列导入用材料(靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入用载体)直接给予体内的体内法(in vivo)和从患者体内取出靶细胞或靶组织,在体外导入基因,然后,将该细胞或组织送回体内的体外法(ex vivo)。
另外,也可以将靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列、或经PCR法扩增了该序列的序列直接导入细胞内,切断RNA链。
另外,可以根据基因治疗(处置)的对象,适当选择导入靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的靶细胞。例如,作为靶细胞,可以举出确认癌基因表达的癌细胞,特别是除了***、肾脏、***、小肠组织之外,还有淋巴细胞、纤维芽细胞、肝细胞、造血干细胞、脂肪细胞等细胞。
上述基因治疗中的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入方法包括病毒性导入方法及非病毒性导入方法。
作为病毒性导入方法,可以举出使用逆转录病毒载体作为载体的方法。作为其他病毒载体,可以举出腺病毒载体、HIV(humanimmunodeficiency virus)载体、腺病毒伴随病毒载体(AAV,adeno-associated virus)、疱疹病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体及埃-巴二氏病毒(EBV,Epstein-Barr virus)载体等。
作为非病毒性基因导入方法,可以使用以下方法:磷酸钙共沉淀法;使封入了多核苷酸的脂质体与预先用紫外线破坏了基因的惰化仙台病毒融和制成膜融和脂质体,使其与细胞膜直接融和,将多核苷酸导入细胞内的膜融和脂质体法;多核苷酸的质粒用金覆盖,经高压放电,将多核苷酸物理性地导入细胞内的方法;直接经体内将寡核苷酸的质粒注入器官或肿瘤内的裸(naked)寡核苷酸法;将包埋在多重膜正电荷脂质体中的基因导入细胞内的阳离子性脂质体法;为了将基因仅导入特定的细胞内而不导入其他细胞内,使与靶细胞内表达的受体接合的配体与本发明的多核苷酸接合,从而将其给予的配体-DNA复合体法等。
作为其中的一例,简要说明本发明的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入用EBV载体的制备,EB病毒(Epstein-Barr virus:EBV)为1964年由Epstein等从来源于伯基特(Burkitt)淋巴肿瘤的培养细胞中分离出来的属于疱疹科的病毒(Kieff,E.and Liebowitz,D.:Virology,2nd ed.Raven Press,New York,1990,pp.1889~1920)。由于该EBV使细胞具有转化活性,因此为了成为基因导入用载体,必需调制缺少该转化活性的病毒。可以如下实施。
即,首先,克隆组成所希望的外来基因的靶DNA附近的EBV基因组。在其中组装具有与外来基因互补的序列的多核苷酸片段和耐药性基因,得到重组病毒制作用载体。然后,将用适当的限制酶切断的重组病毒制作用载体转染在EBV阳性Akata细胞内。利用相同的重组产生的重组病毒经利用抗表面免疫球蛋白处理的病毒产生刺激,也可以与野生型Akata EBV一同回收。使其感染EBV阴性Akata细胞,在药剂存在下选择耐性株,由此能够得到不共存野生型EBV、仅感染所希望的重组病毒的Akata细胞。而且,通过诱导重组病毒感染Akata细胞产生病毒活性,能够产生作为目的产物的大量重组病毒载体。
不使用重组病毒载体将所希望的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入靶细胞、制备非病毒载体可以利用例如采用膜融和脂质体的基因导入方法进行实施。该方法为使膜脂质体(由脂质双层膜构成的小胞)具有对细胞膜的融合活性、由此将脂质体的内容物直接导入细胞内的方法。
上述利用膜融合脂质体导入反义·寡核苷酸可以根据例如中西等人的方法进行(Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res.,159,399~499(1985);Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In trends andFuture Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery(ed.by Lee,V.H.et al.).,Harwood Academic Publishers Gmbh.Amsterdam,1995,pp.337~349)。
另外,作为使用其他的脂质体将靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入靶细胞内的方法,可以举出利用阳离子性脂质体的反义多核苷酸导入法。该方法基于八木等人的方法进行实施(Yagi,K.,et al.,B.B.R.C.,196,1042~1048(1993))。该方法着眼于质粒和细胞均带有负电荷,在脂质体膜的内外两个表面上赋予正电荷,利用静电力增加质粒的进入,提高与细胞的相互作用。此处使用的脂质体为具有正电荷的多层大脂质体(multilamellar large vesicles:MLV)时是有用的,也可以使用1张大单层脂质体(large unilamellar vesicles:LUV)或1张小单层脂质体(small unilamellar vesicles:SUV)与质粒制成复合体,将所希望的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列导入细胞内。
在本发明的基因治疗中,将所希望的基因导入靶细胞或靶组织的方法包含有代表性的2种方法。
本发明针对基因治疗领域,将基因导入靶细胞及目标组织,主要包含两种典型的方法。
第一种方法是,从治疗对象的患者身上取出靶细胞后,将该细胞在体外添加例如白介素-2(IL-2)等物质进行培养,并将包含在逆转录病毒载体中的作为靶点的靶基因寡核苷酸序列以及靶基因用序列导入细胞,将得到的细胞以再移植的方法(ex vivo)再次导入体内。该方法对ADA缺乏症的发生、由基因缺陷引发的基因病及动脉硬化、癌症、AIDS等疾病有很好的疗效。
第2种方法是,将靶基因用多核苷酸序列,及靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)直接注入患者体内的脑、肾脏、***、小肠组织等靶部位,即基因直接导入法。
上述基因治疗的第1种方法具体例如可以按下述实施。即,使用血液分离装置从患者体内分离提取单核细胞,使用AIM-V等适当的培养基并加入IL-2培养72小时,加入含有欲导入的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的载体。为了提高靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的导入效率,也可以在32℃下加入鱼精蛋白以2500转速离心1小时后,在37℃及10%二氧化碳的条件下培养24小时。在进行此操作数次后,再以AIM-V等适当的培养基并加入IL-2培养48小时,用生理盐水洗涤细胞,计算活细胞数,并使用前述的in situ PCR等方法检测例如作为研究对象的与疾病相关的基因的表达活性,或者其活性的程度,以此确认靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的导入效果。
此外,进行培养细胞中有无细菌和真菌生长、支原体感染、及内毒素检索的安全性检查,在确认安全性后,以导入预测效果剂量的靶基因用多核苷酸序列及靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的培养细胞对患者进行点滴静注以进行返回。以所述方法进行如数周或数月的操作,进行基因治疗。
此处的病毒载体的用量根据导入靶细胞进行适当的选择。通常,以病毒量为例,相对于细胞数1×108,采用1×103cfu至1×108cfu范围的给予量。
作为上述第1种方法的另一种形式,使用含有靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的逆转录病毒载体的病毒产生细胞与患者细胞进行共同培养,向该靶细胞中导入靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸),采用此种方法也是可行的。
在实施基因治疗的第2种方法(直接法)时,希望根据特别是体外预备实验的情况及基因导入法的情况,对于靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)有没有实际导入等状况,用靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的PCR法或in situ PCR法进行确认,或者基于靶基因用多核苷酸序列、或靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的导入,确认所期望的作为治疗效果的特殊活性的增加,以及靶细胞的增殖或抑制等情况。此外,在采取逆转录病毒载体的场合,用PCR法检测有复制活性的逆转录病毒,进行逆转录酶的活性测定,以及用PCR法监测膜蛋白(env)基因的活性,由此确认靶基因用多核苷酸序列、或及靶基因用序列在导入时的安全性,这在进行基因治疗时尤为重要。
本发明提供一种同时含有药学有效量的活性成分、适当的无毒性药物载体或稀释剂的药物组合物或药物制剂(基因治疗制剂),所说的活性成分是导入了本发明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列或组装了这些序列的导入用载体,或导入了靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列(含有与疾病相关的基因的RNA互补的寡核苷酸的多核苷酸)的细胞。
在可以与本发明的药物组合物(药物制剂)配合使用的药物辅料方面,根据制剂使用情况的不同,可以举出通常使用的:填充剂、增量剂、粘合剂、增湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等种类的稀释剂以及赋形剂等,可根据上述材料能制得的制剂形态进行适当的选择。
举例说明,本发明中的含有靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列导入用载体的药物制剂,由包含有该载体的脂质体的形态,或者以含有所希望的靶基因用多核苷酸序列,及靶基因用序列的逆转录病毒载体的逆转录病毒感染的培养细胞的形态调制而成。
所述的物质可用磷酸缓冲生理盐水(pH 7.4)、复方生理盐水、细胞内组成液用注射剂形态调制而成,也可用加入鱼精蛋白等提高基因导入效率的物质共同制备而成。
上述药物制剂的给药方法中没有特殊的限制,可根据各种制剂的形态、患者的年龄、性别以及其他条件、病患的程度等等进行选择。
上述药物制剂中应含有的有效成分以及给药量没有特殊的限制,可根据所希望的治疗效果、给药方法、治疗疗程,患者的年龄、性别及其他的条件等选择适当的范围。
通常,作为药物制剂的含有所希望的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的逆转录病毒载体的给药量为,以1日1kg为例,逆转录病毒的效价在1×103pfu到1×1015pfu之间为宜。
对于导入了所希望的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列的细胞而言,在1×104细胞/body到1×1015细胞/body范围之间选择为宜。
该制剂可以每日一次或者每日数次分开给药,也可以一周或数周为间隔进行给药。此外,优选同时给以鱼精蛋白等提高基因导入效率的物质或含有该物质的制剂。
此外,关于本发明的细胞和组织,将含有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离和纯化的单链多核苷酸序列导入该细胞和组织,通过和上述(I)和(III)元件的多核苷酸序列的互补的基因的RNA的结合体现抑制RNA功能的作用,由此,本发明提供了抑制靶基因的方法,以及抑制由该基因编码的氨基酸序列形成的蛋白质及RNA表达的方法,以及可以容易地检测靶基因的功能变化的方法。该方法以后面所述的实施例为例,本发明通过抑制靶基因的mRNA的RNA活性,从而抑制靶基因的功能,并可以观察由此出现的基因功能的变化。该基因的功能变化可通过检测基因表达抑制的DNA杂交分析,DNA微阵列以及由基因编码的蛋白质的表达的抑制来进行判断,并用采用蛋白质抗体的免疫印记分析,可以同时检测出酶反应、荧光反应等各种活性功能的变化,本发明也提供了观察含有检测到的全部基因以及蛋白质的表达量变化的细胞及组织功能变化的方法。
本发明还可以提供:使用本发明的靶基因用多核苷酸的由上述方法生产的培养细胞以及组织功能低下的基因剔除(knock-down)细胞、组织、非人类动物、植物;利用本发明的基因破坏方法生产的培养细胞、组织、非人类动物、植物功能低下的基因剔除细胞、组织、非人类动物、植物。在非人基因剔除动物的制备中,可以使用本发明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列或组装了这些序列的导入用载体,将其导入到受精卵中,该方法比较容易实现。可以以此方法获得小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩、青蛙、鱼等基因剔除动物。对于植物同样有大豆、红花菜豆等豆科植物,水稻、小麦、玉米、白薯等谷物类,黄瓜、番茄、辣椒、茄子、芦笋、洋葱等蔬菜类,苹果、葡萄、无花果、猕猴桃、柑桔类、草莓、杏、桃、甜瓜、核桃等水果及坚果类植物,丝柏、椰子、杉木、枫树、蕨类、栀子、长春花等装饰作物,蔷薇、康乃馨、菊、日本打碗花、凤仙花、秋海棠等观赏性植物,上述植物都可以被容易地转化为基因剔除植物。
通过提供功能抑制的基因剔除细胞、组织、非人类动物以及植物,使用该细胞或组织,可以检测出可能具有对该细胞和组织的功能产生影响的候选化合物。如前所述,如果能综合细胞、组织、非人类动物以及植物的功能的变化,结合疾病的病状以及生物的发育、耐受性等等变化进行观察,则可以使用本发明的靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列,并用前述的候选化合物对细胞、组织等进行给药,通过观察基因功能的变化观测候选化合物对该细胞及组织的作用,以此可以检验候选化合物在药物、农药等领域内的应用价值。
如上所述,被检化合物在与细胞及组织共同培养后,对于该细胞以及组织使用含有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离和纯化的单链多核苷酸进行导入,与前述的(I)和(III)多核苷酸序列互补的基因的RNA功能受到抑制,将其活性抑制与对照组进行比较,由此可以提供检测能促进靶基因RNA破坏的候选化合物。
