CN1635849A - 骨抗重吸收化合物 - Google Patents

骨抗重吸收化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1635849A
CN1635849A CNA028231252A CN02823125A CN1635849A CN 1635849 A CN1635849 A CN 1635849A CN A028231252 A CNA028231252 A CN A028231252A CN 02823125 A CN02823125 A CN 02823125A CN 1635849 A CN1635849 A CN 1635849A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
seq
rankl
amino acid
rank
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028231252A
Other languages
English (en)
Inventor
J·拉姆
F·P·罗斯
S·L·泰特尔鲍姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Barnes Hospital
Original Assignee
Barnes Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Barnes Hospital filed Critical Barnes Hospital
Publication of CN1635849A publication Critical patent/CN1635849A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

本发明涉及和RANK结合且含有RANKL外表面环的氨基酸序列的肽。本发明还涉及该肽的片段、类似物以及衍生物。本发明还涉及含有所述肽的组合物。本发明还包括抑制破骨细胞分化的方法、抑制骨重吸收的方法以及竞争性抑制RANKL活性的方法。本发明还提供治疗至少部分以骨质损失为特征的疾病或者症状的方法。

Description

骨抗重吸收化合物
本申请相关下述美国申请并要求其权益，此处引用作为参考：
2001年3月22日提交的美国专利60/277,855；2002年3月22日提交的美国专利10/105,057，2001年8月9日提交的美国专利60/311,163；2002年8月9日提交的美国专利10/215,446，2001年10月12日提交的美国专利60/329,231；2001年10月15日提交的美国专利60/329,393，2001年10月15日提交的美国专利60/329,360；2001年10月12日提交的美国专利60/328,876；标题为“RANKL模拟物及其使用”的美国非临时申请，Lam等人，2002年10月15日提交；标题为“筛选生骨化合物方法”的美国非临时申请、Lam等人，2002年10月15日提交。
以国立卫生研究院(NIH)的AR32788、AR46123和DE05413基金的形式，本发明部分受到政府资助。政府对本发明拥有特定权益。
发明领域
本发明涉及结合RANK的多肽，且该多肽含有一个或多个RANKL外表面环AA”、CD、EF和DE的氨基酸序列。另外本发明还包括所述多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还涉及含有上述多肽和/或其片段、类似物和衍生物的药物组合物。本发明还提供抑制破骨细胞分化的方法和通过给予有效量所述组合物竞争性抑制RANKL的方法。本发明还提供抑制骨重吸收的方法和治疗至少部分以骨质损失为特征的疾病的方法。
技术背景
表现为骨损失或骨变薄的多种疾病不断增加，已经成为严重的健康问题。据估计单骨质疏松这种疾病，就有3千万美国人受到其威胁，而全世界就有10亿人。Mundy等，科学(Science)，286：1946-1949(1999)。其它与骨损失相关的疾病包括幼年骨质疏松、成骨不全、高血钙、甲状旁腺功能亢进、骨质软化症、骨质缺乏、溶骨疾病、骨坏死、骨佩吉特(Paget’s)病、由风湿性关节炎、炎症性关节炎、骨髓炎、皮质类固醇治疗、转移性骨疾病造成的骨损失、牙周骨损失、癌症造成的骨损失、衰老相关的骨质损失和其它形式的骨质减少。另外，很多情况需要新骨形成，例如：促进骨折的骨修复或置换、骨缺陷、整形手术、牙科和其它移植及其它诸如此类的情况。
骨是致密的***的特化形式。骨基质由位于现存骨基质表面或者附近的成骨细胞形成。骨被已知为破骨细胞(一种巨噬细胞)的其它类型的细胞所吸收(侵蚀)。这些细胞分泌溶解骨无机物的酸和消化其有机成分的水解酶。因此，骨形成和重建是一个涉及成骨细胞和破骨细胞的生成和侵蚀活性进行中的相互作用的动力学过程，。Alberts等，细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell)，Garland出版社，N.Y.(第三版，1994)，pp.1182-1186。
目前批准的临床骨损失治疗药物主要是抗重吸收性质的，因其抑制骨重吸收过程。因能够抑制骨重吸收而用于或推荐用于治疗骨质疏松的药物有：***、选择性***受体调节剂(SERM)、钙、骨化三醇、降钙素(Sambrook，P等人，N.Engl.J.MED.328：1747-1753)、阿仑特罗(Saag，K等，N.Engl.J.Med.339：292-299)和其它二磷酸盐。Luckman等人，J.Bone Min.Res.13，581(1998)。不过，目前的抗重吸收药物在抑制骨吸收/重建方面产生了不好的影响或其它不利的副作用。
因此，人们渴望得到其它能够治疗骨损失疾病的化合物。最近，在骨细胞生物学领域中的一个关键性进展是发现了RANK配体(RANKL，又名为骨保护素配体(OPGL)、TNF相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)以及破骨细胞分化因子(ODF))，该配体表达在基质细胞、成骨细胞、激活的T淋巴细胞和乳腺上皮中，是巨噬细胞分化成破骨细胞所必需的独特分子。Lacey等，细胞(Cell)93：165-176(1998)(骨保护素配体是一种调节破骨细胞分化和激活的细胞因子)，RANKL的细胞表面受体是RANK( Receptor  Activatorof  Necrosis  Factor(NF)- Kappa B)。RANKL是2型跨膜蛋白质，含有少于50个氨基酸的细胞内区域、大约21个氨基酸的跨膜区域和大约240到250个氨基酸的细胞外区域。天然RANKL以跨膜和可溶性形式蛋白质存在。已知至少在小鼠、大鼠和人中存在RANKL的推定的氨基酸序列以及起其它多种变体。参见：Anderson等，美国专利6,017,729，Boyle，美国专利5,843,678，和Xu J.等人，J.BoneMin.Res.(2000/15：2178)，此处引用作为参考。另外，我们还解析了RANKL外部结构域的晶体结构，结果公布于2001年8月9日提交的美国专利申请60/311,163，和2002年8月9日提交的美国专利申请10/215,446中。
已经确认RANKL(OPGL)是一种骨重吸收的强诱导物，同时它又是破骨细胞发育的正调节子。Lacey等，见上文。它发挥破骨细胞分化和激活因子作用以外，据报道，RANKL能够诱导人树状细胞(DC)簇形成。Anderson等人，见上文及mammary epitheliumdevelopment J.Fata等人，“The osteoclast differentiation factorosteoprotegerin ligand is essential for mammary glanddevelopment”Cell，103：41-50(2000)。最近我们确证RANKL在骨形成合成代谢中具有重要作用，而且可以用于刺激成骨细胞增殖或者骨结节矿化。该结果公布于2001年3月22日提交的美国专利申请60/277,855，和2002年3月22日提交的美国专利申请10,105,057中。最近我们还确认了RANKL外部结构域的精确三维结构，并定位了和RANK相互作用的RANKL独特外表面环的氨基酸序列。该结果公布于2001年8月9日提交的美国专利申请60/311,163，和2002年8月9日提交的美国专利申请10/215,446中。
