CN1605027A - 治疗中枢神经***病症的方法和组合物 - Google Patents

治疗中枢神经***病症的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1605027A
CN1605027A CNA028250478A CN02825047A CN1605027A CN 1605027 A CN1605027 A CN 1605027A CN A028250478 A CNA028250478 A CN A028250478A CN 02825047 A CN02825047 A CN 02825047A CN 1605027 A CN1605027 A CN 1605027A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acceptor
jak2
cell
nicotine receptor
nicotine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028250478A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100371714C (zh
Inventor
M·本切里夫
M·B·马莱罗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Georgia Health Sciences University
Gyre Therapeutics Inc
Original Assignee
Targacept Inc
Georgia Health Sciences University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Targacept Inc, Georgia Health Sciences University filed Critical Targacept Inc
Publication of CN1605027A publication Critical patent/CN1605027A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100371714C publication Critical patent/CN100371714C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/946—CNS-stimulants, e.g. ***e, amphetamines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

本发明提供了通过用测试物质接触具有烟碱受体的细胞筛选能作用烟碱受体的物质的方法；和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的任何增加或减少的方法。JAK2磷酸化的增加表明测试物质刺激烟碱受体，和其中JAK2磷酸化的减少表明测试物质抑制烟碱受体。本发明也提供了用于鉴定通过经AT2受体介导的活性能影响烟碱受体活性的物质的筛选方法。也提供了相关的药物组合物和治疗方法。