此外,作为上述候选化合物的检测方法,例如有使用本发明的靶基因用多核苷酸序列对药物靶基因进行筛选的方法,在该细胞和组织中导入含有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离和纯化的单链多核苷酸,抑制与前述的(I)和(III)多核苷酸序列互补的靶基因的mRNA的RNA功能,以此作为鉴别刺激或者抑制靶基因功能的化合物,具体详细表述如下:
(a)利用直接或间接结合在该候选化合物上的标记,测定候选化合物与具有由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物(或携带由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的细胞或其膜)或其融合蛋白质的结合的方法;
(b)在标记竞争物质的存在下,测定候选化合物与导入了该单链多核苷酸序列的细胞(或携带该单链多核苷酸序列的细胞或其膜)或其融合物的结合的方法;
(c)使用适用于携带所述多肽或靶基因表达产物的细胞或细胞膜的检测体系,确定候选化合物是否利用该单链多核苷酸序列活化或抑制由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或该靶基因表达产物而产生的信号的方法;
(d)将候选化合物、与含有由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的溶液同时混合,调制混合物,测定该混合物中该多肽或该靶基因表达产物的活性,将该混合物的活性与标准进行比较的方法:以及
(e)检测候选化合物对细胞中产生编码由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的mRNA及由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的效果的方法。
上述候选化合物可以为下述任何一种物质,例如:肽类、蛋白、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等,这些化合物可以是新化合物,也可以是公知的化合物。
使用本发明的靶基因用多核苷酸序列及基因序列,用候选化合物对前述细胞、组织及非人类动物等进行给药,观察基因功能的变化,与对照组进行比较检测对靶基因的RNA功能具有抑制作用的化合物,作为上述方法的具体方法,在使用后述实施例中描述的靶基因用多核苷酸序列进行转染的前后,在细胞以及组织溶液中添加候选化合物进行共同培养,通过对本发明的基因多核苷酸序列的功能破坏的促进或抑制情况的观察,可检测候选化合物的作用(其活性具有的影响)
对于候选化合物的效果,举例说明,在上述活性实验的情况下,将测定的候选化合物的活性的影响与对照组及不加入候选化合物的组进行比较,如有大约20%以上、优选约30%以上、更优选约50%以上的促进作用,即可选择该候选化合物作为促进本发明中靶基因用多核苷酸序列功能的化合物。另一方面,在上述活性实验的情况下,将测定的候选化合物的活性的影响与对照组及不加入候选化合物的组进行比较,如有大约20%以上、优选约30%以上、更优选约50%以上的抑制作用,即可选择该候选化合物作为抑制本发明中靶基因用多核苷酸序列功能的化合物。
此外,使用本发明的筛选方法得到的候选化合物作为药物使用的情况下,可以采用常规的手段进行实施。例如,含有前述的本发明的靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体的药物,可以采用相同的方式制成片剂、胶囊、酏剂、微囊剂、无菌溶液、混悬剂等。这样制得的制剂具有安全性和低毒性,可以对哺乳动物(如:人、小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩等等)进行给药。该化合物及其盐类的给药量根据对象的疾病、给药对象、给药途径等情况的不同而有所差别,例如,以治疗癌症为目的,能够促进本发明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体对癌细胞中的靶基因的RNA的RNA功能抑制活性的化合物,其口服给药量一般为,成人(体重60kg)每日该化合物约为0.1~100mg,优选约为1.0~50mg,更优选约为0.1~20mg。非口服给药的情况下,该化合物每次的给药量因给药对象、对象疾病等的不同而有所差别,例如,能够促进本发明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体对癌细胞中的靶基因的RNA的RNA功能抑制活性的化合物,其注射给药量一般为,成人(体重60kg)每日该化合物约为0.01~30mg,优选约为0.1~20mg,更优选为约0.1~10mg,在此范围内进行静脉注射是比较好的选择。对于其他的动物情况也相同。
此外,使用本发明中靶基因用多核苷酸及靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体,可以提供靶基因破坏的动物。也即,本发明可以提供携带靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体的非人类哺乳动物、非人类的啮齿类动物、前述啮齿动物为小鼠和大鼠等动物。
本发明中,携带靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体的非人类哺乳动物,针对含有未受精卵、受精卵、***以及其母细胞的胚胎细胞,较适当的做法是,在非人类哺乳动物发育的胚胎发育阶段(更好的做法是,在单细胞及受精***阶段(一般为8细胞***期以前)),使用磷酸钙法、电子脉冲法、脂质体转染法、凝集法、微注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等对作为目标的靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列、及***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体进行转移。作为靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体的转移方法,可以体细胞、体内器官、组织细胞等为靶点,利用靶基因用多核苷酸、靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列以及靶基因的重组载体进行转移,细胞培养,组织培养,进而可以用公知的细胞融合法将上述细胞与前述胚胎细胞进行融合,得到***靶基因用多核苷酸序列、靶基因用序列、***了靶基因用多核苷酸序列或靶基因用序列的重组载体转基因动物。
作为该非人类哺乳动物,举例有牛、猪、羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠等可供使用。其中,从制作动物疾病模型的角度出发,选择个体发育及生命周期较短且容易繁殖的啮齿类动物,特别是小鼠(例如纯种系有:C57、BL/6系、DBA2系等;杂交系有:B6C3F1系、DBF1系、B6D2F1系、BALB/c系,ICR系等)以及大鼠(例如:Wistar,SD等)比较适当。同样,在向人移植器官时,适当选择器官排异反应相关基因被抑制的基因剔除猪。
本发明可提供具有靶基因的RNA功能抑制活性的单链多核苷酸以及使用该多核苷酸对靶基因的功能性表达进行抑制调控的方法,并且可根据对该基因的功能性表达进行选择性抑制,提供可以抑制可能对目的蛋白质及RNA的功能性表达具有抑制调控作用的单链多核苷酸及抑制其功能表达的方法。通过本发明还可提供简便的基因功能分析方法、药物靶基因的筛选方法、通过制作基因剔除小鼠进行药物体内评价(in vivo)的方法、以及针对基因疾病的药物组合物(基因治疗剂)。
具体实施方式
实施例1:本发明的靶基因用多核苷酸的合成
本实施例中,靶基因以荧光素酶基因(Genbank Accession No.U47296)中434-452位的19个核苷酸的序列为RNA干扰的靶部位,合成了含有2种元件序列的靶基因用多核苷酸。
RNA序列的合成使用市售的采用磷酸氨基保护法的自动合成仪(Applied Biosystem社制ABI3900高通量DNA合成仪)与合成RNA所需试剂合成。此外,作为非特异对照组,合成了与EGFP(GenbankAccession No.U55763)的序列位置936-954互补的由21个碱基构成的正向序列(F)和反向序列(R)的RNA。
如此得到的本发明的靶基因用多核苷酸中,元件(II)的12个碱基的序列以uGL3.12RNA命名,元件(II)的7个碱基的序列以uGL3.7RNA命名。合成得到的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的序列,以各自序列号1及2表示,uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的元件序列以序列号3及4表示。
对于非特异对照组,以与EGFP的序列位置936-954互补的由21个碱基构成的正向序列(F)和反向序列(R)的RNA序列号5及6表示,上述序列的末端各自添加2碱基的UU(尿嘧啶)。
实施例2:使用本发明的靶基因用多核苷酸的RNA功能抑制活性实验
1、RNA转染用RNA的配制
将上述得到的uGL3.12RNA(142nM)及uGL3.7RNA(135nM)用蒸馏水溶解配制成100pM/μl溶液。
接着将30μl上述RNA溶解液、30μl蒸馏水以及240μl缓冲液(100mM乙酸钾,pH7.4的30mM HEPES-KOH,2mM乙酸镁)配制成混合溶液,作为uGL3.12RNA及uGL3.7RNA的原液(原液:10pmole/μl)。5倍及10倍的稀释均采用上述缓冲液进行稀释。
2、非特异对照组的siRNA的制备
由上述实施例1得到的与EGFP基因的序列位置936-954互补的由21个碱基构成的单链正向序列(F)RNA和反向序列(R)的RNA各10皮摩尔进行混合,加入退火缓冲液至100μl,以缓冲液进行5倍稀释,作为对照siRNA溶液(EGFPc2)。
3、转染复合物的制备
报道基因表达载体的制备为,将含有荧光素酶报道基因的克隆载体pGL3-对照组(pGL3-control;Promega公司制备)以及(海肾:Renilla)含有荧光素酶基因的pRL/TK(pRL/TK:Promega公司制备)分别与上述配制的RNA混合,配制成转染复合物。
也即,在50μl的OPTI-MEM无血清培养基(Gibco-BRL公司制备)中加入上述各报道基因(1μg的pGL3-control和0.1μg的pRL/TK)、本发明的靶基因用多核苷酸的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA、以及非特异对照组siRNA,调制成溶液(EGFPc2),作为(a)液。
在另一50μl的OPTI-MEM培养基里加入1.5μl的脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(Lipofectamine 2000:Life Technology公司制备)混悬,室温静置5分钟(b液)。然后将a和b两液进行混合,反应20分钟,作为转染复合物。
4、转染
首先,在将HeLa3细胞进行混悬前,使用添加了DMEM/10培养基(DMEM/10∶10%胎牛血清(INTERGEN公司制、#1020-90)的D-MEM培养基(Sigma公司制),用直径为10厘米的培养皿,在5%CO2及37℃条件下进行培养。培养后的细胞以PBS洗涤后,以1ml胰蛋白酶-EDTA进行处理洗脱细胞,再次悬浮于10ml的DMEM/10中。用血细胞计数盘测量细胞数,用DMEM/10配制使细胞浓度达到1.2×105/0.5ml。将HeLa3细胞在24孔板中以每孔0.5ml进行添加,于5%CO2及37℃条件下培养24小时。
转染过程中,将24孔板中的HeLa3细胞的培养上清吸去,在各孔中加入0.5ml新鲜的DMEM/10。然后在各孔中加入0.1ml的转染复合物,轻微振荡细胞板以混匀,于5%CO2及37℃下培养24小时。
5、荧光素酶的活性测定
使用双荧光素酶报道基因检测***(Dual-Luciferase ReporterAssay System:#E1910 Promega公司制备),以此产品附带的操作方法进行操作。在培养板中加入400μl试剂盒附带的溶解缓冲液,将细胞溶解后在桌面离心机中以1500rpm离心5秒钟,再取20μl上清,与添加的100μl反应试剂LARII进行混合,使用荧光测试仪对第一次的化学发光反应进行检测,以GENios(TECAN公司制备)的发光测定软件进行测定。
使用(海肾:Renilla)荧光素酶(内部标准物)的值对萤火虫荧光素酶的测定值进行校正,以RNA不存在时的值为1.0,计算出F-Luc/R-Luc的相对值。
结果在图1及表1中给出。
表1
PP-LucRr-Luc | Pp/Rr 修正值 | |
元件(II)7碱基原液元件(II)7碱基原液×5倍稀释元件(II)7碱基原液×50倍稀释 | 3004 7013625376223084100749320428 | 0.04 0.090.11 0.240.31 0.65 |
溶剂 | 149861310559 | 0.48 1.00 |
元件(II)12碱基原液元件(II)12碱基原液×5倍稀释元件(II)12碱基原液×50倍稀释 | 37267200931507304565108888309057 | 0.05 0.110.10 0.210.35 0.73 |
EGFP2×5倍稀释 | 112486233487 | 0.48 1.00 |
如图1及表1所示,试验结果经修正值修正后,与非特异序列的对照作为1.00进行比较,元件(II)为7碱基长时,50倍稀释、5倍稀释、原液数值分别为0.65、0.24、0.09,随浓度变化而减小,原液中约有90%的活性被抑制。同样,在12个碱基长度的情况下,50倍稀释、5倍稀释、原液分别为0.73、0.21、0.11,随浓度变化而减小,原液中约有90%的活性被抑制,说明无论元件(II)的大小如何,在任意一种情况下,荧光素酶的活性随浓度变化而受到了抑制。
由图1或表1的结果可知,通过本发明中的单链靶基因用多核苷酸的uGL3.12RNA及uGL3.7RNA,使荧光素酶活性随浓度变化受到抑制,具有抑制RNA功能的活性。
此外,在本实验中并没有发现不同元件(II)的长度(7个碱基和12个碱基)的活性有所差异。
并且,确认了元件(II)虽然具有发夹形状的互补序列(-AATT-),但仍然具有RNA功能抑制作用。
实施例3:Lamin A/C基因功能抑制载体的RNA功能抑制效果
本实施例中,通过以Lamin A/C基因(Genbank AccessionNo.X03445)的640-662位置的23个碱基的序列作为RNA干扰的靶部位制作细胞内表达载体,以此评价其RNA功能抑制效果。
(1)Lamin A/C基因功能抑制细胞的制备
1、Lamin A/C基因功能抑制载体的制备
Lamin A/C基因功能抑制载体按以下方法制得。
使用以下引物(寡聚体1及2;序列号7,8)对人U6启动子进行PCR扩增。以此PCR扩增片段作为模板,使用寡聚体1(序列号7)以及寡聚体3(序列号9)进行PCR扩增,并引入Csp45I限制性酶切部位制作改变的U6启动子。将此扩增片段用限制性酶EcoRI及XbaI进行双酶切,并将其克隆入同样被限制性酶EcoRI及XbaI双切的pUC19载体中(pUC19U6)。
使用以下引物(寡聚体4及5;序列号10,11)对小鼠H1启动子进行PCR扩增后,扩增片段用限制性酶EcoRI及SalI进行双酶切,并将其克隆入同样被限制性酶EcoRI及SalI双切的pUC19载体中(pUC19H1)。
寡聚体名称1(序列号7):U6P.F,框内:EcoRI切断部位
寡聚体名称2(序列号8):U6CSP45R,框内:Csp45I切断部位
寡聚体名称3(序列号9):U6P.R,框内:XbaI切断部位
寡聚体名称4(序列号10):mH1.F,框内:EcoRI切断部位
寡聚体名称5(序列号11):mH1.R,框内:SalI切断部位
接下来将寡聚体1(序列号12)与寡聚体2(序列号13)进行退火,使用Ex-Taq酶(宝酒公司制备)进行DNA合成后,用XbaI、SalI切断,并将其克隆入同样被限制性酶XbaI、SalI双切的pUC19H1载体,命名为pUC19H1-Lamin。
使用以下的引物(寡聚体5及6,序列号16,17)对pUC19载体的限制性酶NdeI位点进行扩增,并***由pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司)扩增的新霉素(Neomycin)抗性基因,制作名为pUC19-neo的载体。在此载体的EcoRI、HindIII的切断部位导入由pUC19H1-Lamin载体的EcoRI、HindIII位点双切得到的具有RNA抑制功能的片段,作为Lamin A/C基因功能抑制载体。
寡聚体名称1(序列号12):hLaminAC-4.H1F,框内:XbaI切断部位,下划线:stem区,斜体:Loop区
寡聚体名称2(序列号13):hLaminAC-4.R,框内:SalI切断部位,下划线:stem区,斜体:Loop区
寡聚体名称3(序列号14):Neo-Nde.F,框内:NdeI切断部位
AGAATTC
TGGAATGTGTGTCAGTTAG
寡聚体名称4(序列号15):Neo-Nde.R,框内:NdeI切断部位
2、转染复合物的制备:取1μg上述1中得到的Lamin A/C基因功能抑制载体加入50μl的OPTI-MEM(Invitrogen公司制备)(A液)。另外,取3μl的Lipofectamine2000(Invitrogen公司制备)与50μl的OPTI-MEM混合,室温静置5分钟(B液)。将A液与B液混合,室温下反应20分钟,制备转染复合物。
3、转染:转染的前一天,使用加入了10%FBS的DMEM培养基(Sigma公司)制备2×105/ml的HeLa S3细胞溶液,以每孔0.5ml的量加入24孔板。以CO2培养箱(三洋公司)以37℃,5%CO2进行过夜培养。将上述配制的转染混合物,以每孔100μl的量加入24孔板,将培养板再置于CO2培养箱继续进行过夜培养。
4、细胞的筛选及永生化:用PBS将细胞培养板的各孔洗净后,使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen公司制备)消化细胞并回收。用加入10ml的10%FBS的DMEM培养基(Sigma公司)将回收的细胞再次悬浮,全量铺于10cm的组织上。第二天吸去培养上清,加入10ml含有选择培养液(含有10%FBS,500μg/ml的G418选择性抗生素(Geneticin,Invitrogen公司制备)的DMEM培养基(Sigma公司))。2日到3日更换一次新鲜的选择培养液并于CO2培养箱(三洋公司)以37℃、5%CO2进行培养。最后得到31个G418抗性株细胞。得到的细胞株作为Lamin A/C基因功能抑制细胞株,在以下的评价中使用。
(2)Lamin A/C基因功能抑制细胞株的评价
1、RNA制备:
将与31种Lamin A/C基因功能抑制细胞株进行共培养的10cm组织分别用PBS洗涤2次,每份细胞用3ml的TRIZOL试剂(Invitrogen公司制备)进行消化。消化细胞液分别移至15ml的离心管中,分别加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀,于室温静置3分钟,4℃、3000rpm下离心分离40分钟。将水相(最上层部分)分别转移至新管中后,加入0.5ml异丙醇混和,室温静置5-10分钟。以4℃、3000rpm离心分离40分钟,得到RNA沉淀,用70%乙醇洗净后,用DW溶解。各样品的吸光度用DU650(Beckman公司)在260nm测定,以测定值计算RNA浓度,在Northern分析中使用。
2、蛋白质的制备:
将与31种Lamin A/C基因功能抑制细胞株进行共培养的10cm组织分别用PBS洗净后,用胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen公司制备)消化细胞并回收。回收的细胞再次用PBS洗涤后,在微量离心机上以5000rpm离心5分钟回收细胞。回收的细胞溶于boiling lysisbuffer(5%SDS,5mM sodium ortho-vanadate,50mM Tris pH7.4)后,在100℃下处理5分钟,立即冰浴。在15000rpm、4℃下离心分离20分钟,回收上清作为蛋白质溶液。用蒸馏水10倍稀释蛋白质溶液后,测定总蛋白质浓度。用GENios(TECAN公司)及Advanced ProteinAssay Reagent试剂(cytosleleton公司)测定反应后的稀释蛋白质溶液的吸光度。用BSA作为标准品修正测定值,配制成终浓度为1μg/uL的样品。
3、Lamin A/C表达的Northern Hybridization分析:
使用上述配制的RNA对Lamin A/C mRNA表达进行分析。
Lamin A/C表达分析
将20μg的总RNA进行变性琼脂糖凝胶电泳分离后,使用毛细管描绘法(capillary ploting)转录至Hybond-N+membrane(AmershamPharmacia Biotech)。进一步用UV交联法使RNA桥接于膜上。膜使用prehybridization溶液(50%甲酰胺,5×SSPE,2×Denhardt’s solution,0.1%SDS,100μg/ml变性大马哈鱼***DNA)于42℃处理1小时后,用32P dCTP放射性同位素标记的lamin A/C基因片段作为探针进行杂交过夜。使用2×SSC/0.1%SDS溶液于室温下洗涤膜5分钟,重复操作3次。然后于50℃洗涤10分钟,65℃洗涤10分钟,洗涤2次。洗净的膜于X射线胶片上进行曝光过夜。
结果以图2表示。Lamin A/C基因功能抑制细胞株与未导入载体的细胞株的对比显示,Lamin A/C mRNA的表达功能受到抑制,说明Lamin A/C基因功能抑制载体具有基因特异性的RNA功能抑制活性。
4、蛋白印迹(Western)法分析