因此，鉴于现行药物治疗骨损失效果有限的现状，亟待开发治疗该类疾病的新型药物。
发明简述
因此，本发明的目标是提供含有一个或者多个RANKL外表面环AA”、CD、DE或者EF的多肽，同时该多肽具有RANK结合能力。RANKL环对应RANKL分子(SEQ ID No：：6)的部分如下所述：
AA”含有氨基酸残基170-193(SEQ ID No：2)；
CD含有的氨基酸残基224-233(SEQ ID No：3)；
DE含有的氨基酸残基245-251(SEQ ID No：4)和
EF含有的氨基酸残基261-269(SEQ ID No：5)；
含有AA”环序列部分的多肽也包括在本发明之中，并且它还包括氨基酸残基175-185(SEQ ID No：：1)。SEQ ID No：7和SEQ ID No：11的多肽是天然存在的人RANKL的AA”环的变体。二者都是人RANKL的天然变体。SEQ ID No：8、SEQ ID No：9和SEQ ID No：10分别是人RANKL的CD、DE和EF环的表面环多肽序列。
一方面，本发明包括RANK结合多肽且其由选自SEQ ID No：1-SEQ ID No：5以及SEQ ID No：7-SEQ ID No：11的序列构成。
本发明的另外目的是提供含有RANKL外表面环的且具有竞争性抑制RANKL活性的多肽。
本发明的另外目的是提供这种多肽的片段、类似物和衍生物并描述了获得上述片段、类似物和衍生物的方法。
另一方面，本发明提供了含有该多肽的药物组合物。该组合物可以进一步含有可药用的载体、辅料、增溶剂、稳定剂和/或抗氧化剂。
本发明还包括抑制破骨细胞分化的方法、竞争性抑制RANKL的方法和抑制骨重吸收的方法。这些方法包括本发明组合物的给药方法。还提供治疗至少部分以骨质损失为特征的疾病的方法。在优选的实施方案中，这些方法用于治疗骨质疏松、溶骨疾病、风湿性关节炎和骨骼转移(skeletal metastasis)。
其它目的和特征将在后面的各个部分中分别介绍。
附图简述
图1是描述通过测定TRAP的活性检测PSGSHKVTLSS肽浓度升高对破骨细胞生成的影响的图。
缩略语和定义
为了便于理解本发明，对一些术语定义如下：
此处所提到的氨基酸是20个遗传编码的L-氨基酸，按照常规缩略如下：
    氨基酸     单字母符号     三字母符号
    丙氨酸     A     Ala
    精氨本     R     Arg
    天冬酰胺     N     Asn
    天冬氨酸     D     Asp
    半胱氨酸     C     Cys
    谷氨酰胺     Q     Gln
    谷氨酸     E     Glu
    甘氨酸     G     Gly
    组氨酸     H     His
    异亮氨酸     I     Ile
    亮氨酸     L     Leu
    赖氨酸     K     Lys
    甲硫氨酸     M     Met
    苯丙氨酸     F     Phe
    脯氨酸     P     Pro
    丝氨酸     S     Ser
    苏氨酸     T     Thr
    色氨酸     W     Trp
    酪氨酸     Y     Tyr
    缬氨酸     V     Val
此处除非特殊说明，三字母符号和单字母符号缩略语所指的氨基酸不是D-构型就是L-构型。例如，Arg指的是D-精氨酸和L-精氨酸，R指的是D-精氨酸和L-精氨酸。
除非特别指出，当用一系列单字母和/或三字母缩略语表示多肽序列时，按照惯例，所示序列为从N→C方向。此处的“C”指的是氨基酸残基的α碳。为了确定上述不同肽和肽类似物的保守性氨基酸的取代情况和描述不同的肽和肽类似物，主要根据氨基酸侧链的物理化学性质，按照惯例将氨基酸分成2个主要的类别：亲水性和疏水性氨基酸。这2大类可以进一步分成能更详细定义氨基酸侧链性质的亚类。例如：亲水性氨基酸类能够进一步细分成酸性、碱性和极性氨基酸。疏水性氨基酸可以进一步细分成非极性和芳香族氨基酸。氨基酸的不同类别定义如下：
“亲水性氨基酸”指的是根据Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179：125-142的标准化疏水性检测，氨基酸疏水性少于0的氨基酸。通常亲水性编码氨基酸包括：Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)、和Arg(R)。
“酸性氨基酸”指的是侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH条件下，因为缺少氢离子一般具有负电荷侧链。通常酸性编码氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“碱性氨基酸”指的是侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸在生理pH条件下，因为具有氢离子一般具有正电荷侧链。通常碱性编码氨基酸包括His(H)和Arg(A)和Lys(L)。
“极性氨基酸”指的是侧链在生理pH条件下不带电荷的亲水性氨基酸，不过该类氨基酸至少含有一个这样的键，两个原子共享一对电子，其中更接近的原子保有该电子对。通常极性编码氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”指的是根据Eisenberg等人，1984，J.Mol.Biol.179：125-142的标准化疏水性检测，氨基酸疏水性大于0的氨基酸。通常疏水性编码氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸”指的是侧链至少含有1个芳香环或者异芳香环的疏水性氨基酸。该芳香环或者异芳香环可以含有一个或者多个取代基，如：-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NHR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，此处的R可以是分别是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基团、取代的(C5-C20)芳香基团、(C6-C26)芳香烷基、取代的(C6-C26)芳香烷基、5-20个原子的杂芳香基、取代的5-20个原子的杂芳香基、6-26个原子的杂芳香烷和取代的6-26个原子的杂芳香烷基。通常，芳香族编码氨基酸包括His(H)、Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
“非极性氨基酸”指的是侧链在生理pH条件下不带电荷的疏水性氨基酸，不过该类氨基酸含有这样的键，两个原子共享一对电子，每个原子保有该电子能力相等(即：侧链没有极性)。通常非极性编码氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸”指的是含有脂肪族碳侧链的疏水性氨基酸，通常脂肪族编码氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
“羟基取代的脂肪族氨基酸”指的是含有羟基取代基侧链的脂肪族亲水性极性氨基酸。通常羟基取代脂肪族编码氨基酸包括Ser(S)和Thr(T)。
氨基酸残基Cys(C)并不常见，它可以和其它Cys(C)残基或者含有巯基的氨基酸形成二硫桥。肽中的Cys(C)残基(以及其它具有-SH侧链的氨基酸)或者以自由-SH的形式存在或者以氧化二硫桥联的形式存在，Cys(C)残基的成键与否直接影响着肽的净疏水性或亲水性特性。根据Eisenberg等人的标准化疏水性检测(1984，见上文)，Cys(C)的疏水值为0.29。因此可以理解本发明中将Cys(C)分类为极性亲水性氨基酸，虽然常规分类如上所述。
