CN1625564A - 来源于髓鞘碱性蛋白的耐受原性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种不需要进一步加工就能与MHC I或II类分子结合的肽(也就是一种apitope)，其包括髓鞘碱性蛋白区段(131－158)的一部分，特别是本发明提供了一种选自如下髓鞘碱性蛋白肽：(134－148，135－149，136－150，137－151，138－152，139－153，140－154)的apitope。本发明还提供了该肽在制备药物组合物中的应用和一种采用该肽来治疗和/或预防疾病的方法。

Description

来源于髓鞘碱性蛋白的耐受原性肽
本发明涉及来源于髓鞘碱性蛋白的肽。特别的，本发明涉及包括髓鞘碱性蛋白131-158区段的一部分的肽及其在治疗和/或预防疾病中的应用。
背景技术
在适应性免疫应答中，T淋巴细胞可以识别蛋白抗原的内在表位。抗原呈递细胞(APC)吸收蛋白抗原并将其降解成为短的肽片段。肽可与细胞内主要的组织相容复合物(MHC)I或II类分子结合，并被转运至细胞表面。当与MHC分子结合被呈递至细胞表面时，该肽可被T细胞识别(通过T细胞受体(TCR))，在该情况下该肽为T细胞表位。
T细胞表位在对任何抗原，无论是自身的或是外来的，的适应性免疫应答中扮演了重要的角色。通过使用实验模型，展示了T细胞表位在过敏性疾病(其包括***反应、自身免疫性疾病和移植排斥)中扮演着重要角色。通过注射与佐剂组合的合成肽(基于T细胞表位的结构)可以诱导炎症或过敏性疾病。
经比较，显示通过给药可溶形式的肽表位有可能诱导针对特定肽表位的免疫耐受性。在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE-一种多发性硬化症的模型(MS))(Metzler & Wraith(1993)Int.Immunol.5：1159-1165；Liu & Wraith(1995)Int.Immunol.7：1255-1263；Anderton & Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28：1251-1261)；以及关节炎，糖尿病和葡萄膜视网膜炎实验模型(如上述AndertonWraith(1998)中的评述)中，给药可溶性的肽抗原被证实是一种抑制疾病的有效途径。这也被证实是一种治疗EAE疾病进展的途径(如上述Anderton & Wraith(1998))。
耐受原性肽在治疗或预防疾病中的应用已吸引了相当多的注意力。其一方面的原因是某些耐受原性表位可下调针对相同组织内的不同抗原的T细胞应答。这种现象，被称为是“旁观者抑制”，其意思是采用特定的耐受原性肽(如上述Anderton & Wraith(1998))应当可以诱导针对特定抗原内的多于一个表位的和针对给定疾病的多于一个抗原的耐受性。这避免了需确定特定疾病中的全部病原性抗原的需要。
由于肽相对较低的成本以及可生产出具有改变的免疫性状的肽类似物的事实，肽也是一种有利的治疗选择。因此，可以对肽进行修饰从而改变其与MHC或TCR的相互作用。采用这种方法的一种可能的问题是已经证实不是所有的作为T细胞表位发生作用的肽都能诱导耐受性。髓鞘碱性蛋白(MBP)肽89-101是一种致免疫后的免疫优势性抗原，同时也是一种在引发T细胞反应和诱导EAE方面非常有效的免疫原。然而，当以溶液给药时，该肽显示出在诱导耐受性方面无效(如上述Anderton & Wraith(1998))。
对于这种观察到的在T细胞表位诱导耐受性能力方面的等级现象提出了多种解释(如上述Anderton & Wraith(1998)中的评述)。特别地，有人提出在肽对MHC的亲和力和耐受原性间存在相关性(如上述Liu & Wraith(1995))，但是这与某些观察到的现象并不吻合。例如，非耐受原性的MBP[89-101]以相对高的亲和力与I-AS结合。因此，无法直接预测哪些肽将诱导耐受性。
本发明人已经显示，如果一种肽表位具有适合于被未成熟APC呈递的大小且不需要抗原加工，则其可诱导免疫耐受性(国际专利申请号PCT/GB01/03702)。因此，可以通过一些表位在其能被MHC分子呈递前需要进一步的加工的事实来解释一些T细胞表位为耐受原性而另一些无法诱导耐受性的观察现象。虽然当与佐剂组合注射时，其有能力诱导疾病，但当以溶液形式给药时这些需要进一步加工的表位无法诱导耐受性。
不需要进一步加工的表位可以诱导耐受性，并被发明人称为“apitopes”(不依赖于抗原加工的表位)。
发明简述
本发明人研究了MBP的131-158区段，并发现许多可被固定抗原呈递细胞呈递至T-细胞的肽。