以上述2.的浓度配制的蛋白质样品用SDS缓冲液进行2倍稀释。取6μl样品上样于13%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上,在300V,40mA的条件下进行80分钟的SDS PAGE。使用半干印迹转移装置,以300V、140mA、60分钟的条件将进行凝胶电泳的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(BIORAD公司)。使用1000倍稀释的Lamin A/C抗体(BD Bioscience公司)以及对照抗体(αTubulin抗体、ZymedLaboratories公司)对印迹蛋白质后的硝酸纤维素膜进行处理,接下来使用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体进行反应。Lamin A/C特异性条带的检测使用ECL western blotting detection reagent(AmershamBioscience公司)对进行抗原抗体反应后的硝酸纤维素膜进行处理,反应后在X射线胶片上进行曝光。
结果以图2表示。各样品检出的条带的浓度,与Northern分析中Lamin A/C的mRNA的浓度大体一致,说明不仅对mRNA而且对翻译后的蛋白质都有抑制效果。
实施例4:萤火虫荧光素酶基因抑制功能载体的RNA功能抑制效果
本实施例中,以荧光素酶基因(Genbank Accession No.47296)的357-381的25个核苷酸的序列作为进行RNA干扰的靶基因序列,使用靶基因用多核苷酸制成在细胞内表达的萤火虫荧光素酶基因功能抑制载体,对其RNA功能的抑制效果进行评价。
萤火虫荧光素酶基因功能抑制载体的制备:在U6及H1启动子的调控下,构建了两种表达萤火虫荧光素酶基因功能抑制多核苷酸的载体(U6H1 25stem-Luc,及U6H1 25stemloop-Luc),以及不含有荧光素酶基因序列的对照载体。
对照载体
使用EcoRI及SalI双切实施例3构建的pUC19U6,分离人U6启动子,将片段克隆入EcoRI及SalI双切的pBS载体(pBSU6)。接下来使用实施例3制得的pUC19H1载体以下面的引物(寡聚体1及2)进行PCR扩增,将其扩增片段用SacI及SpeI双切,并将其克隆入用SacI及SpeI双切的pBSU6中,制成对照载体。
寡聚体名称1:biH1pro.SacI,序列号16
TTTTTGAGCTCATGCAAATTACGCGCTGTG
寡聚体名称2:biH1pro.SpeI-2,序列号17
TTTTTACTAGTTGGTCTAGACCGGCCGCCAC
Luciferase基因RNA功能抑制载体
1、U6H1 25stem-luc
将下述序列号为18、19的寡聚体1与寡聚体2进行退火,将其克隆入由限制性酶Csp45I及XbaI双切得到的对照载体中。
寡聚体名称1序列号18:25s#4F,框内:Csp45I切断末端,下划线:stem区
寡聚体名称2序列号19:25s#4R,框内:XbaI切断末端,下划线:stem区
2、U6H1 25stemloop-luc
将下述序列号为10、21的寡聚体1与寡聚体2进行退火后,使用Ex-Taq酶进行DNA合成得到double strand oligo。合成的doublestrand oligo用限制性酶Csp45I及XbaI双切,并将其克隆入Csp45I及XbaI双切的pBSU6中。
寡聚体名称1;ST-UHGL3#4F序列号20;框内:Csp45I切断部位,下划线:stem区,斜体:loop区
(链长52碱基)
寡聚体名称2序列号21;ST-UHGL3#4R框内:XbaI切断部位,下划线:stem区,斜体:loop区
(链长53碱基)
3、转染复合体的制备:在1.8μg的pGL3对照载体(Invitrogen公司)、0.2μg的pRL/Tk载体(Invitrogen公司)以及上述1得到的RNAi诱导载体中加入200μl的OPTI-MEM(Invitrogen公司)(A液)。A液由RNAi诱导载体和对照载体的共计3种分别制备而成。另外,在12μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)中加入200μl OPTI-MEM混合,室温下静置5分钟,配制成3份(B液)。A液和B液混合,室温下反应20分钟,配制成转染复合物(3种)。
转染:转染的前一天,使用加入了10%FBS的DMEM培养基(Sigma公司),配制浓度为105/ml的HeLa S3细胞溶液,以每孔0.5ml的量加入24孔板。用CO2培养箱(三洋公司)在37℃、5%CO2条件下进行过夜培养。将3种上述2配制的转染复合物以每孔100μl的量(每种4个孔;n=4)加入24孔板的孔中,将培养板放回CO2培养箱,继续培养1天。
荧光素酶活性检测:使用双荧光素酶报道基因检测***(DualLuciferase reporter assay system,Promega公司)试剂盒,并以随产品附带的操作方法进行实验。吸去培养板中培养基,用PBS洗净细胞一次。以0.2ml/孔的量加入试剂盒中附带的溶解液,将细胞溶解后,取20μl溶解液与附带的反应试剂LARII100μl混合,使用GENios(TECAN公司)的发光测定程序检测萤火虫荧光素酶的活性。接下来,加入100μl的Stop & Gro试剂后,使用GENios的发光测定程序检测海肾荧光素酶的活性。用萤火虫荧光素酶的活性的测定值除以海肾荧光素酶的活性的测定值,以对照载体得到的值作为100,计算每个得到的测定值。
4、分析结果:结果以图3表示。以各自的RNAi诱导处理的情况下,以对照载体处理过的荧光素酶的表达量作为100,U6H125stem-Luc减少了32.8%,U6H1 25stemloop-Luc减少了16.0%。证明使用任何一种功能抑制载体都使荧光素酶活性受到了抑制。由图3的结果可知,利用本发明的功能抑制载体,可以有效抑制作为靶基因的荧光素酶的活性,并具有RNA功能抑制活性。
序列表
<110>大塚制药株式会社
<120>多核苷酸用靶基因
<130>20045D
<150>JP 2002-46889
<151>2002-02-22
<160>21
<170>Patent In version 3.1
<210>1
<211>52
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>uGL3.12RNA
<400>1
cuuacgcuga guacuucgau uuguccguuc gucgaaguac ucagcguaag uu 52
<210>2
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>uGL3.7RNA
<400>2
cuuacgcuga guacuucgau uuguccucga aguacucagc guaaguu 47
<210>3
<211>12
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>uGL3.12RNA的元件序列
<400>3
uuuguccguu cg 12
<210>4
<211>7
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>uGL3.7RNA的元件序列
<400>4
uuugucc 7
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>RGFP 936-954的正向序列
<400>5
gacccgcgcc gaggugaagu u 21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>RGFP 936-954的反向序列
<400>6
cuucaccucg gcgcgggucu u 21
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>U6P.F
<400>7
tctttggaat tcaaggtcgg gcaggaagag ggccta 36
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>U6CSP45R
<400>8
tgctgccgaa gcgagcacgg tgtttcgaac tttccacaag 40
<210>9
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>U6P.R
<400>9
aaaaattcta gatgtaaaaa tagtgttgtg tgcctaggat atgtgctgcc gaagcgagca 60
c 61
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mH1.F
<400>10
tttttgaatt catgcaaatt acgcgctgtg 30
<210>11
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mH1.R
<400>11
ccaagggtcg acaaaaagat atctggatcc gtctagaccg gccgccacta taag 54
<210>12
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hLaminAC-4.H1F
<400>12
aaaggtctag accctaaaga ataagtcttc tccagctcct taaggag 47
<210>13
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>hLaminAC-4.R
<400>13
attatgtcga caaaaagaat aagtcttctc cagctcctta aggag 45
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Neo-Nde.F
<400>14
agaattccat atgtggaatg tgtgtcagtt ag 32
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Neo-Nde.R
<400>15
agaattccat atgaggtcga cggtatacag ac 32
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>biH1pro.SacI
<400>16
tttttgagct catgcaaatt acgcgctgtg 30
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>biH1pro.SpeI-2
<400>17
tttttactag ttggtctaga ccggccgcca c 31
<210>18
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>25s#4F
<400>18
cgaaaaaaag cataaggcta tgaagagata cgcctttttg gt 42
<210>19
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>25s#4R
<400>19
ctagacc aaa aaggcgtatc tcttcatagc cttatgcttt tttt 44
<210>20
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ST-UHGL3#4F
<400>20
tggaaagttc gaaaaaaagc ataaggctat gaagagatac gccttaaggc gt 52
<210>21
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ST-UHGL3#4R
<400>21
cacgggtcta gaccaaaaag cataaggcta tgaagagata cgccttaagg cgt 53
Claims (40)
1、一种靶基因用多核苷酸序列,其构成为由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列,该靶基因用多核苷酸序列对具有与元件(I)或(III)中的任一个或其中的部分序列互补的序列的RNA有RNA功能抑制活性,其中,
元件(III)包含具有与靶基因互补的序列的、连续15~30个碱基长度的多核苷酸序列,
元件(II)为0碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列(其中,0碱基表示键)或非核苷酸序列,
元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列。
2、如权利要求1所述的多核苷酸序列,其特征在于,所述元件(III)的多核苷酸序列包括DNA或RNA。
3、如权利要求1所述的多核苷酸序列,其特征在于,元件(I)或(III)至少在任一个末端或在互补序列内部缺失、取代、补加由1~数个U、T、G、C或A碱基构成的序列。
4、如权利要求1所述的多核苷酸序列,其特征在于,多核苷酸序列利用化学合成法或基因重组技术获得。
5、一种靶基因用多核苷酸序列,由序列号1或2的单链RNA构成。
6、如权利要求1所述的多核苷酸序列,其中元件(II)为核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种或是由它们组合而成。
7、如权利要求6所述的多核苷酸序列,其中元件(II)的核苷酸序列由1个碱基或1个碱基以上、不足1万个碱基的核苷酸序列构成。
8、如权利要求7所述的多核苷酸序列,其中元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至数百个碱基长度的核苷酸序列构成。
9、如权利要求8所述的多核苷酸序列,其中元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至数十个碱基长度的核苷酸序列构成。
10、如权利要求9所述的多核苷酸序列,其中元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至20个碱基长度的核苷酸序列构成。
11、如权利要求10所述的多核苷酸序列,其特征在于,元件(II)如序列号3或4所示。
12、如权利要求1所述的多核苷酸序列,其特征在于,元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、细胞质转移序列、具有诱导活性的序列、干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性、反义活性、核酶活性及转移RNA中任一种的序列或所述序列的组合构成。
13、权利要求1~12任一项所述的多核苷酸的制备方法,利用化学合成法或基因重组技术。
14、一种重组载体,是将权利要求1~12任一项所述的靶基因用多核苷酸序列***载体中而得到的。
15、如权利要求14所述的重组载体的制备方法,其特征在于,将权利要求1~12任一项所述的靶基因用多核苷酸序列***载体中。