本领域技术人员应当理解上述界定的分类并不相互排斥。因此，具有2种或者更多理化性质侧链的氨基酸可包括在多种分类中。例如：具有芳香族侧链的氨基酸可以带有极性取代基团，如：Tyr(Y)，该氨基酸同时具有芳香族疏水特性和极性或者亲水性特性。因此可以被归为芳香族和极性氨基酸。其它的例子有：His(H)的侧链属于芳香族和碱性氨基酸。本领域技术人员已熟知任何氨基酸的确切分类。不在此再详细说明。
尽管上述分类以遗传编码氨基酸进行了阐明了，取代氨基酸在某些实施方案中优选仅限于遗传编码氨基酸。事实上，所述的很多化合物可以通过合成的方式产生，它们可能含有一个或者多个常见的非编码氨基酸。因此，除了天然存在的编码氨基酸之外，可以用天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸取代结构(1)核心肽上的氨基酸残基。
本发明的化合物中某些常见氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它Ω-氨基酸，如3-氨基丙酸、2，3-二胺基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、N-甲基甘氨酸或者肌氨酸(MeGly)、鸟氨酸(Orn)、胍氨酸(Cit)、t-丁基丙氨酸(t-BuA)、t-丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环已基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、萘基丙氨酸(Nal)、4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-C1))、2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧基酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亚砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰赖氨酸(AcLys)、2，4-二氨基庚二酸(Dbu)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))、N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高丝氨酸(hSer)、羟脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和peptoid(N-取代甘氨酸)。
根据上述分类定义对遗传编码和常规非编码氨基酸进行分类，总结在后面的表3中。在本发明中，表3仅起到说明的目的，不是包罗所有氨基酸残基的列表。其它氨基酸可以在Fasman，1989，PracticalHandbook of Biochemistry和Molecular Biology，CRC Press，Inc，pp.3-70中找到，并且于此作为参考。
此处用核酸的制备方法或核酸的结构定义“重组核酸”。参考制备方法如：一种方法制备的产物，该方法采用重组核酸技术，例如：涉及人对核酸序列的干预，一般是选择或者制备。或者，将天然互不连续的2个片段融合形成核酸序列。不过不排除天然产物，如：天然存在的突变体。因此包括例如用任何非天然存在的载体转化细胞得到的产物，该载体含有用任何寡核酸合成方法得到的核酸。通常采用编码相同或者保守性氨基酸的冗余密码子置换密码子，一般还导入或者去除序列识别位点。或者，将目的功能核苷酸片段连接在一起，生产通常自然界通常不存在的目的功能重组的单个遗传实体。通常限制性酶识别位点是这种人工操作的靶点，还会一起设计包括其它特殊的靶点如：启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或者其它有用的序列。
此处的“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”是可以相互替换的，是指通过磷酸键连接在一起的至少含有2个核苷酸的核酸或者脱氧核酸组成的多聚物。
此处的“序列”指的是单体多聚物线性顺序，例如：多肽的氨基酸的顺序或者多聚核酸的核苷酸顺序。
此处的“肽”、“多肽”和“蛋白质”是可以相互替换的，指的是由肽键连接的2个或者更多氨基酸组成的化合物。
此处的“重组蛋白质”指的是含有天然或突变原始氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质是通过载有重组DNA分子的细胞基因表达得到的，而不是从天然发现该基因和/或蛋白质的细胞中得到的。换而言之，该基因对表达宿主而言是异源的。值得一提的是任何基因的置换、包括向基因中添加编码亲和纯化部分的多聚核苷酸，对于定义而言都是非天然的，这些基因不能天然存在于任何细胞中。
此处的“突变蛋白质”包括多肽的片段、衍生物和类似物。
此处的“RANK”指的是RANK蛋白质、重组RANK蛋白质、RANK融合蛋白质、上述蛋白质的类似物、衍生物和模拟物等。
此处的术语“动物”包括人类。
短语“防止或者抑制”是抑制或者减弱的影响，表现成其它形式是指与未处理相比，可观测的特性指标降低。可以采用本领域技术人员熟知的方法检测体外抑制程度。
术语“有效量”是指产生统计学显著效果的物质的量。例如：治疗应用的“有效量”是指组合物的量含有的活性化合物在骨折修复、逆转或者抑制骨质疏松症的骨质损失、防止或者推迟骨质疏松的发作、修复或者防止牙缺损、或者治疗或抑制其它骨损失症状、疾病或者缺陷的疾病等时，达到临床显著增加治愈率所要求的。所述疾病包括上述疾病，但不限定于此。可采用常规优化技术确定有效量，该剂量主要取决于所要治疗的特定症状、患者的状况、给药途径、剂型、医生的诊断以及其它本领域内技术人员熟知的因素。诱导治疗组和对照组产生统计学上显著差异的量说明所需的本发明化合物的剂量(例如，治疗骨质疏松)。骨质的差异可以看到，例如：至少1-2％、或者治疗组的骨质在临床上出现任何显著提高。其它评价治愈取得临床显著增加的指标还包括：本领域熟知的破坏强度和张力检测、破坏强度和扭转力检测、4-点弯曲度检测以及其它生化检测。通常药物治疗的指导方案是从目的疾病的动物模型试验中得到。
此处的“治疗”包括预防和治疗。即治疗一个个体时，对受到骨质损失疾病困扰的个体施用本发明化合物，防止或抑制此类症状的发生。
发明详述
根据本发明，申请人发现代表RANKL的AA″环部分的多肽通过阻止RANKL诱导破骨细胞前体的细胞分化，发挥RANKL竞争性拮抗剂的作用。而且发现破骨细胞的分化抑制作用表现出剂量依赖性。
分别提交于2001年和2002年8月9日的美国专利申请60/311,163和10/215,446确认了负责结合RANK的RANKL表面，该表面包括外表面环AA″、CD、DE和EF。RANKL的外(接触溶剂的)表面环在TNF家族中具有独特性，它表现出与众不同的长度和构型：AA″环(RANKL蛋白质的170-193残基)连接着A和A’链，CD环(224-233残基)连接着C链和D链，EF环(261-269残基)连接E链和F链，DE环(245-251残基)连接着D链和E链。与一般的TNF家族成员相比，RANKL具有更长的AA″环和更短的EF环。AA″环和CD环的排列在RANKL分子的上三分之一形成了独特的表面，反之，DE环的细微改变在RANKL分子底部形成了受体结合沟。有关RANKL环的详述和RANK/RANKL相互作用的结合特异性可以参见分别提交于2001年和2002年8月9日的美国专利申请60/311,163和10/215,446。
因此，申请人考虑抑制破骨细胞分化的含有RSNKL外表面环序列的多肽及其突变蛋白质等的应用。并且，这类多肽可以用于治疗表现至少部分骨质损失的疾病和症状。
本发明提供的多肽含有一个或多个RANKL的外表面AA″、CD、DE或者EF环，并且具有RANK结合能力。RANKL环对应的RANKL分子(SEQ ID No：6)部分介绍如下：
AA″含有氨基酸残基170-193(SEQ ID No：2)，
