CN1630721A

CN1630721A - 人凝血因子vii变体

Info

Publication number: CN1630721A
Application number: CNA018156045A
Authority: CN
Inventors: 埃贡·珀森; 奥利·H·奥尔森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2005-06-22
Anticipated expiration: 2021-09-13
Also published as: NO20031129D0; CA2420892A1; KR20030067669A; RU2326126C2; US7026524B2; ES2429523T3; US20030100740A1; KR100882482B1; NO331251B1; ZA200301610B; NO20031129L; US20030104978A1; CN101486761A; BR0113854A; CZ2003611A3; MXPA03001984A; US7695935B2; CN100475959C; US20060252129A1; US7176288B2

Abstract

本发明涉及具有凝血活性的新的人凝血因子VIIa变体及编码所述变体的核酸构建物，包含并表达该核酸的载体和宿主细胞，药物组合物、用途以及治疗方法。

Description

人凝血因子VII变体

发明领域

本发明涉及具有凝血活性的新的人凝血因子VIIa变体及编码这类变体的核酸构建物、包含并表达该核酸的载体和宿主细胞，药物组合物、用途以及治疗方法。

血液凝固是由一系列不同血液成分(或因子)的复杂相互作用组成、并最终产生纤凝块的过程。通常，血液中参与所谓凝血“级联”反应的成分，是在激活剂(它本身是活化的凝血因子)的作用下转变为蛋白水解酶的酶学无活性蛋白质(酶原(proenzymes或者zymogens))。已经历这种转变的凝血因子一般被称为“活性凝血因子”，并在凝血因子名称后添加字母“a”表示(例如凝血因子VIIa)。

止血过程的引发是由缘于血管壁损伤而暴露的组织凝血因子和凝血因子VIIa之间复合物形成而介导的。然后，复合物将凝血因子IX和X转化为其活性形式。在产生组织凝血因子的细胞上，凝血因子Xa把有限量的凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶激活血小板和凝血因子V和VIII使之成为Va和VIIIa，后两种是进一步的过程中导致全部凝血酶爆发的辅凝血因子。此过程包括通过凝血因子IXa(与凝血因子VIIIa构成复合物形式)产生凝血因子Xa，并发生在活化的血小板表面。最终凝血酶将纤维蛋白原转化为导致纤维蛋白凝块形成的纤维蛋白。近年来，凝血因子VII和组织凝血因子已被认为是血液凝固的主要引发剂。

凝血因子VII是以单链酶原形式在血液中循环的痕量血浆糖蛋白。此酶原无催化活性。单链凝血因子VII可以在体外被凝血因子Xa、凝血因子XIIa、凝血因子IXa、凝血因子VIIa或凝血酶转变为双链凝血因子VIIa。认为凝血因子Xa是凝血因子VII的主要生理性激活剂。象其它几种参与止血过程的血浆蛋白一样，凝血因子VII的活性依赖于维生素K，这是簇集在蛋白质氨基末端附近的多谷氨酸残基的γ-羧化作用所需要的。这些γ-羧化的谷氨酸是金属离子-诱导的凝血因子VII与磷脂相互作用所需要的。酶原凝血因子VII向激活的双链分子的转化，通过裂解内部的Arg₁₅₂-IIe₁₅₃肽键而完成。在组织凝血因子、磷脂和钙离子的存在下，双链凝血因子VIIa通过有限量的蛋白酶解迅速地激活凝血因子X或凝血因子IX。

经常期望刺激或改善个体的凝血级联反应。凝血因子VIIa已被用于控制具有数种原因的出血病症，所述原因如凝血因子缺乏(例如例如血友病A和B或者凝血因子XI或VII缺乏)或凝血因子抑制剂。凝血因子VIIa也已被用于控制具有正常机能血液凝固级联反应(没有凝血因子缺乏或者针对任一凝血因子的抑制剂)的主体的大量出血。出血可以例如由血小板功能缺陷、血小板减少症或者冯维勒布兰德氏病(von Willebrand′s disease)引起。出血也是与手术及其它形式组织损伤有关的主要问题。

欧洲专利200,421(ZymoGenetics)涉及编码人凝血因子VII的核苷酸序列以及凝血因子VII在哺乳动物细胞中的重组表达。

Dickinson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，14379-14384)涉及凝血因子VII变体，其中Lys 157、Val 158、Glu 296、Met 298、Asp 334、Ser336或者Lys 337已经分别被Ala替代。

Iwanaga等(Thromb.Haemost.(supplement August 1999)，466，abstract1474)涉及FVIIa变体，其中残基316-320被删除或者残基311-322被来自胰蛋白酶的相应残基取代。

然而，仍需要具有凝血活性的凝血因子VIIa变体、具有高活性的可以以相对低剂量施用的变体，和不产生与传统治疗有关的不希望的副作用(如分别出现凝血***的全身性激活和出血)的变体。

发明描述

本发明提供具有凝血活性的凝血因子VIIa多肽。

第一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的157位Lys的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala 157)。

第二方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala337)。

第三方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala334)。

另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala336)。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala158)。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala296)。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1中298位的Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代；前提是变体不是FVII(Ala298)。

还一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的一个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met；前提是，变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

另一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的两个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的三个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的四个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的五个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

再一方面，本发明提供包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中独立地选自下组的6个氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

再一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽，其中下组的氨基酸已被不同的氨基酸替代：SEQ ID NO：1中的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

还一方面，本发明提供凝血因子VII变体，其中下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；且，任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代；前提是，变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

本文所用术语“FVII(Ala157)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中157位的Lys已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala337)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中337位的Lys已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala334)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中334位的Asp已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala336)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中336位的Ser已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala158)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中158位的Val已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala296)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中296位的Glu已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

本文所用术语“FVII(Ala298)”，是指具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII变体，其中SEQ ID NO：1中298位的Met已被丙氨酸替代。该术语不包括例如下述凝血因子VII变体，在该VII变体中，SEQ ID NO：1的两个或更多氨基酸已被不同氨基酸替代。

另一方面，本发明涉及编码本发明凝血因子VII多肽的核酸构建物。

另一方面，本发明提供包含编码凝血因子VII变体的核苷酸序列的核酸构建物。

另一方面，本发明提供包含编码FVIIa变体的核酸构建物的重组载体。

另一方面，本发明提供包含编码所述核酸构建物或载体的重组宿主细胞。

另一方面，本发明提供包含并表达所述核酸构建物的转基因动物。

另一方面，本发明提供包含并表达所述核酸构建物的转基因植物。

再一个方面，本发明涉及生产本发明凝血因子VII多肽的方法，方法包括：在使得核酸构建物表达的条件下、在适当生长培养基中培养包含核酸构建物的细胞，并从培养介质中回收产生的多肽。

再一个方面，本发明提供生产本发明凝血因子VII变体的方法，方法包括：在使得核酸构建物表达的条件下、在适当生长培养基中培养包含该核酸构建物的细胞，并从培养介质中回收产生的变体。

此外一个方面，本发明涉及生产凝血因子VII多肽的方法，方法包括从转基因动物产生的乳汁中回收多肽。

再一方面，本发明提供生产凝血因子VII变体的方法，方法包括从转基因动物产生的乳汁中回收变体。

还一方面，本发明涉及生产本发明凝血因子VII多肽的方法，方法包括：培养包含核酸构建物的转基因植物细胞，并从产生的植物中回收多肽。

还一方面，本发明提供生产凝血因子VII变体的方法，方法包括：培养包含核酸构建物的转基因植物细胞，并从产生的植物中回收变体。

还有一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的157位Glu的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还有一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的337位lys的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还有一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还有一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还一方面，本发明提供包括凝血因子VII变体及任选地可药用载体的药物组合物，其中所述变体中属于下组的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；并任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的157位Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还一方面，本发明提供凝血因子VII变体用于制备治疗出血性事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，所述凝血因子VII变体中，下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；且任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的157位Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

再一方面，本发明涉及治疗患者出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的包含SEQ ID NO：1氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体中，至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同的氨基酸替代。

还一方面，本发明提供治疗出血性事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的凝血因子VII变体，该凝血因子VII变体中，下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；且任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代。

还一方面，本发明提供包括凝血因子VII变体并任选包含可药用载体的药物组合物，该凝血因子VII变体中，下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代；前提是，变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

还一方面，本发明提供凝血因子VII变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，在该凝血因子VII变体中，下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代；前提是，变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

还一方面，本发明提供治疗或预防患者出血病症或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的患者施用治疗或预防有效量的凝血因子VII变体，该凝血因子VII变体中，下组中的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代：SEQ ID NO：1中的157位残基Lys、337位残基Lys、334位残基Asp、336位残基Ser、158位残基Val、296位残基Glu和298位残基Met；任选地，其中蛋白酶结构域的其余位置的一个或多个其它的氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的氨基酸残基替代。前提是，变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

在本发明的一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1157位的Lys已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1337位的Lys已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中334位的Asp已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中336位的Ser已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中158位的Val已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中296位的Glu已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中298位的Met已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中在蛋白酶结构域的其余位置上的至少一个氨基酸已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中在蛋白酶结构域的其余位置上的至多20个其它氨基酸已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，其中相当于选自SEQ ID NO：1中159-170位的至少一个氨基酸已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血凝血因子VIIVII多肽是一多肽，其中相当于选自SEQ ID NO：1中290-312位的至少一个氨基酸已被不同的氨基酸替代。

在本发明的另一实施方案中，凝血凝血因子VIIVII多肽是一多肽，其中相当于选自SEQ ID NO：1中330-339位的至少一个氨基酸已被不同氨基酸替代。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1157位所述Lys已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1中337位所述Lys已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1334位所述Asp已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Gly和Glu。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1336位所述Ser已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Gly和Glu。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1158位所述Val已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1296位所述Glu已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Arg、Lys和Val。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中SEQ ID NO：1298位所述Met已被选自下组的氨基酸替代的多肽：Lys、Arg、Gln和Asn。

本发明的另一实施方案中，凝血因子VII多肽是其中氨基酸已被由核酸构建物编码的不同氨基酸替代的多肽。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VII。

本发明另一实施方案中，凝血因子VII多肽是一多肽，所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa。

本发明的另一实施方案，凝血因子VII多肽是独立地选自下组的多肽：[E296V]-FVII、[M298Q]-FVII和[S336G]-FVII。

本发明的另一实施方案，凝血因子VII多肽是独立地选自下组的多肽：[V158T/M298Q]-FVII、[E296V/M298Q]-FVII，[V158D/E296V]-FVII、V158D/M298Q]-FVII和[V158D/M298K]-FVII。

本发明的另一实施方案，凝血因子VII多肽是[V158D/E296V/M298Q]-FVII。

本发明的另一实施方案，凝血因子VII多肽是[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII。

在另一实施方案中，凝血因子VII变体下述变体：其中SEQ ID NO：1157位Lys残基、337位Lys残基、334位Asp残基、336位Ser残基、158位Val残基、296位Glu残基、298位Met残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代，以及任选地，在蛋白酶结构域的其余位置的其它氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的其它氨基酸残基替代；前提是，所述变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

在一实施方案中，凝血因子VII变体下述变体：其中SEQ ID NO：1157位Lys残基、337位Lys残基、334位Asp残基、336位Ser残基、158位Val残基、296位Glu残基、298位Met残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代；前提是，所述变体不是FVII(Ala157)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基和337位Lys残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基、158位Val残基、296位Glu残基和298位Met残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基以及一个或多个选自158位Val残基、296位Glu残基和298位Met残基的残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基、334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基以及334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 337位Lys残基、158位Val残基、296位Glu残基和298位Met残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 337位Lys残基以及一个或多个选自158位Val残基、296位Glu残基和298位Met残基的残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 337位Lys残基、334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 337位Lys残基以及一个或多个选自334位Asp残基和336位Ser残基的残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 158位Vals残基、296位Glu残基和298位Met残基中的一个或多个以及334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 157位Lys残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 337位Lys残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 158位Val残基、296位Glu残基和298位Met残基中的一个或多个已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，SEQ ID NO：1 334位Asp残基和336位Ser残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，157位Lys残基已被Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu替代；和/或337位Lys残基已被Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu替代；和/或158位Val残基已被Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu替代；和/或296位Glu残基已被Arg、Lys或Val替代；和/或298位Met残基已被Arg、Lys、Gln或Asn替代；和/或334位Asp残基已被Glu替代；和/或336位Ser残基已被Gly替代。

在另一实施方案中，157位Lys残基或337位Lys残基或334位Asp残基或336位Ser残基是唯一已被替换的氨基酸残基。

在另一实施方案中，158位Val残基和296位Glu残基以及298位Met残基是唯一已被替换的氨基酸残基。

在另一实施方案中，在本文定义的“体外水解测定”中测试时，本发明变体的活性与SEQ ID NO：1所示天然凝血因子VII多肽的活性之比值是至少约1.25。在另一实施方案中，比值是至少约2.0；另一实施方案中，是至少约4.0。

另一实施方案中，蛋白酶结构域的312位Gln残基没有被替换。

在另一实施方案中，重组宿主细胞是哺乳动物来源的细胞。在另一实施方案中，细胞选自CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞。

在另一实施方案中，在蛋白酶结构域(位置153-406)的其余位置中至多20个其它氨基酸残基被替代。在一实施方案中，至多15个其它氨基酸残基被替代；在另一实施方案中，至多10个氨基酸残基被替代；在另一实施方案中，至多5个氨基酸残基被替代。

在另一实施方案中，157、337、158、296、298、334或336位的一个或多个氨基酸残基是唯一已被替代的氨基酸残基。

在另一实施方案中，157位和337位Lys残基中的一个或两个已被中性氨基酸残基替代，或者所述残基之一已被一个带负电荷的氨基酸残基替代，或者一个Lys残基已被一个中性氨基酸残基替代而另一个Lys残基已被一个带负电荷的氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或两个已被能够形成氢键和/或能够形成盐桥的氨基酸残基替代，或者所述残基之一或两个所述残基被小的氨基酸残基替代。

在另一实施方案中，157位Lys残基和/或337位Lys残基是仅有的已被替代的氨基酸残基。在一实施方案中，157位Lys残基已被替代。在另一实施方案中，337位Lys残基已被替代。

在另一实施方案中，158位Val残基和/或298位Met残基是仅有的已被替代的氨基酸残基。

在另一实施方案中，334位Asp残基和/或336位Ser残基是仅有的已被替代的氨基酸残基。

在另一实施方案中，157位Lys残基已被选自下列的氨基酸残基替代：Val、Leu、IIe、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Arg、His、Asp和Gln。在另一实施方案中，157残基位已被选自下组的氨基酸残基替代：Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

在另一实施方案中，337位Lys残基已被选自下列的氨基酸残基替代：Val、Leu、IIe、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Arg、His、Asp或Gln。在另一实施方案中，337位Lys残基已被选自下组的氨基酸残基替代：Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp或Glu。

在另一实施方案中，158位Val残基已被选自下列的氨基酸残基替代：Leu、IIe、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glu、Iys、Arg、His、Asp和Gln。在另一实施方案中，158位Val残基已被选自下组的氨基酸残基替代：Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

在另一实施方案中，296位Glu残基已被选自下列的氨基酸残基替代：Val、Leu、IIe、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Lys、Arg、His、Asp或Gln。在另一实施方案中，所述残基已被Arg、Lys或Val替代。

在另一实施方案中，298位Met残基已被选自下列的氨基酸残基替代：Val、Leu、IIe、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Lys、Arg、His、Glu、Asp或Gln。在另一实施方案中，所述残基已被Lys、Arg、Gln或Asn替代。

在另一实施方案中，334位Asp残基已被Gly和Glu替代。

在另一实施方案中，336位Ser残基已被Gly和Glu替代。

在本发明的另一实施方案中，在本文定义的“体外水解测定”中测试时(实施例11)，变体的活性与SEQ ID NO：1所示天然凝血因子VII多肽的活性之比值是至少约1.25。在又一个的实施方案中，比值至少是约2.0；另一实施方案中，是至少约4.0。

另一方面，本发明提供具有与天然FVIIa相比组织因子非依赖性活性增加的FVIIa变体。在其中的一实施方案中，活性增加不伴有底物特异性的改变。在一实施方案中，变体与组织因子的结合并不削弱(与野生型FVIIa相比)；在另一实施方案中，变体与组织因子结合时具有至少野生型凝血因子VIIa的活性。

在另一实施方案中，凝血因子VII变体，除已进行157、158、296、298、334、336或337位以及任选的蛋白酶结构域其它位置氨基酸的替代之外，在N-末端Gla结构域(残基1-37)也有氨基酸残基替代。在另一实施方案中，凝血因子VII(指SEQ ID NO：1)10和32位的一个或多个氨基酸残基已被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。在一实施方案中，10位Pro氨基酸残基被Gln、Arg、His、Gln、Asn或Lys替代；和/或32位Lys氨基酸残基被Glu、Gln或Asn替代。

附图简述

图1显示天然人凝血因子VII(SEQ ID NO：1)的全长氨基酸序列。

在本说明书中，使用如表1所示的IUPAC-生物化学命名法(CBN)IUB委员会批准的缩写符号表示氨基酸。除非另外指明，否则用名称或用下列缩写表示的氨基酸以及具有异构体的氨基酸均是天然L型。此外，除非另作说明，否则肽中氨基酸序列的左侧和右侧末端分别是N-和C-末端。

表1：氨基酸的缩写。

氨基酸	3字母代码	单字母代码
氨基酸	3字母代码	单字母代码	甘氨酸	Gly	G
脯氨酸	Pro	P	甘氨酸	Gly	G
脯氨酸	Pro	P	丙氨酸	Ala	A
缬氨酸	Val	V	丙氨酸	Ala	A
缬氨酸	Val	V	亮氨酸	Leu	L
异亮氨酸	IIe	I	亮氨酸	Leu	L
异亮氨酸	IIe	I	蛋氨酸	Met	M
半胱氨酸	Cys	C	蛋氨酸	Met	M
半胱氨酸	Cys	C	苯丙氨酸	Phe	F
酪氨酸	Tyr	Y	苯丙氨酸	Phe	F
酪氨酸	Tyr	Y	色氨酸	Trp	W
组氨酸	His	H	色氨酸	Trp	W
组氨酸	His	H	赖氨酸	Lys	K
精氨酸	Arg	R	赖氨酸	Lys	K
精氨酸	Arg	R	谷氨酰胺	Gln	Q
天冬酰胺	Asn	N	谷氨酰胺	Gln	Q
天冬酰胺	Asn	N	谷氨酸	Glu	E
天门冬氨酸	Asp	D	谷氨酸	Glu	E
天门冬氨酸	Asp	D	丝氨酸	Ser	S
苏氨酸	Thr	T	丝氨酸	Ser	S

现已发现，当lys 157、Val 158、Glu 296、Met 298、Asp 334、Ser 336或lys 337(以及任选地一个或多个其它残基)中至少一个氨基酸残基被另一氨基酸残基替代时，这样的FVIIa变体具有凝血活性。

这些残基位于被认为影响蛋白酶结构域氨基末端的***从而影响凝血因子VIIa催化活性构象的形成的区域中，所述催化活性构像的形成依赖于IIe153的末端氨基和Asp343侧链之间的盐桥。所述替代可以消除静电排斥、添加氢键，或者相反便利于氨基末端的***。

由于所述凝血因子VIIa变体与天然FVIIa相比具有更高的固有活性，故可以预见低剂量即足以在作用位点获得功能上足够的浓度，因此，有可能向具有***件或需要提高正常止血***功能的主体施用低剂量。

如上简要讨论的那样，本发明人做这样的假定：通过替代157位Lys残基和337位Lys残基和158位Val残基和296位Glu残基和298位Met残基和334位Asp残基和336位Ser残基中的一个或多个残基，凝血因子VIIa自发地获得更加有效的构象，所述构象在正常情况下不得不通过组织因子诱导形成。这样的凝血因子VIIa变体显示出有治疗意义的固有活性，这样活性可用于促凝血活性(procoagulant activity)不依赖于组织因子(在血小板表面产生凝血因子Xa)的情况，例如在施用高剂量NovoSeven^时。

除通过替换157位Lys残基和337位Lys残基和158位Val残基和296位残基和298位Met残基和334位Asp残基和336位Ser残基中一个或多个残基而获得的影响之外，蛋白酶结构域中其它氨基酸残基的替换更进一步促进这种分子的活性构象的形成。然而，据信，宣称的最大影响在上述七种残基附近发生突变时才能见到。

凝血因子VII N-末端Gla结构域(残基1-37)中一些氨基酸残基的替换，可以使该蛋白对膜磷脂(如组织因子负载细胞或血小板的膜磷脂)的亲和力大大提高。因此，上述的凝血因子VII变体，除已进行157、158、296、298、334、336或337位以及任选的蛋白酶结构域其它位置的氨基酸替代之外，在N-末端Gla结构域也有某些氨基酸残基替代，从而得到与天然凝血因子VII相比活性增加且对膜磷脂的亲和力增加的蛋白。优选地，凝血因子VII(指SEQ ID NO：1)10和32位的氨基酸残基被可由核酸构建物编码的另一氨基酸残基替代。优选的掺入上述位置的氨基酸残基的实例是：

第10位的Pro氨基酸残基被Gln、Arg、His、Gln、Asn或Lys替代；和/或第32位的Lys氨基酸残基被Glu、Gln或Asn替代。

以不同磷脂亲和力和维生素K-依赖性血浆蛋白的序列为基准，也可考虑取代Gla结构域的其它残基。

本文中，三个字母表示的氨基酸以其传统的含义使用。除非明确地指出，否则本文提到的氨基酸是L-氨基酸。

术语“N-末端GLA-结构域”是指FVII的1-37氨基酸序列。

术语“蛋白酶结构域”是指FVII的153-406氨基酸序列(FVIIa的重链)。

三个字母“GLA”是指4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)。

术语“中性氨基酸残基”(pH为6-8)旨在包括选自下列的氨基酸：Ala、Val、Leu、IIe、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln。

术语“小的氨基酸”旨在包括选自Gly、Glu和Ala的氨基酸。

术语“带负电荷的氨基酸残基”(pH为6-8)旨在包括选自Asp和Glu的氨基酸。

本文所用术语“凝血因子VII多肽”，是指包含天然人凝血因子VII(SEQID NO：1)的1-406氨基酸序列的任何蛋白或其变体。包括但不局限于人凝血因子VII、人凝血因子VIIa和其变体。

本文所用术语“凝血因子VII”旨在包括无活性单链酶原型凝血因子VII分子和活化的双链凝血因子VII分子(凝血因子VIIa)。这包括那些具有天然人凝血因子VII或凝血因子VIIa的1-406氨基酸序列的蛋白。它也包括具有稍微修饰的氨基酸序列的蛋白，例如修饰N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或增加，只要蛋白基本上保持凝血因子VIIa的活性即可。本文所用术语“凝血因子VIIa”或“FVIIa”是指由活化型(凝血因子VIIa)组成的产物。具有上述定义的“凝血因子VII”或“凝血因子VIIa”也包括那些可能存在和发生的由一个变为另一个的天然等位基因变异。

同时，糖基化程度和位置或其它翻译后修饰可能依选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质不同而异。

本文所用术语“变体”，旨在命名具有SEQ ID NO：1的凝血因子VII，其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已被另一氨基酸取代，和/或其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已被删除，和/或其中一个或多个氨基酸已被***蛋白，和/或其中一个或多个氨基酸已被加到亲本蛋白中。此添加可以发生在亲本蛋白的N-末端或C-末端或者同时发生在N-末端和C-末端。所定义的“变体”当为活化的双链分子形式时具有FVII活性。在一实施方案中，变体与SEQ ID NO：1的序列具有65％的同一性。在一实施方案中，变体与SEQ ID NO：1的序列具有80％的同一性。在另一实施方案中，变体与SEQID NO：1的序列具有90％的同一性。在另一实施方案中，变体与SEQ IDNO：1的序列具有95％的同另一性。

本文所用术语“核酸构建物”是指cDNA、基因组DNA、合成DNA、半合成DNA、RNA来源或混合来源的任何核酸分子。术语“构建物”是用来指单-或双链形式的核酸片段，其可以以编码目的多肽的天然核苷酸序列的完全或部分序列为基础。构建物可任选地含有其它核酸片段。同样，术语“可由核酸构建物编码的氨基酸残基”包括可以由以上定义的核酸构建物编码的氨基酸残基，即氨基酸Ala，Val，Leu，IIe，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr， Asn，Glu，Lys，Arg，His，Asp和Gln。

本文所用术语“不同氨基酸”是指不同于天然存在于那个位置的氨基酸的氨基酸。这包括但不局限于可以由核酸构建物编码的氨基酸。优选地，不同氨基酸呈天然L型并且可以由核酸构建物编码。一个具体实例是L-半胱氨酸(Cys)。

本文中，术语“治疗”旨在包括以抑制或减少出血为的目的来预防可能发生的出血(如手术中的出血)和控制已经发生的出血(如外伤出血)。因此，预防性施用本发明凝血因子VIIa变体包括在术语“治疗”中。

本文所用术语“活性”，是指凝血因子VII多肽或其变体将其底物凝血因子X转换为活性凝血因子Xa的能力。凝血因子VII多肽的活性可以用“体外蛋白酶解测定”测得。

术语“固有活性”也包括在缺少组织因子时在活化的血小板表面上产生凝血酶的能力。

术语“提高正常止血***功能”是指提高产生凝血酶的能力。

本文所用术语“出血病症”，反映表现为出血的源于细胞或分子的任何缺陷，无论缺陷是先天性、获得性或诱导性的。实例是：凝血因子缺乏(例如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺陷)、凝血因子抑制、血小板功能缺陷、血小板减少症或冯维勒布兰德氏(von Wilebrand)疾病。

术语“出血事件”是指包括不受控制的和过量的出血，这是与手术及其它形式组织损伤有关的主要问题。不受控制的和过量的出血可以发生在具有正常凝血***功能的主体和患有凝血或出血病症的主体。凝血因子缺乏(血友病A和B、凝血因子XI或VII缺陷)或凝血因子抑制可以是出血病症的原因。过量出血也发生在具有功能正常的凝血级联反应(没有凝血因子缺陷或针对任一种凝血因子的抑制剂)的主体，并可以由血小板功能缺陷、血小板减少症或冯维勒布兰德氏病引起。

在此情况下，出血可能类似于血友病引起的那些出血，因为它象血友病一样止血***功能异常、缺乏引起主要出血的凝血必需″化合物″(如血小板或冯维勒布兰德凝血因子蛋白)或所述凝血必需″化合物″异常。在经受与手术或巨大外伤有关的广泛组织损伤的主体中，由于即时止血的需求超出正常的止血机制，尽管具有正常的止血机制，但是这些主体可以发展为出血。在出血发生在器官如脑、内耳区和眼睛时，由于外科止血的可能性有限，能否成功止血也是一个问题。在从各种器官(肝、肺、瘤组织、胃肠道)采集活组织检查标本以及腹腔镜手术过程中，可引起相同的问题。所有这些情况的共同情况是难以由外科技术(缝合、止血钳等)提供止血，在弥漫性出血(出血性胃炎和弥散性子宫出血)时，也存在此问题。急性和弥漫性出血也发生在由于接受抗凝血疗法治疗而已诱发止血缺陷的主体。当不得不迅速地抑制抗凝血剂的影响时，主体可能需要外科手术介入。

根治性耻骨后***切除术，通常是对患有限局性***癌的主体进行的手术。手术常常复杂，伴有显著并且有时是大量的失血。在***切除术期间相当大的失血主要与复杂的解剖构造有关，***上有不容易采取外科止血的各种密集的血管化位点，这会导致大面积的弥漫性出血。在不能成功止血的情况中，可以引起问题的另一情况是，为预防血栓栓塞性疾病而对具有正常止血机制的主体施用了抗凝血治疗。这种治疗可能包括肝素，其它形式的蛋白聚糖、华法令(warfarin)或其它形式的维生素K拮抗剂以及阿斯匹林和其它血小板凝集抑制物。

在本发明的一实施方案中，出血与血友病有关。在另一实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的血友病有关。在另一实施方案中，出血与血小板减少症有关。在另一实施方案中，出血与冯维勒布兰德氏病有关。在另一实施方案中，出血与严重的组织损伤有关。在另一实施方案中，出血与严重的外伤有关。在另一实施方案中，出血与手术有关。在另一实施方案中，出血与腹腔镜手术有关。在另一实施方案中，出血与出血性胃炎有关。在另一实施方案中，出血与弥漫性子宫出血有关。在另一实施方案中，出血发生在机械止血可能性受限的器官。在另一实施方案中，出血发生在脑、内耳区或眼睛。在另一实施方案中，出血与采集活组织检查标本操作有关。在另一实施方案中，出血与抗凝血治疗有关。

本文所用术语“主体”旨在指任何动物，特别是哺乳动物如人，而且适当情况下，可与术语“患者”交换使用。

本文所用术语“合适的生长培养基”，是指含有细胞生长和编码本发明凝血因子VII变体的核酸序列表达所需要的营养素和其它组分的培养基。

制备凝血因子VII变体

通过重组核酸技术可以制造本文所述的凝血因子VII。一般说来，将克隆的野生型凝血因子VII核酸序列进行修饰以编码所需蛋白。然后，将修饰的序列***到表达载体中，后者转化或转染入宿主细胞。高等真核细胞，特别是培养的哺乳动物细胞，优选作为宿主细胞。人凝血因子VII的完整核苷酸和氨基酸序列是已知的(参见美国专利4,784,950，其中描述了重组人凝血因子VII的克隆和表达)。牛凝血因子VII序列描述在Takeya等J.Biol.Chem.263：14868-14872(1988)中。

通过各种技术可以改变氨基酸序列。通过定位诱变可以进行核酸序列修饰。定位诱变技术为本领域技术人员所熟知，并描述在例如Zoller和Smith(DNA 3：479-488，1984)或Horton等Gene 77，1989，pp.61-68“通过扩充重叠的剪接”中。因此，可以在凝血因子VII的核苷酸和氨基酸序列的基础上可以引入所选择的改变。同样，使用特异性引物利用聚合酶链式反应制备DNA构建物是所属技术领域的专业人员所熟知的(参看PCR Protocols，1990，Academic Press，San Diego，California，USA)。

编码本发明凝血因子VII变体的核酸构建物可以适宜地是基因组来源或cDNA来源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并根据标准技术使用合成寡核苷酸探针通过杂交来筛选编码所有或部分多肽的DNA序列而得到(参见Sambrook等人，Molecular Clonina：A Laboratory Manual，2nd.Ed.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)。

编码凝血因子VII变体的核酸构建物也可通过已建立的标准方法合成制备，例如由Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，或者Matthes等在EMBOJournal 3(1984)，801-805中描述的方法。根据亚磷酰胺方法，人工合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中合成，纯化、退火、连接并克隆在适宜载体中。

此外，核酸构建物可以是合成核酸和基因组核酸的混合物，合成cDNA和cDNA的混合物，或基因组和cDNA来源核酸的混合物，它们是按照标准技术，通过连接合成片段、基因组或cDNA来源的片段(视情况而定)而制得，这些片段相当于整个核酸构建物的各个部分。

核酸构建物优选是DNA构建物。

用于生产本发明凝血因子VII变体的DNA序列通常在凝血因子VII氨基末端编码前原多肽(pre-pro polypeptide)以得到正确的翻译后加工(例如γ-羧基化的谷氨酸残基)并由宿主细胞分泌。前原多肽可以是凝血因子VII或其它维生素K-依赖性血浆蛋白，如凝血因子IX、凝血因子X、凝血酶原、蛋白C或蛋白S的前原多肽。如本领域技术人员所要知晓的那样，在凝血因子VII变体的氨基酸序列中可进行另外的修饰，而不显著地削弱此蛋白作为凝血剂的能力。譬如，如在美国专利5,288,629中一般描述的那样，也可在活化裂解位点修饰凝血因子VII变体从而抑制酶原凝血因子VII转化成为活化的双链形式。

用于表达凝血因子VIIa变体的表达载体包括能够指导所克隆的基因或cDNA转录的启动子。优选的用于培养的哺乳动物细胞的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。病毒启动子包括SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1：854-864，1981)和CMV启动子(Boshart等，Cell 41：521-530，1985)。一种特别优选的病毒启动子是来自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufmanand Sharp，Mol.Cell.Biol.2：1304-1319，1982)。细胞启动子包括小鼠κ基因启动子(Bergman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7041-7045，1983)和小鼠VH启动子(Loh等人，Cell 33：85-93，1983)。一种特别优选的细胞启动子是小鼠金属硫蛋白-I启动子(Palmiter等人，Science 222：809-814，1983)。表达载体也可含有一套位于启动子下游和凝血因子VII序列自身***位点上游的RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。表达载体也含有位于***位点下游的聚腺苷酸化信号。特别优选的聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，出处同上)，来自腺病毒5E1b区的聚腺苷酸化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto等人Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)或来自人凝血因子VII基因或牛凝血因子VII基因的聚腺苷酸化信号。表达载体也可包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码性病毒前导序列，如腺病毒2三联前导序列；和增强子序列，如SV40增强子。

克隆的DNA序列通过例如磷酸钙-介导的转染法(Wigler等人，Cell 14：725-732，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603-616，1981；Graham and Van der Eb，Virology 52d：456-467，1973)或电穿孔法(Neumann等人，EMBO J.1：841-845，1982)而被引入培养的哺乳动物细胞。为了鉴别和挑选表达外源DNA的细胞，一般将赋予可选择表型(一种选择性标记)的基因与目的基因或cDNA一起引入细胞中。优选的选择性标记包括赋予对药物如新霉素、潮霉素和氨甲喋呤抗药性的基因。选择性标记可以是可扩增的选择性标记。一种优选的可扩增的选择性标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。选择性标记由Thilly综述(Mammalian Cell Technology，ButterworthPublishers，Stoneham，MA，在此引入作为参考)。所属技术领域的专业人员能够很容易地选择适宜的选择性标记。

选择性标记可以与在不同质粒上的目的基因同时转入细胞，也可以与在同一质粒上的目的基因一同转入。如果在同一质粒上，选择性标记和目的基因可以在不同启动子或相同启动子的控制下，后一情形产生双顺反子(dicistronic)信息。此类构建物为本领域技术人员所已知(例如，Levinson andSimonsen，U.S.4,713,339)。向待引入细胞的混合物中添加另外的DNA(称为“载体DNA”)也是有益的。

细胞吸收该DNA后，在合适的生长培养基中生长，通常1-2天，以开始表达目的基因。用于培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何传统的培养基，如含有合适补充物的最小或复合培养基。适宜的培养基可商购或根据出版物公开的方法制备(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录)。使用本领域已知的方法制备培养基(参见例如，有关细菌和酵母的参考文献；Bennett，J.W.and LaSure，L.，editors，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。生长培养基一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白和生长因子。为产生γ-羧化的凝血因子VII变体，培养基含有维生素K，优选浓度约0.1mg/ml至5mg/ml。然后，利用药物筛选选出稳定表达选择性标记的细胞。对于已用可扩增的选择性标记转染的细胞可以增加药物浓度以挑选高拷贝数的克隆序列，从而增加表达水平。然后，筛选表达所需凝血因子VII变体的稳定转染的细胞克隆。

优选的哺乳动物细胞系包括CHO(ATCC CCL 61)、COS-1(ATCC CRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)和293(ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk^-ts 13 BHK细胞系(Waechter andBaserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1106-1110，1982)，以下简称BHK 570细胞。BHK 570细胞系购自美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852，ATCC登记号码为CRL 10314。tk-ts 13 BHK细胞系也购自ATCC，登记号为CRL 1632。另外，可以使用大量其它细胞系，包括大鼠Hep I(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC1469(ATCC CCL 9.1)和DUKX细胞(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。

可以使用转基因动物技术生产本发明的凝血因子VII变体。优选在宿主雌性哺乳动物的乳腺内生产蛋白质。在乳腺表达之后，将目的蛋白质分泌到乳汁中，这克服了许多分离源自其它来源的蛋白质遇到的困难。乳汁很容易收集，便于大批量获得，而且生物化学表征好。此外，乳汁中的主要蛋白呈高浓度(通常约1至15g/l)。

从商业观点出发，显然优选那些具有大的产乳量的种类作为宿主。虽然可以使用较小的动物如小鼠和大鼠(而且在基础验证阶段为优选)，但是优选使用家畜类哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。由于下列因素，使得绵羊成为特别优选的宿主：在绵羊中的早期转基因历史、产乳量、费用和收集绵羊乳所用的设备方便易得(关于影响宿主类类选择的因素的比较，请参见例如WO 88/00239)。一般期望挑选那些已被培育为乳用的宿主动物育种，如East Friesland绵羊，或者在晚些时候通过繁殖转基因品系而引入乳畜。无论如何，应该使用已知的、健康状况良好的动物。

为了获得在乳腺的表达，使用来自乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括那些编码酪蛋白(见美国专利5,304,489)，β-乳球蛋白、α-乳蛋白和乳清酸性蛋白的基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。在绵羊β-乳球蛋白基因情况下，一般使用该基因序列5′侧翼的至少约406bp序列区域，虽然优选长达约5kbp的5′侧翼序列的更长部分，如包括β-乳球蛋白基因的5′侧翼启动子和非-编码部分的约4.25kbp DNA片段(见Whitelaw等人，Biochem.J.286：31-39(1992))。来自其它物种的启动子DNA的类似片段也是适宜的。

也可将β-乳球蛋白基因的其它区域整合入构建物中，这可以是待表达基因的基因组区域。本领域一般认为，例如，缺乏内含子的构建物与含有这类DNA序列的构建物相比表达较差(见Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：836-840(1988)；Palmiter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：478-482(1991)；Whitelaw等人，Transgenic Res.1：3-13(1991)；WO 89/01343；and WO 91/02318，每一篇文献在此引入作为参考)。在这方面，可能情况下一般优选使用包含编码目标蛋白质或多肽的基因的所有或部分天然内含子的基因组序列，因此，优选进一步包含至少一些源自，例如，β-乳球蛋白基因的内含子。一种这样的区域是提供用于内含子剪接和从绵羊β-乳球蛋白基因的3′非编码区RNA聚腺苷酸化的DNA片段。当取代基因的天然3′非编码序列时，该绵羊β-乳球蛋白片段便可同时提高和稳定目的蛋白质或多肽的表达水平。其它实施方案中，用源自乳特异性蛋白质基因的相应序列取代变体凝血因子VII序列起始ATG的周围区域。该种取代提供推定的组织特异性起始环境以便提高表达。用例如BLG基因取代整个变体凝血因子VII前原序列和5′非编码序列是方便的，虽然可以取代较小的区域。

为了在转基因动物中表达凝血因子VII变体，将编码变体凝血因子VII的DNA片段可操作地连接到其它表达所必需的DNA片段上以产生表达单元。这种其它片段包括上述提到的启动子，以及用于提供转录终止和mRNA聚腺苷酸化的序列。表达单元进一步包括编码可操作地连接到修饰的凝血因子VII的片段上的分泌性信号序列的DNA片段。分泌性信号序列可以是天然凝血因子VII分泌性信号序列或者可以是另一种蛋白质如乳蛋白的分泌性信号序列(参见例如，von Heijne，Nucl.Acids Res.14：4683-4690(1986)；和Meade等人，美国专利4,873,316，这些文献在此引入作为参考)。

通过把变体凝血因子VII序列***含有其它DNA片段的质粒或噬菌体载体中，可以很方便地完成用于转基因动物的表达单元的构建，尽管实质上可以通过任何序列的连接而构建表达单元。特别方便的是，提供含有编码乳蛋白的DNA片段的载体，和用编码变体凝血因子VII多肽的序列取代乳蛋白的编码序列；从而产生包括该乳蛋白基因的表达控制序列的融合基因。无论如何，质粒或其它载体中的表达单元的克隆有利于变体凝血因子VII序列的扩增。扩增可在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中方便地进行，因此，载体通常包括复制起点和在细菌宿主细胞中有功能的选择性标记。然后，把表达单元引入所挑选的宿主物种的受精卵(包括早期胚)中。可通过数种方式中的一个完成异源DNA的引入，包括显微注射(如美国专利4,873,191)，逆转录病毒感染(Jaenisch，Science 240：1468-1474(1988))或利用胚胎干细胞(ES)进行定点整合(由Bradley等综述，Bio/Technologv 10：534-539(1992))。将受精卵植入假妊娠的雌性动物的输卵管或子宫中以使之发育足月。在其生殖系中携带引入的DNA的子代将该DNA以正常孟德尔方式传入其子代，由此发展为转基因种群。用于生产转基因动物的一般程序为本领域已知(参见例如，Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986；Simons等人，Bio/Technology 6：179-183(1988)；Wall等人，Biol.Reprod.32：645-651(1985)；Buhler等人，Bio/Technologv 8：140-143(1990)；Ebert等人，Bio/Technologv 9：835-838(1991)；Krimpenfort等人，Bio/Technoloay 9：844-847(1991)；Wall等人，J.Cell.Biochem.49：113-120(1992)；美国专利4,873,191；美国专利4,873,316；WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；和GB 87/00458)。用于将外源DNA序列引入哺乳动物和其生殖细胞的技术最初是在小鼠中发展来的(参见例如，Gordon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380-7384(1980)；Gordon and Ruddle，Science 214：1244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，Cell41：343-345(1985)；Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442(1985)；和Hogan等人(出处同上))。这些技术随后被修改以适用于较大的动物，包括家畜类(参见例如，WO 88/00239，WO 90/05188，和WO 92/11757；和Simons等人，Bio/Technoloqv 6：179-183(1988))。总之，在迄今产生转基因小鼠或家畜的最有效途径中，可按照已建立的技术将数百个线性目的DNA分子注射入受精卵的一个核原(pro-nuclei)中。也可将DNA注射入受精卵(zygote)的胞质中。

也可以利用转基因植物中的生产。表达可以是广泛的或者是定向于特定器官，如块茎(参见Hiatt，Nature 344：469-479(1990)；Edelbaum等人，J.Interferon Res.12：449-453(1992)；Sijmons等人，Bio/Technologv 8：217-221(1990)；和EP 0 255 378)。

从细胞培养基或乳汁中回收本发明凝血因子VII变体。可用本领域已知的各种方法纯化本发明凝血因子VII变体，包括但不限于：层析(例如离子交换、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)、电泳方法(例如制备性等电焦距(IEF)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取法(参见例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，NewYork，1989)。优选地，在抗-凝血因子VII抗体柱上通过亲和层析法进行纯化。按照Wakabayashi等，J.Biol.Chem.261：11097-11108，(1986)和Thim等Biochemistrv 27：7785-7793.(1988)描述的那样，使用钙-依赖型单克隆抗体。纯度至少98％。通过例如凝胶电泳和氨基末端氨基酸序列分析法可以评价纯度。

将凝血因子VII变体在其活化位点裂解以便使它转化为其双链形式。可以根据本领域已知的方法进行活化，诸如Osterud等，Biochemistry 11：2853-2857(1972)；Thomas，美国专利4,456,591；Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841(1983)；或Kisiel and Fujikawa，Behring lest.Mitt.73：29-42(1983)公开的那些方法。或者，按照Bjoern等人(Research Disclosure，269 September 1986，pp.564-565)所述的那样，使凝血因子VII通过离子交换层析柱如Mono QX(Pharmacia fine Chemicals)或类似柱而被活化。然后，再如下配制和施用所产生的活性凝血因子VII变体。

测定

本发明也提供适宜的筛选优选的本发明凝血因子VIIa变体的测定方法。这些测定可以是简单的初步体外试验。

因此，本文实施例11公开了检测本发明凝血因子VIIa变体活性的简易试验(命名为“体外水解测定”)。基于所述试验，特别感兴趣的凝血因子VIIa变体是那些在本文定义的“体外水解测定”中，变体活性与图1所示天然凝血因子VII活性的比值为1.0以上，如至少约1.25，优选至少约2.0，如至少约3.0，或者甚至优选至少约4.0的变体。

使用生理性底物如凝血因子X(体外蛋白质水解测定，参见实施例12)，适宜浓度为100-1000nM，也可测得变体的活性，其中在添加适宜的显色底物(例如S-2765)之后测定产生的凝血因子Xa。另外，在生理温度测定活性。

也可在包含生理浓度(在摹拟血友病A条件下，减去(minus)凝血因子VIII)的所有相关凝血因子和抑制剂以及活化的血小板的试验中测定FVIIa变体产生凝血酶的能力(象Monroe等(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547的第543页中描述的那样，故将该文献引入作为参考)。

施用和药物组合物

本发明凝血因子VII变体可用于控制由数种原因导致的出血病症，所述原因如凝血因子缺陷(如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺陷)或凝血因子抑制，或者，本发明凝血因子VII变体可用于控制具有功能正常的血液凝固级联反应(没有凝血因子缺陷或针对任一种凝血因子的抑制)的主体发生的过量出血。出血可以起因于血小板功能缺陷、血小板减少症或冯维勒布兰德氏病。出血也可见于由各种刺激诱导而致纤维蛋白溶解活性提高的主体。

在承受与手术或巨大外伤有关的广泛组织损伤的主体中，由于立即止血的需求，其止血机制可能超负荷，尽管有正常的止血机制，但是主体可发展为出血。在发生器官如脑、内耳区域和眼睛出血的时候，达到满意的止血也成问题，而且在难以确定出血部位时发生的弥漫性出血(出血性胃炎和大量子宫出血)，达到满意的止血也成问题。在从各种的器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)采集活组织检查标本以及腹腔镜手术过程中，可出现相同的问题。这些情况均很难通过外科技术(缝合、止血钳等)进行止血。急性和大量出血也可发生在进行抗凝治疗的主体中，这些主体被所接受的治疗诱发了止血缺陷。万一抗凝剂影响不得不被迅速抵消的话，此类主体可能需要外科手术介入。在不能满意止血的情况下可能引起问题的另一情况是，具有正常止血机制的主体为了防止血栓栓塞性疾病而接受抗凝治疗。此类治疗包括包括肝素、其它形式的蛋白多糖、华法令或其它形式的维生素K-拮抗剂以及阿斯匹林及其它血小板凝集抑制物。

凝血级联的全身性激活可以导致弥漫性血管内凝血(DIC)。然而，由于通过FVIIa和血管壁损伤位点暴露的TF之间形成复合物而诱导一种局部止血过程，故在用高剂量重组FVIIa治疗的主体未见到此种并发症。因此，本发明凝血因子VII变体也可以其活性型使用，以便控制这种与正常止血机制有关的过量出血。

为了治疗与故意介入有关的出血，通常在进行介入操作前约24小时施用本发明凝血因子VII变体，并且在之后施用7天或更长时间。可通过如本文所述的各种途径来施用凝血剂。

对于70公斤主体而言，根据主体的体重和病症的严重程度，凝血因子VII变体的负荷和维持剂量的范围是约0.05mg至500mg/天，优选约1mg至200mg/天等，更优选约10mg至175mg/天。

为了预防和/或治疗，药物组合物主要是为胃肠外给药设计的。优选地，经胃肠外即静脉内、皮下、或肌内注射施用药物组合物，或通过连续或脉动式输注而施用。胃肠外给药组合物，包括优选地溶于可药用载体、优选含水载体的本发明凝血因子VII变体。可以使用各种含水载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等等。也可以将本发明凝血因子VII变体制备成用于输送或定位到损伤位点的脂质体制剂。脂质体制剂的一般性描述参见例如U.S.4,837,028、U.S.4,501,728和U.S.4,975,282。通过传统的众所周知的灭菌技术对本发明组合物予以灭菌。所得的水溶液可以包装备用，或者在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水溶液混合。组合物可以含有近似生理条件所需的可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，渗透压调节剂等等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。

这些制剂中凝血因子VII变体的浓度可以在较大范围内变动，即按重量算从小于约0.5％，通常在1％或至少约1％，到多达15或20％，主要由符合所选特定施用模式的液量、粘性等加以选择。

因此，代表性的用于静脉输注的药物组合物，可制成含有最多250ml无菌林格氏(Ringer′s)溶液和10mg凝血因子VII变体。制备胃肠外施用组合物的具体方法为本领域所已知或者对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且更详细内容描述在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990)一书中。

为了预防和/或治疗，可以施用含有本发明凝血因子VII变体的组合物。在治疗性应用中，如上所述，向已经患有疾病的主体施用足以治愈、减轻或部分阻止疾病和其并发症的量的组合物。足以达到这些目的的量称为“治疗有效量”。如所属技术领域的专业人员所理解的那样，对此目的有效的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及主体的体重和一般状况。然而，一般说来，对于70公斤的主体而言，每日凝血因子VII变体的有效量范围是约0.05mg至约500mg，更加通常使用的每日凝血因子VII变体的剂量是约1.0mg至200mg。

必须记住，本发明物质一般用于严重的疾病或损伤状况，即危急生命或潜在地危急生命的情况。在此情况下，由于外源物质很少且人体中人凝血因子VII变体普遍缺乏免疫原性，所以，施用大大过量的变体凝血因子VII组合物是可能的而且也许是治疗医师所期望的。

在预防性应用中，向易于受到或者处于疾病状况或损伤的威胁的主体施用含有本发明凝血因子VII变体的组合物，以提高主体自身的凝血能力。这样的量称为“预防有效量”。在预防性应用中，精确的量再度取决于主体的健康状况和重量，但是，对于70公斤的主体而言，每日凝血因子VII变体一般剂量范围是约0.05mg至约500mg，更加通常使用的每日凝血因子VII变体的剂量是约1.0mg至200mg。

可以按照治疗医师所选剂量水平和模式，完成组合物的单次或多次施用。对于需要每日维持量水平的门诊患者，可以使用例如便携式泵***通过连续输注来施用凝血因子VII变体。

本发明凝血因子VII变体的局部释放，例如局部施用，可以例如通过喷雾、灌注、双气囊导管、支架(stent)、整合入血管的移植物或支架、用于包裹气囊导管的水凝胶或其它已建立的方法进行，无论如何，药物组合物将提供足以有效地治疗主体的凝血因子VII变体的量。

通过下列实施例进一步描述本发明，然而，实施例不是为了限定保护范围。上文描述的和在下文实施例中公开的特征，无论分别地还是其任意联合，均是为了理解不同形式本发明的素材。

实施例

下列实施例中氨基酸取代使用的术语如下。首字母代表天然存在于SEQ ID NO：1各位置上的氨基酸。下列数字代表SEQ ID NO：1中的位置。第二字母代表替代(取代)天然氨基酸的不同氨基酸。一个实施例是M298Q，其中SEQ ID NO：1的298位蛋氨酸被谷氨酰胺替代。另一实例中，V158T/M298Q，SEQ ID NO：1的158位缬氨酸被苏氨酸替代，以及相同凝血因子VII多肽中SEQ ID NO：1的298位蛋氨酸被谷氨酰胺替代。

实施例1

编码[V158T/M298Q]-FVII，[K157A]-FVII，[E296V]-FVII， [E296V/M298Q]-FVII和[V158D/E296V]-FVII，[V158D/M298Q]-FVII， [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [S336G]-FVII，[K337A]-FVII，[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII的DNA。

使用超螺旋的带有目的***物的双链DNA载体和两种含有所需突变的合成引物，通过定位诱变制备编码[V158T/M298Q]-FVII，[K157A]-FVII，[E296V]-FVII，[E296V/M298Q]-FVII和[V158D/E296V]-FVII，[V158D/M298Q]-FVII，[V158D/M298K]-FVII，[V158D/E296V/M298Q]-FVII，[M298Q]-FVII，[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII[S336G]-FVII，[K337A]-FVII的DNA构建物。使用下列引物对：

对于[K157A]-FVII：

5′-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3′(SEQID NO：2)

5′-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3′(SEQID NO：3)

对于[V158D]-FVII：

5′-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3′(SEQ ID NO：4)

5′-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3′(SEQ ID NO：5)

对于[V158T]-FVII：

5′-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3′(SEQ ID NO：6)

5′-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3′(SEQ ID NO：7)

对于[E296V/M298Q]-FVII：

5′-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3′(SEQ ID NO：8)

5′-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3′(SEQ ID NO：9)

对于[M298Q]-FVII：

5′-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3′(SEQ ID NO：10)

5′-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3′(SEQ IDNO：11)

对于[M298K]-FVII：

5′-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3′(SEQ ID NO：12)

5′-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3′(SEQ ID NO：13)

对于[S336G]-FVII：

5′-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3′(SEQ IDNO：14)

5′-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3′(SEQ IDNO：15)

对于[K337A]-FVII：

5′-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3′(SEQ ID NO：16)

5′-CCC TTG CAG GAG ICC GCG CTG CCA TCC G-3′(SEQ ID NO：17)

在循环变温期间，通过Pfu DNA聚合酶将各自与载体的相反链互补的寡核苷酸引物延伸。基于引物的结合，产生含有交错切口的突变质粒。随着循环变温，用DpnI处理产物以消化亲代DNA模板并且选择含有合成DNA的突变物，所述DpnI对于甲基化和半甲基化的DNA是特异的。

利用特异引物使用聚合酶链式反应制备DNA构建物的方法为所属技术领域的专业人员所熟知(参见PCR Protocols，1990，Academic Press，SanDiego，California，USA)。

实施例2

制备[V158T/M298Q]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241 243)，以表达变体[V158T/M298Q]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[V158T/M298Q]-FVII的级分，并施加到含有与CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)偶联的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[V158T/M298Q]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例3

制备[K157A]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[K157A]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[K157A]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2MNaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[K157A]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例4

制备[V158D/M298Q]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[V158D/M298Q]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[V158D/M298Q]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[V158D/M298Q]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例5

制备[V158D/M298K]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[V158D/M298K]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[V158D/M298K]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[V158D/M298K]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例6

制备[V158D/E296V/M298Q]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385)，以表达变体[V158D/E296V/M298Q]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％ Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[V158D/E296V/M298Q]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[V158D/E296V/M298Q]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例7

制备[M298Q]-FVII

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[M298Q]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[M298Q]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2MNaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[M298Q]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例8

制备[S336G]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[S336G]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[S336G]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2MNaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[S336G]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例9

制备[K337A]-FVII

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385)，以表达变体[K337A]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％ Triton X-100，pH8.0。合并含有[K337A]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2MNaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[K337A]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例10

制备[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII。

基本上按照前述方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson and Nielsen(1996)FEBS Lett.385，241243)，以表达变体[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII。如下纯化凝血因子VII变体：

在加入5mM EDTA、0.1％Triton X-100和10mM Tris并调整pH为8.0之后，将条件培养液加载到25-ml Q Sepharose Fast Flow柱(PharmaciaBiotech)上，并且通过加水调节传导率为10-11mS/cm。通过下列步骤而完成蛋白质的洗脱：从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH8.0，到10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％Triton X-100，pH8.0。合并含有[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII的级分，并施加到含有偶联到CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)上的单克隆抗体F1A2(NovoNordisk，Bagsvaerd，Denmark)的25-ml柱上。该柱用pH7.5、含有10mMCaCl₂、100mM NaCl和0.02％Triton X-100的50mM Hepes予以平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液洗涤后，用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱结合的物质。使用或贮存之前，加入超过EDTA的过量CaCl₂或者把[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII转移到含Ca²⁺的缓冲液中。继之，用凝血因子VII ELISA测定法测定各步骤的产物，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质。

实施例11

体外水解测定

平行测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VIIa变体(此后均称为“凝血因子VIIa”)以便直接比较它们的比活性。在微量滴定板上(MaxiSorp，Nunc，Denmark)进行测定。把终浓度1mM的生色底物D-IIe-Pro-Arg-对硝基酰替苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到溶于pH7.4、含有0.1MNaCl、5mM CaCl₂和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes中的凝血因子VIIa(终浓度100nM)中。

在SpectraMax^TM340平皿阅读器(Molecular Devices，USA)上连续测定405nm处的吸光度。在减去不含酶的空白孔的吸光度之后，20-分钟温育期间显色的吸光度用于计算变体和野生型凝血因子VIIa之间的活性比值：

比值＝(A_405nm凝血因子VIIa变体)/(A_405nm凝血因子VIIa野生型)。

实施例12

体外蛋白水解测定

平行测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VIIa变体(此后均称为“凝血因子VIIa”)以便直接比较它们的比活性。在微量滴定板上(MaxiSorp，Nunc，Denmark)进行测定。溶于100μL pH7.4、含有0.1M NaCl、5mM CaCl₂和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes中的凝血因子VIIa(10nM)和凝血因子X(0.8μM)温育15分钟。然后通过加入50μL pH7.4、含有0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes，来终止凝血因子X的裂解。通过加入终浓度0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基酰替苯胺(S-2765，Chromogenix，Sweden)，测定产生的凝血因子Xa的量。在SpectraMax ^TM340平皿阅读器(Molecular Devices，USA)上连续测定405nm处的吸光度。在减去不含FVIIa的空白孔的吸光度之后，10分钟温育期间显色的吸光度用于计算变体和野生型凝血因子VIIa之间蛋白水解活性的比值：

比值＝(A_405nm凝血因子VIIa变体)/(A_405nm凝血因子VIIa野生型)。

实施例13

实施例11和12所述测定法中测定的FVIIa变体的相对活性

变体实施例11中的比值实施例12中的比值

K157A 0.9 未测

V158T/M298Q-FVIIa 3.8 10

V158D/M298Q-FVIIa 2.0 2.7

V158D/M298K-FVIIa 0.3 未测

V158D/E296V/M298Q- 7.8 28

FVIIa

M298Q-FVIIa 3.4 5.5

V158D/E296V/M298Q/ 11.0 47

K337A-FVIIa

S336G-FVIIa 0.6 未测

K337A-FVIIa 3.9 4.4

wt-FVIIa 1.0 1.0

序列表

SEQ ID NO.1(天然的人凝血因子VII的氨基酸序列)

Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-

5 10 15

GLA-GLA-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-

20 25 30 35

Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro-

40 45 50

Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys-

55 60 65 70

Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile-

75 80 85 90

Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-

95 100 105

Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-

110 115 120 125

Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile-Leu-Glu-Lys-Arg-

130 135 140

Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly-

145 150 155 160

Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly-

165 170 175 180

Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-

185 190 195

Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-

200 205 210 215

Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-A1a-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr-

220 225 230

Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln-Pro-Val-

235 240 245 250

Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu-

255 260 265 270

Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-Trp-G1y-Gln-Leu-Leu-

275 280 285

Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-

290 295 300 305

Thr-Gln-Asp-Cys-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr-

310 315 320

Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys-Lys-Gly-

325 330 335 340

Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly-

345 350 355 360

Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-

365 370 375

Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-

380 385 390 395

Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro

400 405 406

SEQ ID NO：2(DNA引物，用于制备[K157A]-FVII：

5-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3′

SEQ ID NO：3(DNA引物，用于制备[K157A]-FVII：

5′-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3′

SEQ ID NO：4(DNA引物，用于制备[V158D]-FVII：

5′-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3′

SEQ ID NO：5(DNA引物，用于制备[V158D]-FVII：

5′-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3′

SEQ ID NO：6(DNA引物，用于制备[V158T]-FVII：

5′-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3′

SEQ ID NO：7(DNA引物，用于制备[V158T]-FVII：

5′-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3′

SEQ ID NO：8(DNA引物，用于制备[E296V/M298Q]-FVII：

5′-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3′

SEQ ID NO：9(DNA引物，用于制备[E296V/M298Q]-FVII：

5′-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3′

SEQ ID NO：10(DNA引物，用于制备[M298Q]-FVII：

5′-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3′

SEQ ID NO：11(DNA引物，用于制备[M298Q]-FVII：

5′-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3′

SEQ ID NO：12(DNA引物，用于制备[M298K]-FVII：

5′-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3′

SEQ ID NO：13(DNA引物，用于制备[M298K]-FVII：

5′-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3′

SEQ ID NO：14(DNA引物，用于制备[S336G]-FVII：

5′-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3′

SEQ ID NO：15(DNA引物，用于制备[S336G]-FVII：

5′-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3′

SEQ ID NO：16(DNA引物，用于制备[K337A]-FVII：

5′-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3′

SEQ ID NO：17(DNA引物，用于制备[K337A]-FVII：

5′-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3′

Claims

1.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的157位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala157)。

2.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala337)。

3.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala334)。

4.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala336)。

5.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala158)。

6.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala296)。

7.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体，其中至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同氨基酸替代；前提是该变体不是FVII(Ala298)。

8.根据权利要求2-7中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQID NO：1中第157位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

9.根据权利要求1、3-8中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQID NO：1中第337位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

10.根据权利要求1-2、4-9中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中第334位Asp的氨基酸已被不同氨基酸替代。

11.根据权利要求1-3、5-10中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中第336位Ser的氨基酸已被不同氨基酸替代。

12.根据权利要求1-4、6-11中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中第158位Val的氨基酸已被不同氨基酸替代。

13.根据权利要求1-5、7-12中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中第296位Glu的氨基酸已被不同氨基酸替代。

14.根据权利要求1-6、8-13中任一项的凝血因子VII多肽，其中相当于SEQ ID NO：1中第298位Met的氨基酸已被不同氨基酸替代。

15.根据权利要求1-14中任一项的凝血因子VII多肽，其中在蛋白酶结构域其余位置的至少一个氨基酸已被不同氨基酸替代。

16.根据权利要求15的凝血因子VII多肽，其中在蛋白酶结构域的其余位置的至多20个其它氨基酸已被不同氨基酸替代。

17.根据权利要求15-16中任一项的凝血因子VII多肽，其中选自相当于SEQ ID NO：1的159-170位氨基酸的至少一个氨基酸已被不同氨基酸替代。

18.根据权利要求15-17中任一项的凝血因子VII多肽，其中选自相当于SEQ ID NO：1的290-312位氨基酸的至少一个氨基酸已被不同氨基酸替代。

19.根据权利要求15-18中任一项的凝血因子VII多肽，其中选自相当于SEQ ID NO：1的330-339位氨基酸的至少一个氨基酸已被不同氨基酸替代。

20.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组中的一个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met；前提是，变体不是FVII(Alal57)、FVII(Ala334)、FVII(Ala336)、FVII(Ala337)、FVII(Ala158)、FVII(Ala296)或FVII(Ala298)。

21.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组的2个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

22.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组的3个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

23.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组的4个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

24.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组的5个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

25.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中独立地选自下组的6个氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

26.具有SEQ ID NO：1序列的凝血因子VII多肽，其中下组的氨基酸已被不同氨基酸替代：SEQ ID NO：1的157位Lys、337位Lys、334位Asp、336位Ser、158位Val、296位Glu和298位Met。

27.根据权利要求1、8、20-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中SEQID NO：1的157位所述Lys已被选自下组的氨基酸替代：Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

28.根据权利要求2、9、20-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中SEQID NO：1的337位所述Lys已被选自下组的氨基酸替代：Ala、Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

29.根据权利要求3、10、20-26中任一项的凝血因子多肽，其中SEQ IDNO：1的334位所述Asp已被选自下组的氨基酸替代：Gly和Glu。

30.根据权利要求4、11、20-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中SEQ ID NO：1的336位所述Ser已被选自下组的氨基酸替代：Gly和Glu。

31.根据权利要求5、12、20-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中SEQ ID NO：1的158位所述Val已被选自下组的氨基酸替代：Ser、Thr、Asn、Gln、Asp和Glu。

32.根据权利要求6、13、20-26中任一项的凝血因子多肽，其中SEQ IDNO：1的296位所述Glu已被选自下组的氨基酸替代：Arg、Lys和Val。

33.根据权利要求7、14、20-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中SEQ ID NO：1的298位所述Met已被选自下组的氨基酸替代：Lys、Arg、Gln和Asn。

34.根据权利要求1-26中任一项的凝血因子VII多肽，其中氨基酸已被由核酸构建物编码的不同氨基酸替代。

35.根据权利要求1-34中任一项的凝血因子VII多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VII。

36.根据权利要求1-34中任一项的凝血因子VII多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa。

37.根据权利要求20的凝血因子VII多肽，其是独立地选自下组的凝血因子VII多肽：[E296V]-FVII、[M298Q]-FVII和[S336G]-FVII。

38.根据权利要求21的凝血因子VII多肽，其是独立地选自下组的凝血因子VII多肽：[V158T/M298Q]-FVII、[E296V/M298Q]-FVII、[V158D/E296V]-FVII、[V158D/M298Q]-FVII和[V158D/M298K]-FVII。

39.根据权利要求22的凝血因子VII多肽，其是[V158D/E296V/M298Q]-FVII。

40.根据权利要求23的凝血因子VII多肽，其是[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII。

41.核酸构建物，包含编码权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽的核苷酸序列。

42.根据权利要求41的核酸构建物，其是载体。

43.重组宿主细胞，包含权利要求41定义的核酸构建物。

44.根据权利要求43的重组宿主细胞，其来源于哺乳动物。

45.根据权利要求44的重组宿主细胞，其中所述细胞选自CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞。

46.转基因动物，包含并表达权利要求41定义的核酸构建物。

47.转基因植物，包含并表达权利要求41定义的核酸构建物。

48.生产权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括：在使得核酸构建物表达的条件下、在合适的生长培养基中培养权利要求43-45中任一项定义的细胞，并从培养基中回收产生的多肽。

49.生产权利要求1-40任一项定义的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括从权利要求46定义的转基因动物产生的乳汁中回收凝血因子VII变体。

50.生产权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括：培养权利要求47定义的转基因植物的细胞，并从产生的植物中回收凝血因子VII变体。

51.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的157位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

52.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

53.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同氨基酸替代。

54.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的可药用组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同氨基酸替代。

55.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的药物组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同氨基酸替代。

56.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的可药用组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同氨基酸替代。

57.包括含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体并可任选包含可药用载体的可药用组合物，其中至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同氨基酸替代。

58.药物组合物，包括权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽并可任选包含可药用载体。

59.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的157位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

60.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

61.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同氨基酸替代。

62.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同氨基酸替代。

63.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同氨基酸替代。

64.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同氨基酸替代。

65.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的凝血因子VII多肽或其变体在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途，其中至少相当于SEQ ID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同氨基酸替代。

66.权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽在制备用于治疗出血事件或用于提高正常止血***功能的药物中的用途。

67.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的157位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

68.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的337位Lys的氨基酸已被不同氨基酸替代。

69.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的334位Asp的氨基酸已被不同氨基酸替代。

70.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的336位Ser的氨基酸已被不同氨基酸替代。

71.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的158位Val的氨基酸已被不同氨基酸替代。

72.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的296位Glu的氨基酸已被不同氨基酸替代。

73.治疗主体出血事件或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽或其变体，所述凝血因子VII多肽或其变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中至少相当于SEQID NO：1的298位Met的氨基酸已被不同氨基酸替代。

74.治疗或预防主体出血病症或提高正常止血***功能的方法，方法包括向需要的主体施用治疗或预防有效量的权利要求1-40中任一项定义的凝血因子VII多肽。