16、一种使用权利要求1~12的靶基因用多核苷酸序列筛选药物靶基因的方法,该方法是将由连续的(I)+(II)+(III)元件构成的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入细胞或组织中,通过增减具有与所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补的序列的基因的、由单链多核苷酸序列产生的RNA功能抑制活性,确定刺激或抑制与靶基因相关的功能的化合物,
其特征在于,所述筛选方法使用选自下述方法中的任一种方法:
(a)利用直接或间接结合在该候选化合物上的标记,测定候选化合物与具有由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物(或携带由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的细胞或其膜)或其融合蛋白质的结合的方法;
(b)在标记竞争物质的存在下,测定候选化合物与导入了该单链多核苷酸序列的细胞(或携带该单链多核苷酸序列的细胞或其膜)或其融合物的结合的方法;
(c)使用适用于携带所述多肽或靶基因表达产物的细胞或细胞膜的检测体系,确定候选化合物是否利用该单链多核苷酸序列活化或抑制由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或该靶基因表达产物而产生的信号的方法;
(d)将候选化合物、与含有由靶基因编码的氨基酸序列的多肽或靶基因表达产物的溶液同时混合,调制混合物,测定该混合物中该多肽或该靶基因表达产物的活性,将该混合物的活性与标准进行比较的方法;以及
(e)检测候选化合物对细胞中产生编码由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的mRNA及由该靶基因编码的氨基酸序列的多肽的效果的方法。
17、一种药物组合物,以权利要求1~12任一项所述的靶基因用多核苷酸序列为有效成分。
18、一种药物组合物,以权利要求14所述的重组载体为有效成分。
19、一种抑制靶基因功能的方法,所述方法为将具有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入细胞或组织内,利用具有与所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补序列的基因的RNA功能抑制活性,抑制靶基因的功能;其中,
元件(III)包含具有与靶基因互补序列的、连续15~30个碱基长度的多核苷酸序列,
元件(II)为0碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列(其中,0碱基表示键)或非核苷酸序列,
元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列。
20、如权利要求19所述的抑制方法,其特征在于,由所述元件(III)的多核苷酸序列构成的核苷酸序列包括DNA或RNA。
21、如权利要求19所述的抑制方法,其特征在于,元件(I)或(III)为至少在任一个末端或在内部缺失、取代、补加由1~数个U、T、G、C或A碱基构成的序列的DNA或RNA。
22、如权利要求19所述的抑制方法,其特征在于,多核苷酸序列利用化学合成法或基因重组技术获得。
23、如权利要求19所述的抑制方法,其中,单链多核苷酸序列由序列号1或2的单链RNA构成。
24、如权利要求19所述的抑制方法,其中,元件(II)为核苷酸序列或非核苷酸序列中的任一种或由它们的组合构成。
25、如权利要求24所述的抑制方法,其中,元件(II)的核苷酸序列由1个碱基或1个碱基以上、不足1万个碱基的核苷酸序列构成。
26、如权利要求25所述的抑制方法,其中,元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至数百个碱基长度的核苷酸序列构成。
27、如权利要求26所述的抑制方法,其中,元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至数十个碱基长度的核苷酸序列构成。
28、如权利要求27所述的抑制方法,其中,元件(II)的核苷酸序列由1个碱基长度至20个碱基长度的核苷酸序列构成。
29、如权利要求28所述的抑制方法,其特征在于,元件(II)用序列号3或4表示。
30、如权利要求18所述的抑制方法,其特征在于,元件(II)的核苷酸序列或非核苷酸序列由PNA、细胞质转移序列、具有诱导活性的序列、干扰素诱导抑制序列、具有RNase抑制活性、反义活性、核酶活性及转移RNA的任一种的序列或所述序列的组合构成。
31、一种抑制靶基因蛋白质表达的方法,所述方法利用了权利要求19~30所述的抑制靶基因功能的方法。
32、一种抑制靶基因转录子活性的方法,所述方法利用了权利要求19~30所述的抑制靶基因功能的方法。
33、一种基因剔除细胞或组织、非人类基因剔除动物或基因剔除植物,是利用权利要求31或32的方法产生并培养的。
34、如权利要求33所述的基因剔除细胞或组织、非人类基因剔除动物,用于器官移植。
35、一种基因治疗剂,由权利要求17或18所述的药物组合物构成。
36、一种试验靶基因功能的方法,所述方法为将具有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入细胞、组织、非人动物或植物内,利用具有与所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补序列的基因的RNA功能抑制活性,试验靶基因的功能;其中,
元件(III)包含具有与靶基因互补序列的连续15~30个碱基长度的多核苷酸序列,
元件(II)为0碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列(其中,0碱基表示键)或非核苷酸序列,
元件(I)为包含与元件(III)互补的序列的多核苷酸序列。
37、一种检测增强靶基因功能的候选化合物的方法,所述方法包括下述步骤:
将待检化合物与细胞、组织、非人类动物或植物共同培养后,将具有连续的(I)+(II)+(III)元件的经分离或纯化的单链多核苷酸序列导入细胞、组织、非人类动物或植物内的步骤;
将具有与所述(I)或(III)元件的多核苷酸序列互补序列的基因中RNA的RNA功能抑制活性与对照组进行比较的步骤;
其中,
元件(III)包含具有与靶基因互补序列的、连续15~30个碱基长度的多核苷酸序列,
元件(II)为0碱基~1万个碱基长度的核苷酸序列(其中,0碱基表示键)或非核苷酸序列,
元件(I)为包含与元件(III)互补序列的多核苷酸序列。
38、如权利要求1~4任一项所述的靶基因用多核苷酸序列,其中,元件(III)由连接与靶基因互补的18~25个核糖核苷酸的任意种类的1~5个核糖核苷酸构成,元件(I)由与元件(III)的18~25个核苷酸互补的18~25个核糖核苷酸构成。
39、一种靶基因用核苷酸的合成方法,所述方法包括以下步骤:
(i)制作由元件(I)及元件(II)构成的单链核苷酸,使元件(II)3’末端的数个核苷酸与元件(I)或(II)的数个核苷酸互补的步骤;
(ii)使用由该元件(I)及(II)构成的单链核苷酸,利用核苷酸合成酶活性,合成元件(III)的步骤,或使用由该元件(I)及(II)构成的单链核苷酸,导入细胞内,利用存在于细胞内的所述核苷酸合成酶活性,合成元件(III)的步骤。
40、一种随机化靶基因用核苷酸,是利用权利要求39所述的方法得到的,其中,元件(I)及(III)为随机的寡核苷酸。
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