CD含有氨基酸残基224-233(SEQ ID No：3)，
DE含有氨基酸残基245-251(SEQ ID No：4)，和
EF含有氨基酸残基261-269(SEQ ID No：5)，
本发明描述含有AA″环序列部分的多肽，其包括氨基酸残基175-185(SEQ ID No：1)。
一方面，RANKL环对应人RANKL部分，包括SEQ ID No：7和SEQ ID No：11肽，其为天然存在的人RANKL的AA″环的变体。上述2个序列都是人RANKL的变体。SEQ ID No：8、SEQ ID No：9和SEQ ID No：10分别是人RANKL的CD环、DE环和EF环的表面环的肽序列。
另一方面，本发明包括的RANK结合肽由选自SEQ ID No：1-SEQ ID No：5和SEQ ID No：7-SEQ ID No：11的肽所组成。另外，本发明包括选自序列1-序列5和序列7-序列11中的一个或者多个多肽的串连。此外，本发明包括所述多肽的治疗性联合使用。本发明还提供含有RANKL外表面环并具有竞争性抑制RANKL的活性的肽。
显然，根据本发明，可以采用本领域技术人员常规使用的传统合成工艺合成上述多肽。例如：可以按照Sheppard等人，Journal ofChemical Society Perkin I，p.538(1981)的方法用肽自动合成仪(如：Pharmacia LKB Biotechnology公司，LKB Biolynk 4170或者Milligen、Model 9050(Millien，Millford，MA))化学合成上述肽。该操作工艺步骤是，将N，N’-二环己基碳二亚胺添加到氨基功能基团被9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸和合成的目的氨基酸酸酐中。Fmoc氨基酸酸酐用于肽合成。用二甲氨基吡啶作为催化剂，将对应于C-末端氨基酸残基的Fmoc氨基酸酸酐羧基固定在Ulrtosyn A树脂上。然后，用含有哌啶的二甲基甲酰胺洗涤树脂，并且去除C-末端氨基酸功能基团的保护基团。之后，在该C-末端氨基酸上偶联下一个对应于目的合成肽的氨基酸。然后重复去保护步骤。按照相同的步骤连续将目的氨基酸固定直到完成目的序列的肽链为止。用乙酰氨基甲基去除保护性基团，并用溶剂释放肽。
或者，可使用含有编码本发明多肽核酸的适当表达载体合成该多肽。这类DNA分子可以利用遗传密码的密码子-氨基酸关系用自动DNA序列仪制备。还可以用寡核苷酸探针和传统的杂交方法得到作为基因组DNA或者cDNA的这类DNA分子，将这类DNA分子整合到表达载体中，包括：质粒，使其适于在适当的宿主中表达该DNA和合成多肽。所述宿主有细菌，如：大肠杆菌，酵母细胞、哺乳动物细胞或者昆虫细胞。哺乳动物表达***利于糖基化，能够改善化合物的药物和/或者免疫学特性。
本发明的另一方面提供本发明的多肽的片段、类似物和衍生物。此处所用术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指以保留RANK结合活性的某种形式修饰后的化合物。只要该片段保留了RANK结合功能，该片段可以是本发明的多肽的任何一部分。可以采用本领域已知的将肽衍生成片段、类似物或者衍生物的任何技术进行修饰。这些术语，尤其是“类似物”也专门包括肽，非肽、小分子和其它作用为RANKL模拟物的可结合RANK的化合物。
本领域技术人员明白可以进行肽、多肽或者蛋白质的氨基酸序列修饰而得到等价的、可能改善的、第二代肽等，其与原始肽氨基酸序列相比，表现出等同或更优的功能特征。本发明相应包括这样修饰的氨基酸序列。修饰改变可包括但不限定于氨基酸的***、缺失、置换、截短、融合、环化、二硫键桥连、亚基序列的重排以及其它，前提是经过这样修饰的肽序列仍然保留有RANK结合能力。这类修饰可以改善化合物的半衰期、生物活性、吸收、分布、代谢、排除、毒性以及其它。进行这些改变时需要考虑的一个因素是氨基酸的疏水指数。Kyte和Doolittle对氨基酸疏水指数在蛋白质相互作用的生物功能上的重要性进行过讨论(J.Mol.Biol.，157：105-132，1982)。这很容易理解，氨基酸的相对疏水特性对最终蛋白质的二级结构具有影响。进而影响到蛋白和酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
根据其疏水性和电荷特性，每个氨基酸都被赋有一个疏水指数，其值如下：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酰氨/谷氨酸/天冬氨酸/天冬氨酸(-3.5)、赖氨酸(-3.9)、精氨酸(-4.5)。如本领域内已知，肽或蛋白质的某些氨基酸可以被其它具有相似疏水指数或疏水值的氨基酸所替换，得到的最终的肽或者蛋白质具有相似的生物学活性，即始终保持其生物学功能。进行这类改变时，优选疏水指数差异在±2之间的氨基酸彼此取代，更优选疏水指数差异在±1之间的氨基酸进行取代，最优选疏水指数差异在±0.5之间的氨基酸进行取代。
氨基酸也可以根据其亲水性进行取代，美国第4,554,101号专利公布了蛋白质最大局部亲水性平均值，该值主要受临近氨基酸的亲水性影响，并关系到蛋白质的生物学特性。下面对每个氨基酸都赋予了亲水值：精氨酸/赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰氨/谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸/组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。肽、多肽或者蛋白质上的一个氨基酸可以被具有相似亲水值的其它氨基酸所代替且仍能够得到具有相似生物学活性的最终蛋白质，即始终保留正确的生物学功能。进行这类改变时，优选亲水指数差异在±2之间的氨基酸彼此取代，更优选氨基酸的亲水指数差异在±1之间的氨基酸进行取代，最优选亲水指数差异±0.5之间的氨基酸进行取代。
如上述概述，可根据氨基酸侧链取代基团的相似性进行本发明的多肽上的氨基酸取代。例如：它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。为得到保守性氨基酸改变，考虑前述多种特性而最终得到本发明多肽的沉默改变进行的实例，可以选择氨基酸天然归属类别中的其它成员。氨基酸可以分成下面四类：(1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸和(4)中性非极性氨基酸。这几类的代表性氨基酸包括但不限于此：(1)酸性(负电荷)氨基酸，如：天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸(正电荷)如：精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸如：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰氨和谷氨酰胺；(4)中性非极性氨基酸如：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。需要提醒的是如果最终产生功能性序列，则不一定有利的改变也可能有用。
因此，本发明多肽的片段、衍生物或者类似物可以是下述例子，不过不限定于此：(i)用保守或非保守性氨基酸残基取代一个或者多个氨基酸残基，并且这些取代氨基酸残基可能是或不是遗传密码编码的氨基酸；(ii)一个或者多个氨基酸残基含有取代基团；(iii)成熟蛋白质和其它如能增加蛋白质半衰期的化合物融合的产物；(iv)该蛋白质和其它氨基酸融合，以利于纯化、检测或鉴定，或者(v)该蛋白质和其它氨基酸融合，以利于改进组织分布或令蛋白质定位于某些位置如细胞膜或者细胞外间质；或者(vi)其它分子，可能小的、非肽类分子模拟该多肽的RANK结合功能。
通过修饰多肽来改进其药物功效是本领域的标准操作。不完全影响多肽结合RANK和/或它抑制破骨细胞分化的活性，就可以对其进行修饰性改造。例如：RANKL寡聚化已经成为推迟蛋白质内化的有用技术。另外，环化也可以稳定本发明的模拟物。与此相似，已有增加多肽稳定性或其它有益特性的处理方法，如：用D-氨基酸取代L-氨基酸或PEG-加翼可用于实现本发明的RANKL模拟物。