Description

治疗中枢神经***病症的方法和组合物
发明领域
本发明涉及具有药用性质的化合物，和特别地，涉及用于预防和/或治疗中枢神经***(CNS)病症，包括与阿尔茨海默病相关的病症的化合物。
本发明涉及用于预防和/或治疗患有或易感上述病症的患者的方法，和特别地，涉及用于预防和/或治疗患有那些与脑神经元神经变性相关的病症的患者的方法。本发明也涉及在预防和/或治疗已经归因于神经变性疾病的CNS病症中用作为药物组合物的物质的组合物。
发明背景
烟碱性受体  烟碱性乙酰胆碱受体(nAChR)由α亚基(α2-α9)和β亚基(β2-β4)的不同组合而组成的，并根据它们对烟碱或α-银环蛇毒素(αBTX)的亲和力分为两类(Vijayaraghavan，S.等，Neuron8：353-362(1992))。在已知的αBTX结合亚型α7-α9中，只有α7受体的表达遍及哺乳动物脑组织。α7受体形成功能同数的(homomeric)离子通路促使Ca2+的流入，其被快速地脱敏化(Breese，C.R.等，J.Com.Neurol.387：385-398(1997)；Vijayaraghavan，S.等，Neuron8：353-362(1992))并因此被认为与突触传递有关(McGehee，D.S.等，Science 269：1692-1696(1995))。选择作用于α7受体的烟碱性激动剂已被证明能有效地提高大鼠、灵长类动物和AD患者的认知功能。基于在AD中所观察到的多方面的缺陷和有限的用于治疗AD患者的处方，因此急切需要新的治疗方法和用于优化已有的和出现的疗法的方法。
烟碱也被发现能抑制在无血清培养基中培养的PC12细胞的死亡(Yamashita，H.和S.Nakamura，Neurosci.Lett.213：145-147(1996))。此外，选择性的α7受体激动剂，anabaseine衍生的3-(4)-dimethylaminocinamylidine(DMAC)(de Fiebre，C.M.等，Mol.Pharmacol.47：164-171(1995))，和nAChR的活化剂，包括α7亚型，ABT-418(Donnelly-Roberts，D.L.等，Brain Res.719：36-44(1996))也已被报道能发挥细胞保护的作用。
在神经元细胞中烟碱诱导的保护作用被αBTX、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(LY294002和渥曼青霉素)和Src抑制剂(PP2)抑制。此外，通过烟碱能增加PI3K的效应物磷酸化Akt的水平(Kihara，T.S.等，J.Biol.Chem.276：13541-13546(2001))。这些发现暗示α7烟碱性受体以级联的方式转导信号到PI3K，最终有助于神经保护作用。
AngII信号途径  血管紧张素II(AngII)的作用是通过两种类型的细胞表面受体(AT1和AT2)被介导的。在肾小球膜细胞(GMC)中大多数针对AngII的生理响应是通过AT1受体亚型发生(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6：179-187(1996)；Marrero，M.B.等，Cell.Signal.8：21-26(1996))。对于AT1受体，通过AngII激活产生G蛋白介导的信号，包括蛋白激酶C依赖的磷脂酶C的激活和释放来自于细胞内储藏的钙(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6：179-187(1996))。AT1受体也激活传统上与生长因子和细胞因子受体相关的信号途径导致产生早期生长响应基因。通过AngII信号级联诱导早期生长响应基因，如c-fos和c-jun原癌基因，通常不需要合成新蛋白质和看来能通过预先存在的转录因子的翻译后修饰被调控(Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73：413-423(1993)；Okuda，M.，Y.Kawahara，和M.Yokoyama，Am.J.Physiol.271：H595-H601，(1996)；Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73：413-423(1993)；Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73：424-438(1993)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264：526-530(1989))。因此，这些早期生长响应基因的AngII诱导表达是在胞内信号转导途径的直接调节下进行的。近来已暗示三个胞内信号途径与原癌基因的激活有关：JAK/STAT、p21ras/Raf-1/MAP激酶和PLC-γ1级联(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6：179-187(1996)；Marrero，M.B.等，Cell.Signal.8：21-26(1996)；Sayeski，P.P.等.Reguatory Peptides78：19-29(1998))。从关注于AT1受体信号转导途径的多方面研究中，已经清楚激动剂刺激信号的时间排列(temporal arrangemnet)的变化从秒(即PLC-γ1的激活和肌醇磷酸的产生)到分钟(如，MAP激酶的激活)到小时(如，JAK/STAT途径)(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6：179-187(1996)；Sayeski，P.P.等.Regulatory Peptides 78：19-29(1998))。AT1受体与不同信号转导途径的有差别地偶联的确切机制是不清楚的，但推测包括一系列复杂的步骤，即以时间依赖性机制选择性恢复、激活和接着失活每一信号***。
在AngII信号中JAK/STAT途径的作用  JAK家族的胞质酪氨酸激酶通常被认为偶联细胞因子受体如那些白细胞介素和干扰素，其有四个成员(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)(Darnell，J.E.，Jr.等，Science 264：1415-1421(1994)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264：526-530(1989))。在配体结合的响应中，这些JAK酪氨酸激酶联合酪氨酸磷酸化并激活自身的细胞因子受体。一旦被激活，JAK酪氨酸磷酸化并激活其它信号分子包括在STAT和受体结合后的STAT家族的核转录因子(Darnell，J.E.，Jr.等，Science 264：1415-1421(1994)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264：526-530(1989))。因此，JAK/STAT途径是在细胞表面受体和导致细胞生长的核转录活动中的重要连接。近来，Baker和其同事已经证明在心脏纤维原细胞和AT1受体转染的CHO细胞中STAT1、STAT3和STAT5在响应AngII过程中酪氨酸被磷酸化(Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.269：31443-31449(1994)；Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.270：19059-19065(1995)；McWhinney，C.D.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30：751-761(1998))。这些研究者也发现AngII的暴露刺激磷酸化单体STAT蛋白形成同-(STAT12、STAT32或STAT52)或异-(STAT1:STAT3)二聚复合体，称为SIF(sis-诱导因子)。这些SIF复合体随后移位到细胞核并与在c-fos启动子中被称为SIE(sis-诱导元件)或PIE(催乳素诱导元件)类似元件的特定DNA基序相互作用，最后激活早期生长响应基因(Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.269：31443-31449(1994)；Darnell，J.E.，Jr.等，Science 264：1415-1421(1994)；McWhinney，C.D.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30：751-761(1998)；Schindler，C.和J.E.Darnell，Jr.，Annu.Rev.Biochem.64：621-651(1995))。JAK/STAT级联能通过AngII产生的JAK2、STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化和STAT1和STAT3移位到细胞核被激活(Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.270：19059-19065(1995)；Marrero，M.B.等.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23：83-88 1996；Marrero，M.B.等，Nature 375：247-250(1995))。此外，AT1受体的羧基末端尾部以AngII依赖的方式结合到JAK2上(Ali，M.S.等，J.Biol.Chem.272：23382-23388(1997))。另外，用药理上的JAK2抑制剂(AG490)抑制JAK2酪氨酸磷酸化或用抗STAT1或STAT3的抑制性抗体的电穿孔来抑制AngII诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和DNA合成(Marrero，M.B.等，J.Biol.Chem.272：24684-24690(1997))。这些结果表明G蛋白偶联受体，特别是AT1受体能通过同样的先前结合促有丝***的细胞因子和生长因子受体的细胞内酪氨酸磷酸化途径来起作用。最后，酪氨酸磷酸酯酶，SHP-1和SHP-2，在AngII诱导的JAK2磷酸化中具有相反的作用。SHP-1显示引起JAK2去磷酸化和AngII诱导的JAK/STAT级联的终止，而SHP-2显示出在JAK2磷酸化和导致细胞增殖的AngII诱导的JAK/STAT级联的启动中起着关键的作用(见Jiao，H.等.Direct association with anddephosphorylation of Jak2 kinase by the SH2-domain-containingprotein tyrosine phosphatase SHP-1.Mol Cell Biol 16(12)：6985-92(1996))。
AT1受体的基序需要与JAK2结合，其也需要与SHP-2结合(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275：C1216-C1223(1998))。此外，SHP-2也需要与JAK2-AngII AT1受体结合(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275：C1216-C1223(1998))。SHP-2因此可起着作为一个JAK2与受体结合的接头蛋白的作用，从而帮助JAK2磷酸化和激活(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275：C1216-C1223，1998)。
烟碱性乙酰胆碱受体和β-淀粉状蛋白毒性  胆碱能的不足在阿尔茨海默病中已被清楚地明确了并且是当前治疗该病症的策略的基础。在阿尔茨海默病患者的脑中高亲合力的烟碱受体具有早期和明显的减少(Court，J.等.Biol.Psychiatry 49：175-184(2001))，且一些研究已经表明给予靶向nAChRs的配体能提高啮齿动物、包括人类的灵长类动物的认知能力(Newhouse P A，等，BiolPsychiatry 49(3)：268-78(2001))。除他们所知的对症状的影响外，神经元烟碱性配体在体外(Donnelly-Roberts，D.L.等.Brain Res.719：36-44(1996))和体内(Ryan RE等，132(8)：1650-6(2001))已经显示出神经保护活性，暗示存在用于治病的额外潜能。
α7受体形成功能同数的(homomeric)配体控制(gated)的离子通路以促使快速减少Ca2+的流入，其在哺乳动物脑中广泛地表达，并与感觉的控制、识别和神经保护相关(Seo，J.等，Biol Psychiatry 49(3)：240-7(2001))。通过α-Bgt和发挥细胞保护作用的选择性α7-nAChR激动剂-anabaseine衍生的3-(4)-dimethylaminocinamylidine(DMAC)，烟碱诱导的抗β-淀粉状蛋白诱导毒性的神经保护作用被抑制(De Fiebre C.M.等，Mol.Pharmacol.47：164-171(1995)；Kem WR.，Behav Brain Res.113(1-2)：169-81(2000))。PI-3-K效应物磷酸化Akt的水平通过烟碱被增加且细胞保护作用通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(LY294002和渥曼青霉素)和Src抑制剂(PP2)被抑制(Kihara，T.等，J.Biol.Chem.276：13541-13546(2001))。在级联中α7-nAChR转导信号到PI3K，最后有助于抗Aβ的神经保护作用。
相对于α7-nAChR的减少，来自于患有阿尔茨海默病的患者的颞叶(temporal)皮层中的血管紧张素转换酶(ACE-该酶转换血管紧张素I为血管紧张素II)的浓度增加了(Barnes，N.M.等，Eur.J.Pharmacol.200：289-292(1991))，且在一些人中该ACE基因型与AD有关(Narain Y等JMed Genet.，37(9)：695-7(2000))。在培养的细胞和体内AT2受体都发挥抑制生长的作用或细胞凋亡作用(Horiuchi，M.等，Endocr.Res.24：307-314(1998))，其在PC12细胞中表达，并已显示能抑制JAK/STAT信号级联(Horiuchi，M.等，Circ.Res.84：876-882(1999))。
期望能进一步地了解在α7 nAChR介导的有益途径和AT2介导的细胞凋亡作用之间任何关系，可通过调节nAChR和/或AT2的活性来使细胞的生存最大化。
也期望能进一步地了解在Aβ介导的毒性和受烟碱性受体影响的信号途径之间的任何关系。例如，进一步阐明这些关系能提供发现用于减轻阿尔茨海默病症状的治疗组合物。
发明简述
本发明提供了一种测定能刺激或抑制烟碱受体的物质的方法。本发明也提供了增加通过Janus-活化激酶2(JAK2)磷酸化介导刺激烟碱受体活性的物质的作用。
本发明者已经表明血管紧张素II，类型2(AT2)受体的拮抗剂(或能刺激AT2受体的物质的抑制剂)通过减轻或消除AT2介导的干扰烟碱受体诱导的JAK2磷酸化而增加烟碱样刺激物质的作用。进一步地，发明者已经证明通过JAK2的磷酸化启动抗β-淀粉状蛋白介导的毒性的烟碱性保护作用。提供了用于预防和/或治疗的方法和组合物和筛选方法，包括适合于高通量筛选(HTS)的方法。
因此，在一方面，本发明涉及一种筛选物质或能作用于烟碱受体物质的方法。该方法包含用测试化合物接触具有烟碱受体的细胞；和测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。
在另一方面，本发明涉及一种筛选能增加或减少能刺激烟碱受体物质的作用的物质的方法。该方法包含用能刺激烟碱受体的物质接触具有烟碱受体的细胞；用测试物质接触该细胞；和相对于在测试物质不存在的条件下当该细胞与能刺激烟碱受体的物质接触时测量的JAK2磷酸化水平，在存在测试物质的条件下测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。
还在另一方面，本发明涉及一种筛选能抑制或刺激AT2受体和/或削弱或增强介导对AT2受体作用的物质的作用的物质的方法。该方法包含用可刺激烟碱受体的物质接触具有烟碱受体和AT2受体的细胞；用测试物质接触该细胞；和相对于在测试物质不存在的条件下当该细胞与能刺激烟碱受体的物质接触时测量的JAK2磷酸化水平，在存在测试物质的条件下测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化的增加表示该测试物质抑制AT2受体，削弱了能刺激AT2受体的物质的作用，或增强了能抑制AT2受体的物质的作用。JAK2磷酸化的减少表示该测试物质刺激AT2受体，增强了能刺激AT2受体的物质的作用，或削弱了能抑制AT2受体的物质的作用。
还在另一方面，本发明涉及一种减少含有烟碱受体和AT2受体的细胞的凋亡的方法。该方法包含用能刺激烟碱受体的物质和AT2受体的抑制剂或能刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者接触该细胞。
还在另一方面，本发明涉及一种减少含有烟碱受体和AT2受体的细胞的凋亡的方法。该方法包含用能刺激烟碱受体的物质接触该细胞；和用AT2受体的抑制剂或能刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者接触细胞。
还在另一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防患有通过烟碱受体介导的中枢神经***病症的患者的方法。该方法包含施用有效量的包括至少一种AT2受体抑制剂或至少一种能刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；能刺激烟碱受体的物质；和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物的量能有效地刺激烟碱受体。
仍在另一方面，本发明涉及一种用于治疗和/或预防中枢神经***病症施用于患有该病症的患者的药物组合物。该药物组合物包含至少一种AT2受体抑制剂或至少一种能刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；能刺激烟碱受体的物质；和药学上可接受的载体。
本发明也提供了涉及β-淀粉状蛋白和烟碱样受体相互作用的方法和组合物。因此，在一方面，本发明涉及一种筛选能作用于通过β-淀粉状蛋白肽、多肽或蛋白和烟碱样受体的结合而介导的β-淀粉状蛋白关联的神经毒性的物质的方法。该方法包含用β-淀粉状蛋白多肽接触具有烟碱受体的细胞和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的水平；和用测试物质接触该细胞并测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。
在另一方面，本发明也涉及一种筛选能减少通过β-淀粉状蛋白多肽和烟碱受体结合介导的β-淀粉状蛋白多肽的神经毒性的物质的方法。该方法包含用β-淀粉状蛋白多肽接触具有烟碱受体的细胞和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的水平；和用测试物质接触该细胞并测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。任何JAK2磷酸化的增加意味着该测试物质减少β-淀粉状蛋白肽的神经毒性。
在另一方面，本发明涉及一种防止或减少具有烟碱受体的细胞的凋亡的方法，包含用能增加JAK2磷酸化的物质接触该细胞。此细胞凋亡与β-淀粉状蛋白介导的毒性相关。
在另一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗与阿尔茨海默病有关的神经变性的方法，包含施用治疗有效量的可增加JAK2磷酸化的物质。
还在另一方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗与与阿尔茨海默病有关的神经变性的组合物，包含治疗有效量的可增加JAK2磷酸化的物质。
附图简要描述
图1显示在PC12细胞中JAK2抑制剂AG-490对烟碱诱导的JAK2和PI-3激酶的酪氨酸磷酸化和Akt的丝氨酸磷酸化的作用。PC12细胞，在存在或不存在10μM的JAK2抑制剂AG-490条件下，预温育1小时，用烟碱(10μM)刺激不同的时间(0，5，10，30，60和120分钟)。裂解细胞并用磷酸特异性和磷酸非特异性抗JAK2和抗Akt抗体免疫印迹，或裂解细胞，用抗PI-3激酶抗体免疫沉淀。PI-3激酶免疫沉淀的蛋白接着用抗磷酸酪氨酸和抗PI-3激酶的抗体免疫印迹。结果显示的是三次实验的代表值。
图2显示Western印迹分析结果，阐明了在PC12细胞中烟碱对由α7受体形成的JAK2复合体的影响。PC12细胞用烟碱(10μM)刺激不同的时间(0，5，10，30和60分钟)。细胞被裂解，并用抗JAK2的抗体从裂解液(1mg蛋白)中免疫沉淀JAK2。免疫沉淀物接着用抗α7抗体进行免疫印迹。在三次实验中获得了相似的结果。
图3显示在PC12细胞中用或不用AngII受体拮抗剂预处理的AngII对烟碱诱导的JAK2活化的作用。PC12细胞，在有或无100nM的AT1拮抗剂(candesartan)或100nM的AT2拮抗剂(PD 123177)的100nM的AngII存在或不存在的条件下预温育8小时，用烟碱(10μM)刺激不同的时间(0，10和30分钟)。细胞也用磷酸特异性和磷酸非特异性抗JAK2裂解和免疫印迹。结果显示的是三次实验的代表值。
图4是一副表示在PC12细胞中JKA2抑制剂AG-490对抗Aβ-和AngII诱导的细胞死亡的烟碱保护作用的影响的图。PC12细胞在存在或不存在烟碱和/或AG-490的条件下，用100nM的Aβ(1-42)肽或100nM的AngII处理8小时。PC12细胞培养用在实施例中描述的方法进行，并在分别温育结束后计数细胞数目。结果代表四个独立培养物的平均±SEM。Aβ诱导细胞数目明显的减少(*P＜0.01)，其通过用烟碱共温育其明显地被抑制(**P＜0.01)。在另一方面，烟碱在存在AG-490的条件下无作用。AngII也明显地减少PC12细胞的数目(+P＜0.01)，用烟碱对结果没有明显地影响(#P＞0.05)。
图5是一副表示在PC12细胞中JAK2抑制剂AG-490和烟碱对Aβ(1-42)淀粉状蛋白诱导的caspase 3的激活的影响的图。PC12细胞在存在或不存在10μM的烟碱和用AG-490(10μM)共温育的烟碱的条件下用100nM的Aβ(1-42)温育0，2，4，8，12和24小时。Caspase 3活性用实施例中描述的方法测定。结果代表三个独立培养物的平均±SEM。在4，8，12和24小时，Aβ诱导的caspase3活性明显地增加(*P＜0.01)，其被与烟碱共温育明显地抑制(**P＜0.01)。在另一方面，烟碱在AG-490存在的条件下无作用。
图6显示Western印迹分析结果，阐明了在PC12细胞中JAK2抑制剂(AG-490)对抗Aβ诱导的细胞凋亡的烟碱保护作用的作用。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是细胞在经历凋亡过程中的标记物。通过Western印迹分析在存在或不存在烟碱和/或AG-490的条件下用Aβ处理8小时的PC12细胞核的提取物来测定PARP的表达。
图7显示Western印迹分析结果，阐明了在PC12细胞中JAK2抑制剂(AG-490)对抗Aβ-和AngII-诱导的细胞凋亡的烟碱保护作用的作用。PARP是细胞在经历凋亡过程中的标记物。通过Western印迹分析在存在或不存在烟碱和/或AG-490的条件下用100nM的Aβ(1-42)肽或100nM的AngII处理8小时的PC12细胞裂解物来测定PARP的表达。
图8显示Western印迹分析结果，阐明了α7nAChR和Aβ(1-42)淀粉状蛋白的共免疫沉淀。制备自用10μM的Aβ(1-42)肽处理5分钟的PC12细胞的等量的PC12细胞膜蛋白用抗Aβ(1-42)免疫沉淀并用抗α7nAChR进行Western印迹分析。第1行是用Aβ(1-42)肽单独处理的细胞，和第2行是在存在AG-490(10μM)的条件下用Aβ(1-42)肽处理的细胞。在存在10μM的烟碱和有AG-490或无AG-490的条件下用10μM的Aβ(1-42)肽处理的PC12细胞分别在第3行和第4行中显示。
图9显示Western印迹分析结果，阐明了AG-490对Aβ(1-42)淀粉状蛋白诱导的JAK2磷酸化的作用。PC12细胞，在存在或不存在10μM的JAK2抑制剂AG-490的条件下预温育1小时，用100nM(A)或1μM(B)的Aβ(1-42)淀粉状蛋白肽刺激不同的时间(0，5，10，30，60和120分钟)。裂解细胞并用磷酸特异性和磷酸非特异性抗JAK2抗体免疫印迹。结果显示的是三次实验的代表值。
图10是烟碱受体介导的生存途径的示意图，阐明了该途径与AT2-和Aβ介导的凋亡途径的关系。
图11显示Western印迹分析，基本同图1一样进行，使用化合物TC-1698并显示在PC12细胞中JAK2、Akt和PI-3激酶的活化，在存在JAK2抑制剂AG-490的条件下激活被抑制。
图12阐明在PC12细胞中血管紧张素II诱导的SHP-1的磷酸化。
图13阐明在PC12细胞中SHP-1抑制剂钒酸盐(vanadate)对血管紧张素II诱导的SHP-1的激活的作用(见，Jiao，H.，等，Mol Cell Biol 16(12)：6985-92(1996)，在此全文作为参考文献，用于SHP-1活性单位的定义)。
图14阐明JAK2抑制剂AG-490和SHP-1抑制剂钒酸盐对TC-1698诱导的抗Aβ(1-42)和血管紧张素II诱导的细胞凋亡的神经保护作用的作用(PARP是凋亡的标记物—缺乏表明产生神经保护的影响，如上所述及于此所述)。
图15显示在存在或不存在SHP-1抑制剂钒酸盐的条件下，在PC12细胞中TC-1698诱导的JAK2的激活。
发明详述
本发明提供了用于检测能刺激或抑制(直接或间接)烟碱受体的物质的筛选方法，包括高通量的方法。这些因子可以针对α7烟碱受体被检测并鉴定。测量Janus活化激酶2(JAK2)的酪氨酸磷酸化可检测烟碱受体的激活或抑制。进一步地，提供筛选方法，能检测和鉴定能刺激或抑制(直接或间接)AT2受体的物质。也提供了减少细胞凋亡和增加能刺激烟碱受体物质的作用的方法
在一些情况中，可期望进行初步或随后的筛选分析来确定是否测试物质对细胞凋亡途径(如，AT2或Aβ途径)能发挥抑制作用，或对存活途径(如，烟碱途径)具有刺激效应。例如，单独的配体可通过使用选择性激动剂或拮抗剂的竞争性结合方法来测试以排除任一途径。但是本发明的筛选方法不需要该额外的测定方法，无需进一步的筛选就能完成对测试物质的所需的评估。
本发明也证明了β-淀粉状蛋白肽和α7烟碱样乙酰胆碱受体(α7-nAChR)之间的直接相互作用。进一步地，也阐明了nAChR介导的神经保护的分子机制，包括JAK2磷酸化信号级联。α7-nAChR的烟碱刺激导致磷酸化酪氨酸激酶Janus活化激酶2(JAK2)的水平开始的增加和随后PI-3激酶和Akt的磷酸化水平的增加。这些作用通过用JAK2特异性抑制剂AG-490预温育和通过用α-Bgt阻断。α7-nAChR用磷酸化的JAK2共沉淀且该作用和烟碱对Aβ毒性的神经保护作用可通过AG-490被取消。在缺乏烟碱的条件下，暴露于β-淀粉状蛋白导致和JAK2解偶联，诱导产生caspase-3，并诱导产生DNA修复酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。此级联用烟碱通过JAK2磷酸化被抑制。这些发现暗示α7-nAChR在产生神经保护的级联中经JAK2转导信号到PI3K和Akt。在α7-nAChR和β-淀粉状蛋白诱导的细胞死亡之间的负反馈调节通过JAK2磷酸化介导。烟碱刺激的JAK2和它的神经保护作用通过激活AT2受体可被阻止。因此，本发明人已经确定关于神经生存能力的受体相互作用的新机制。该机制为尽可能地保护神经提供了新的治疗策略。
本发明的方法和组合物可选择性地针对α7nAChR。本发明这方面能提供用于选择性增强α7介导的活性，因此可达到本文中所述的有益作用且副作用发生率低，如，那些通过非α7受体亚型介导的副作用。为了达到本发明此方面的有益效果，结合α7受体的选择性比其它受体亚型高大约10到大约100倍。进一步地，对于α7-nAChR的选择性能高大约100到大约1000倍。作为公认的，选择性也能通过评估功能的激活或抑制被确定，如，依本发明通过测量JAK2磷酸化来确定。
也提供了预防和/或治疗中枢神经***病症的方法，在该方法中使用的药物组合物。
本文中所用的如下术语具有的含义表示为：
“激动剂”是一种能刺激其结合配偶体，特别是受体的物质。刺激在上下文的特殊方法中定义的，或是在文献中显而易见的，通过与被本领域技术人员公认的特殊结合配偶体的“激动剂”或“部分激动剂”的因子或物质作比较的讨论中得到。刺激也可被定义为通过激动剂或部分激动剂与结合配偶体的相互作用所诱导的在特定作用或功能中的增加，且能包括变构作用。
“拮抗剂”是一种能抑制其结合配偶体，特别是受体的物质。抑制在上下文的特殊方法中定义，或在文献中显而易见的，通过与被本领域技术人员公认的特殊结合配偶体的“拮抗剂”的因子或物质作比较的讨论中得到的。抑制也可被定义为通过拮抗剂与结合配偶体的相互作用所诱导的在特定作用或功能中的减少，且能包括变构作用。
在这里，术语Aβ、Aβ肽、β-淀粉状蛋白、淀粉状蛋白β和淀粉状蛋白指与阿尔茨海默病的淀粉状蛋白特性有关的任何种类的肽、多肽或蛋白。术语“Aβ(1-42)”指42个氨基酸的β-淀粉状蛋白，但也包括能结合烟碱受体或介导通过烟碱受体的作用的其片段。
术语“α7nAChR”指被报道在动物和人类中与认知和神经保护相关的同五聚(homopentamieric)的烟碱性乙酰胆碱受体。在人脑中也广泛表达的异五聚α4β2也具有这些作用(见Bencheri，M.和J.D.Schmitt，Current Drug Targets第1卷，第4期，2002年8月；pp349-357的评论—也见整期，其专门讨论烟碱受体的分布和作用(如α4β2和α7))。因此，术语“nACnR”和“烟碱受体”在这里包括包含这些亚基的此类受体。
在这里所用的“PC12”指大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞系PC12。该细胞系，最初由Greene和Tischler建立(Greene，L.A.和A.S.Tischler，Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenalpheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor.ProcNatl Acad Sci USA，73(7)：2424-8(1976))，其已被经常地用于研究神经元乙酰胆碱受体，包括α7nAChR(见，如Patrick，J.和W.B.Stallcup，Immunological distinction between acetylcholine receptorand the alpha-bungarotoxin-binding component on sympatheticneurons.Proc Natl Acad Sci U S A.，74(10)：4689-92(1977)；Whiting，等，Functional acetylcholine receptor inPC12 cells.Nature 327：515-518(1987)；Cooper，S.T.和N.S.Millar，Host cell-specificfolding and assembly of the neuronal nicotinic acetylcholine receptoralpha7 subunit.J.Neurochem.68(5)：2140-51(1997)，所有的全文在此引用作为参考)。血管紧张素受体亚型II(AT2)也已在PC12细胞中表达(见，如Wolf，G.等，Angiotensin II′s antiproliferative effectsmediated through AT2-receptors depend on down-regulation of SM-20.Lab Invest.82(10)：1305-17(2002)；和Lehtonen，J.Y.等，Analysisof functional domains of angiotensin II type 2 receptor involved inapoptosis.MolEndocrinol.13(7)：1051-60(1999)，所有的全文在此引用作为参考)。该PC12细胞系众所周知且已被保藏，如，具有美国典型培养物收集中心保藏号ATCC：CRL-1721。
现有编码nAChRs的多种核酸序列，包括编码α7的核酸序列(见，如，Chini，B.等，Molecular cloning and chromosomal localization ofthe human alpha7-nicotinic receptor subunit gene(CHRNA7)，Genomics 19(2)：379-381(1994)；登录号NM_000746，版本NM_000746.2 GI：21536283，所有的全文在此引用作为参考)。
也已知编码AT2受体的核酸序列，和关于表达克隆的指南在文献中可得到(见，如，Mukoyama，M.等，Expression cloning of type 2angiotensin II receptor reveals a unique class of seven-transmembranereceptors.J Biol Chem.268(33)：24539-42(1993)；Nakajima，M.等，Cloning of cDNA and analysis of the gene for mouse angiotensin IItype 2 receptor.Biochem Biophys Res Commun.197(2)：393-9(1993)；和Nakajima，M.等，The angiotensinII type 2(AT2)receptorantagonizes the growth effects of the AT1 receptor：gain-of-functionstudy using gene transfer.Proc Natl Acad Sci USA.92(23)：10663-7(1995)；Homo sapiens angiotensin receptor 2(AGTR2)，mRNA，登录号XM_030897，版本XM_030897.2 GI：22058388，所有的全文在此引用作为参考)。
当然，其它适合于本发明方法的细胞系存在并可被制备。例如，人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y也是“α7容许的”并可用于根据本发明的α7特异性方法(见，如，Cooper，S.T.和N.S.Millar，JNeurochem.68(5)：2140-51(1997))。基于对nAChR亚型的评价，其它的细胞系可以是适用的。
除非另有指定，本发明的实施将使用本领域技术人员所熟悉的常规分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的技术。见，如，Sambrook，Fritsch，和Maniatis，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，(F.M.Ausubel等编，1987)；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，INC.)，PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.McPherson，B.D.Hames和(G.R.Taylor编，1995)；ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编，1987)；ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL(Harlow等编，1987)，所有的全文在此引用作为参考。
因此，在一方面，本发明涉及一种通过用测试物质接触具有烟碱受体的细胞；和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的任何增加或减少来筛选能作用烟碱受体的物质的方法。JAK2磷酸化的增加表示此测试物质刺激了烟碱受体，和JAK2磷酸化的减少表示此测试物质抑制了烟碱受体。
此测试物质可以是测试物质文库中的一员，且该文库可是组合化学文库、肽、多肽、非肽肽模拟物、抗体或小分子有机化合物文库。该文库也可以是化合物的随机组合。该测试物质可通过高通量筛选被筛选。
在另一方面，本发明涉及一种筛选能增加或减少能刺激烟碱受体的物质的作用的物质的方法，通过用能刺激烟碱受体的物质来接触具有烟碱受体的细胞；用测试物质来接触该细胞；和相对于在不存在测试物质的条件下当细胞与能刺激烟碱受体的物质接触时测量的JAK2磷酸化水平，在存在测试物质的条件下测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化增加表示该测试物质增加了能刺激烟碱受体的物质对烟碱受体的作用；和JAK2磷酸化减少表示该测试物质减少了可刺激烟碱受体的物质对烟碱受体的作用。
在另一方面，本发明涉及一种筛选能抑制或刺激AT2受体的物质的方法，通过用能刺激烟碱受体的物质和具有烟碱受体和AT2受体的细胞接触；用测试物质接触该细胞；和相对于在不存在该测试物质的条件下当细胞与能刺激烟碱受体的物质接触时测量的JAK2磷酸化水平，在存在测试物质条件下测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化增加表示该测试物质抑制AT2受体；和JAK2磷酸化减少表示该测试物质刺激AT2受体。在不存在AT2受体的条件下测试物质对烟碱受体的任何作用被预先测定，相对于相关该作用的任何JAK2磷酸化的JAK2磷酸化的任何增加或减少被测定。此测试物质可以是测试物质文库的一员，且该文库可是组合化学文库、肽、多肽、非肽性肽模拟物(peptidominetic)、抗体或小分子有机化合物文库。该文库也可以是化合物的随机组合。该测试物质通过高通量筛选被筛选。
在另一方面，本发明涉及一种筛选可削弱或增强能刺激AT2受体的物质的作用的物质的方法，通过用能激烟碱受体和能激AT2受体的物质接触具有烟碱受体和AT2受体的细胞；用测试物质接触该细胞；和相对于在不存在测试物质的条件下当细胞和能刺激烟碱受体的物质及能刺激AT2受体的物质接触时测量的JAK2磷酸化水平，在存在测试物质的条件下测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化增加表示该测试物质削弱了能刺激AT2受体的物质的作用，或增强了能抑制AT2受体的物质的作用；和JAK2磷酸化减少表示该测试物质增强了能刺激AT2受体的物质的作用，或削弱了能抑制AT2受体的物质的作用。
在另一方面，本发明涉及一种筛选对通过烟碱样受体介导的β淀粉状蛋白关联的神经毒性具有作用的物质的方法，通过用β淀粉状蛋白肽接触含有烟碱受体的细胞并测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和用测试物质接触该细胞并测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化的增加表示该测试物质是一种能进一步用于评估作为能减少β淀粉状蛋白关联的神经毒性的物质的一种候选物质。
在另一方面，本发明涉及一种筛选能减少通过烟碱性受体介导的β淀粉状蛋白肽的神经毒性的物质的方法，通过用β淀粉状蛋白肽和含有烟碱受体的细胞接触并测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和用测试物质接触该细胞并测定JAK2磷酸化的任何增加或减少。JAK2磷酸化的任何增加表示该测试物质减少β淀粉状蛋白肽的神经毒性。
在另一方面，本发明涉及一种在包含有烟碱受体和AT2受体的细胞中增加能刺激烟碱受体的物质的作用的方法，通过用能刺激烟碱受体的物质接触该细胞；和用选自AT2受体抑制剂和能刺激AT2受体的物质的抑制剂的物质接触该细胞。
在另一方面，本发明涉及一种在包含有烟碱受体和AT2受体的细胞中减少细胞凋亡的方法，通过用能刺激烟碱受体的物质接触该细胞；和用选自AT2受体的抑制剂和能刺激AT2受体的物质的抑制剂的物质和该细胞接触。增加的细胞存活表示凋亡的减少。减少的凋亡也能通过多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)活性的减少、caspase3活性的减少，或Bcl2的诱导结果来表示。
在另一方面，本发明涉及一种用于患有通过烟碱受体介导的中枢神经***病症的患者的治疗或预防的方法，通过施用一定量的包含有能刺激烟碱受体的物质；至少一种AT2受体抑制剂或至少一种可刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物的用量能有效地刺激此受体。
在另一方面，本发明涉及一种治疗与阿尔茨海默病相关的神经变性的方法，通过施用治疗有效量的可增加JAK2酪氨酸磷酸化的物质。
在另一方面，本发明涉及一种治疗或预防与阿尔茨海默病相关的神经变性的方法，通过施用一定量的包含能刺激烟碱受体的物质；至少一种AT2受体抑制剂或至少一种可刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物的用量能有效地刺激此受体。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防中枢神经***病症施用于患有该病症的患者的药物组合物，包含能刺激烟碱受体的物质；和至少一种AT2受体抑制剂或至少一种可刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体。该能刺激烟碱受体的物质可以是胆碱能配体、烟碱性激动剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂。此可刺激烟碱受体的物质也对α7-nAChR是选择性的。此对α7-nAChR选择性的选择性物质能是取代的奎宁环化合物。此物质也能用选自下列的I、II和III式表示：
Figure A0282504700251
能抑制AT2受体或抑制能刺激AT2受体的物质的物质可以是一种能抑制能刺激AT2的物质的物质，包括，例如，血管紧张素II转换酶(ACE)抑制剂。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗或预防神经变性病症施用于患有该病症的患者的药物组合物，包含能刺激烟碱受体的物质；和至少一种AT2受体抑制剂或至少一种可刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体。该能刺激烟碱受体的物质可以是胆碱能配体、烟碱性激动剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂。能刺激烟碱受体的物质对α7-nAChR是选择性的。对α7-nAChR是选择性的物质可以是取代的奎宁环化合物。刺激烟碱受体的物质能用选自下列的I、II和III式表示：
能抑制AT2受体或抑制能刺激AT2受体的物质的物质可以是一种抑制能刺激AT2的物质的物质，例如，血管紧张素II转换酶(ACE)抑制剂。抑制AT2受体或抑制能刺激AT2受体的物质的物质是一种能刺激AT2的物质。该刺激AT2的物质可以是PD123177和/或PD123319。
神经元信号中的烟碱和JAK/STAT途径  在PC12细胞中烟碱激活生长启动酶Janus活化激酶2(JAK2)。这些细胞和JAK2特异性抑制剂AG490预温育(见Kumano，K.，A.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.270：209-214(2000))阻断了PI3K和Akt的烟碱诱导活化(图1)。此外，在JAK2和α7受体之间烟碱也诱导形成复合物(图2)。这些结果为在PC12细胞中JAK2和烟碱诱导的PI3K级联活化之间联系提供了直接的证据。
JAK2抑制剂AG490对PC12细胞中烟碱诱导的JAK2和PI-3激酶酪氨酸磷酸化和Akt的丝氨酸磷酸化的作用  在响应烟碱的5到10分钟内JAK2酪氨酸磷酸化且该激活甚至在暴露于烟碱后的更长时间(120分钟)内，仍保持在超过基底的水平上(图1)。JAK2抑制剂AG-490抑制该基底水平和烟碱刺激的JAK2酪氨酸磷酸化、PI-3K酪氨酸磷酸化和Akt丝氨酸磷酸化(图1)。相似的结果在人细胞系SH-SY5Y中也观察到了。这些结果暗示通过烟碱的JAK2的激活在PI-3K和其效应物Akt的激活之前。JAK2激活能被α银环蛇毒素预温育完全阻止，证明了受体介导作用(图3)。
烟碱对与α7受体形成的JAK2复合物的作用  为检验JAK2直接和α7-nAChR相互作用的假设，用兔多克隆抗JAK2抗体来进行免疫沉淀研究。培养的PC12细胞用烟碱(10μM)刺激不同时间，裂解，且JAK2用抗JAK2抗体来免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白通过凝胶电泳被分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用抗α7的抗体进行免疫印迹。如图2中所示，在5分钟内烟碱诱导了JAK2和α7受体的快速结合。α7受体结合JAK2的时间过程类似于烟碱诱导的JAK2的激活(图1)。当该实验用抗α7受体的抗体来免疫沉淀此受体并用抗JAK2的抗体进行Western印迹的标记时，也获得了同样的结果。
用或不用AngII受体拮抗剂预处理的AngII对烟碱诱导的JAK2的激活的作用  AngII发挥其生物学功能通过激活两种不同的受体，它们已知为AT1和AT2受体，都属于G蛋白偶联受体家族(Horiuchi，M.，W.等，Circ.Res.84：876-882(1999))。不但在培养的细胞和其它PC12细胞中，也同样在体内该AT1受体刺激增殖，而AT2受体发挥生长抑制作用(Gallinat，S.，S.等.，FEBS Lett.443：75-79(1999))。此外，还报道在来自阿尔茨海默病患者的颞叶(temporal)皮层中血管紧张素转化酶的密度增加了(Barnes，N.M.等，Eur.J.Pharmacol.200：289-292(1991))。与血管紧张素II(AngII)预温育的PC12细胞通过AT2受体阻断烟碱诱导的JAK2的激活(图3)。
与AngII预温育的PC12细胞通过AT2受体阻断了烟碱诱导的JAK2酪氨酸磷酸化(图3)。该抑制通过用AT2拮抗剂(100nM的PD123177)预温育可被完全地阻止，但不被AT1拮抗剂(100nM的candesartan)阻止，与在PC12细胞中表达的受体表现型一致。烟碱诱导的JAK2磷酸化的抑制伴有烟碱诱导的神经保护的完全逆转，通过细胞生存和通过烟碱非敏感的PARP诱导来表示。
α7-nAChR和Aβ(1-42)淀粉状蛋白的共免疫沉淀和JAK2磷酸化  近来的研究已经表明Aβ(1-42)高亲和力与α7-nAChR结合，且该相互作用能被α7-nAChR的拮抗剂抑制。该研究导致本发明证实了在用Aβ(1-42)(10μM，5分钟)处理并用抗Aβ(1-42)抗体免疫沉淀的细胞中Aβ(1-42)与α7-nAChR之间的分子结合。用抗α7-nAChR抗体的Western印迹分析鉴定一个与内源的Aβ(1-42)共免疫沉淀与抗α7-nAChR反应的57kDa的蛋白(图8)。用AG-490预处理的细胞中该作用被阻止(图8)。然而，当细胞用10μM烟碱共温育时，Aβ(1-42)和α7-nAChR的复合物形成甚至在存在AG-490的条件下被阻断(图8)。虽然不希望与任何特殊的理论束缚，这些结果看来暗示在Aβ(1-42)和α7-nAChR之间的相互作用能通过烟碱不依赖JAK2被抑制。用Aβ(1-42)(0.1μM到1μM)预处理并不能导致JAK2的活化(图9A和9B)，甚至在十分高的浓度下(如在10μM和100μM下，在图9A和9B中未显示)也不行。
烟碱对Aβ(1-42)诱导的细胞凋亡的作用和JAK2的作用Caspase 3在PC12细胞中表达，且已知与细胞凋亡有关。在Aβ(1-42)诱导的细胞凋亡后测定Caspase 3活性。荧光肽底物Ac-DEVD-7AMC被用于测量在细胞裂解物中的caspase 3类似的(caspase 3-like)活性。在图5中所示，导致分解肽底物Ac-DEVD-7AMC的caspase 3活性在4小时的Aβ(1-42)处理后是明显的且随着时间的过去一直增加，直到处理8小时后达到顶峰。Aβ(1-42)诱导的caspase 3的活化通过烟碱被阻断(P＜0.01)，而该抑制通过AG-490被阻止(图5)。
在Aβ(1-42)处理后caspase 3的激活通过用Western印迹方法测量DNA修复酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解进一步地被研究。PARP是caspase 3的内源性底物，在不同形式的细胞凋亡中其被裂解为典型的85kDa片段。如图7所示，在Aβ(1-42)处理后PARP(116KDa)被裂解成其85kDa片段。此PARP裂解进一步地表明在Aβ(1-42)诱导的细胞死亡中caspase 3或caspase 3类似蛋白酶被激活。
测试在存在或不存在Aβ(1-42)的条件下，在烟碱诱导的细胞保护中JAK2所涉及的情况。在存在或不存在烟碱和AG-490的条件下，在Aβ(1-42)和AngII处理后用COULTTER计数器(zM型，Coulter，Hialeah，F1)测量PC12细胞数目的减少。如图4所示，通过Aβ(1-42)处理诱导的细胞死亡在存在烟碱的条件下明显地减少(P＜0.01)。当与AG-490共温育时，烟碱对Aβ(1-42)诱导的细胞死亡没有影响(图4)。这些结果证明了JAK2在烟碱诱导的抗Aβ(1-42)诱导的细胞死亡的神经保护中起作用。相反地，AngII诱导的细胞凋亡不受烟碱的影响(图4)。
α7-nAChR/JAK2神经保护级联  在α7-nAChR和酪氨酸磷酸化酶JAK2之间的直接关联产生随即而来的PI-3-K、Akt和Bcl-2诱导的激活。当Aβ(1-42)与α7-nAChR相互作用时，该复合物的形成和下游的神经保护级联被阻止。通过前凋亡事件包括caspase 3诱导、PARP诱导和细胞生存的减少被证实。然而，通过JAK2激活与α7-nAChR相互作用的烟碱对Aβ(1-42)的毒性是有“统治优势”的，通过AT2受体激活烟碱神经保护作用能被中和，可通过JAK2的磷酸化被逆转以烟碱诱导的神经保护作用的抑制来证明。
烟碱性神经传递在AD患者的脑中受到损害且在β-淀粉状蛋白的沉淀脑区中而选择性失去nAChR的主要作用(Court，J.，等，Biol.Psychiatry 49：175-184(2001))。在包括由β-淀粉状蛋白毒性产生的神经元死亡的许多的细胞和动物模型中，大量的证据表明神经元烟碱性受体(NNR)-选择性配体也能提供神经保护作用。通过近来的发现证实了在β-淀粉状蛋白肽和α7-nAChR之间的直接相互作用。β-淀粉状蛋白肽高亲和力与α7-nAChR相互作用，并导致在海马神经元中α7-nAChR的功能性非竞争阻断(Wang，H.Y.等，J.Biol.Chem.275：5626-5632(2000)；Liu，Q.等，Proc Natl Acad Sci USA 98(8)：4734-9(2001))。在克隆细胞中烟碱介导的神经保护机制与PI3P激酶的磷酸化有关，该酶涉及磷酸肌醇新陈代谢及与细胞的生存和凋亡相关。在许多研究中已经报道了经JAK2的抗凋亡信号转导。在造血细胞中，JAK2的激酶功能区介导Bcl-2的诱导并抑制细胞死亡(Sakai，1.和A.S.Kraft，J.Biol.Chem.272：12350-12358(1997))。用JAK2抑制剂AG-490处理减少PI-3-K的磷酸化(Kumano，K.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.270：209-214(2000))和STAT3的磷酸化，其导致在急性心肌梗塞中caspase-3活性和Bax蛋白的增加(Negoro，S.等，Cardiovasc.Res.47：797-805(2000))。神经元EPO受体(EPORs)激活阻止了通过在JAK2信号途径和核因子-kappaB(NF-kappaB)之间触发通讯(crosstalk)由NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)或NO诱导的细胞凋亡(Digicaylioglu，M.和S.A.Lipton.Nature 412：641-647(2001))。
本发明已表明α7-nAChR激活诱导JAK2磷酸化且此最初事件伴随PI-3激酶的磷酸化和Akt的磷酸化，如AG-490对上述两种蛋白的磷酸化的抑制作用所示。在存在烟碱条件下JAK2磷酸化可被α-银环蛇毒素(α7-nAChR的一种拮抗剂)所完全抑制。烟碱刺激的α7-nAChR导致在α7受体蛋白和酪氨酸磷酸化的JAK2之间形成一种复合物。
因为基于配体结合和功能的研究，已报道在α7-nAChR和Aβ(1-42)之间的相互作用，β-淀粉状蛋白也能诱导α7-nAChR/JAK2复合物的可能性被测试。证实了β-淀粉状蛋白和α7-nAChR的关联，但显示结合没有引起可检测水平的酪氨酸磷酸化JAK2。在存在烟碱的条件下，在细胞裂解物中Aβ免疫反应性没有被检测到，表明烟碱已经从α7-nAChR“置换”了Aβ。该作用不依赖于JAK2的磷酸化，通过在存在AG-490的条件下该作用缺少任何逆转作用所证明。
烟碱抑制Aβ毒性的机制是不清楚的。本发明阐明了JAK2酪氨酸磷酸化在细胞生存和前细胞凋亡途径的抑制中涉及的的关键细胞酶的α7-nAChR激活过程中的重要作用。烟碱抑制β-淀粉状蛋白细胞毒性且该作用能被JAK2酪氨酸磷酸化的抑制所完全阻止。这些作用能通过细胞毒性的标记(如PARP)、前细胞凋亡酶的诱导(如，caspase 3)、细胞数目或Bcl2的诱导的测定来证明。
AT2受体在PC12细胞中表达并已表明可抑制JAK/STAT信号级联(Kunioku，H.等，Neurosci.Lett.309：13-16(2001))。相对于烟碱诱导的抗Aβ(1-42)的神经保护，用AngII预处理的细胞阻断了经AT2受体烟碱诱导的JAK2的活化，并完全阻止了α7-nAChR介导的神经保护作用，进一步地证实JAK2磷酸化的关键作用。本发明阐明了α7-nAChR和AT2受体活性(激活后者抑制了前者的潜在作用)对于细胞生存的对立的作用。这些结果和磷酸化的JAK2的这些途径集中表明了α7-nAChR介导的抗Aβ(1-42)的神经保护的恢复在AT2介导的JAK2磷酸化的抑制被最小化的条件下可被最优化。这些发现证明了新的分子机制，其与AT2和β-淀粉状蛋白对在阿尔茨海默病患者的脑中观察到的病理生理学的作用完全一致。
高通量筛选(HTS)  本发明的筛选方法可容易地适用于推动高通量分析。酪氨酸磷酸化状态的评估提供了关于能刺激或抑制烟碱受体如α7受体、或能刺激或抑制AT2受体的候选物质的信息。
物质(化合物)可存在于组合的或其他化合物文库中，例如，先导产生(lead generation)和/或先导最优化(lead optimization)文库。对于本发明的目的而言，先导产生文库是含有潜在的先导化合物的比较大的文库，先导最优化文库是围绕着通过分析先导产生文库而被鉴定为潜在的先导化合物的化合物而产生的。这些文库典型地包括大量的化合物，包括至少两个化合物，和可包括超过好几万个化合物。
潜在的活性化合物的逻辑排列集合能用在此所述的高通量生物鉴定法测定，如结构-活性关系(SARs)能被获得。用于排列测定化合物的逻辑排列的方法为本领域的技术人员所熟知，并在例如，Zambias等的美国专利5,962,736中描述，其内容在此全文引入作为参考。在一个实施方案中，化合物被加到“阵列”形式的多孔滴定板上，在此其定义为Cartesian coordinates逻辑位置排序的化合物，该阵列包括具有类似核心结构和不同的取代基的化合物。关于HTS分析方法的额外指南见Brooker的美国专利6,468,736；和Wu的美国申请公开号2002/0039749A1。
通过在多管阵列或多孔板中以逻辑阵列的方式放置化合物，可评估单个化合物的作用，并与结构类似的化合物作比较以产生SAR数据。
在一个实施方案中，化合物的特性和活性被储存在相关的数据库中。通过评估SAR数据，可鉴定出先导化合物，并设计出最优化的先导文库。可用一种自动生成完全相关结构信息的方法来评价逻辑排列的阵列，这样一个阳性结果可提供：(1)在多孔平板上的任何给定空间地址的化合物的信息和(2)在存在阳性结果的条件下，从阴结果中提取相关结构信息的能力。
在本发明的分析中任何化学化合物都能被用作为测试物质(化合物)。该分析可被设计通过自动化该分析的步骤和为分析提供来自任何方便来源的化合物以筛选大的化学文库，其可典型地平行运行(如，在自动分析中在微量滴定板上以微滴的形式)。有许多的化学化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo)、Aldrich(St.Louis，Mo)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo)、Fluke Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，瑞士)等。
在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量测试物质的组合文库，接着该“组合化学文库”在一种或多种分析中被筛选，如在此所述的，来鉴定那些显示期望的特征活性的文库成员(特殊的化学物质或亚类)。这样鉴定的化合物可作为常规的“先导化合物”或它们本身能被用作为潜在的或实际的治疗剂。
组合化学文库是一个不同的化学化合物的集合，所述化合物通过组合许多的化学“结构单元”如反应物，通过化学合成或生物合成产生的。例如，线性组合的化学文库如多肽文库对于给定的化合物长度(即在多肽化合物中氨基酸的数目)通过结合一组化学结构单元(氨基酸)以任何可能的方式来形成。通过此化学结构单元的组合混合能合成成百万的化学化合物。
制备和筛选组合化学文库对于本领域的技术人员而言是众所周知的。这样的组合化学文库包括，但不限于，肽文库(见，如美国专利5,010,175，Fluka，int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature 354：84-88(1991))。其它用于产生化学多样性文库的化学物质也可被利用。这样的化学物质包括，但不限于：肽(peptoids)(PCT公开号WO 91/19735)、编码肽(PCT公开号WO 93/20242)、随机生物寡聚体(random bio-oligomers)(PCT公开号WO 92/00091)、苯并二氮杂(美国专利号5,288,514)、diversomers如乙内酰脲、苯并二氮杂和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、联乙烯多肽(vinylogous polypeptide)(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、类似有机合成的小化合物文库(Chen，等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 261：1303(1993))、和/或肽基膦酸盐(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(见，Ausubel，Berger和Sambrook，如上)、肽核酸文库(见美国专利号5,539,083)、抗体文库(见，如Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(见，如Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利号5,593,853)、有机小分子文库(见，如苯并二氮杂，Baum C & EN，Jan 18，page 33(1993)；类异戊二烯，美国专利号5,569,588；噻唑烷并酮(thiazolidinones)和metathiazanones，美国专利号5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物(morpholinocompounds)，美国专利号.5,506,337；苯并二氮杂，美国专利号.5,288,514，等)。
用于制备组合文库的设备是商品化的(见如，357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.，Symphony，Rainin，Wobum，Mass.，433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.，9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。此外，无数的组合文库本身是商品化的(见如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.，Martek Biosciences，Columbia，Md.，等)。
值得注意的是，本发明提供了影响烟碱受体活性的测试物质的体外分析方法，其通过以高通量形式检测JAK2酪氨酸磷酸化。由于这些分析方法是高度一致的，不包括任何测试物质的反应中测量JAK2磷酸化水平的对照反应是任选的。这样任选的对照反应是适当的并可增加该分析方法的可靠性。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括这样一个对照反应。对于所述的每一个分析方法，不包括测试物质的对照反应能提供JAK2磷酸化的背景水平的测试物质。
在一些分析方法中，期望使用阳性对照来确保分析方法的组分工作正常。至少两种类型的阳性对照是适合的。首先，一种已知的可增加JKA2磷酸化的nAChR刺激物可与该方法中的一种样品温育，且信号产生的增加通过本发明中的方法能被测定。其次，可加入一种已知的nAChR抑制剂，产生的活性减少被类似地检测。应当理解测试物质也能与刺激物质或抑制剂组合以发现抑制激活或通过存在已知的刺激物质或抑制剂导致的抑制的测试物质。因为由刺激nCAhR产生的JAK2磷酸化的水平在此证明被能刺激AT2受体的物质减少，应当理解用于测试通过AT2受体介导作用的物质的同样的方法可被安排来测试物质通过AT2介导的作用，或间接地，通过他们本身是AT2活性的调节剂的物质的作用(如，ACE抑制剂的作用，阻止形成AngII)。
在本发明的高通量分析方法中，在一天内可筛选多达几千种不同的测试物质。特别地，可用微量滴定板的每一个孔来对一个被选择的测试物质运行一个独立的分析，或如果要观察聚集或诱导时间的作用，每5-10个孔能测试一个单独的测试物质。因此，一块单独的标准的微量滴定板能分析大约100(96)个物质。如果使用1536孔板，那么一块单独的板能容易地分析大约100到1500个不同的化合物。每天可能分析许多不同的板；用本发明的完整的***可能分析筛选多达大约6,000～20,000个，甚至多达大约100,000～1,000,000个不同的化合物。
动物模型测试  就本发明的针对治疗和/或预防神经变性病症的组合物和方法而论，基于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导作用的动物模型是相关的(Behmand，R.A.和S.I.Harik.Nicotineenhances 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine neurotoxicity.J.Neurochem.，58：776-9(1992)；Ferger，B.等，Effects of nicotine onhydroxyl free radical formation in vitro and on MPTP-inducedneurotoxicity in vivo.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，358：351-9(1998)；Fung，Y.K.等，Chronic administration of nicotine failsto alter the MPTP-induced neurotoxicity in mice.Gen Pharmacol22(4)：669-72(1991)；Maggio，R.等，Nicotine prevents experimentalparkinsonism in rodents and induces striatal increase of neurotrophicfactors.J Neurochem，71：2439-46(1998)；和Parain，K等，Nicotine，but not cotinine，partially protects dopaminergic neurons againstMPTP-induced degeneration in mice.Brain Res.890：347-350(2001)，所有的全文在此一并引用作为参考)。
基于MPTP-诱导作用的模型包括慢性半帕金森氏病的猴(chronichemi-Parkinsonian monkeys)(Domino，E.F.等，Nicotine alone and incombination with L-DOPA methyl ester or the D(2)agonist N-0923 inMPTP-induced chronic hemiparkinsonian monkeys.Exp Neurol，158：414-21(1999)，全文在此引入作为参考)，在小鼠中黑质纹状体多巴胺神经元变性(Janson，A.M.等，Differential effects of acute andchronic nicotine treatment on MPTP-(l-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine)induced degeneration of nigrostriatal dopamineneurons in the black mouse Clin Investig，70：232-8(1992)，在此全文引入作为参考)，在MPTP-处理的动物中认知功能评估(Schneider，J.S.等，Nicotinic acetylcholine receptor agonist SIB-1508Y improvescognitive functioning in chronic low-dose MPTP-treated monkeys.JPharmacol Exp Ther，290：731-9(1999)，在此全文作为参考)，和测量1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)的纹状体(striatal)水平(Quik，M.和D.A.Di Monte，Nicotine administration reduces striatal MPP+levels inmice.Brain Res，917：219-24(2001)，在此全文作为参考)。
其它相关的动物模型包括红藻氨酸诱导的效应(Borlongan，C.V.等，(-)-nicotine protects against systemic kainic acid-inducedexcitotoxic effects.Exp Neurol，136：261-5(1995)，在此全文作为参考)，大鼠中6-羟多巴胺(6-OHDA)损害(Costa，G.等，Nicotineprevents striatal dopamine loss produced by 6-hydroxydopaminelesion in the substantia nigra.Brain Res，888：336-342(2001)；Ryan，R.E.等，Dose-related neuroprotective effects of chronic nicotine in6-hydroxydopamine treated rats，and loss of neuroprotection in α4nicotinic receptor subunit knockout mice.Br J Pharmacol.132：1650-6(2001)；和Soto-Otero，R.等，Effects of(-)-nicotine and(-)-cotinine on 6-hydroxydopamine-induced oxidative stress andneurotoxicity：relevance for Parkinson′s disease.Biochem Pharmacol，64(1)：125-35(2002)，在此全文作为参考)；喹啉酸诱导的海马神经变性(O’Neill，A.B.等，Histological and behavioral protection by(-)-nicotine against quinolinic acid-induced neurodegeneration in thehippocampus.Neurobiol Learn Mem，69：46-64(1998)，在此全文作为参考文献)；新生兴奋性中毒脑损伤的鼠模型(Laudenbach，V.等，Selective activation of central subtypes of nicotinic acetylcholinereceptor has opposite effects on neonatal excitotoxic brain injuries.FASEB J.16：423-425(2002)，在此全文作为参考)；和利血平-诱导的纹状体多巴胺缺乏(Oishi，R.等，Possible explanations for theantagonism by nicotine against reserpine-induced depletion ofmonoamines in mouse brain.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.348：154-7(1993))。
黑质纹状体多巴胺能神经元与老化相关的损失的作用也可被评估以测定用于预防或减轻神经变性疾病的潜在物质(见，如，Prasad，C.，等，Chronic nicotine intake decelerates aging of nigrostriataldopaminergic neurons.Life Sci，54：1169-84(1994)；和通常见，Picciotto，M.R.和M.Zoli，Nicotinic receptors in aging anddementia.J Neurobiol.53：641-55(2002)，在此所有的全文作为参考)。
组合物  预防和/或治疗的方法和药物组合物可包括直接或间接地刺激烟碱受体的物质和抑制AT2受体的物质。
直接或间接地刺激烟碱受体的物质包括α7激动剂、胆碱能配体、烟碱性激动剂和/或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本发明的烟碱受体激动剂可包括那些在如，美国专利5,977,144；美国专利6,218,383；美国专利6,310,102；美国专利6,232,316；Miller等，国际专利申请公开号WO0190109A1；Bencherif等，国际专利申请公开号WO 0182978A2；Dull等，国际专利申请公开号WO 0071520A2；Bencherif，国际专利申请公开号WO 0007600Al；和Caldwell等，国际专利申请公开号WO 9965876A1中所讨论的(在此所有的全文一并作为参考)。可用于根据本发明的方法的物质包括在下式I-III中所代表的化合物：
Figure A0282504700381
能被使用的物质也包括在美国专利5,952,339；5,986,100；6,057,446；和6,211,372中所披露的化合物(在此全文作为参考)。选择性刺激特定受体如α7-nAChR的物质能被使用。Schmitt和Bencherif提供了关于选择与特定受体包括α7-亚型可选择性相互作用的化合物的指南(见Schmitt，J.和M.Bencherif，Chapter 5，″NicotinicAcetylcholine Receptors，″in Ann.Rep.Med.Chem.35：41-51(2000)；和Schmitt，J.，Curr.Med.Chem.，7(8)：749-800(2000)，在此所有全文作为参考)。
已经报道有许多化合物和α7烟碱性受体相互作用，且已被建议作为治疗的基础。见，例如，PCT WO 99/62505、PCT WO 99/03859、PCT WO 97/30998、PCT W001/36417、PCT WO 02/15662、PCT WO02/16355、PCT WO 02/16356、PCT WO 02/16357、PCT WO 02/16358、PCT WO 02/17358，Stevens等，Psychopharm.136：320(1998)，Dolle等，J.Labelled Comp.Radiopharm.44：785-795(2001)和Macor，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：319-321(2001)和它们的参考文献。在这些化合物中，共有的结构主体是三位取代的二环(bicylic)胺(如，奎宁环)。类似的取代的奎宁环化合物也被报道可结合毒蕈碱性受体。见，如，Sabb的美国专利5,712,270和PCTs WO 02/00652和WO02/051841。
直接或间接地抑制AT2受体的物质包括可干扰AT2刺激物血管紧张素II转化酶或ACE的作用的ACE抑制剂(见Brown，N.J.和D.E.Vaughan，Circulation.97：1411-1420(1998)，在此全文作为参考)。这样的物质也包括AT2受体抑制剂自身(如，PD123177和PD123319；见Fischer，J.W.等，Cardiovasc.Res.51(4)：784-91(2001)；和Horiuchi等，J.Clin.Invest.103(1)：63-71(1999)，在此全文作为参考)。
多肽、抗体和相关的方法  化合物可以是，例如，抗体、抗体片段、酶、蛋白、肽、核酸如寡核苷酸或小分子。
具有一个或多个氨基酸的模拟物(mimic)，另外已知的多肽模拟物或肽模拟物也能被用作为本发明的蛋白或多肽化合物。在此所用的术语“模拟物”指氨基酸或该氨基酸的具有同样或类似功能特性的氨基酸类似物。因此，例如，(D)精氨酸类似物可以是(D)精氨酸的模拟物，如果该类似物在生理pH时含有具有正电荷的侧链，其为精氨酸特有的guinidinum侧链反应基团。多肽模拟物或肽模拟物是一种保留有位于相应多肽中的药效基团的类似多肽链的有机分子。基于对侧链功能性的修饰，在氨基酸和上述的肽模拟物中发生的非天然氨基酸取代能增强单独的多肽的整体活性或特性。例如，这些类型的改变能被应用在本发明的寡聚物组分中以进一步增强多肽抗酶解和/或提高其生物活性。
抗体可以是，例如，单克隆抗体、人源化(嵌合)或多克隆抗体和能利用常规技术制备的抗体。
能产生结合烟碱性受体，如α7-nAChR的抗体。也能产生结合AT2受体的抗体。这些抗体能被选择以致于当结合到它们的靶目标时，它们能有效地阻止受体的激活。也能产生结合刺激或抑制受体的物质的抗体，以某种方式干扰该物质所期望的功能或活性。也能制备结合并影响酶(如ACE)活性的抗体，其产生刺激或抑制受体活性的活性配体。在此，用于制备特导抗体的受体、配体、相关的酶和其它效应物可简单地称为“抗原”。术语“配体”可指受体的特异结合配偶体，其可刺激或抑制一种特殊的活性。
可使用多克隆抗体，倘若它们全部的作用是期望的作用(即期望的刺激或抑制作用)。单克隆抗体和人源化(嵌合)抗体都能被使用。通过空间干扰和/或结合到受体或配体的实际结合位点的全部或部分上，这些抗体可抑制结合配偶体如受体和它们的配体之间的结合。
术语“抗体”指一种实质上由免疫球蛋白基因或它们的片段编码的多肽，能特异地结合和识别被分析物或抗原，如与本发明的方法相关的受体和/或配体(刺激或抑制物质)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因和无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ型或λ型。重链分为γ型、μ型、α型、δ型或ε型，依次分别定义了免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。
典型的免疫球蛋白(抗体)的结构单位包括一个四聚体。每一个四聚体由两对同样的多肽链组成，每一对有一条“轻链”(大约25kDa)和一条“重链”(大约50-70kDa)。每一条链的N-末端有大约100到110个或更多的氨基酸组成的主要负责抗原识别的可变区。术语“轻链可变区”(或“VL”)和“重链可变区”(或“VH”)分别指这些轻链和重链。
抗体可以以例如完整的免疫球蛋白或许多通过用不同的肽酶消化产生的充分定性的抗原结合片段的形式存在。例如，胃蛋白酶消化抗体绞链区域的二硫键可产生F(ab′)2片段，Fab的二聚体，其自身是通过二硫键结合至VH-CH1的轻链。F(ab′)2片段在破坏铰链区二硫键的适度条件下能被还原，从而将该F(ab′)2二聚体转变为Fab′单体。该Fab′单体实质上是具有铰链区部分的Fab(见FundamentalImmunology，第3版，W.E.Paul(编)，Raven Press，N.Y.(1993)，其内容在此作为参考)。当依据完整抗体的消化来定义不同的抗体片段时，本领域的普通技术人员应明白该片段能通过化学方法或使用重组DNA方法被重新合成。因此在此所用的术语抗体也包括抗体片段，如单链抗体、抗原结合F(ab′)2片段、抗原结合Fab′片段、抗原结合Fab片段、抗原结合Fv片段、单条重链或嵌合(人源化的)抗体。这些抗体能通过修饰整个抗体或用重组DNA方法重新合成而产生。
受体、配体或与本发明的方法相关的其它物质(“抗原”-包括片段、衍生物和它们的类似物)能被用作免疫原以产生能免疫特异地结合该免疫原的抗体。这样的抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、结合抗原的抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或超变区)、和mAb或Fab表达文库。在一些实施方案中，提供了抗原的多克隆抗体和/或单克隆抗体。也在另外的实施方案中，被鉴定有免疫原性的受体或配体片段被作为免疫原来产生抗体。
可用在本领域中已知的多种方法生产多克隆抗体。多种宿主动物(包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、骆驼等动物)能通过注射抗原、片段、衍生物或类似物被免疫。基于宿主的种类，可使用不同的佐剂增加免疫应答。这样的佐剂包括，例如，弗氏佐剂(完全和不完全)、无机物胶体如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、乳油、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanins)、二硝基酚和其它佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
提供用于通过培养中的连续细胞系生产抗体分子的任何技术可被用于制备针对根据本发明的方法的受体或配体(刺激或抑制物质)的单克隆抗体。这些技术包括，例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(见，如，Nature 256：495-97(1975))、三体杂交瘤技术(见，如，Hagiwara和Yuasa，Hum.Antibodies Hybridomas 4：15-19(1993)；Hering等，Biomed.Biochim.Acta 47：211-16(1988))、人B细胞杂交瘤技术(见，如，Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983))和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(见，如Cole等，In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。可使用人抗体，其通过使用人杂交瘤(见，如Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-30(1983))或通过在体外用EBV病毒转化人B细胞而得到((见，如Cole等，在前所述)。
可能制备“嵌合”或“人源化”抗体(见，如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-55(1984)；Neuberger等，Nature 312：604-08(1984)；Takeda等，Nature 314：452-54(1985))。产生该“嵌合”分子的方法通常是众所周知的且被描述于，例如，美国专利号4,816,567；4,816,397；5,693,762；和5,712,120；PCT专利公开号WO 87/02671和WO 90/00616；和欧洲专利公开号EP 239 400(以上内容在此作为参考)。或者，人单克隆抗体或其部分能通过根据Huse等，Science246：1275-81(1989)提出的常规方法(其内容在此引入作为参考)，首先筛选编码可特异性结合本发明的受体或配体的抗体的核酸分子的cDNA文库鉴定。接着核酸分子被克隆并扩增以获得编码具有目的特异性的抗体(或抗原结合区域)的序列而被鉴定。噬菌体展示技术提供了另一种技术用于选择能结合受体、配体或与本发明的方法相关的酶、其片段、衍生物或类似物(见，如国际专利公开号WO 91/17271和WO 92/01047；Huse等，在前所述)。
可使用用于生产单链抗体的技术(见，如，美国专利4,946,778和5,969,108)。另一方面本发明使用了被称为Fab表达文库构建的技术(见，如，Huse等，在前所述)，可快速并容易地鉴定对抗原、其片段、衍生物或类似物具有目的特性的克隆的Fab片段。
通过已知的技术可产生含有独特型分子的抗体。例如，该片段包括，但不限于，通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段、通过还原F(ab′)2片段的二硫键生成的Fab′片段、通过用木瓜蛋白酶和还原试剂处理抗体分子而产生的Fab片段和Fv片段。使用如描述于美国专利号5,965,405(其内容在此一并作为参考)的方法在真核细胞中也能产生重组Fv片段。
通过本领域已知的技术(如，ELISA(酶联免疫吸附测定))能完成抗体的筛选。在一个例子中，可使用能识别抗原的特定区域的抗体来分析产生的用于可结合含有该区域的多肽的产品的杂交瘤。能在CHO细胞的瞬时表达***中产生小量的人源化抗体用于确定它们结合到与本发明方法相关的表达抗原的HUVEC细胞上。然后分离稳定的细胞系产生大量的纯化的物质。可用在Krause等Behring Inst.Mitt.，87：56-67(1990)中描述的方法来测定鼠和人源化抗体的结合亲和力。
根据本领域已知的方法，与本发明的方法相关的抗原(包括片段、衍生物和类似物)结合的抗体能被用于被动抗体处理。根据如上所述的方法产生该抗体且可以是多克隆或单克隆抗体，并能静脉、肠内(如，以肠衣片的形式)、通过气溶胶、口服、经皮、经转化粘液质(transmucosally)、向胸膜内、向鞘内或其它适合的途径施用。
前述的与抗体相关的方法可用于产生能特异性结合受体如AT2或α7nAChR，或结合可调节受体活性的物质，如能刺激或抑制受体激活的物质如血管紧张素II、烟碱或β-淀粉状蛋白的抗体。进一步地，可制备抑制或影响酶(如经激活刺激物质而间接影响有关受体的刺激的ACE)的活性的特异抗体。
药物组合物  本发明也涉及用于预防易感病症或疾病的患者的该病症或疾病的组合物，和用于治疗患有上述病症的患者的组合物。例如，该组合物可以化合物有效量施用于患者以提供对CNS病症的进展的一定程度的阻止(即提供保护作用)，改善CNS病症的症状和改善CNS病症的复发。该组合物可包括有效量的能刺激烟碱受体化合物。本发明也涉及施用有效量的抑制AT2受体或抑制AT2受体的刺激物的作用的化合物。能阻止Aβ-介导的干扰JAK2磷酸化的化合物也能作为本发明的药物组合物施用。
化合物可以以游离基质形式或盐(如作为药学上可接受的盐)的形式使用。适合的药学上可接受的盐的例子包括无机酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸加成盐如乙酸盐、galactarate、hemigalactarate、丙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲苯甲酰酒石酸盐和抗坏血酸盐；具有酸性氨基酸的盐如天冬氨酸盐和谷氨酸盐；碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如镁盐和钙盐；铵盐；碱性有机盐如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐和N，N′-二苄基乙二胺盐；和具有碱性氨基酸的盐如赖氨酸盐和精氨酸盐。这些盐可是一些水合物或醇溶剂合物的形式。
用于本文所述的方法中的化合物可以是那些在如下所述的，例如，Williams等.DN & P 7(4)：205-227(1994)，Arneric等，CNS DrugRev.1(1)：1-26(1995)，Arneric等，Exp.Opin.Invest.Drugs 5(1)：79-100(1996)，Bencherif等.，JPET 279：1413(1996)，Lippiello等，JPET 279：1422(1996)，Damaj等，Neuroscience(1997)，Holladay等，J.Med.Chem 40(28)：4169-4194(1997)，Bannon等，Science 279：77-80(1998)，PCT WO 94/08992，PCT WO 96/31475，和Bencherif等的美国专利5,583,140，Dull等的美国专利5,597,919，和Smith等的美国专利5,604,231，以上文献所披露的内容在此全文一并作为参考。本发明的化合物能被用作为止痛剂来预防或治疗多种神经变性疾病，并可治疗惊厥如那些癫痫症所表现出的症状。根据本发明的内容，能被预防或治疗的CNS病症包括早老性痴呆(早期发作的阿尔茨海默病)、老年性痴呆(阿尔茨海默氏痴呆)、HIV-痴呆、多发性脑梗死、帕金森综合征包括帕金森病、皮克氏病、亨廷顿舞蹈症(Huntington′schorea)、进行性核上瘫痪(progressive supra nuclear palsy)、路易士肢体痴呆(Lewy body dementia)和轻度认知损害。本发明的化合物也能被用于预防或治疗如梅毒和克雅氏症等疾病。
药物组合物也包括许多其它组分作为添加剂或助剂。用于相关环境中的典型的药学上可接受的组分或助剂包括抗氧化剂、自由基清除剂、肽、生长因子、抗体、抑菌剂、免疫抑制剂、抗凝血剂、缓冲剂、抗炎剂、退热剂、缓释剂、麻醉剂、类固醇和皮质类固醇。这些组分能提供额外的治疗功效，能影响药物组合物治疗效果或可阻止由于施用该药物组合物而引起的任何潜在的副作用。
化合物能以不同的方法施用。化合物能通过吸入法施用(如，以气溶胶的形式通过鼻或使用在Brooks等的美国专利4,922,901(在此全文作为参考)中提出的输送物来进行)；局部性施用(如，以洗剂的形式)；口服施用(如，在溶剂中的液体形式如水成液或非水成液，或在固体载体中)；静脉施用(如，在葡萄糖或盐溶液中)；输注或注射(如，以在药学可接受的液体或液体混合物中的悬浮剂或乳剂)；鞘内施用；脑室内(intracerebro ventricularly)施用或经皮肤(如，使用透皮贴剂)施用。虽然能以大量的活性化学物质的形式使用化合物，但每一种化合物都能存在于药物组合物或制剂中有效地施用。施用这样的化合物的典型方法对于熟练的技术人员来说是显而易见的。例如，此化合物能被以片剂、硬(明胶)胶囊或缓释胶囊的形式被施用。作为另外的例子，此化合物能通过使用如来自Novartis和Alza公司的可用的贴剂技术经皮输送。本发明的药物组合物对暖血动物(如，哺乳动物如小鼠、大鼠、猫、兔、狗、猪、牛或猴)的给药可以是间歇的或逐渐的、持续的、恒量的或以控制的速度；但优选对人类给药。此外，该药物制剂的给药天数和每天给药的次数可以不同。给药方式可以是使得药物制剂的活性成分和在患者体内的可影响CNS功能的受***点相互作用。更特别地，在预防和/或治疗CNS病症中，给药方式可以是使对那些相关的能影响CNS功能的受体亚型优化或对肌肉型受体亚型的影响最小的给药方式。其它可适用的本发明的化合物的给药方法描述于Smith等的美国专利5,604,231中。
化合物的合适的剂量是能预防患者患有的病症症状发生或治疗病症的某些症状的有效量。“有效量”、“治疗量”或“有效剂量”指得到期望的药理学或治疗效果，因此导致能有效地预防或治疗该病症的足够量。因此，当治疗CNS病症时，化合物的有效量是可通过患者的血脑屏障而结合患者脑中相关受***点并激活相关的烟碱性受体亚型(如，提供神经递质分泌，从而导致有效地预防或治疗该病症)的足够量。预防该病症是延迟该病症的症状的发生。治疗该病症是减轻该病症相关的症状或改善该病症症状复发。
有效剂量可以不同，基于如下因素：患者的情况、症状的严重性和药物组合物的给药方式。对于人类患者，典型化合物的有效剂量通常需要给予该化合物以可激活相关受体来影响神经递质(如，多巴胺)的释放的足够量，但是该剂量应不足以对骨骼肌和神经节产生任何明显程度的影响。患者间的化合物的有效剂量当然不同，但是通常包括使CNS效应或其它期望的治疗作用发生的起始量，但要低于可观察到的肌肉效应的量。
典型地，化合物的有效剂量通常需要以约1μg到约20mg每公斤患者体重的量口服给药该化合物。通常，本发明的化合物以约10μg到约10mg每公斤患者体重的量给药，更常地以10μg到约1mg每公斤患者体重的量给药。前述的有效剂量通常表示作为单次剂量给药的量，或在24小时的时间中作为一或多次剂量给药。
对于人类患者，典型的化合物的有效剂量通常需要以至少约1、通常至少约10和更经常地至少约1到约100mg/24小时/患者的量给予该化合物。对于人类患者，典型的化合物的有效剂量通常需要以常规剂量不超过约500、通常不超过400和更经常地不超过300mg/24小时/患者的量给予该化合物。此外，给药的有效剂量是指化合物在患者血浆中的浓度通常不超过10μg/ml和更经常地不超过1μg/ml。
根据本发明方法的化合物具有通过患者血脑屏障的能力。该化合物具有能进入患者的中枢神经***的能力。用于实施本发明的典型化合物的log P值一般大于约-0.5，通常大于约0和更经常地大于约0.5。该典型化合物的log P值一般小于约3，通常小于约2和更经常地小于约1。Log P值估量了化合物通过扩散障碍如生物膜的能力。见，Hansch，等，J.Med.Chem.11：1(1968)。
用于实施本发明的典型化合物的受体结合常数一般大于约0.1nM，通常大于约1nM和更经常地大于约10nM。某些化合物的受体结合常数小于约100μM，通常小于约10μM和更经常地小于约5μM；其它化合物的受体结合常数小于约1μM，通常小于约100nM和更经常地小于约50nM。某些化合物能具有小于10μM，和甚至小于100μM的受体结合常数。受体结合常数估量了化合物与患者某些脑细胞中相关受***点的一半结合的能力。见，Cheng，等，Biochem.Pharmacol.22：3099(1973)。
用于根据本发明的方法的某些化合物能通过有效地结合到烟碱性乙酰胆碱受体证明烟碱性功能。这样的化合物能激活相关神经元以释放或分泌乙酰胆碱、多巴胺和其它神经递质。一般地，用于实施本发明的典型化合物提供了烟碱性乙酰胆碱受体的活化，活化的受体的量至少比用于激活肌型(muscle-type)烟碱性受体的量少1/3，典型地至少少约10倍，经常地至少少约100倍和有时至少少约1,000倍。本发明的某些化合物能与同等摩尔量的(S)-(-)烟碱引起的量相当的量的多巴胺分泌。
根据本发明的方法使用的化合物，当依据本发明的方法使用有效量时，能选择针对某些相关的烟碱性受体，但不导致与在至少大于激活多巴胺释放所需的浓度时所产生的不期望的副作用相关的受体的明显的激活。这就意味着在比激活多巴胺释放所需的浓度高5倍、高100倍和高1,000倍的浓度时，能预防和/或治疗CNS病症的特定剂量的化合物是基本上不引发某些肌型烟碱受体的激活。本发明抗那些造成心血管副作用的神经节型受体的某些化合物的选择性通过那些化合物在大于激活多巴胺释放所需的浓度的浓度时可激活肾上腺嗜铬组织的烟碱性功能的能力的缺乏而被证明。
用于根据本发明的方法的某些化合物，当依据本发明的方法使用有效量时，能有效地预防CNS病症的进展，改善CNS病症的症状和改善CNS病症复发时的症状。然而，这些化合物的有效量是不足以引起任何可察觉到的副作用，通过与骨骼肌相关的作用的增加被证明。同样地，使用本发明某些化合物提供了一个治疗窗口，其中提供了某些CNS病症的治疗且避免了某些副作用。就是说，本发明有效剂量的化合物是足以对CNS提供期望的效果但不足以(即，不是足够高的水平)产生明显的不期望的副作用。
以下详述的实施例是不受限制的且其仅是对本发明的方法和组合物起解释作用。
                        实施例
以下实施例所使用的如下所述原料和方法：
化学品。购买自Bio-Rad实验室(Hercules，CA，USA)的分子量标准、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、N，N′-亚甲基-双丙烯酰胺、N，N，N′，N′-四亚甲基二胺、蛋白质分析试剂和硝酸纤维素膜。得自Santa-Cruz(Santa Cruz，CA，USA)的蛋白A/G-琼脂糖和得自Mediatech Biotechnology Inc.(Herndon，VA，USA)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)、胎牛血清、胰岛素和所有的培养基添加剂。磷酸化酪氨酸(PY20)的单克隆抗体、JAK2、Akt和PI3激酶购自Transduction Laboratories(Lexington，KY，USA)。抗磷酸化Akt和PARP抗体购自New England Biolabs(Beverly，MA，USA)。抗酪氨酸磷酸化JAK2抗体得自Biosource International(Camarillo，CA，USA)。Pierce SUPERSIGNAL底物化学发光检测试剂盒得自PIERCE(Rockford，IL，USA)。山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG得自Amersham(Princeton，NJ，USA)，和TWEEN-20、烟碱、Aβ(1-42)肽、抗Aβ(1-42)和抗α7-nAChR和所有其它化学品购自Sigma化学公司(St.Louis，MO，USA)。
分离和培养PC12细胞。PC12(大鼠嗜铬细胞瘤)细胞根据常规方法(Liu Q等，Proc Natl Acad Sci USA 98(8)：4734-9(2001))在添加有10％马血清、5％胎牛血清(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)和抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)培养基中保持在增残生长阶段。对特殊的实施例，该培养基在烟碱刺激前更换为含有10μM AG-490或10μM Aβ(1-42)的新鲜无血清培养基。
数据分析。用Student’s t检验(Student’s t test)和方差(ANOVA)分析对成对的数据进行所有的统计比较。显著性是P＜0.05。
实施例1-途径蛋白的免疫沉淀和磷酸化分析
PC12细胞用烟碱刺激一定时间。免疫沉淀和Western印迹用前述的(Liang，H.等，J.Biol.Chem.274：19846-19851(1999)；Marrero，M.B.等，Nature 375：247-250(1995).Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275：C1216-C1223(1998))的方法来进行。
下列抗体被用于免疫沉淀蛋白：抗α7受体、抗PI-3激酶(2μg/ml)、抗JAK2(2μg/ml)或抗磷酸化酪氨酸(PY20克隆，10μg/ml)。回收的免疫沉淀的蛋白被转移到硝酸纤维素膜上并用适当的抗体印迹。对于磷酸特异性的JAK2和Akt蛋白，硝酸纤维素膜与亲和纯化的抗磷酸特异性JAK2和Akt抗体在4℃温育过夜。最后，蛋白用辣根过氧化酶缀合的山羊抗小鼠或猴抗兔IgG和增强化学发光试剂盒检测。
实施例2-JAK2和Akt的Western印迹分析
在存在或不存在10μM AG-490(预温育1小时)的条件下，用10μM烟碱刺激0到120分钟不同时间的血清饥饿的PC12细胞中测定JAK2和Akt蛋白的磷酸化。在刺激结束时，细胞用冰冷的PBS-V(含1mmol/L Na3VO4的磷酸盐缓冲液)洗涤两次。每一培养皿接着用冰冷的裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.4，2.5mmol/L EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，10mmol/LNa4P2O7，50mmol/L NaF，1mmol/L Na3VO4和1mmol/LPMSF)处理60分钟，接着通过细胞裂解物在58,000g、4℃下离心25分钟得到上清液部分。样品通过7.5％SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上并在室温(22℃)下在加5％脱脂奶粉的TTBS(含0.05％Tween-20的TBS，pH7.4)中温育60分钟被封闭。该硝酸纤维素膜与亲和纯化的抗磷酸化特异性JAK2和Akt抗体在4℃下温育过夜。该硝酸纤维素膜用TTBS洗涤两次每次各10分钟，并用山羊抗兔IgG辣根过氧化酶缀合物温育不同时间。在大量的洗涤后，结合的抗体用KODAK BIOMAX胶片，PIERCE SUPERSIGNAL底物化学发光检测试剂盒检测。分子量标记用于评估条带的特异性。
实施例3-PI-3激酶的免疫沉淀研究
血清饥饿的PC12细胞用10μM烟碱刺激0到120分钟不同的时间，并用冰冷的PBS-V(含1mmol/L Na3VO4的磷酸盐缓冲液)洗涤两次。每一培养皿接着用冰冷的裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.4，2.5mmol/L EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，10mmol/LNa4P2O7，50mmol/L NaF，1mmol/LNa3VO4和1mmol/L PMSF)处理60分钟，接着通过细胞裂解物在58,000g、4℃下离心20分钟得到上清液部分。细胞裂解物在4℃与10μg/ml的抗PI3激酶单克隆抗体温育2小时并通过加入50μl的蛋白A/G琼脂糖在4℃沉淀过夜。通过离心回收免疫沉淀物并用冰冷的洗涤缓冲液(TBS，0.1％Triton X-100，1mmol/L PMSF，和1mmol/LNa3VO4)洗涤三次。免疫沉淀的蛋白在100ml Laemmli样品缓冲液中溶解和80ml的每个样品通过SDS-PAGE凝胶电泳分离。样品被转移到硝酸纤维素膜上并在室温(22℃)下在加5％脱脂奶粉的T的TBS(含0.05％Tween-20 TBS，pH 7.4)中温育60分钟被封闭。硝酸纤维素膜接着与10μg/ml亲和纯化的抗磷酸化酪氨酸抗体在4℃下温育过夜，且结合的抗体用PIERCE SUPERSIGNAL化学发光检测试剂盒检测。
实施例4-PC12细胞凋亡的评估
通过用Western印迹分析方法测定DNA修复酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的断裂程度来测定细胞凋亡程度。PARP(116kDa)是caspase-3的内源性底物，在多种细胞凋亡中其被断裂为典型的85kDa片段。在存在或不存在烟碱和/或AG-490的条件下，PC12细胞用100nM Aβ处理8小时。收集这些细胞，并用PBS洗涤，接着在120μl的SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸10分钟裂解。总的细胞裂解物(30μg蛋白)通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。该膜在含5％脱脂奶粉的TBST(25mM Tris-HCl，pH7.5，0.5M NaCl.0.05％Tween-20)中在25℃下封闭1小时。膜用对85kDa片段特异性的PARP一抗在25℃下温育2-3小时，用TBST漂洗，并用二抗在25℃下温育1小时。用增强化学发光(ECL)***(Amersham)和合适的抗体进行免疫检测。
PC12细胞粗提物中的Caspase 3酶活性通过用其荧光底物来测定。caspase-3荧光肽Ac-DEVD-AMC(Promega，Madison，WI)含有偶联到荧光染料7-氨基-4-甲基香豆素的C-末端上的特异性caspase-3剪切序列(DEVD)。当在360nm波长处被激发时，该底物能发出蓝色的荧光。当通过细胞裂解物中caspase 3酶活性剪切该肽时，自由的7-氨基-4-甲基香豆素被释放出并能通过其在460nm处发出的黄/绿光被检测到。适当的对照物包括可用来评估caspase 3酶活性的特异作用的caspase-3的可逆醛抑制剂。相对于细胞提取物的总蛋白浓度对荧光单位进行标准化。该分析重复进行三次，且试验也被重复三次。此外，使用COULTER计数器(ZM型，Coulter，Hialeah，FI)测定PC12细胞数目的减少。
实施例5-用于评估神经保护作用的动物模型
连同具有可提供关于如何使用每一动物模型的引文(在此所有的全文内容一并引入作为参考)的适合的终点(基于所述的烟碱)，用于评估根据本发明的组合物和方法的神经保护作用的动物模型被提供如下：
6-OHDA(部分损伤)-大鼠
烟碱(NIC)(1.0mg/kg；皮下)削弱了在黑质中6-OHDA(6μg)诱导的多巴胺能的神经毒性(即，纹状体多巴胺损失的丧失)(Costa，G.等，Brain Res，888：336-342(2001)；Soto-Otero，R.等，BiochemPharmacol，64(1)：125-35(2002))。
利血平诱导的多巴胺缺失-小鼠
NIC(3mg/kg；s.c.)阻断了利血平(0.5mg/kg；i.v.)诱导的多巴胺缺失，NIC的该作用能被梅坎米胺(mecamylamine)阻断但不被六甲铵(hexamethonium)阻断(Oishi，R.等，Naunyn Schmiedebergs ArchPharmacol.348：154-7(1993))。
脱氧麻黄碱(methamphetamine)毒性-小鼠和大鼠
在鼠中NIC(1.0mg/kg)阻止脱氧麻黄碱(5mg/kg)毒性(脑水平)类似于MK-801(Maggio，R.等，J Neurochem，71：2439-46(1998)；和Parain，K，等，Brain Res.890：347-350(2001))。
MPTP作用
小鼠
NIC(0.75mg/kg)减少MPTP(30mg/kg；s.c.)诱导的纹状体MPP+水平类似于MK-801(Quik，M.和D.A.Di Monte，BrainRes，917：219-24(2001))。
非人灵长类
SIB-1508Y(1.8mg/kg)在增强L-多巴对在灵长类MPTP模型中的运动和认知功能的作用方面比烟碱更有效(Domino，E.F.等，ExpNeurol，158：414-21(1999)；Schneider，J.S.等，J Pharmacol Exp Ther.290(2)：731-739(1999))。
实施例6-TC-1698介导的JAK2磷酸化的增加
在PC12细胞中，类似烟碱，TC-1698(2-吡啶-3-基-1-氮杂-双环[3.2.2]壬烷)诱导Jak-2磷酸化并能有效地激活该途径。见图11-15和在前所述的内容。
TC-1698是有效的和选择性的α7激动剂。功能分析表明TC-1698不激活神经节亚型α3β4、肌亚型α1β1γδ、神经元亚型α3β2和α4β2。相反地，TC-1698能高亲和力(Ki＝0.8nM)结合α7并在激活α7nAChR中比内源性神经递质乙酰胆碱更有效50倍。

Claims (39)

1.一种筛选对烟碱受体有作用的物质的方法，包括
a)使具有烟碱受体的细胞与测试物质接触；和
b)测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的任何增加或减少，其中JAK2磷酸化的增加表明测试物质刺激烟碱受体，和其中JAK2磷酸化的减少表明测试物质抑制烟碱受体。
2.根据权利要求1的方法，其中测试物质是测试物质文库的一员。
3.根据权利要求1的方法，其中文库是组合化学文库。
4.根据权利要求1的方法，其中文库是肽、多肽、非肽peptidominetic、抗体或小分子有机化合物文库。
5.根据权利要求1的方法，其中文库是化合物的随机组合。
6.根据权利要求1的方法，其中测试物质是通过高通量筛选被筛选。
7.一种筛选能增加或减少刺激烟碱受体的物质的作用的物质的方法，包括
a)使具有烟碱受体的细胞与刺激烟碱受体的物质接触；
b)使该细胞与测试物质接触；和
c)相对于当细胞在不存在测试物质的条件下接触刺激烟碱受体的物质时测量的JAK2磷酸化水平，测定在存在该测试物质的条件下JAK2磷酸化的任何增加或减少，
其中JAK2磷酸化的增加表明测试物质增加刺激烟碱受体的物质对烟碱受体的作用；和其中JAK2磷酸化的减少表明测试物质减少刺激烟碱受体的物质对烟碱受体的作用。
8.一种筛选抑制或刺激AT2受体的物质的方法，包括，
a)使具有烟碱受体和AT2受体的细胞与刺激烟碱受体的物质接触；
b)使该细胞与测试物质接触；和
c)相对于当细胞在不存在测试物质的条件下接触刺激烟碱受体的物质时测量的JAK2磷酸化水平，测定在存在测试物质的条件下JAK2磷酸化的任何增加或减少，
其中JAK2磷酸化的增加表明测试物质抑制AT2受体；其中JKA2磷酸化的减少表明测试物质刺激AT2受体；和
其中在不存在AT2受体的条件下测试物质对烟碱受体的任何作用被预先测定，和相对于涉及该作用的任何JAK2磷酸化，JAK2磷酸化的任何增加或减少被测定。
9.根据权利要求8的方法，其中测试物质是测试物质文库的一员。
10.根据权利要求8的方法，其中文库是组合化学文库。
11.根据权利要求8的方法，其中文库是肽、多肽、非肽性肽模拟物、抗体或小分子有机化合物文库。
12.根据权利要求8的方法，其中文库是化合物的随机组合。
13.根据权利要求8的方法，其中测试物质是通过高通量筛选被筛选。
14.一种筛选能削弱或增强刺激AT2受体的物质的作用的物质的方法，包括
a)使具有烟碱受体和AT2受体的细胞与刺激烟碱受体的物质和刺激AT2受体的物质接触；
b)使该细胞与测试物质接触；和
c)相对于当细胞在不存在测试物质的条件下接触刺激烟碱受体的物质和刺激AT2受体的物质时测量的JAK2磷酸化水平，测定在存在该测试物质的条件下JAK2磷酸化的任何增加或减少，
其中JAK2磷酸化的增加表明测试物质削弱了刺激AT2受体的物质的作用，或增强了抑制AT2受体的物质的作用；和其中JAK2磷酸化的减少表明测试物质增强了刺激AT2受体的物质的作用，或削弱了抑制AT2受体的物质的作用。
15.一种筛选对通过烟碱性受体介导的β淀粉状蛋白关联的神经毒性具有作用的物质的方法，包含
a)用β淀粉状蛋白肽接触具有烟碱受体的细胞和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和
b)使该细胞与测试物质接触和测定JAK2磷酸化的任何增加或减少，
其中JAK2磷酸化的增加表明测试物质是用于进一步评估作为减少β淀粉状蛋白关联的神经毒性的物质的候选物质。
16.一种筛选能减少通过烟碱性受体介导的β淀粉状蛋白肽的神经毒性的物质的方法，包括，
a)使具有烟碱受体的细胞与β淀粉状蛋白肽接触和测定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和
b)使该细胞与测试物质接触和测定JAK2磷酸化的任何增加或减少，
其中JAK2磷酸化的任何增加表明测试物质减少β淀粉状蛋白肽的神经毒性。
17.一种在包含烟碱受体和AT2受体的细胞中增加刺激烟碱受体的物质的作用的方法，该方法包含，
a)使该细胞与刺激烟碱受体的物质接触；和
b)使该细胞与选自由AT2受体抑制剂和刺激AT2受体的物质的抑制剂组成的组的物质接触。
18.一种在包含烟碱受体和AT2受体的细胞中减少细胞凋亡的方法，包含
a)使该细胞与能刺激烟碱受体的物质接触；和
c)使该细胞与选自由AT2受体抑制剂和刺激AT2受体的物质的抑制剂组成的组的物质接触。
19.根据权利要求18的方法，其中增加的细胞生存表明细胞凋亡的减少。
20.根据权利要求18的方法，其中细胞凋亡的减少由选自减少的多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)活性、减少的caspase 3活性和Bcl2的诱导中的至少一种观察结果所表明。
21.一种对患有通过烟碱受体介导的中枢神经***病症的患者的治疗或预防的方法，包含施用一定量的包含刺激烟碱受体的物质；至少一种AT2受体的抑制剂或至少一种刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体的药物组合物；其中该药物组合物的量能有效刺激该受体。
22.一种治疗与阿尔茨海默病相关的神经变性的方法，包含施用治疗有效量的增加JAK2酪氨酸磷酸化的物质。
23.一种治疗或预防与阿尔茨海默病相关的神经变性的方法，包含施用一定量的包含刺激烟碱受体的物质；至少一种AT2受体的抑制剂或至少一种刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和药学上可接受的载体的药物组合物；其中该药物组合物的量能有效刺激该受体。
24.一种用于治疗或预防中枢神经病症而对患有该病症的患者给药的药物组合物，包含
a)刺激烟碱受体的物质；和
b)至少一种AT2受体的抑制剂或至少一种刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和
c)药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质选自胆碱能配体、烟碱性激动剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂。
26.根据权利要求24的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质对α7-nAChR是选择性的。
27.根据权利要求26的药物组合物，其中对α7-nAChR有选择性的物质是取代的奎宁环化合物。
28.根据权利要求24的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质是通过选自以下的I、II和III的通式表示的：
Figure A028250470006C1
29.根据权利要求24的药物组合物，其中抑制AT2受体或抑制刺激AT2受体的物质的物质是抑制刺激AT2的物质的物质。
30.根据权利要求29的药物组合物，其中抑制刺激AT2的物质的物质是血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。
31.一种用于治疗或预防神经变性病症而对患有该病症的患者给药的药物组合物，包含，
a)刺激烟碱受体的物质；和
b)至少一种AT2受体的抑制剂或至少一种刺激AT2受体的物质的抑制剂的任一者或两者；和
c)药学上可接受的载体。
32.根据权利要求31的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质选自胆碱能配体、烟碱性激动剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂。
33.根据权利要求31的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质对α7-nAChR是选择性的。
34.根据权利要求33的药物组合物，其中对α7-nAChR有选择性的物质是取代的奎宁环化合物。
35.根据权利要求31的药物组合物，其中刺激烟碱受体的物质是通过选自下列I、II和III的通式表示的：
Figure A028250470007C1
36.根据权利要求31的药物组合物，其中抑制AT2受体或抑制刺激AT2受体的物质的物质是抑制刺激AT2的物质的物质。
37.根据权利要求36的药物组合物，其中抑制刺激AT2的物质的物质是血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。
38.根据权利要求31的药物组合物，其中抑制AT2受体或抑制刺激AT2受体的物质的物质是刺激AT2的物质。
39.根据权利要求3的药物组合物，其中刺激AT2的物质选自PD123177和PD123319。
CNB028250478A 2001-12-14 2002-12-13 治疗中枢神经***病症的方法和组合物 Expired - Fee Related CN100371714C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34058201P 2001-12-14 2001-12-14
US60/340,582 2001-12-14
US36993402P 2002-04-04 2002-04-04
US60/369,934 2002-04-04

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007101065785A Division CN101099736A (zh) 2001-12-14 2002-12-13 治疗中枢神经***病症的方法和组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1605027A true CN1605027A (zh) 2005-04-06
CN100371714C CN100371714C (zh) 2008-02-27

Family

ID=26992172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028250478A Expired - Fee Related CN100371714C (zh) 2001-12-14 2002-12-13 治疗中枢神经***病症的方法和组合物

Country Status (13)

Country Link
US (2) US7067261B2 (zh)
EP (1) EP1463481A4 (zh)
JP (1) JP2005538683A (zh)
CN (1) CN100371714C (zh)
AU (1) AU2002360598B2 (zh)
BR (1) BR0214929A (zh)
CA (1) CA2470567A1 (zh)
HU (1) HUP0501017A3 (zh)
IL (1) IL162153A0 (zh)
NO (1) NO20043085L (zh)
NZ (2) NZ554913A (zh)
PL (1) PL374384A1 (zh)
WO (1) WO2003051302A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006114019A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Versitech Limited Polysaccharide extract from lycium barbarum as neuroprotective agent against beta-amyloid peptide neurotoxicity
CN101657715B (zh) * 2006-11-10 2012-07-25 戴麦里克斯生物科学有限公司 检测***及其应用

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10164139A1 (de) 2001-12-27 2003-07-10 Bayer Ag 2-Heteroarylcarbonsäureamide
CA2575706A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-23 Bebaas, Inc. Vitamin b12 compositions
US7459469B2 (en) 2004-11-10 2008-12-02 Targacept, Inc. Hydroxybenzoate salts of metanicotine compounds
RS52927B (en) * 2004-12-24 2014-02-28 Spinifex Pharmaceuticals Pty Ltd TREATMENT OR PROPHYLAX PROCEDURE
US20130131007A1 (en) 2005-09-07 2013-05-23 Bebaas, Inc. Vitamin b12 compositions
US20070178141A1 (en) * 2005-09-07 2007-08-02 Bebaas, Inc. Vitamin B12 compositions
AU2007229322B2 (en) * 2006-03-20 2012-04-05 Novartis Ag Method of treatment or prophylaxis inflammatory pain
CN101528698A (zh) 2006-05-09 2009-09-09 阿斯利康公司 (2s)-(4e)-n-甲基-5-[3-(5-异丙氧基吡啶)基]-4-戊烯-2-胺的盐形式
TWI389889B (zh) 2006-05-09 2013-03-21 Targacept Inc （２ｓ）-（４ｅ）-ｎ-甲基-５-〔３-（５-異丙氧基吡啶）基〕-４-戊烯-２-胺之新穎多晶型
JP5153114B2 (ja) * 2006-10-12 2013-02-27 知宏 千葉 新規のアルツハイマー病検出方法
US8314119B2 (en) * 2006-11-06 2012-11-20 Abbvie Inc. Azaadamantane derivatives and methods of use
JP5502494B2 (ja) * 2007-01-22 2014-05-28 ターガセプト・インコーポレイテッド メタニコチンアナログの鼻腔内、バッカル、または舌下投与
WO2008109517A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 University Of South Florida Neurodegenerative disease treatment using jak/stat inhibition
WO2010056622A1 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 Targacept, Inc. TREATMENT WITH ALPHA α7-SELECTIVE LIGANDS
EP2540297B1 (en) 2008-11-19 2015-04-08 Forum Pharmaceuticals Inc. Treatment of Cognitive Disorders with (R)-7-chloro-N-(quinuclidin-3-yl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide and pharmaceutically acceptable salts thereof
RU2011150248A (ru) * 2009-05-11 2013-06-20 Энвиво Фармасьютикалз, Инк. Лечение когнитивных расстройств с определенными рецепторами альфа-7 никотиновой кислоты в комбинации с ингибиторами ацетилхолинэстеразы
CN105837566B (zh) 2010-05-17 2018-02-06 富瑞姆制药公司 (R)‑7‑氯‑N‑(奎宁环‑3‑基)苯并[b]噻吩‑2‑甲酰胺盐酸盐单水合物的晶型
US8703802B2 (en) 2010-05-20 2014-04-22 Targacept, Inc. Process for the preparation of aryl substituted olefinic amines
KR20130108586A (ko) 2010-09-23 2013-10-04 애브비 인코포레이티드 아자아다만탄 유도체의 일수화물
EP2846796A4 (en) 2012-05-08 2015-10-21 Forum Pharmaceuticals Inc METHODS OF MAINTAINING, PROCESSING OR ENHANCING COGNITIVE FUNCTION
WO2015189342A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions comprising an at2r agonist for treating pain
US20230151000A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-18 Lenz Therapeutics, Inc. Aceclidine Derivatives, Compositions Thereof and Methods of Use Thereof

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0216357A3 (en) 1985-09-25 1988-08-31 Nippon Zeon Co., Ltd. Phosphoramidite compounds and process for production thereof
US4922901A (en) * 1988-09-08 1990-05-08 R. J. Reynolds Tobacco Company Drug delivery articles utilizing electrical energy
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US6440681B1 (en) * 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5977144A (en) * 1992-08-31 1999-11-02 University Of Florida Methods of use and compositions for benzylidene- and cinnamylidene-anabaseines
IL107184A (en) 1992-10-09 1997-08-14 Abbott Lab Heterocyclic ether compounds that enhance cognitive function
US5837815A (en) * 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
US5597919A (en) * 1995-01-06 1997-01-28 Dull; Gary M. Pyrimidinyl or Pyridinyl alkenyl amine compounds
US5604231A (en) * 1995-01-06 1997-02-18 Smith; Carr J. Pharmaceutical compositions for prevention and treatment of ulcerative colitis
US5585388A (en) 1995-04-07 1996-12-17 Sibia Neurosciences, Inc. Substituted pyridines useful as modulators of acetylcholine receptors
US5583140A (en) * 1995-05-17 1996-12-10 Bencherif; Merouane Pharmaceutical compositions for the treatment of central nervous system disorders
US5712270A (en) * 1995-11-06 1998-01-27 American Home Products Corporation 2-arylamidothiazole derivatives with CNS activity
SE9600683D0 (sv) 1996-02-23 1996-02-23 Astra Ab Azabicyclic esters of carbamic acids useful in therapy
WO1999066041A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Human Genome Sciences, Inc. 94 human secreted proteins
AR013184A1 (es) 1997-07-18 2000-12-13 Astrazeneca Ab Aminas heterociclicas espiroazobiciclicas, composicion farmaceutica, uso de dichas aminas para preparar medicamentos y metodo de tratamiento o profilaxis
US5952339A (en) * 1998-04-02 1999-09-14 Bencherif; Merouane Pharmaceutical compositions and methods of using nicotinic antagonists for treating a condition or disorder characterized by alteration in normal neurotransmitter release
US6057446A (en) * 1998-04-02 2000-05-02 Crooks; Peter Anthony Certain 1-aza-tricyclo [3.3.1-13,7 ] decane compounds
US5986100A (en) * 1998-04-02 1999-11-16 Crooks; Peter Anthony Pharmaceutical compositions and methods for use
US6277870B1 (en) * 1998-05-04 2001-08-21 Astra Ab Use
WO1999062505A2 (en) 1998-06-01 1999-12-09 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Method for treating neurodegenerative disorders
US6232316B1 (en) * 1998-06-16 2001-05-15 Targacept, Inc. Methods for treatment of CNS disorders
AU4230799A (en) 1998-06-16 2000-01-05 Targacept, Inc. Aryl substituted olefinic amines and their use as cholinergic receptors agonists
US6218383B1 (en) 1998-08-07 2001-04-17 Targacept, Inc. Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of central nervous system disorders
US6262124B1 (en) * 1998-10-22 2001-07-17 Gary Maurice Dull Pharmaceutical compositions and methods for use
BR0011534A (pt) 1999-05-24 2002-02-26 Targacept Inc Alquilaminas aril substituìdas capazes de ativação de receptores colinérgicos nicotìnicos
US20020052311A1 (en) * 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
JP2003509478A (ja) * 1999-09-21 2003-03-11 エモリー・ユニバーシティ 血小板関連障害を処置する方法および組成物
SE9904176D0 (sv) 1999-11-18 1999-11-18 Astra Ab New use
AU2001257449A1 (en) 2000-05-01 2001-11-12 Targacept, Inc. Imaging of nicotinic acetylcholine receptor subtypes
DE60109924T2 (de) 2000-05-25 2006-02-09 Targacept, Inc. Heteroaryldiazabicycloalkane als liganden für den nikotinischen acetylcholin-rezeptor
US6440970B1 (en) * 2000-05-25 2002-08-27 Targacept, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for use
ES2213703T5 (es) 2000-06-27 2011-11-02 Laboratorios S.A.L.V.A.T., S.A. Carbamatos derivados de arilalquilaminas.
AU2001282874A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Pharmacia And Upjohn Company Quinuclidine-substituted aryl moieties for treatment of disease (nicotinic acetylcholine receptor ligands)
WO2002016356A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Pharmacia & Upjohn Company Quinuclidine-substituted aryl moieties for treatment of disease (nicotinic acetylcholine receptor ligands)
JP2004506734A (ja) 2000-08-21 2004-03-04 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 疾患治療用のキヌクリド置換ヘテロアリール部分
AU2001284646A1 (en) 2000-08-21 2002-03-04 Pharmacia And Upjohn Company Quinuclidine-substituted heteroaryl moieties for treatment of disease
US6500840B2 (en) 2000-08-21 2002-12-31 Pharmacia & Upjohn Company Quinuclidine-substituted heteroaryl moieties for treatment of disease
EP1345937B1 (en) 2000-12-22 2005-09-28 Almirall Prodesfarma AG Quinuclidine carbamate derivatives and their use as m3 antagonists

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006114019A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Versitech Limited Polysaccharide extract from lycium barbarum as neuroprotective agent against beta-amyloid peptide neurotoxicity
CN101657715B (zh) * 2006-11-10 2012-07-25 戴麦里克斯生物科学有限公司 检测***及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0501017A2 (en) 2006-01-30
BR0214929A (pt) 2006-05-30
IL162153A0 (en) 2005-11-20
AU2002360598A1 (en) 2003-06-30
NO20043085L (no) 2004-07-13
WO2003051302A3 (en) 2003-09-04
US20060160835A1 (en) 2006-07-20
EP1463481A2 (en) 2004-10-06
EP1463481A4 (en) 2008-06-25
NZ554913A (en) 2009-01-31
AU2002360598B2 (en) 2008-02-14
PL374384A1 (en) 2005-10-17
US20030158211A1 (en) 2003-08-21
NZ533259A (en) 2007-10-26
WO2003051302A2 (en) 2003-06-26
HUP0501017A3 (en) 2010-06-28
CA2470567A1 (en) 2003-06-26
US7067261B2 (en) 2006-06-27
CN100371714C (zh) 2008-02-27
JP2005538683A (ja) 2005-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1605027A (zh) 治疗中枢神经***病症的方法和组合物
Shaw et al. Janus kinase 2, an early target of α7 nicotinic acetylcholine receptor-mediated neuroprotection against Aβ-(1–42) amyloid
Thétiot‐Laurent et al. Schistosomiasis chemotherapy
Heidinger et al. Metabotropic glutamate receptor 1-induced upregulation of NMDA receptor current: mediation through the Pyk2/Src-family kinase pathway in cortical neurons
Connor et al. TNFα modulates protein degradation pathways in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts
Lotocki et al. Tumor necrosis factor receptor 1 and its signaling intermediates are recruited to lipid rafts in the traumatized brain
Glatfelter et al. Structure–activity relationships for psilocybin, baeocystin, aeruginascin, and related analogues to produce pharmacological effects in mice
Michel et al. Spatial restriction of PDK1 activation cascades by anchoring to mAKAPα
Jaggi et al. Protein kinase D1: a protein of emerging translational interest
Hua et al. P7C3‐A20 alleviates fatty liver by shaping gut microbiota and inducing FGF21/FGF1, via the AMP‐activated protein kinase/CREB regulated transcription coactivator 2 pathway
Takasaki et al. In silico screening identified novel small-molecule antagonists of PAC1 receptor
Giacobini Cholinesterase inhibitors do more than inhibit cholinesterase
Sun et al. Methamphetamine produces cardiac damage and apoptosis by decreasing melusin
Utsuki et al. Identification of novel small molecule inhibitors of amyloid precursor protein synthesis as a route to lower Alzheimer's disease amyloid-β peptide
Loos et al. Metformin suppresses development of the Echinococcus multilocularis larval stage by targeting the TOR pathway
Morimoto et al. Dose-dependent effects of a brain-penetrating iduronate-2-sulfatase on neurobehavioral impairments in mucopolysaccharidosis II mice
Zhang et al. Pretreatment with metformin prevents microcystin‐LR‐induced tau hyperphosphorylation via mTOR‐dependent PP2A and GSK‐3β activation
Bronson et al. To market, to market—2012
Hulverson et al. Repurposing infectious disease hits as anti-Cryptosporidium leads
Sturgess et al. Adenosine A1 and A2A receptors are not upstream of caffeine’s dopamine D2 receptor‐dependent aversive effects and dopamine‐independent rewarding effects
Bu et al. Activated central galanin type 1 receptor alleviated insulin resistance in diabetic rat muscle
Tzeng et al. Activation of opioid μ-receptors by loperamide to improve interleukin-6-induced inhibition of insulin signals in myoblast C 2 C 12 cells
Mikami et al. 5-Amino-6-chloro-N-[(1-isobutylpiperidin-4-yl) methyl]-2-methylimidazo [1, 2-α] pyridine-8-carboxamide (CJ-033,466), a novel and selective 5-hydroxytryptamine4 receptor partial agonist: pharmacological profile in vitro and gastroprokinetic effect in conscious dogs
US20150216865A1 (en) Methods of treating a bruton's tyrosine kinase disease or disorder
JPH10120562A (ja) Ｖ−ＡＴＰａｓｅ 脱共役 Ｈ＋ ポンプ阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080227

Termination date: 20100113