由于其不需要进一步的加工就可与MHCI或II类分子结合，因此将这些肽定义为apitopes。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种包括髓鞘碱性蛋白131-158区段的一部分的apitope。
本发明人还确定了该区段中可被特定T-细胞克隆识别的两个最小的表位。所述肽可包括这两个表位中的一个或两个，它们是MBP142-152和140-148。
在一优选的实施方案中，所述肽选自下述髓鞘碱性蛋白肽：134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
在第二个方面，本发明提供了一种包括一种或多种如本申请第一个方面所述的肽的药物组合物。
在第三个方面，本发明提供了一种治疗和/或预防需要治疗和/或预防的个体中的疾病的方法，其包括对个体给药如本发明第一个方面所述的肽的步骤。
本发明还提供了如本发明第一个方面所述的肽在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
本发明所述的肽可用于预防和/或治疗多发性硬化症。
附图简述
图1显示了T细胞克隆MS60：D2对由APC在131-158区段呈递嵌合MBP肽的应答。
图2显示了T细胞克隆N5对由APC呈递MBP肽140-154的应答。
图3显示了T细胞克隆N5对由APC在136-157区段呈递嵌合MBP肽的应答。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及一种肽。
肽
术语“肽”根据其标准含义是用来表示一系列残基，典型地为典型地通过α-氨基和相邻氨基酸的羧基基团之间的肽键相互连接起来的L-氨基酸。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。
本发明中的肽可以是不需进一步加工就可与MHC I或II类分子结合的任何长度。
能与MHC I类分子结合的肽典型地为7至13，更通常为8至10个氨基酸长度。所述肽的结合通过在肽的主链原子与所有MHC I类分子的肽结合沟槽的非可变位点之间的接触来使其两个末端稳定。在与肽的氨基和羧基末端结合的沟槽两端都有非可变位点。肽链长度的变化通过肽主链卷曲来调节，通常在能提供所要的柔性的脯氨酸或苷氨酸残基处发生。
与MHC II类分子结合的肽典型地为8至20个氨基酸的长度，更通常地为10至17个氨基酸的长度，且可以更长。这些肽以沿着两端开放的MHC II肽结合沟槽(与MHC I类肽结合沟槽不同)伸展的构象存在。主要通过主链原子与排列形成肽结合沟槽的保守残基接触，使肽处于合适的位置。
本发明的肽可以通过化学方法制备(肽化学，实用教程。MikosBodansky，Springer-Verlag，Berlin.)。例如，可通过固相技术来合成肽(Roberge JY et al(1995)Science 269：202-204)，从树脂上切下，并且通过制备性的高压液相色谱纯化(例如，Creighton(1983)蛋白质结构和分子原理，WH Freeman & Co，New York NY)。例如，根据制造商提供的说明书，采用ABI 43 1 A肽合成仪(Perkin Elmer)可实现自动合成。
所述肽可选择地可以通过重组方式，或从一较长多肽上切除的方式来制备。例如，所述肽可通过从髓鞘碱性蛋白上切除来获得。肽的组成可通过氨基酸分析或测序来确定(例如，Edman降解法)。
本发明中的肽来源于MBP的131-158区段。优选的所述肽来源于经APC对抗原天然加工而产生的抗原片段。
为了实用目的，有所述肽应当显示的各种其他的特性。例如，所述肽应当在一允许其在体内应用的浓度下是可溶的。优选的，所述肽应当在0.5mg/ml的浓度下是可溶的，更优选所述肽应当在1mg/ml的浓度下是可溶的，最优选所述肽应当在5mg/ml的浓度下是可溶的。
为了鼻内给药，采用当前操作可以被吸收的剂量的最大体积为每个鼻孔大约200μl。如果所述肽在1mg/ml时是可溶的，则每鼻孔双倍剂量可使向每个病人给药800μg。在任何单独剂量中给药多于5mg是不寻常的。
为了治疗有效，所述肽在体内足够稳定也是十分重要的。本发明人发现，在体内给药30分钟后试验肽的总量降至约50％，在给药4小时后总量降至约30％，但经5天后所述肽仍然可被检测到(约5％)。所述肽在体内的半衰期应当至少为10分钟，优选至少为30分钟，更优选至少为4小时，最优选至少为24小时。
本发明人发现在经鼻内给药后，引流***中肽的量在给药约4小时后达到峰值，不过5天后肽仍然可被检测到(在最大约5％的水平)。优选的所述肽能足够稳定地以治疗活性浓度存在于引流***中足够长的一段时间从而发挥治疗效果。
所述肽在体内也应当显示出良好的生物可利用率。所述肽应当在体内保持能使其与细胞表面的MHC分子无适当障碍的结合的构象。
髓鞘碱性蛋白(MBP)
MBP是一种以前经特征描述和测序的髓鞘抗原(Roth et al(1987)J.Neurosci.Res.17(4)321-328；序列号M30516)。
本发明中的肽来源于MBP的区段131-158。
优选所述肽为或包括该区段中一个或多个最小的T-细胞表位，例如最小表位MBP142-152或140-148。
优选的所述肽选自如下的髓鞘碱性蛋白肽：
MBP肽  序列
134-148  YKSAHKGFKGVDAQG
135-149  KSAHKGFKGVDAQGT
136-150  SAHKGFKGVDAQGTL
137-151  AHKGFKGVDAQGTLS
138-152  HKGFKGVDAQGTLSK
139-153  KGFKGVDAQGTLSKI
140-154  GFKGVDAQGTLSKIF
不依赖于抗原加工的表位(APITOPES)
本发明中的肽不需要进一步加工就能与MHC I或II类分子结合(在肽结合沟槽部位)。这种肽在此被称作“apitopes”(不依赖于抗原加工的表位)。
细胞表面呈递来源于特定抗原的肽不是随机的而是往往由少量的频繁出现的表位来支配。对特定肽的支配依赖于许多因素，例如结合MHC分子的相对亲和力、在APC内的增殖时空点和对降解的抗性。抗原的表位等级可根据免疫应答的进展而改变，其对自身耐受性和自身免疫具有重要的含义。免疫优势性决定区段有可能成为良好的耐受原。因此，在一优选实施方案中，本发明的apitope是基于优势性表位的。
然而，在对免疫优势性肽发生首次免疫应答后，表位“摊开”可发生于亚优势性决定区段(Lehmann et al(1992)Nature 358：155-157)。亚优势性表位的呈递对引发自身免疫十分重要。因此，本发明的apitope可以基于亚优势性表位。
对任何特定的抗原，也可能存在隐蔽表位(cryptic epitopes)。隐蔽表位是那些当以肽形式给药时能刺激T细胞应答，但当以完整抗原给药时不能产生这种应答的表位。这可能是在APC中将抗原加工成肽的过程中，隐蔽表位被破坏了。
隐蔽表位在体外可作为apitope而起作用，因为其不需要进一步加工就可与MHC分子结合，同时诱导识别该隐蔽表位的T细胞发生无反应性。然而，这种apitope不太可能具有治疗效果，因为其不能耐受可识别天然加工的抗原表位的T细胞。
抗原表位可通过测量被APC呈递时针对跨越整个抗原的重叠肽(参加下文)的T细胞应答来确定。这种研究通常产生“嵌套组”的肽，同时特定的T细胞系/克隆的最小表位可通过测量对截短肽的应答来评估。
不能假设抗原的最小表位可作为apitope而发挥作用。为了与MHC最佳结合要求最小表位两侧氨基酸是十分必要的。应当将Apitope设计成能涵盖不同T细胞克隆的最小表位间的细微差别的可能性。
应当强调，不可能确定一适合所有表位的apitope。有清楚的证据显示一些表位以依赖于内体中的负载MHC的方式与MHC结合，因此其需要加工((Viner et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：2214-2218)。这是为什么不能假设每一最小表位将不可避免地发挥apitope的作用的另一原因。
含有T细胞表位的肽的确定
本领域有许多已知的方法来确定给定抗原中的T细胞表位。
可通过对从抗原-负载的APC上洗脱下的肽进行质谱分光光度分析来确定天然加工的表位。这些是被刺激吸收抗原的，或通过采用适当基因转化而被迫产生胞内蛋白的APC。典型的APC与可溶形式的或适于靶向APC细胞表面的蛋白一起培养。经在37℃下培养后，细胞在去垢剂中裂解，同时通过，例如亲和层析来纯化II类蛋白。采用合适的化学介质(例如酸条件)处理纯化的MHC，从而将肽从MHC上洗脱下来。分离该肽库，并将其分布型与来源于采用相同方式处理的对照APC的肽相比较。分析特异于蛋白表达/滋养细胞的峰值(例如通过质谱法)，并确定肽片段。该操作通常产生有关通过抗原加工从特定抗原得到的产生的肽范围(通常以“嵌套组”的形式发现)的信息。
另一种确定表位的方法是在体外试验中筛选重叠且跨越抗原全长的合成肽文库。例如可采用15个氨基酸长度的并且有5或10个氨基酸重叠的肽。采用包括抗原呈递细胞和T细胞的抗原呈递***来测试肽。例如，抗原呈递***可以是鼠脾细胞制备物，和来源于扁桃体或PBMC的人细胞制备物。可选的，抗原呈递***可包括特定的T细胞系/克隆和/或特定的呈递抗原的细胞类型。
T细胞活化可通过T细胞增殖(例如采用掺入3H-胸腺嘧啶核苷)或细胞因子生成来测量。TH1-型CD4+T细胞的活化，例如可通过可采用标准技术如ELISPOT试验检测的IFNγ生成来检测。
重叠肽研究通常显示表位所处的抗原区域。一种特定T细胞的最小表位可通过测量对截短肽的应答来评估。例如，如获得一针对重叠文库中的包括1-15个残基的肽的应答，两端均被截短的组(例如，1-14，1-13，1-12等和2-15，3-15，4-15等)可被用于确定最小表位。
不依赖于抗原加工的呈递***(APIPS)
一旦确定了一个表位，下一步将调查其是否也起apitope的作用。
一种apitope必须是无需抗原加工即可呈递至T细胞。在确定了含有T细胞表位的肽后，apitopes可通过无加工的***来确定。可采用独立于抗原加工的呈递***(APIPS)来测试截短的肽和肽类似物。
APIPS的例子包括：
a)固定的APC(含有或不含CD28抗体)；
b)含有MHC I或II类分子的脂质膜(含有或不含CD28抗体)；
和
c)纯化的天然或重组的与平板结合(plate-bound)形式的MHC(含有或不含CD28抗体)。
已知可采用固定的APC来调查T细胞应答，例如在研究中，通过测量对截短肽的应答来调查多肽内的最小表位(Fairchild et al(1996)Int.Immunol.8：1035-1043)。可采用，例如甲醛(通常为多聚甲醛)或戊二醛来固定APC。
脂质膜(其可为平面膜或脂质体)可通过采用人工脂质制备或其可以是来源于APC的原生质膜/微粒体碎片。
在使用中，可将APIPS施用于组织培养皿的孔中。随后加入肽抗原，并通过添加挑选的T细胞系或克隆来检测肽与APIPS的MHC部分的结合。通过本领域已知的任何方法，例如通过掺入3H-胸腺嘧啶核苷或细胞因子分泌都可测量T细胞系或克隆的活化。
耐受性
本发明的肽应当能诱导针对MBP的耐受性，因为其是该抗原的apitopes。
如本文所使用的，术语“耐受原性”是指能诱导耐受性。
耐受性是指对抗原不应答。对自身抗原的耐受性是免疫***的一个重要特征，当其失去时将产生自身免疫性疾病。适应性免疫***必须保持对大量的各种感染抗原的应答能力同时避免其自身组织中含有的自身抗原的免疫攻击。这在很大程度上受不成熟T淋巴细胞对胸腺中细胞程序性死亡的灵敏度的调控(中枢耐受)。但是，不是所有的自身抗原都能在胸腺中检测到，因此自身反应性的胸腺细胞死亡并不完全。因此，外周组织中也存在通过成熟的自身反应性T淋巴细胞而获得耐受性的机制(外周耐受)。Anderton等人在(1999)(Immunological Reviews 169：123-137)中给出了对中枢和外周耐受性机制的综述。可通过诱导在至少一部分CD4+T细胞中发生无反应性来产生或特征描述耐受性。为了活化T细胞，肽必须与一种能向T细胞传递两个信号的“专业”APC联合。第一信号(信号1)被APC细胞表面上的MHC-肽复合体传递，并通过TCR被T细胞接收。第二信号(信号2)被APC表面上的共同刺激分子，例如CD80和CD86传递，并被T细胞表面上的CD28接收。认为当T细胞在缺乏信号2的情况下接收信号1时，其并未被活化，事实上，变得无反应性。无反应性的T细胞对随后的抗原刺激也无反应，并且能抑制其他的免疫应答。无反应性的T细胞被认为与介导T细胞的耐受性有关。
不希望受到理论的束缚，本发明人预测，由于其需要通过呈递成熟抗原的细胞进行加工，因此在与MHC分子联合被呈递前，需要加工的肽不能诱导耐受性。呈递成熟抗原的细胞能加工抗原，但是也能传递信号1和信号2二者至T细胞，导致T细胞活化。另一方面，apitopes能与不成熟APC表面上的MHC II类分子结合。因此，其无需共同刺激就可被呈递至T细胞，从而导致T细胞的无反应性和耐受性。
毫无疑问，apitopes也能与成熟APC细胞表面上的MHC分子结合。不过，免疫***含有比成熟APC更丰富的不成熟APC(有人提出少于10％的树突状细胞被活化Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159：285-295)。因此，apitope的默认状态为无反应性/耐受性，而非活化。
已经显示，当通过吸入肽诱导耐受性时，抗原特异性的CD4+T细胞的增殖能力下降。同时由这些细胞产生的IL-2，IFN-γ和IL-4的生成量被下调，但IL-10的生成量增加。对处于肽诱导耐受性状态的小鼠中的IL-10进行中和显示完全恢复了对疾病的敏感性。有人提出调控细胞的总数持续保持在产生IL-10同时介导免疫调节的耐受状态(Burkhart et al(1999)Int.Immunol.11：1625-1634)。
因此可通过各种技术来监测耐受性的诱导，其包括：
(a)降低对感染其中所述肽为该疾病的体内目标表位的疾病的敏感性；
(b)在CD4+T细胞中诱导无反应性(可通过随后的体外抗原刺激来检测)；
(c)改变CD4+T细胞数量，包括：
(i)降低增殖；
(ii)下调IL-2、IFN-γ和IL-4的生成量；
(iii)增加IL-10的生成量。
目标疾病
本发明的肽可用于治疗和/或预防疾病。
本发明的肽在治疗和/或预防多发性硬化症(MS)中十分有效。多发性硬化症是一种以多种髓鞘脱失损害为特征的，在整个CNS白质中传播并在各种位点和各个时期发生的慢性炎症疾病(McFarlin &McFarland，1982 New England J.Medicine 307：1183-1188 &1246-1251)。MS被认为通过自身反应性T细胞介导。
在动物中，MBP具有致免疫性同时MBP-特异性T淋巴细胞具有致脑炎活性(Segal et al.，1994 J.Neuroimmunol.51：7-19；Voskuhletal.，1993 J.Neuroimmunol 42：187-192；Zamvil et al.，1985 Nature317：355-8)。
药物组合物
在第二个方面，本发明涉及一种包含一种或多种本发明第一个方面所述肽的药物组合物。所述组合物还可包括来源于MBP另一区段或来源于不同抗原的一个或多个apitopes。
本发明人预测，尽管存在“旁观者抑制”，但靶向许多不同的T细胞克隆从而有效诱导耐受性是十分必要的。从而为了预防和治疗疾病可将较多的肽给药至个体。
所述药物组合物可以，例如包括介于1至50个apitopes，优选地1至15个apitopes。如果存在多于一个的apitope，优选地，该apitopes为不需进一步加工就全部可与MHC I类分子结合，或全部可与MHC II类分子结合。
当存在两个或更多的apitopes时，所述药物组合物可以为试剂盒的形式，其中一些或每一种apitopes均分开提供，用于同时的，分开的或按顺序的给药。
可选的(或另外)，如果所述药物组合物(或其任何部分)以多剂量给药，则每一剂量可独立包装。
所述药物组合物可包括治疗或预防有效量的特定或每一apitope，同时可选的包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
同样地，在本发明的药物组合物中，特定的或每一apitope可与任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、或助溶剂混合。
给药
所述肽可在无佐剂的情况下以溶解形式给药。
优选的所述肽通过粘膜途径给药。
研究显示，当以溶解形式经腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)或鼻内(i.n.)或口服给药时，该肽可诱导T细胞耐受性(如上述Anderton& Wraith(1998)；Liu & Wraith(1995)如上述；Metzler & Wraith(1999)Immunology 97：257-263)。
优选的肽经鼻内给药。
小鼠研究显示，诱导耐受性所必需的肽的给药持续时间视受体中的T细胞前体频度而定(如上述Burkhart et al(1999))。在许多实验性研究中显示，重复剂量的肽是诱导耐受性所必须的(如上述Burkhart et al(1999))。因此，肽的确切剂量和剂数将视个体而定，不过在一优选实施方案进行了多剂量给药。
如果同时给药多种肽，其可以为适合单剂或多剂给药的“鸡尾酒”形式。可选的，优选给予多剂但调整剂与剂之间肽的相对浓度。
在一优选实施方案中，可沿用“剂量梯度增加”方案，其中多个剂量以递增浓度的方式对病人给药。这种方法已被采用，例如，被用于针对蜜蜂毒***反应的免疫治疗应用中的磷脂酶A2(Müller et al(1998)J.Allergy Clin Immunol.101：747-754 & Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.102：98-106)。
实施例
如下实施例用于举例说明本发明，但不能解释为对本发明的限定。本发明特别的涉及描述于这些实施例中的特定的具体实施方式。
实施例1-确定MBP区段134-154中的apitopes
材料和方法
抗原
如Deibler等人所述，从脑白质中制备得到人MBP(Deibler etal.，1972 Preparative Biochemistry 2：139)，并通过SDS-PAGE来检测其纯度。MBP和肺结核分支杆菌纯化的蛋白衍生物(PPD)(UK中心兽医学实验室，Surrey)在预先设定的最适浓度下用于增殖实验；每一抗原的最适浓度为20ug/ml。在Abimed AMS 422多肽合成仪上(Abimed，Langenfeld，Germany)通过F-moc化学方法合成了跨越MBP区段131-158的一组15-链节的重叠肽。每一肽有1个氨基酸被替换，并有14个氨基酸重叠。
组织培养的培养基
添加有20mM HEPES(Sigma，Poole，UK)、青霉素(100U/ml)、链霉素硫酸盐(100mg/ml)和4mM L-谷酰胺(均来源于LifeTechnologies，Paisley，Scotland)的RPMI-1640培养基被作为组织培养的培养基使用。无血清培养基被用于漂洗淋巴细胞和TCL。对于所有的培养条件和实验，培养基均添加有10％的热灭活的自体血浆。
T细胞克隆的产生
从8位MS病人和2位健康对照捐赠者中产生MBP-特异性T细胞系(TCL)。按上述方法分离来源于每一个体的PBMC，并以1×106细胞/ml的密度平铺至含有MBP(50μg/ml)的6孔板中；来源于每一个体的一部分PBMC经常规冷冻并保存用于随后的再刺激。七天后，采用含有2％IL-2(Lymphocult-HT；Biotest LTD.，Birmingham，UK)的新鲜培养基来培养细胞，并在培养第12天，所有的细胞均采用抗原、IL-2以及作为抗原呈递细胞(APC)来源的经辐射的(2500 Rad)自体PBMC以1T细胞：5 APC的细胞比例进行再刺激。每3-4天在IL-2中扩增细胞，并在第14天采用抗原、IL-2和PBMC按上述方法进行再刺激。在首次再刺激的那一天，检测细胞对MBP的特异性增殖。简单来说，将三份2×104个T细胞和1×105个经辐射的自体PBMC培养于含有MBP的96孔圆底平板中。培养细胞两天，并在培养的最后18小时采用(3H)-胸腺嘧啶核苷0.4μCi/孔的浓度进行脉冲。然后如上文所述收获细胞，δcpm＞1000和SI＞3的TCL被认为是MBP-特异性的。
经3轮再刺激/扩增循环后，在作为APC的自体经辐射的PBMC的存在下利用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)对TCL进行克隆。T细胞在0.1细胞/孔，0.3细胞/孔和1细胞/孔的限制稀释条件下平铺，并在含有1×104个经辐射的PBMC、5μg/ml PHA和2％IL-2的Terasaki平板(Nunc International，Costar)中培养。经10-12天后，采用1×105个经辐射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在96孔圆底长阳性孔进行扩增。三天后采用含有IL-2的新鲜培养基培养这些孔，同时在第7天，采用1×105个经辐射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在48-孔板中扩增克隆；在该时间点，在增殖实验中测量克隆对MBP的特异性应答。一周后，采用1×106经辐射的PBMC和PHA或Dynabeads(Dynal，UK)和IL-2，在24-孔板中扩增MBP-特异性克隆。采用7-10天的再刺激/扩增循环使克隆保持于24-孔板中。
增殖实验
将活的或p-甲醛固定的Mgar(HLA-DR2+ve)细胞与肽一起在含有T细胞的血清中或在单独的血清中培养。通过如下的3H-胸腺嘧啶核苷吸收来测量T细胞增殖应答。三等份每份100μl的每一培养物在96-孔圆底微量滴定板中生长48小时，随后采用0.4μCi的[3H]-胸腺嘧啶核苷(Amersham International，Amersham，UK)进行脉冲。经20小时后，采用Mach 111收获器96(Tomtec，Orange，New Jersey，USA)将细胞收获至玻璃纤维垫上(LKB-Wallac，Turku，Finland)。采用Microbeta液体闪烁计数器(LKB-Wallac)来确定[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入。当δcpm＞1000且刺激指数SI＞3时，含有抗原的测试孔被认为呈阳性，其中SI＝含有CPM抗原的培养物/不含抗原的CPM培养物。
结果
T细胞克隆MS60：D2对在131-158区段的嵌套MBP肽的递呈的应答如图1所示。由于其不需要进一步加工就可被固定的APC呈递至T细胞，因此肽134-148，135-149，136-150，137-151，138-152，139-153和140-154被定义为apitopes。
T细胞克隆N5对肽140-154的呈递的应答如图2所示。这进一步证实了肽140-154无需进一步加工即可被固定的APC呈递。
实施例2-被T细胞克隆N5和MS60：D2识别的最小表位的确定
将活的Mgar细胞与来源于MBP区段136-157的重叠肽一起在含有N5T细胞的血清中或在单独血清中培养。通过3H-胸腺嘧啶核苷吸收来测量T细胞增殖。
结果示于图3中。被T细胞克隆N5识别的最小表位为MBP142-152。
对T细胞克隆MS60：D2进行了类似的实验(图1，未固定的Mgar)。被T细胞克隆识别的最小表位是MBP140-148。
对本发明所述方法和***的各种改进和改变，对于本领域的熟练技术人员来说是显而易见的，其并未背离本发明的范围和主旨。虽然结合特定实施方案来描述了本发明，但应当理解，权利要求书所要求保护的发明不应当过分局限于该特定的实施方案。事实上，本发明意图包括那些为了实现本发明而对记载的模型的各种改进，这些对于化学或生物学或相关领域的熟练技术人员而言，是显而易见的。上述说明书中提到的所有出版物在此通过参考文献并入。
序列表
<110>Apitope Technology(Bristol)Limited
<120>来源于髓鞘碱性蛋白的耐受原性肽
<130>P013368WO LCH
<140>PCT/GB2003/000399
<141>2003-01-30
<150>GB 0202399.2
<151>2002-02-01
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>1
Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly
1               5                   10                  15
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>2
Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr
1               5                   10                  15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>3
Ser A1a His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu
1               5                   10                  15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>4
Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>5
His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys
1               5                   10                  15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>6
Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile
1               5                   10                  15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>7
Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe
1               5                   10                  15

Claims (8)

1.一种无需进一步加工就可与MHC I或II类分子结合的肽，其包括髓鞘碱性蛋白区段131-158的一部分。
2.一种如权利要求1所述的肽，其包括最小表位142-152和/或最小表位140-148。
3.一种如权利要求1或2所述的肽，其选自如下的髓鞘碱性蛋白肽：134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
4.如前述任意一项权利要求所述的肽，其用于治疗和/或预防疾病。
5.如权利要求4所述的肽，所述的疾病为多发性硬化症。
6.一种包含一种或多种如权利要求1至5中任意一项所述的肽的药物组合物。
7.一种用于治疗和/或预防在需要治疗和/或预防的个体中的疾病的方法，其包括给个体服用如权利要求1至5中任意一项所述的肽的步骤。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的肽在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
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