一方面，可以向多肽序列的N-和/或C-末端中的一端或者两端添加侧翼残基。当包括时，这些侧翼残基应不显著改变核心肽结合RANK、抑制RANK/RANKL相互作用的能力。侧翼残基可以含有便于形成二硫键的半胱氨酸。因此在实施方案中，可以在本发明的多肽的每个末端含有分别小于5个氨基酸的侧翼残基。在优选的实施方案中，每个末端的侧翼残基小于3个，更优选没有侧翼残基。
这类分子可含有一定数量本领域技术人员所熟知的修饰。如：可取代酰氨连接的通常包括但不限定于下式基团：-C(O)NR-、其中R是(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基团、取代的(C5-C20)芳香基团、(C6-C26)芳香烷基、取代的(C6-C26)芳香烷基、5-20个原子的杂芳香基、取代的5-20个原子的杂芳香基、6-26个原子的杂芳香烷和取代的6-26个原子的杂芳香烷基。
酰氨连接的等电子排列体通常包括但不限定于：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-C(O)CH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。本领域的技术人员已经熟知含有非酰氨连接的化合物和制备这类化合物的方法(见，如：Spatola，March 1983，Vega Data Vol.1，Issue 3；Spatola 1983，“Peptide BackboneModifications In：Chemstry and Biochemstry of Amino Acids Peptidesand Proteins，Weinstein，de.，Marcel Dekker，New York，p.267(一般综述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1：463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14：177-185(-CH2NH-、-CH2CH2-)；Spatola等，1986，Life Sci.38：1243-1249(-CH2-S)；Hann，1982，J.Chen.Soc.PerkinTrans.I.1：307-314(-CH＝CH-，顺式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.23：1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等，Tetrahedron.Lett.23：2533(-COCH2-)；欧洲专利申请EP45665(1982)CA 97：39405(-CH(OH)CH2-)；Holladay等人，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-4404(-C(OH)CH2-)、和Hruby，1982，Life Sci 31：189-199(-CH2-S-)。
另外，可以用不会显著干预肽活性或结构的肽模拟物或者酰氨模拟部分置换一个或者多个酰氨连接。或者，所有的酰氨连接都可以用肽模拟部分置换。例如，适当的酰氨模拟物参见如Olson等人，1993，J.Med.Chem.36：3039-3049。
肽和肽类似物可选在一端或者两端含有1到5个氨基酸残基或者更长一点的肽或者肽类似物。肽类似物一般含有至少一个修饰的中间连接，如上述的取代的酰氨或者酰氨的等电子体。这些额外的肽或者肽类似物可具有来自RANKL其它部分的氨基酸序列或者完全随机的序列。肽中的这些随机序列可以用于检测生物活性，即它们结合RANK的能力。
通过分析目的化合物和RANK结合等方法检测RANK结合化合物。一方面，令所述化合物和RANK相接触以测定其解离率。在本领域中已有多种进行结合分析的方法。如通过确认化合物和RANK的结合能力的指标解离率并且利用本领域早已建立的结合活性和解离活性之间的相互关系。
例如：可以用如125I放射物标记的参照化合物、肽或蛋白质，如：RANKL或其分离的外表面环等，并用RANK在1.5ml管中共同孵育。将被检化合物添加到这些反应物中，并逐步增加其浓度。经过适当孵育后，分离RANK/化合物的复合物，如采用层析柱，并用γ计数器测定结合有125I标记的肽。确定被检化合物抑制50％参照肽的结合的所需量。测定的值规算成未标记的参照肽结合的浓度(相对的抑制浓度(RIC)-1＝浓度检测/浓度参照)。小的RIC-1值表明相对强的结合。反之，大的RIC-1值表明相对弱的结合。见，例如：Latek等，Proc.Natl.Acad.Sci/USA，Vol.97，No.21，pp.11460-11465，2000。当然，高通量结合分析如PerkinElmer、Actelion及其它公司提供的商业服务同样适合检测化合物的结合性。
用和N-末端-NH2或者C-末端-C(O)OH发生反应的物质对肽和肽类似进行封闭，这类N-和/或C-末端“封闭”形式的肽和肽类似也包括在本发明范围内。这种封闭化合物一般在N-末端乙酰化和/或者C-末端酰氨化或酯化。通常N-末端封闭基团包括：R1C(O)-、其中R1是氢原子、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳香基团、(C6-C26)芳香烷基团、5-20个原子的杂芳香基团、或6-26个原子的杂芳香烷基团。优选N-末端封闭基团包括：乙酰基、甲酰和丹酰。一般C-末端封闭基团包括：-C(O)NR1R1和-C(O)OR1，其中每个R1分别如上面的定义。优选的C-末端封闭基团包括其R1分别为(C1-C6)烷基、优选甲基、乙基、丙基或异丙基的那些。
在本发明优选的实施方案中，根据所述筛选方法确定化合物，通过给予含有上述化合物的组合物提供了防止或抑制骨损失的方法，抑制破骨细胞分化的方法、竞争性抑制RANKL活性的方法。通过对有需要的个体提供有效量的骨形成组合物而使用本发明的该组合物。该方法和组合物可用于治疗以骨质损失或变薄为特征的疾病或症状。这些疾病和症状包括：骨质疏松、幼年骨质疏松、成骨不全、高血钙、甲状旁腺功能亢进、骨质软化症、骨质缺乏、溶骨疾病、骨坏死、骨佩吉特氏病、由风湿性关节炎、炎症性关节炎、骨髓炎、皮质类固醇治疗、转移性骨疾病造成的骨损失、牙周骨损失、癌症造成的骨损失、衰老相关的骨质损失和其它形式的骨质减少。在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗骨质疏松、溶骨疾病、由于类风湿性关节炎和骨骼转移造成的骨损失。
为了用于动物个体治疗，本发明的组合物可以制成药用或者兽医用组合物。根据要进行治疗的个体、给药的模式和所需治疗类型如：防止、预防、治疗，可将该组合物制备成满足上述参数的制剂。其技术可参考Remington的制药科学(Pharmaceutical Sciences)，最后一版，Mack出版公司，Easton，PA。
进行本发明组合物给药时，可以调节下述多种给药参数对其进行药动学和药效学控制。这些参数包括：给药的频率、剂量、间隔模式、途径。可以通过对给药剂量、间隔时间和模式的不同控制达到所要求的活性。
为了对动物或人个体进行给药，本发明化合物的剂量一般为0.01-100mg/kg。不过，剂量水平主要取决于疾病或者状况的天然状态、患者状况、医生的判断以及给药的频率和模式。如果采用口服给药，物质吸收将是影响生物利用度的因素。低吸收将造成胃肠道药物浓度高，并且需要采用更高剂量。
这是可以理解的，物质的适宜剂量经过相应的动物模型检测评价的，在适合的可接受的动物模型中可得到有效量水平(如：ED50)和毒性剂量水平(如：TD50)以及致死剂量水平(如：LD50或者LD10)。而且，如果一个物质在动物检测中证明有效，将开始进行临床试验。
通常用于治疗时，本发明的化合物可单独或联合其它组合物治疗骨损失。这些组合物含有抗重吸收物质，如：二磷酸盐、降钙素、***、SERM’s和钙源或骨形成补充剂，如甲状旁腺激素或它的衍生物、骨形态发生蛋白质、成骨素、NaF或者抑制素。参见参考文献美国专利6,080,779。根据给药模式、化合物可制成适合的组合物。
本发明的药物可制备成适当的***给药或局部或定位给药的剂型。***给药剂型包括不过不限定于，如用于注射(例如，肌肉、静脉内或者皮下注射)或者可以制备成用于透皮、透粘膜、鼻部或者口服给药的剂型。剂型通常包括稀释液，某些情况下，还有辅料、缓冲剂，防腐剂等。
用于口服给药时，该组合物可以以脂质体组合物或者微乳化剂的形式给药。相应的形式包括在本领域内熟知的：糖浆、胶囊、片剂。用于注射时，剂型可以制备成传统的液体、悬液、适于在注射前溶解或重悬在液体中的固体，或制成乳状液。适当的赋形剂包括例如：水、盐水、葡萄糖、甘油等。这类组合物可以含有一定量非毒性辅助物，如：湿润或者乳化剂、pH缓冲剂等，例如：醋酸钠、山梨聚糖单月桂酸酯及其它。
本发明的组合物可用于对患者局部定位给药，患者包括人和其它脊椎动物，如：家用动物、鼠和家畜类。对需要减少骨损失和/或者增加骨质量的位点，可以使用本领域内技术人员所熟知的多种技术形式。例如，喷雾、洗液、凝胶、或其它载体如：醇、聚乙二醇、酯类、油和硅酮。需要局部用药的情况包括：例如：骨折、修复缺陷或损伤骨复位。另外，还可以将抗重吸收药物加到适当的载体中，对自体移植物、异种移植物、假体和天然骨的结合处进行给药，以辅助移植物或假体和天然骨的结合。
本发明的其它实施方案涉及到采用RANKL环竞争性结合的分析来筛选RANKL的抑制剂。用前面介绍的目的化合物和RANK结合分析进行RANK的结合检测。一方面，令被检化合物和RANK接触并测定其解离率。已知本领域中有多种方法可用于结合分析。测定化合物和RANK结合能力的指标，如：用本领域已经成熟建立的解离率，并将结合活性和解离率相互关联。例如：可通过放射性标记参照化合物进行检测，如：用带有125I的SEQ ID NO：1的AA″环序列部分的多肽和RANK在1.5ml的管中孵育，以增加的浓度将检测化合物加入这些反应中。经过适当孵育后，分离RANK/化合物复合物，如：用层析柱，并用γ计数器评价结合的125I标记的肽。检测化合物抑制50％参照肽的结合的必需量。将该值规算成未标记参照肽的结合浓度(相对抑制浓度(RIC)-1＝浓度检测/浓度参照)。小的RIC-1值表明相对强的结合。反之，大的RIC-1值表明相对弱的结合，例如：Latek等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，No.21，pp.11460-11465，2000。在这些分析中，可单独或者联合采用SEQ ID No：2-5确认的RANKL环或其片段作为参照化合物。另外，涉及一个或者多个RANKL环时，也可以采用高通量分析的方法进行结合分析。
另外，本发明的目标和优点在本领域中是显而易见的。此处所作出的解释和阐述目的是使其它领域的技术人员了解本发明的原则和应用。本领域的技术人员能够接受并应用多种形式本发明。同时可能非常适合某些特殊需要。因此，本发明所述的特定实施方案，不能完全包括或者限定本发明。
此处实施例所列举的所有的出版物和专利申请一并作为参考文献，每一个出版物或者专利应用又可以单独作为参考文献。
下面的例子阐述了本发明，不过不能完全阐述本发明的各个方面。
实施例
实施例1
RANKL的部分AA″环多肽对TRAP活性的作用效果。野生型C3H/HENJ小鼠购自Harlan Industries(Indianapolis，IN)。为了建立破骨细胞前体细胞培养，从4到6周龄小鼠的全骨髓中分离得到骨髓巨噬细胞(BMM)，并在37℃的含5％CO2的组织培养箱中培养。培养24小时后，收集非粘附的细胞，并置于Ficoll Hypaque梯度，收集梯度界面上的细胞。按照65000/cm2，将细胞重新置于α-最小基本培养基中，其补充有10％热灭活的胎牛血清，在重组鼠M-CSF(10ng.ml)存在下，于37℃，5％CO2的孵箱中培养。该细胞培养物或者用递增浓度的SEQ ID No：1的多肽(AA环的子部分)进行处理，或者用和检测化合物具有相同分子量的阴性对照拼凑(scrambled)肽进行处理。
图1展示了该试验的结果。如该图显示，通过酒石酸特异性酸性磷酸酶(TRAP)检测可以看到，向破骨细胞前体中添加的检测化合物竞争性抑制RANKL诱导破骨细胞分化的能力。上述磷酸酶是一种破骨细胞特异的酶，并且它的活性对应于破骨细胞的分化。测定该酶在生色反应中切割底物的能力以检测TRAP活性。
从图1中同样可以看到，破骨细胞分化抑制呈剂量依赖性。即随着培养物中被检化合物浓度的增加，TRAP的活性被降低。同时，阴性对照肽对TRAP活性没有影响。
                                序 列 表
<110>Lam，Jonathan
     Ross，F.Patrick
     Teitelbaum，Steven
<120>骨抗重吸收肽
<130>BJCH 10079
<160>611
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>1
Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser
1               5                   10
<210>2
<211>24
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>2
Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser
1               5                   10                  15
Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala
            20
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>3
His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp
1               5                   10
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>4
Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>5
Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe
1               5
<210>6
<211>316
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>6
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro
            20                  25                  30
Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser
        35                  40                  45
Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser
    50                  55                  60
Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu
                85                  90                  95
Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro
            100                 105                 110
Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys
        115                 120                 125
Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala
    130                 135                 140
Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu
145                 150                 155                 160
Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser
                165                 170                 175
Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp
            180                 185                 190
Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn
        195                 200                 205
Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His
    210                 215                 220
Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr
225                 230                 235                 240
Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys
                245                 250                 255
Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr
            260                 265                 270
Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile
        275                 280                 285
Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala
    290                 295                 300
Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp
305                 310                 315
<210>7
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>7
Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser
1               5                   10                  15
Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala
            20
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>8
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu
1               5                   10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>9
Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>10
Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe
1               5
<210>11
<211>24
<212>PRT
<213>人
<400>11
Asn Ala Thr Asp Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser
1               5                   10                  15
Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Gly
            20

Claims (25)

1.分离的多肽，含有一个或者多个选自SEQ ID No：1-SEQ IDNo：5和SEQ ID No：7-SEQ ID No：11的氨基酸序列，该多肽具有RANK结合能力。
2.权利要求1的多肽，具有保守性或非保守性修饰并仍具有结合RANK的能力。
3.多肽，含有涉及结合RANK的RANKL序列，其中所述序列基本由一个或者多个选自SEQ ID No：1-SEQ ID No：5和SEQ IDNo：7-SEQ ID No：11的氨基酸序列构成，并且所述多肽具有结合RANK的能力。
4.权利要求3的多肽，其具有保守性或者非保守性修饰并且具有抑制RANKL结合RANK的能力。
5.一个非RANKL的多肽，含有一个或者多个RANKL的外表面环，所述多肽具有结合RANK的能力。
6.多肽，包含一个或者多个RANKL外表面环，所述多肽具有竞争性抑制RANKL同RANK结合的活性。
7.权利要求1的多肽，其中基本由选自SEQ ID No：1-SEQ IDNo：5和SEQ ID No：7-SEQ ID No：11的氨基酸序列构成。
8.包含权利要求1、2、3、4、5、6或者7的多肽的片段、类似物、模拟物或者衍生物的化合物，所述化合物具有结合RANK的能力。
9.药物组合物，其在可药用的载体、辅料、助溶剂、稳定剂和/或者抗氧化剂中包含有效量的权利要求1、2、3、4、5、6、7的多肽。
10.药物组合物，其在可药用的载体、辅料、助溶剂、稳定剂和/或者抗氧化剂中包含有效量的权利要求8的化合物。
11.抑制破骨细胞分化的方法，包括给予有效量的权利要求9的药物组合物。
12.抑制骨重吸收的方法，包括给予有效量的权利要求9的药物组合物。
13.竞争性抑制RANKL的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求1-8的化合物。
14.竞争性抑制RANKL的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求9的药物组合物。
15.治疗选自骨质疏松、幼年骨质疏松、成骨不全、高血钙、甲状旁腺功能亢进、骨质软化症、骨质缺乏、溶骨疾病、骨坏死、骨佩吉特病、由风湿性关节炎、炎症性关节炎、骨髓炎、皮质类固醇治疗、转移性骨疾病造成的骨损失、牙周骨损失、癌症造成的骨损失、衰老相关的骨质损失和其它形式的骨质减少等疾病或症状的方法，其中所述方法包括给予有效量的权利要求9的药物组合物。
16.权利要求15的方法，其中该疾病或症状包括骨质疏松、溶骨疾病、风湿性关节炎和骨骼性转移。
17.多肽，包含(a)涉及结合RANK的RANKL序列，其中所述序列基本由至少一个选自SEQ ID No：1-SEQ ID No：5和SEQ IDNo：7-SEQ ID No：11的氨基酸序列构成，并且所述多肽具有RANK结合能力；及(b)另外的氨基酸残基，其在所述序列两侧翼而不消除该序列结合RANK的能力。
18.权利要求1的多肽，具有一个或者多个下述修饰：
(i)其中用保守或者非保守的氨基酸残基取代该多肽的一个或者多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基能或者不能被遗传密码所编码；
(ii)其中一个或者多个氨基酸残基包含取代基的修饰；
(iii)其中该多肽和其它化合物融合的修饰，如增加该蛋白质半衰期的化合物；
(iv)其中附加氨基酸融合于该多肽以助于纯化或者检测和鉴定的修饰；或者
(v)其中附加氨基酸残基融合于该多肽以助于改变该蛋白质的组织分布或者对特定位点如细胞膜或者胞外区室定位的修饰。
19.筛选RANKL结合化合物的方法，所述方法包括对被检化合物、参考化合物同RANK之间进行结合分析，其中所述参考化合物基本由选自SEQ ID No：1-SEQ ID No：5和SEQ ID No：7-SEQ IDNo：11的至少一个序列构成。
20.编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
21.权利要求20的多核苷酸，其根据遗传密码简并性表现出规则的简并性。
22.编码权利要求20的多肽的多核苷酸，其显示对权利要求1多肽的保守性取代。
23.包含权利要求20、21或者22的多核苷酸的表达载体。
24.包含权利要求23的表达载体的宿主细胞。
25.权利要求15的治疗疾病的方法，包括给予需治疗的个体有效量的一种或者多种药物组合物以增强其骨生长。
CNA028231252A 2001-10-15 2002-10-15 骨抗重吸收化合物 Pending CN1635849A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32936001P 2001-10-15 2001-10-15
US60/329,360 2001-10-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1635849A true CN1635849A (zh) 2005-07-06

Family

ID=23285025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028231252A Pending CN1635849A (zh) 2001-10-15 2002-10-15 骨抗重吸收化合物

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1572891A2 (zh)
JP (1) JP2005514919A (zh)
CN (1) CN1635849A (zh)
CA (1) CA2463925A1 (zh)
IL (1) IL161386A0 (zh)
MX (1) MXPA04003527A (zh)
WO (1) WO2003033664A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108064231A (zh) * 2015-05-20 2018-05-22 国立大学法人大阪大学 具有炎性细胞因子分泌抑制活性的寡肽
CN108329391A (zh) * 2011-05-27 2018-07-27 埃博灵克斯股份有限公司 使用rankl结合肽抑制骨质吸收

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7381792B2 (en) 2002-01-04 2008-06-03 Xencor, Inc. Variants of RANKL protein
CA2472049A1 (en) 2002-01-04 2003-07-17 Xencor Dominant negative proteins and methods thereof
WO2006024096A1 (en) * 2004-08-31 2006-03-09 Chemgenex Pharmaceuticals Limited Method for modulating osteoclastogenesis
FR2883873B1 (fr) 2005-03-31 2009-07-10 Pharmamens Sarl Inhibiteurs d'age
WO2018084311A1 (ja) * 2016-11-07 2018-05-11 国立大学法人大阪大学 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108329391A (zh) * 2011-05-27 2018-07-27 埃博灵克斯股份有限公司 使用rankl结合肽抑制骨质吸收
CN108064231A (zh) * 2015-05-20 2018-05-22 国立大学法人大阪大学 具有炎性细胞因子分泌抑制活性的寡肽

Also Published As

Publication number Publication date
CA2463925A1 (en) 2003-04-24
WO2003033664A2 (en) 2003-04-24
JP2005514919A (ja) 2005-05-26
MXPA04003527A (es) 2005-06-20
IL161386A0 (en) 2004-09-27
EP1572891A2 (en) 2005-09-14
WO2003033664A9 (en) 2013-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101035806A (zh) 新的糊精家族多肽－6（afp－6）类似物和制备和使用它们的方法
CN1057118C (zh) 重组的c140受体
CN1635849A (zh) 骨抗重吸收化合物
CN1917898A (zh) 用于治疗非典型肺部感染的血管活性肠肽的生物活性物质
CN1675241A (zh) 免疫偶联物
CN1308346C (zh) 新型人磷脂酰乙醇胺结合蛋白，其编码序列及用途
CN1216910C (zh) 新的肝再生相关蛋白、其编码序列及用途
CN1506375A (zh) 具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白及其用途和含有其的药物组合物
CN1296974A (zh) 一种新的多肽——人组蛋白h2a.21和编码这种多肽的多核苷酸
CN1769299A (zh) 一种新型融合蛋白的制造及应用
CN1386855A (zh) 一种多肽——锌金属内切酶－41.25和编码这种多肽的多核苷酸
AU2002348445A1 (en) Bone anti-resorptive compounds
CN1297913A (zh) 一种新的多肽——人质膜转运识别蛋白25和编码这种多肽的多核苷酸
CN1407102A (zh) 一种多肽——顺乌头酸酶－10.57和编码这种多肽的多核苷酸
CN1301861A (zh) 一种新的多肽——γ－谷氨酰转肽酶9和编码这种多肽的多核苷酸
CN1493690A (zh) 一种多肽－人蛋白质代谢酶29和编码这种多肽的多核苷酸
CN1316515A (zh) 一种人肝癌相关抑癌蛋白及其编码序列
CN1272542A (zh) 一种人蛋白磷酸聚糖蛋白及其编码序列
CN1393473A (zh) 一种多肽——佛波酯/二酰甘油蛋白－9.57和编码这种多肽的多核苷酸
CN1339486A (zh) 一种新的多肽——人萌发蛋白36.85和编码这种多肽的多核苷酸
CN1342768A (zh) 一种新的多肽——二肽基肽酶iv蛋白27.5和编码这种多肽的多核苷酸
CN1465587A (zh) 一种多肽——线粒体载体18和编码这种多肽的多核苷酸
CN1269415A (zh) 一种新的人硫氧化还原蛋白相关蛋白及其编码序列
CN1297906A (zh) 一种新的多肽——人细胞凋亡相关蛋白22和编码这种多肽的多核苷酸
CN1343687A (zh) 一种新的多肽——转运蛋白17.05和编码这种多肽的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication