CN1592792B

CN1592792B - 检测核酸的材料和方法

Info

Publication number: CN1592792B
Application number: CN018126650A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯R·普鲁登特; 戴维J·马歇尔; 克里斯多弗B·谢里尔; J·L·普塔辛; 克雷格S·里奇蒙; 詹尼弗K·格伦尼尔; 西蒙娜·朱西克; 吉迪恩·夏皮罗
Original assignee: Eragen Biosciences Inc
Current assignee: Luminex Corp
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: US7517651B2; WO2001090417A2; US8519117B2; JP5685561B2; US20020150900A1; US7541147B2; ATE497018T1; US9611509B2; AU7125401A; WO2001090417A3; JP5138141B2; US20140057269A1; CN1592792A; EP1349954B1; US7422850B2; JP2013005803A; US20060252091A1; EP1349954A2; US20070031885A1; CA2409309A1

Abstract

本发明描述了利用非天然碱基的测试分析。在一个实施方案中，本方法包括将怀疑含有靶核酸的样品与聚合酶和第一和第二引物接触；如果样品中存在靶核酸，利用第一和第二引物通过PCR扩增靶核酸，以便产生具有一个双链区和一个含有非天然碱基的单链区的扩增产物；将该样品与含有标记和与单链区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子接触；至少将报道分子的一部分与扩增产物的单链区退火；在退火后，至少将报道分子的一部***解，以便至少释放一个报道分子片段；并且将该至少一个报道分子片段的释放与样品中的靶核酸的存在进行关联。本发明也提供了用于检测样品中的靶核酸的对应的试剂盒。或者，将报道分子掺入扩增产物而不是退火和然后裂解。

Description

检测核酸的材料和方法

本申请正由David J.Marshall，James R.Prudent，Christopher B.Scherrill，Gideon Shapiro，JenniferK.Grenier，Craig S.Richmond，和Simona Jurczk，美国国藉人员和居民作为PCR申请递交，并且指定了除美国以外的所有国家。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)是DNA的特定区段的酶扩增的方法。PCR是基于下面的基本步骤的重复循环：双链DNA变性，接着将寡核苷酸引物与DNA模板退火，由核酸聚合酶延伸引物(Mullis等人和Saiki等人1985；和U.S.PatentNos.4,683,195，4,683,202和4,800,159，其公开内容全文引入作为参考)。将用于PCR的寡核苷酸引物设计成与该DNA的相反链可退火，并且定位使一个引物的核酸聚合酶催化延伸产物可以作为其他引物的模板链。PCR扩增方法导致长度由寡核苷酸引物的5’末端确定的不连续的DNA片段的指数增加。

目前使用的PCR技术是扩增核酸序列的极其有效的方法，被扩增物质的检测通常需要别的操作，随后对PCR产物进行操作以确定是否存在目的DNA。开发新的方法和分析方法是需要的。

引入本文作为参考的美国专利号5,210,015涉及利用标记的寡核苷酸检测靶核酸的方法。该方法利用具有5’到3’核酸酶活性的聚合酶裂解可以随后检测的退火的标记的寡核苷酸探针。

引入本文作为参考的美国专利5,846,717涉及通过在靶序列上形成核酸裂解结构然后利用具有5’核酸酶活性以位点特异方法裂解核酸裂解结构以检测靶核酸的方法。

引入本文作为参考的美国专利5,432,272公开了非标准碱基，该碱基对在DNA或RNA中，但具有的氢键方式与标准的A:T或G:C碱基对观察到的方式不同。

发明概述

本发明涉及快速检测靶核酸的材料和方法。本发明的方法利用了报道寡核苷酸；核酸聚合酶；和第一和第二寡核苷酸引物，其中至少第一和第二寡核苷酸引物之一至少含有一个非天然碱基。

在一个实施方案中，本发明提供了在样品中检测靶核酸的方法，该方法包括将样品与核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接触，第一寡核苷酸引物含有与靶核酸的第一部分互补的序列，第二寡核苷酸引物含有一个第一区和一个第二区，第一区含有与靶核酸的第二部分互补的序列，第二区含有非天然碱基；如果样品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通过PCR扩增靶核酸产生扩增产物，所述扩增产物具有(i)双链区和(ii)含有非天然碱基的单链区；将样品与含有一个标记和一个与单链区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子接触；报道分子的至少一部分与扩增产物的单链区退火；在退火后裂解报道分子的至少一部分以便至少释放一个报道分子片段；和将该至少一个报道分子片段的释放与样品中靶核酸的存在进行关联。

在另一个实施方案中，本发明提供了在样品中检测靶核酸的方法，该方法包括将样品与核酸聚合酶、第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物接触，第一寡核苷酸引物含有与靶核酸的第一部分互补的序列，第二寡核苷酸引物含有一个第一区和一个第二区，第一区含有与靶核酸的第二部分互补的序列，第二区含有非天然碱基；如果样品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物通过PCR扩增靶核酸产生扩增产物，所述扩增产物具有(i)双链区和(ii)含有非天然碱基的一个单链区；将样品与含有一个标记和一个与单链区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子接触；将报道分子在单链区的非天然碱基对侧掺入扩增产物；并且将报道分子的掺入与样品中的靶核酸的存在进行关联。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测靶核酸的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有：核酸聚合酶；含有与靶核酸的第一部分互补的序列的第一寡核苷酸引物；含有第一区和第二区的第二寡核苷酸引物，第一区含有与靶核酸的第二部分互补的序列，第二区含有非天然碱基；和含有一个标记和一个与单链区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子。试剂盒任选进一步含有其他成分，如缓冲液和试剂来进行本发明的方法。

本发明的方法可以掺入到各种质量筛选技术和读出平台。

附图简述

本发明可以考虑下面本发明的各种实施方案的详细叙述，联系附图来更全面地理解，其中：

附图1A-1E图解说明本发明的一个实施方案的测试方法；

附图2A-2E图解说明了本发明的第二个实施方案的测试方法；

附图3展示了许多非天然碱基的化学结构，其中A是附着于多聚体骨架的点，X是N或C-Z，Y是N或C-H，Z是H，取代或非取代的烷基基团，或卤素；

附图4A-4D图解说明了本发明的第3个实施方案的测试方法；

附图5A-5E图解说明本发明的第4个实施方案的测试方法；

附图6A-6E图解说明本发明的第5个实施方案的测试方法；

附图7A-7E图解说明了本发明的第6个实施方案的测试方法；

附图8A-8E图解说明了本发明的第7个实施方案的测试方法；

附图9A-9E图解说明了本发明的第8个实施方案的测试方法；

附图10A-10E图解说明了本发明的第9个实施方案的测试方法；

附图11A-11E图解说明了本发明的第10个实施方案的测试方法；

附图12A-12E图解说明了本发明的第11个实施方案的测试方法；

附图13图解说明制备含有等位基因特异性PCR混合物和模板样品的测定平板的一般程序方法；

附图14是显示通过在PCR扩增产物中位点特异地掺入淬灭化合物，在PCR反应中淬灭荧光的图，相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴；

附图15图解说明了根据方法A制备已标记的非天然碱基的合成方案；

附图16图解说明了根据方法B制备已标记的非天然碱基的合成方案；

附图17A是显示通过在PCR扩增产物中位点特异地掺入淬灭化合物“实时”检测PCR反应中淬灭荧光的图；相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴，附图17B是显示附图17A的PCR产物的解链曲线分析的附图；解链温度表示在X轴；

附图18A是显示通过在PCR扩增产物中位点特异地掺入淬灭化合物“实时”检测PCR反应中淬灭荧光的图；相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴，附图18B是证明附图17A的PCR产物的解链曲线的分析；解链温度表示在X轴；

附图19是显示“实时”检测扩增基因组DNA的PCR反应中荧光的增加的图；相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴；

附图20是显示“实时”检测扩增不同量的逆转录RNA的PCR反应中的荧光的增加的图；相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴；

附图21是显示“实时”检测通过在PCR扩增产物中位点特异地掺入淬灭化合物，扩增不同量的逆转录RNA的PCR反应中淬灭荧光的图；相关的荧光单位(RFU’s)表示在Y轴，PCR循环的数目表示在X轴；

附图22是显示来自野生型，突变体，和杂合因子VDNA靶的多重PCR分析的总合结果的图；HEX荧光RFU表示在Y轴，FAM荧光RFU表示在X轴；

附图23A-B是显示来自各种小鼠株的基因组DNA的小鼠STS序列27.MMHAP25FLA6中的多态现象的多重PCR分析的总合结果的图；PCR循环的数目表示在X轴。在附图23A，HEX荧光RFUs表示在Y轴；在附图23B，FAM荧光RFU表示在Y轴；和

附图24是来自通过位点特异掺入淬灭化合物而扩增不同量的逆转录RNA的反应的PCR产物的解链曲线分析；随时间的荧光变化表示在Y轴，解链温度表示在X轴。

本发明可以进行各种修饰和替代形式，其特例已经通过附图中的例子表示，并且将详细叙述。但是应该可以理解，本发明不限于所述的特定实施方案。相反，本发明覆盖了所有的修饰形式，等同物，和替代形式，它们都在本发明的精神和范围内。

发明详述

本发明涉及检测，分析样品中的靶核酸中的突变或对其定量的方法和材料。本发明的方法通常包括利用PCR。PCR可以是Fast-shot^TM扩增。本发明的方法利用了报道寡核苷酸；核酸聚合酶；和第一和第二寡核苷酸引物，其中至少第一和第二引物寡核苷酸之一至少含有一个非天然碱基。利用固相支持物的其他相关的测试方法在题目为“固相支持实验***和利用非天然碱基的方法”的WO02/33126中有叙述。

如本文所用，“核酸”包括多聚分子，如脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，肽核酸(PNA)，或通常指与化学主链相连的碱基的任何序列，其中碱基具有形成碱基对或与互补的化学结构杂交的能力。适当的非核苷酸主链例如包括聚酰胺和聚吗啉主链。术语“核酸”包括寡核苷酸，核苷酸，或聚核苷酸序列，和其片段或部分。核酸可以任何适当的形式提供，例如从天然来源分离，重组产生，或人工合成，可以是单或双链，并且可以代表有义或反义链。

术语“寡核苷酸”通常指短链(例如，小于约100个核苷酸长度，通常约6到约50个核苷酸长度)可以利用本领域目前可得的技术如固相支持核酸合成，DNA复制，逆转录，限制性消化，失控转录等等来制备。寡核苷酸的准确的大小将取决于许多因子，依次将取决于最终的功能或寡核苷酸的应用。

“序列”指核苷酸的有顺序的排列。

术语“样品”利用的是它的最广泛的意义。该术语包括样品或培养物(例如，微生物培养物)，以及生物学和非生物学样品。

如本文所用，“靶”或“靶核酸”指含有怀疑是在样品中的和在本发明的方法或***中待检测或定量的核酸序列的核酸。靶核酸含有在测试方法过程中实际测试的靶核酸序列。该靶可以直接或间接测试。至少在一些实施方案中，靶核酸如果在样品中存在，可以用作本发明的方法中扩增的模板。

如本文所用，术语“互补”或“互补性”，当用于指核酸(即核苷酸序列如寡核苷酸或靶核酸时)，指通过碱基配对规则相关的序列。对于天然碱基，碱基配对规则是Watson和Crick发现的那些规则。对于非天然碱基，如本文所用，碱基配对规则包括以和Watson-Crick碱基对规则相似的方法或通过疏水，熵，或范德华力形成氢键。作为实例，序列“T-G-A”，互补序列是“A-C-T”。互补性可以是“部分”的。其中只有核酸的一些碱基可以根据碱基配对规则匹配。或者，在这些核酸之间可以是“完全”或“总体”互补的。在核酸链之间的互补的程度对核酸链之间的杂交的效率和长度具有影响。

术语“杂交”用于指互补的核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，在核酸之间相关的强度)是受这些因子如这些核酸之间的互补的程度，涉及的杂交条件的严格度，形成的杂交体的解链温度(T_m)和核酸内的G∶C比例的影响。

如本文所用，“标记”指可以提供可检测(优选可定量的)信号，并且可以附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子。这些标记提供了通过如，比色，荧光，电泳，电化学，光谱，色谱，密度计，或放射照相技术等等可检测的信号。标记可以是本身不产生可检测信号的分子，但当用于与另一个标记联合使用时可以产生或淬灭可检测信号。例如，一个标记可以是淬灭剂—染料对的淬灭剂。

如本文所用，术语“耐热的核酸聚合酶”指催化核苷的聚合的酶，并且是例如当与来自大肠杆菌的核苷酸聚合酶比较时是相对热稳定的酶。通常，该酶将能够启动与靶序列退火的引物的3’末端的合成的酶，并且将沿着模板的5’方向前行，如果具有5’到3’核酸酶活性，则水解间插的退火寡核苷酸而释放间插的核苷酸碱基或寡核苷酸片段，直到合成终止。耐热的酶在至少约37℃到约42℃的温度下具有活性，温度范围通常在约50℃到约75℃。代表性的耐热聚合酶包括例如，耐热的聚合酶，包括，但不限于水生栖热菌(Taq)，黄栖热菌(Tfl)，和嗜栖热菌(Tth)，和栖热袍菌属物种，包括但不限于那不勒斯栖热袍菌的天然的和已改变的聚合酶。

如本文所用，术语“DNA多态性”指两个或多个不同的核苷酸序列可以存在于DNA的特定位点的状况，包括任何核苷酸的变异，如单个或多个核苷酸的取代，缺失或***。这些核苷酸的变异可以是突变体或多态性的等位基因的变异。本文所述的方法的实施方案中至少一些可以检测核酸中的单个核苷酸的变异，如发生在单个碱基突变，叠加或缺失引起的β球蛋白遗传疾病(一些β—重型地中海贫血症，镰刀型细胞贫血症，C血红蛋白疾病等等)，以及多个碱基变异如α地中海贫血症或一些β地中海贫血症中涉及的那些。另外，本文的方法可以检测多态性，所述多态性与一种疾病不是必定相关的，仅仅是一种状况，其中两个或多个不同的核苷酸序列(是否具有取代，缺失或***的核苷酸碱基对)可以在该群体中的核酸的特定位点中存在，该方法可以检测人基因组的HLA区和随机多态性如线粒体的DNA。

本发明提供了检测样品中的靶核酸的方法和材料。在一个实施方案中，一个方法包括将怀疑含有靶核酸的样品与聚合酶和第一和第二引物接触；如果样品中存在靶核酸，通过PCR，利用第一和第二引物扩增靶核酸产生具有双链区和至少含有一个非天然碱基的单链区的扩增产物；将样品与含有一个标记和与单链区的非天然碱基(或多个碱基)互补的非天然碱基(或多个碱基)的报道分子接触；至少将一部分报道分子与扩增产物的单链区退火；在退火后裂解报道分子的至少一部分，以释放至少一个报道分子片段；和将至少一个报道分子片段的释放与样品中的靶核酸的存在进行关联。

在另一个实施方案中，一个方法包括将怀疑含有靶核酸的样品与聚合酶和第一和第二引物接触；如果样品中存在靶核酸，利用第一和第二引物，通过PCR，扩增靶核酸，产生具有双链区和至少含有一个非天然碱基的单链区的扩增产物；将样品与含有一个标记和与单链区的非天然碱基(或多个碱基)互补的非天然碱基(或多个碱基)的报道分子接触；将该报道分子掺入扩增产物；和将报道分子的掺入与样品中的靶核酸的存在相关联。

本发明也可以包括利用本文所述的一个或多个方法，检测样品中靶核酸的相应的试剂盒。

本发明可以提供许多优点，如果需要，包括在一些实施方案中提供检测样品中的靶核酸的能力，而不需要反应后的加工如洗涤或分离(例如，通过凝胶电泳进行)。另外，在一些实施方案中，该方法可以通过在利用一系列反应条件加工的一个反应混合物中加入所有的元素进行。这可以避免或减少与多个反应步骤和试剂相关的问题。

一般的讨论

本发明的一个实施方案现在将参考附图1所示的图解说明大体地叙述。参考附图1A，一个样品怀疑含有靶核酸100，靶核酸100包括第一部分102和第二部分104。如附图所示，靶核酸100是链100a和100b组成的双链分子。

参考附图1B，将样品与第一引物106和所述的第二引物108接触。第一引物106是与靶核酸100的第一部分102互补的。第二引物108包括第一区110，和第二区112，第一区110含有与靶核酸100的第二部分104互补的序列。第二引物108的第二区112包括非天然碱基114。第二区112是不与靶核酸100互补的。

除了第一引物和第二引物，样品也与聚合酶接触，如本文所述进行聚合酶链式反应(PCR)。如果靶核酸100存在于样品中，第一引物106的互补部分和第二引物108的互补部分与靶核酸100的对应的102和104区根据标准的碱基配对规则退火。如附图所示，当引物与靶退火时，第一引物106的3’端核苷酸是通过附图1B中作为107描述的核苷酸的一个序列，或一个“空位”与第二引物108的3’端核苷酸分离的。在优选的实施方案中，第一和第二寡核苷酸引物设计成当与模板核酸退火时，模板核酸上约0至约5个碱基的空位107存在于PCR引物的3’末端之间。

正如附图1B所示，将聚合酶用于利用PCR，或Fast-shot^TM扩增来从每个引物的3‘-OH末端合成单链。即，将第一引物106用于合成与靶核酸100的链100a 的至少一部分互补的链120a，和将第二引物108用于合成与靶核酸100的链100b的至少一部分互补的链120b，如附图1C所示。聚合酶链式反应允许进行需要数目的循环得到扩增产物120。

如附图1C所示，扩增产物120包括双链区122和单链区124。如这一实施方案所示，非天然碱基114定位于单链区124，邻接双链区122。单链区124可以包括不止一个非天然碱基。

现在参考附图1D，将扩增产物120与报道分子126接触。我们考虑可以在已经存在靶核酸的扩增之前，期间或之后的反应中加入报道分子126。报道分子126包括标记128，132，和与扩增产物120的单链区124的非天然碱基114互补的非天然碱基130。在附图1D所示的实施方案中，报道分子126包括含有染料128和淬灭剂132的一个标记和非天然碱基130。报道分子126允许与扩增产物120退火。在退火后，至少将报道分子126的一部***解，产生包括染料128的报道分子片段134，如附图1E所示。报道分子片段134的释放与样品中的靶核酸的存在相关。在所述的情况中，检测了未淬灭的报道分子片段染料的存在。在或选的实施方案中，染料和淬灭剂的定位是相反的，而报道分子片段在裂解时带走了淬灭剂。

附图8叙述了或选的测试方法，其中淬灭剂132是与第二引物108而不是报道分子偶联的。淬灭剂132淬灭了报道分子126的染料128的荧光，直到报道分子126的一部***解产生了包括染料128的报道分子片段134。如一个或选方法中，淬灭剂可以与报道分子偶联，染料可以与第二个引物偶联。在目前的说明书中，这些附图的实施方案之间共同的元素是相同地编号的，并且这些元素不需要分开讨论。

附图9A-9E，10A-10E，11A-11E，和12A-12E叙述了许多与附图1A-1E的测试相似的实施方案，其中X和Y代表非标准碱基。例如，X可以代表异胞苷，Y代表异鸟苷。下面的叙述说明了在附图1A-1E的测试和这些实施方案之间的差异。另外，同样的考虑方法和条件也可以应用。

在附图9A-9E的测试中，将第一和第二引物106，108与双链靶核酸100接触，如附图9A所示。第二引物具有与靶核酸的一部分互补的第一部分110，和与靶核酸不互补的第二部分112，该部分通常不与靶核酸杂交。第二引物108在第二部分112具有非标准碱基114，并且与和靶核酸退火的第二引物的第一部分 110邻接。将第一和第二引物用于通过PCR合成一个与靶核酸的部分互补的扩增产物120，如附图9B和9C所示。扩增产物120具有双链区122和单链区124。将报道分子126与扩增产物120的单链区124接触，如附图9C所示。报道分子包括与单链区124的非标准碱基114互补的非标准碱基119。报道分子126与单链区124退火，如附图9D所示。在报道分子126中，与非标准碱基119邻接的碱基127可以与邻接于单链区的非标准碱基114的双链区的碱基131互补，但不是必需这样的。通过聚合酶裂解碱基127，形成报道分子片段134，如附图9E所示，报道分子片段134通常含有一个标记或标记的一个部分128，如荧光团或淬灭剂，以便允许检测扩增产物120的报道分子片段。任选地，用通常包括标记128的寡核苷酸序列替代碱基127，并且从报道分子的剩余部***解。

附图10A-10E中叙述了另一个实施方案。在这一实施方案中，碱基131不是与靶核酸序列互补的第二引物108的第一区110的部分，而碱基131是与该靶核酸序列不互补的，并且是第二引物108的第二区112的部分。否则，这一测试的步骤和方法是与附图9A-9E的测试相同的。

在另一个实施方案中，第一和第二引物106，108是与双链靶核酸100接触的，如附图11A所示。第二引物具有与靶核酸的一部分互补的第一部分110，和与靶核酸不互补的第二部分112，该部分通常不与靶核酸杂交。第二引物108至少具有在第二部分112中的两个连续的非标准碱基114，117，并且与靶核酸退火的第二引物的第一部分110邻接。第一和第二引物用于通过PCR合成与靶核酸的许多部分互补的扩增产物120，如附图11B和11C所示。扩增产物120具有双链区122和单链区124。任选地，碱基141从非标准碱基114，117的第一个对侧错误掺入。报道分子126接触扩增产物120的单链区124，如附图11C所述。报道分子包括与第二引物的非标准碱基互补的非标准碱基。报道分子126与单链区124退火，如附图11D所示。非标准碱基127是通过聚合酶裂解的，产生报道分子片段134，如附图11E所示，该片段通常含有一个标记或标记的一个部分128，如荧光团或淬灭剂，以便允许检测报道分子片段或扩增产物120。或者，用通常包括标记128的寡核苷酸序列取代碱基127，并且从报道分子的剩余部分中裂解。

在另一个实施方案中，第一和第二引物106，108与双链靶核酸100接触，如附图12A所示。第二引物具有与靶核酸的一个部分互补的第一部分110，和与靶核酸不互补的第二部分112，该部分通常不与靶核酸杂交。第二引物108具有在第二部分112中的两个非标准碱基114，117，并且与和靶核酸退火的第二引物的第一部分110邻接。第一和第二引物用于通过PCR合成与靶核酸的多个部分互补的扩增产物120，如附图12B和12C所示。扩增产物120具有双链区122和单链区124。任选地，扩增产物120包括从非标准碱基117对侧通过聚合酶错误掺入的碱基121。报道分子126与扩增产物120的单链区124接触，如附图12C所示。报道分子包括与第二引物的非标准碱基114互补的非标准碱基。报道分子126与单链区124退火，如附图12D所示。报道分子126包括偶联于与单链区的碱基114退火的非标准碱基119的碱基127，但碱基127与单链区的碱基117不互补。碱基127通过聚合酶裂解，形成报道分子片段134，如附图12E所示，该片段通常含有一个标记或标记的一个部分128，如荧光团或淬灭剂，以便允许检测报道分子片段或扩增产物120。任选地，用通常含有标记128的寡核苷酸序列取代碱基127，并且从报道分子的剩余部分中裂解。

在附图2中图解说明了本发明的另一个实施方案。如附图2A所示，双链靶核酸100包括第一部分102和第二部分104。样品与第一引物106和第二引物108接触。第一引物106是与靶核酸100的第一部分102互补的。第二引物108包括与靶核酸100的第二部分104互补的第一区110，和含有非天然碱基114，并且是不与靶核酸100互补的第二区114。

除了第一引物106和第二引物108，样品与聚合酶(未示出)接触，并且进行聚合酶链式反应。与附图1所示的实施方案相似，如果靶核酸100存在于样品中，第一引物106的互补部分和第二引物108的互补部分110将与靶核酸100的对应区102，104根据标准的碱基配对规则退火。与附图1所示的实施方案相似，当引物与靶退火时，第一引物106的3’端核苷酸是通过一个核苷酸序列或“空位”107与第二引物108的3’端核苷酸分离的。在优选的实施方案中，将第一和第二寡核苷酸引物设计成当与模板核酸退火时在PCR引物的3’末端之间存在模板核酸上约0到约5个碱基的一个空位。

如附图2B和2C所示，聚合酶用于利用聚合酶链式反应，或Fast-shot^TM扩增，从每个引物的3’-OH末端合成单链120a、120b。聚合酶链式反应允许进行需要数目的循环，得到附图2C所示的扩增产物120。

如附图2C所示，扩增产物120包括双链区122和单链区124。如示，单链区 124包括第二引物108的非天然碱基114。虽然证实单链区124包括单个的非天然碱基，但本发明并不限于止，单链区可以包括一个以上非天然碱基。

现在参考附图2D，扩增产物120与报道分子150接触。在PCR扩增之前，期间或之后，在样品中加入报道分子150。报道分子150包括一个标记154和与扩增产物120的单链区124的非天然碱基114互补的非天然碱基152，如附图2E所示。将报道分子150掺入与非天然碱基114相对的扩增产物中。如下面更详细讨论的，报道分子150的掺入可以利用任何适当的酶，如聚合酶或连接酶来进行。样品中的靶核酸的存在是通过与扩增产物中的报道分子的存在进行关联而确定的。在所述的情况中，例如，靶核酸的存在是通过检测标记154，例如通过荧光或其他显示方法来确定的。适当的检测和显示方法将在下面更详细地叙述。

尽管附图1和2的附图解表示了本发明的成分的相关的位置和大小，这些代表的含义是仅为了说明的目的。正如将在本文的讨论中理解的，第一引物和第二引物的相对大小以及靶核酸的第一部分和第二部分将根据特定的应用而变化。另外，沿着靶核酸的第一引物和第二引物的相对位置将变化。另外，用于本发明的非天然碱基和标记的位置将根据用途而变化。

聚合酶

本发明提供了利用聚合酶链式反应，或Fast-shot^TM扩增的材料和方法以检测样品中需要的靶核酸。适当的核酸聚合酶例如包括能够通过掺入与模板寡核苷酸互补的核酸延伸寡核苷酸的聚合酶。例如，聚合酶可以是DNA聚合酶。

具有聚合酶活性的酶催化在核酸引物的延伸端的3’羟基基团和核苷酸三磷酸的5’磷酸基团之间形成键。这些核苷酸三磷酸通常是选自脱氧腺苷三磷酸(A)，脱氧胸苷三磷酸(T)，脱氧胞苷三磷酸(C)和脱氧鸟苷三磷酸(G)。但是，至少在一些实施方案中，用于本发明的方法的聚合酶也可以利用那些非天然碱基的核苷酸三磷酸掺入非天然碱基。

因为在各种方法例如PCR过程中的链变性需要的相对高的温度可以导致许多核酸聚合酶的不可逆的失活，用于本发明中的核酸聚合酶，优选地保留了足够的聚合酶活性，当遭受许多方法如PCR的极端温度时将能够完成反应。优选地用于本发明的方法的核酸聚合酶是热稳定的核酸聚合酶。适当的热稳定核酸聚合酶包括，但不限于来源于嗜热生物体的酶。衍生适当的热稳定核酸聚合酶的嗜热生物体的例子包括，但不限于水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，那不勒斯栖热袍菌和芽孢杆菌，以及热球菌属，硫化叶菌和火球菌属的物种。核酸聚合酶可以直接从这些嗜热生物体中纯化。但是，核酸聚合酶产量的大量增加可以首先在多拷贝表达载体中通过重组DNA技术方法克隆编码酶的基因，将载体***能够表达酶的宿主细胞菌株，培养含有载体的宿主细胞，然后从已经表达酶的宿主细胞菌株中提取核酸聚合酶而完成。适当的热稳定核酸聚合酶如上面所述的那些是可以购买得到的。

许多核酸聚合酶具有核酸聚合酶活性以外的活性；这些可以包括5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。5’-3’和3’-5’外切核酸酶活性是本领域普通技术人员已知的。3’-5’外切核酸酶活性通过除去已经掺入的不准确的碱基，提高了新合成的链的准确度。相反，经常存在于核酸聚合酶中的5’-3’外切酶活性可能在特定的应用中并不理想，因为它可能消化核酸，包括具有未保护的5’末端的引物。所以，具有减弱的5’-3’外切核酸酶活性或其中缺乏这样的活性的热稳定核酸聚合酶是在本发明的至少一些实施方案中利用的酶的需要的特征。在其他实施方案中，聚合酶需要具有5’-3’外切核酸酶活性来有效地裂解报道分子和释放已标记的片段，使该信号可以直接或间接地产生。

没有5’-3’外切核酸酶活性或具有减弱的5’-3’外切核酸酶活性的适当的核酸聚合酶是本领域已知的。已经叙述了各种核酸聚合酶，其中已经在完成该靶核酸聚合酶中导入了一个修饰。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段可以以全酶的蛋白质水解片段形式产生，其中已经除去控制5’-3’外切核酸酶活性的蛋白质区域。缺5’-3’外切核酸酶活性的适当的核酸聚合酶是可以商业获得的。缺乏5’-3’外切核酸酶活性的商业可得聚合酶的例子包括AMPLITAQSTOFFEL^TMDNA聚合酶和KlenTaq^TMDNA聚合酶。

聚合酶可以是PCR过程中“错误掺入”的碱基。用另一句话说，聚合酶可以在合成的链的3’位置上掺入一个核苷酸(例如，腺苷)，它不与模板核酸链上的配对的核苷酸(例如，胞苷)形成规范的氢碱基对。可以改变PCR条件降低碱基的错误掺入的发生。例如，可以改变反应条件，如湿度，盐浓度，pH，去垢剂浓度，金属的类型，金属的浓度，等等来降低聚合酶将掺入与模板链不互补的碱基的可能性。

正如利用单个聚合酶的或选方案，任何本文所述的方法可以利用多个酶进行。例如，聚合酶，如外切核酸酶缺失的聚合酶，和外切核酸酶可以联合使用。另一个例子是外切核酸酶缺失聚合酶和热稳定瓣内切核酸酶的使用。另外，应该认识到，RNA可以用作样品，逆转录酶可以用于将RNA转录为cDNA。转录可以在PCR扩增之前或期间发生。

第一引物和第二引物

本发明提供了利用包括聚合酶，第一引物和第二引物的PCR检测靶核酸的方法。如附图1，2，和9-12所示，第一引物106含有与靶核酸100的第一部分102互补的序列。第二引物108含有第一区110和第二区112，第一区110含有与靶核酸的第二部分104互补的序列，第二区112至少含有一个非天然碱基。第二区通常与靶核酸不互补。

在PCR技术中，将引物设计成与已知存在于待扩增的靶核酸中的序列互补。通常，选择与待扩增的靶核酸序列的侧翼序列(可以是部分)互补的引物。优选地，选择与待检测的靶核酸的序列侧翼互补的引物。一旦靶核酸的序列已知，首先确定待检测的靶核酸的长度或大小，确定靠近靶核酸序列的5’和3’末端或紧邻5’和3’末端的适当的侧翼序列，和利用标准的Watson-Crick碱基配对规则确定靶核酸序列的侧翼互补核酸序列，然后合成已确定的引物序列来制备引物的序列。这一制备过程可以利用本领域已知的适当方法来完成，例如克隆和限制消化适当的序列和直接的化学合成。化学合成方法可以包括例如，Narang等人(1979)，酶学方法68：90所述的磷酸三酯方法，Brown等人(1979)，酶学方法68：109中公开的磷酸二酯方法，Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters22：1859中公开的二乙基氨基磷酸酯方法和美国专利4,458，066中公开的固相支持方法，所有这些掺入本文作为参考。

第一和第二引物与靶核酸形成足够稳定的杂交体的能力取决于几个因素，例如在引物和靶核酸之间展示的互补性程度。通常，与它的靶具有更高程度的互补性的寡核苷酸将与靶形成更稳定的杂交体。

另外，引物的长度可以影响引物与靶核酸杂交的温度。通常，与较短引物相比，较长的引物与靶核酸序列在更高的温度下形成足够稳定的杂交体。

另外，在引物中存在高比例的G或C或特定的非天然碱基可以增强在引物和靶核酸之间形成杂交体的稳定性。这种增强的稳定性例如可以是由G-C相互作用中或其他非天然碱基对相互作用中存在3个氢键造成的，相比之下，A- T相互作用中存在两个氢键。

通过解链温度，或“T_m”可以估计或表示核酸双链体的稳定性。在特定条件下的特定的核酸双链体的T_m是核酸双链体的50％的群体解离成单链核酸分子的温度。特定的核酸双链体的T_m可以通过任何适当的方法来推测。确定特定的核酸双链体的Tm的适当的方法例如包括软件程序。适当的用于这些方法中的引物和本发明的试剂盒可以根据含有该引物的寡核苷酸双链体的推测的T_m来预定。

如附图1和2所示，当将第一和第二引物与靶核酸退火，空位107存在于第一引物106的3’末端核苷酸和第二引物108的3’末端核苷酸之间。空位107含有靶核酸的许多核苷酸。空位可以是任何数目的核苷酸，前提是聚合酶可以有效地掺入核苷酸到延长的链中，在一轮PCR反应(例如，一轮退火，延伸，变性)中填充空位。通常，聚合酶可以在每秒放置约30到约100个碱基。所以，引物之间空位的最大长度取决于一轮PCR中的时间，其中温度是在一个范围中，其中聚合酶是有活性的，并且引物是退火的。

对于Fast-shot^TM扩增，利用标准热循环仪，温度变化相对是慢的，只要限制了Peltier冷却和加热。当利用标准热循环仪时，Fast-shot^TM扩增反应的条件是在温度范围内的，其中聚合酶是有活性的，引物退火约10到15秒。应该考虑，本发明的方法可以利用能够快速热循环样品温度的微流***来进行。当延伸时间相对短时，温度变化相对快速。这样的快速热循环可以利用例如，LabChip^TM技术来进行(Caliper技术，Palo Alto，CA)。在一个实施方案中，第一和第二寡核苷酸引物设计成当与靶核酸退火时，在PCR引物的3’末端之间存在靶核酸上的约0到约5个碱基的空位。

非天然碱基

正如本发明所考虑的，第二引物的第二区通常至少含有一个非天然碱基。DNA和RNA是包括分别用磷酸二酯键偶联的脱氧核糖或核糖的寡核苷酸。各个脱氧核糖或核糖包括与糖偶联的一个碱基。掺入天然存在的DNA和RNA中的碱基是腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，和尿嘧啶(U)。这5个碱基是“天然碱基”。根据Watson和Crick阐述的碱基配对规则，天然碱基可以杂交形成嘌呤—嘧啶碱基对，其中G与C配对，A与T或U配对。这些配对规则促进了寡核苷酸与互补的寡核苷酸的特异的杂交。

通过在各个碱基对的两个碱基之间产生两个或3个氢键有助于天然碱基的碱基对的形成。各个碱基包括两个或三个氢键供体和氢键受体。碱基对的氢键是通过在一个碱基上的至少一个氢键供体与另一个碱基的氢键受体之间的相互作用来形成的。氢键供体例如包括至少具有一个附着的氢的杂原子(例如，氧或氮)。氢键受体包括例如，具有单个电子对的杂原子(例如，氧或氮)。

通过在非氢键位置取代可以使天然碱基，A，G，C，T，和U衍生形成修饰的天然碱基。例如，通过将反应性官能团(例如，硫，肼，醇，胺等等)与碱基的非氢键原子连接附着于支持物上，可以修饰天然碱基。其他可能的取代基包括例如，生物素，地高辛配基，荧光基团，烷基(例如，甲基或乙基)等等。

形成氢键的碱基对的非天然碱基也可以如美国专利5,432,272，5,965,364，6,001,983和6,037,120和美国专利申请系列号08/775,401中所述构建，该文献引入本文作为参考。附图3说明了适当的碱基和它们对应的碱基对的几个实例。这些碱基的特定的例子包括在碱基对组合中的下面的碱基(iso-C/iso-G，K/X，H/J，和M/N)：

Figure DEST_PATH_S01812665019960327D000161

其中A是附着于糖或多聚体主链的其他部分的位置，R是H或取代或未取代烷基基团。可以认识到，利用氢键的其他非天然碱基是可以制备的，以及通过在碱基的非氢键原子中掺入官能团可以修饰上面鉴定的非天然碱基。

这些非天然碱基对的氢键是与天然碱基的那些相似的，其中在配对的非天然碱基的氢键受体和氢键供体之间形成两个或3个氢键。在天然碱基和这些非天然碱基之间的不同之一是氢键受体和氢键供体的数目和地址。例如，胞嘧啶可以认为是供体/受体/受体碱基，鸟嘌呤是互补的受体/供体/供体碱基。Iso-C是受体/受体/供体碱基，iso-G是互补的供体/供体/受体碱基，如美国专利号6,037,120中所述，引入本文作为参考。

用于寡核苷酸的其他非天然碱基例如包括在引入本文作为参考的Ren等人，J.Am.Chem.Soc.118，1671(1996)和McMinn等人，J.Am.Chem.Soc.121，11585(1999)讨论的萘，菲，和芘衍生物。这些碱基不利用氢键稳定，而是依靠疏水性或范德华力形成碱基对。

根据本发明所述的非天然碱基的利用是在样品中存在的核酸序列的检测和定量下可延伸的。例如，非天然碱基可以被催化与核酸相关的反应的许多酶识别。尽管聚合酶需要互补核苷酸以继续聚合一种延伸寡核苷酸链，其他酶不需要互补核苷酸。如果模板中存在非天然碱基，并且在反应混合物中不存在它的互补的非天然碱基，当尝试使延长中的引物延伸超过非天然碱基时，聚合酶通常将终止(或者在一些情况中，当给予足够的时间，错误掺入一个碱基)。但是，催化与核酸相关的反应的其他酶，如连接酶，激酶，核酸酶，聚合酶，拓扑异构酶，螺旋酶等等可以催化包括非天然碱基的反应。这样的非天然碱基的特征是可以利用的，并且在本发明的范围内。

例如，非天然碱基可以用于产生具有单个链突出端的双链核酸序列。这可以通过进行PCR反应检测样品中的靶核酸来完成，靶核酸具有第一部分和第二部分，其中反应***包括所有四种天然存在的dNTP，第一引物与靶核酸的第一部分互补，第二引物具有第一区和第二区，第一区是与靶核酸的第一部分互补的，第二部分是与靶核酸不互补的。第二引物的第二区含有非天然碱基。如果存在靶核酸，第一引物和第二引物的第一区与其杂交。几轮PCR将产生含有(i)双链区和(ii)单链区的扩增产物。双链区是通过在PCR中延伸第一和第二引物形成的。单链区包括一个或更多非天然碱基。由于聚合酶不能够在缺乏互补的非天然碱基的核苷酸三磷酸时，通过超过非天然碱基的聚合作用来形成延伸产物，因而导致扩增产物的单链区。以这种方式，非天然碱基的功能是维持扩增产物的单链区。

如上面提到的，在一些情况下，聚合酶可以是在非天然碱基的对侧错误掺入一个碱基。在这一实施方案中，错误掺入是因为该反应混合物不包括互补的非天然碱基而发生的。所以，如果给予足够的时间，在一些情况中，聚合酶在反应混合物中非天然碱基对侧错误掺入了一个碱基。

扩增

在PCR过程中，聚合酶，第一引物和第二引物是用于产生如本文所述的扩增产物的。可以利用的一个PCR技术是修饰的PCR，或Fast-shot^TM扩增。如本文所用，术语“Fast-shot^TM扩增”指修饰的聚合酶链式反应。

传统的PCR方法包括下面步骤：变性，或双链核酸的解链；引物的退火；和利用聚合酶延伸引物。这一循环是通过变性延伸的引物和再起始来重复的。理论上，靶序列的拷贝数是指数增长的。在实践中，它通常在每个循环中加倍直到达到一个平台，这时引物模板积累，多于在循环过程中酶的延伸；然后靶核酸变成线性增加。

Fast-shot扩增是修饰的聚合酶链式反应，其中延伸步骤，以及退火和解链步骤是非常短或没有。正如本文所用，当提到PCR的“步骤”时，一个步骤是一个时期，其中反应维持在需要的温度，而没有温度的很大波动。例如，典型的PCR的延伸步骤约为30秒到约60秒。Fast-shot^TM扩增的延伸步骤通常的范围是约0秒到约20秒。优选地，延伸步骤约1秒或更少。在优选的实施方案中，删除了延伸步骤。典型的PCR的退火和解链步骤的时间可以是在30秒到60秒的范围内。Fast-shot^TM扩增中的退火和解链步骤通常可以在约0到约60秒的范围内。对于Fast-shot^TM扩增，退火和解链步骤通常不超过2秒，优选地约1秒或更少。当删除了延伸步骤时，温度是在退火和解链步骤之间循环，但不包括在退火和解链温度之间的中间延伸步骤。

另外，从退火温度到解链温度中温度可以改变多快的限制是取决于在延伸引物上掺入碱基过程中的聚合酶的效率和必需掺入的碱基的数目，这是通过引物之间的空位和引物的长度而确定的。Fast-shot^TM扩增的例子如实施例中所示。

用于确定样品中核酸序列的存在所需的Fast-shot^TM扩增循环的数目可以根据样品中靶分子的数目而改变。在如下所述的一个实施例中，总共37个循环足够用于检测少至100个靶核酸分子的。

扩增产物

如附图1，2，和9-12所示，PCR可用于产生含有双链区122和单链区124的扩增产物120。如这些附图所示，双链区122是从第一和第二引物106和108延伸得到的。如上讨论，单链区124通过在本发明的第二个引物中掺入非天然碱基得到的。第二引物108的第二区112是与靶核酸100不互补的。如上讨论，因为非天然碱基遵循Watson和Crick的碱基配对原则并且与其他非天然碱基形成键，非天然碱基的存在维持了第二区112，作为扩增产物120中的单链区124。

在或选的实施方案中，单链区124包括一个以上的非天然碱基。非天然碱基的数目包括在第二引物108的第二区112，可以根据需要选择。

报道分子

如本文所用，术语“报道分子”指互补的成分(例如，一个寡核苷酸)，所以形成了具有第二引物的第二部分的双链体结构。参考例如附图1，2和9-12所示的实施方案，报道分子含有一个标记，128，132(附图2中的154)和与单链区124的非天然碱基114互补的至少一个非天然碱基130(附图2中的152)。优选地，报道分子是与聚合酶链式反应的第一引物或第二引物不互补的。优选地，报道分子的3’末端是“封闭的”，抑制了在引物延伸产物中掺入报道分子。“封闭”可以通过利用非互补碱基或通过在最后的核苷酸的3’羟基加一个化学部分如生物素或磷酸基团来达到，取决于选择的部分，它也可以通过作为标记到达双重目的。

用于本发明的报道分子可以含有一个以上的非天然碱基。包括在报道分子中的非天然碱基的数目可以由使用者确定，将取决于一些因素，如第二引物的第二区的长度和碱基组成和需要的杂交条件和杂交的特异性。

第二引物的第二区的核苷酸含量通常决定了报道分子的核苷酸含量。即，通过确定第二引物的第二区的序列，和利用Watson和Crick发现的标准规则确定第二区的互补序列来确定报道分子的序列。在一个实施方案中，例如，第二引物的第二区含有单个的非天然碱基。在这一实施方案中，报道分子将优选地包括单个的非天然碱基，该碱基与第二引物的中的非天然碱基互补。同样，当第二引物的第二区中包括一个非天然碱基时，第二区的序列确定了该序列的互补序列，并且因此合成了报道分子。

假如第二引物的第二部分在多种测试中相同，具有能够与第二引物的第二部分杂交的相同序列的报道分子可以在这些测试中使用。用另一句话说，可以使用“通用”的报道分子和第二引物的第二部分。第二引物的“通用”的第二部分然后可以附着于第二引物或作为第二引物的部分而合成，其中第一部分是特异于靶核酸的。这例如可以用于使用者为了需要的靶核酸购买的试剂盒中。

在其他实施方案中，在给定的测试中，利用几个第二引物是有益的，每个在它们的第二区具有不同的序列，并且几个报道分子中的每个具有与几个不同的第二引物之一的第二部分互补的序列。在这样的测试中，每个报道分子具有不同的标记可能是有益的。在一些实施方案中，报道分子可以将它们的3’末端附着于固体或其他独特的支持物的不同区。

报道分子与具有互补序列的寡核苷酸形成足够稳定的杂交体的能力取决于几个因素，如上文关于引物的讨论。

在或选的实施方案中，第二引物和报道分子是单个的化合物。这一实施方案在附图4中有叙述。如附图4A所示，靶核酸100与第一引物106和第二引物108接触。在这一实施方案中，第二引物具有，第一区110，第二区112，接头180，报道分子190，和淬灭剂196。在这一实施方案中，接头180与将第二引物108与报道分子190连接。报道分子190含有染料192，非天然碱基194，淬灭剂196。非天然碱基194是与第二引物108的非天然碱基114互补的。如附图4B所示，第一区110与靶核酸100的第一部分102退火。接头180具有将一个核苷酸的5’末端与另一个核苷酸的3’末端连接的化学接头。接头180允许报道分子126回折，与第二引物102的第二区112形成碱基对，如附图4B所示。在一个实施方案中，接头180具有足够长度的核苷酸序列，允许报道分子126与第二区112杂交。优选地，在这一实施方案中含有接头180的核苷酸能够形成发夹环182。在另一个实施方案中，报道分子126与第二区112杂交的温度低于第一区110与靶110的第二区104杂交的温度。

附图4C表示了在PCR或Fast-shot^TM扩增中引物104和106延伸产生的扩增产物200。扩增产物200包括双链区202和单链区204。报道分子190与扩增产物的单链区204退火。

如附图4D所示，通过酶，例如聚合酶或其他适当的酶，裂解报道分子190，这样释放了报道分子片段198。释放的报道分子片段198包括染料192。如本文所述可以观察到从淬灭剂196的附近释放染料192。在一些实施方案中，可以将报道分子126与第二区112杂交，而第一和第二引物106，108延伸，如附图4所示。这允许第一引物106充分延伸时聚合酶裂解报道分子片段198，并且可以允许在PCR过程中“实时”检测测试而不需要随后加入报道分子。在第一和第二引物的延伸过程中，报道分子与第二区的杂交不是必需的特征。在以附图1所述的测试所述的相似的方法延伸后，可能发生报道分子与第二区的杂交。

标记

根据本发明，报道分子含有一个标记。通过分光光谱，光化学，生物化学，免疫化学或化学测试掺入可检测的部分可以标记核苷酸和寡核苷酸。将标记与核苷酸或寡核苷酸连接或偶联的方法取决于利用标记的类型，和核苷酸或寡核苷酸上的标记的位置。

适用于本发明的各种标记，以及将其引入探针中的方法是本领域已知的，标记包括但不限于酶底物，放射活性原子，荧光染料，生色团，化学发光标记，电化学发光标记，如ORI-TAG^TM(Igen)，具有特异的结合伙伴的配体或可以相互作用以增强，改变或减弱一个信号的任何其他标记。应该理解，PCR可以利用热循环仪器进行实验，应该选择一个标记，该标记适应这一自动过程中需要的温度循环。

适用于本发明的方法的一个标记的一个放射性原子是³²P。在核酸中导入³²P的方法是本领域已知的，且包括例如用激酶进行5’标记，或通过切口翻译随机插入。

应该理解，上面的叙述并不意味中在不同的类别中分类各种标记，因为相同的标记可以以几个不同的方式起作用。例如，¹²⁵I可以作为放射性标记或作为电子密度试剂。另外，为了需要的效果，可以组合各种标记。例如，可以标记具有生物素的核苷酸，和用具有¹²⁵I标记的抗生物素检测它的存在。其它变更和可能性将是本领域普通技术人员明了的，并且认为是在本发明的范围内。

在一些情况中，在单个寡核苷酸上利用两个相互作用的标记是需要的，同时考虑在寡核苷酸上标记之间保持适当的间隔，以允许寡核苷酸水解过程中这些标记的分离。在不同的寡核苷酸上如报道分子和第二引物的第二区利用两个相互作用的标记同样是需要的。在这一实施方案中，报道分子和第二区设计成相互杂交的。再次，考虑在杂交时维持寡核苷酸之间的标记的适当的间隔。

相互作用的标记对的一个类型是淬灭剂-染料对。优选地，淬灭剂-染料对是由荧光团和淬灭剂组成的。适当的荧光团包括例如，荧光素，级联蓝，六氯荧光素，四氯荧光素，TAMRA，ROX，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5，p-甲氧苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-indacene-丙酸，6-羧基-X-罗丹明，N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明，德克萨斯红，伊红，荧光素，44-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸，4，4-二氟-5，p-乙氧苯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-indacene3-丙酸，和4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-indacene-丙酸。适当的淬灭剂包括例如，Dabcyl，QSY7^TM(分子探针，Eugene，OR)等等。另外，如果吸收另一个染料发射的光，染料也可以用作淬灭剂。

这些标记可以直接或间接地通过各种技术附着于核苷酸，包括非天然碱基，或寡核苷酸。根据利用的标记的准确类型，该标记可以定位于报道分子的5’或3’端，内部地定位于报道分子的核苷酸序列中，或附着于从报道分子延伸的间隔臂，并且具有各种大小和组成以促进信号相互作用。利用商业可得的亚磷酰胺试剂，可以生产在每端含有官能团(例如，硫醇或伯胺)的寡核苷酸，例如通过将亚磷酰胺染料与5’碱基的5’羟基通过形成磷酸键，或内部地通过适当的已保护的亚磷酰胺偶联来生产，可以利用如PCR方案：A，方法和应用的指导，Innis等人，学术出版社，1990所述的方案来标记它们，该文献引入本文作为参考。

在引入本文作为参考的美国专利4,914,210中叙述了通常在5’末端的寡核苷酸报道分子序列中掺入具有一个或几个硫氢基，氨基或羟基成分的寡核苷酸官能化试剂的方法。例如，5’磷酸基团可以作为放射性同位素利用多核苷酸激酶和[γ³²P]掺入，以便提供报道分子基团。可以通过使在合成过程中导入的氨基胸苷残基与抗生物素的羟基琥珀酰亚胺酯反应，在5’末端加入生物素。

在3’末端的标记例如可以利用多核苷酸末端转移酶加入需要的成分，如蛹虫草菌素，³⁵S-dATP和生物素dUTP。

寡核苷酸衍生物也可以作为标记获得。例如，Etheno-dA和etheno-A是已知可以掺入报道分子的荧光腺嘌呤核苷酸。同样，etheno-dC是可以在报道分子合成中利用的另一个类似物。含有这样的核苷酸衍生物的报道分子可以水解以便在PCR过程中核酸聚合酶延伸引物时通过聚合酶5’到3’核酸活性释放更强的荧光单核苷酸。

在一些实施方案中，已标记的报道分子含有第一和第二标记，其中通过核酸酶敏感的裂解位点从第二标记分离第一标记。

报道分子的标记可以在报道分子的任何适当的位置来定位。例如，当报道分子具有一个以上核苷酸时，该标记可以附着于报道分子序列的任何适当的核苷酸。标记可以定位于报道分子的5’末端，并且通过非互补序列从与靶核酸互补的报道分子的序列分离。在这一实施方案中，报道分子具有与扩增产物的非天然碱基互补的非天然碱基，和与第二引物的第二区不互补的序列，该标记定位于与第二区非互补的序列中。另外，标记可以利用适当的间隔基或化学接头间接地附着于报道分子的核苷酸。

在另一个实施方案中，已标记的报道分子具有有效地定位于报道分子或在报道分子和测试的第二个成分(如第二个寡核苷酸)上的相互作用的信号产生标记以致当相互作用的信号产生标记是足够相互靠近时淬灭可检测信号的产生。优选地这些标记是通过在对核苷酸裂解敏感的报道分子内的一个位点分离的，从而允许核酸聚合酶的5’到3’核酸酶活性通过在核酸酶敏感位点裂解报道分子，从第二个相互作用的信号产生标记分离第一个相互作用的信号产生标记。相互作用的信号产生成分的分离(例如，裂解报道分子，释放含有一个标记的报道分子片段)导致可检测信号的产生。这样的标记的例子包括染料/淬灭剂对或两个染料对(其中一个染料的发射刺激了第二个染料的发射)。

在例举的实施方案中，相互作用的信号产生对具有荧光团，例如荧光素，5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-硫酸(EDANS)，四甲基罗丹明，等等，和可以淬灭荧光团的荧光发射的淬灭剂，例如二甲基氨基偶氮苯氨基exal-3-acrinido(Dabcyl)。普通技术人员可以选择将淬灭特定的荧光团的发射的适当的淬灭剂成分。在列举的实施方案中，Dabcyl淬灭剂吸收从荧光团成分发射的荧光。荧光淬灭剂对已经在Morrison，在非同位素探测，印迹和测序中能量转移和荧光淬灭的检测，学术出版社，1995，引入本文作为参考的文献中有叙述。

或者，这些相互作用的信号产生标记可以用于检测方法中，其中第二引物的第二区至少具有一个非天然碱基和一个标记。该对的第二标记是通过报道分子提供的，其中至少具有与第二引物的非天然碱基互补的一个非天然碱基和第二个标记。在附图6中说明了这一实施方案。例如，如果利用了染料/淬灭剂，报道分子与扩增产物的杂交或扩增产物的掺入将导致荧光素的减少。

或者，可以利用荧光素共振能量转移(FRET)或荧光素极化检测两个标记的邻近性。FRET是两个染料分子的电子激发状态之间的依赖距离的相互作用，其中将激发从供体分子转移到受体分子而不发射光子。FRET的供体/受体染料对的例子是荧光素/四甲基罗丹明，IAEDANS^TM/荧光素(分子探针，Eugene，OR)，EDANS^TM/Dabcyl，荧光素/荧光素(分子探针，Eugene，OR)，BODIPY^TMFL/BODIPY^TMFL(分子探针，Eugene，OR)，和荧光素/QSY7^TM。

退火

在检测方法过程中，在样品中，在适当的时间内加入报道分子。在附图1所述的实施方案中，在PCR产生了足够的扩增产物120后，将报道分子126与扩增产物120的单链区124退火。在这一所述的实施方案中，报道分子126含有染料128，淬灭剂132，和与第二引物108的非天然碱基114互补的非天然碱基130。报道分子126与对应于第二引物108的第二区112的序列退火。报道分子126可以在PCR已经产生足够的扩增产物120后加入反应混合物，或者可以在PCR扩增之前，在反应混合物中加入报道分子126。优选在PCR扩增之前在反应混合物中加入报道分子126。在扩增后，温度优选地降低到低于报道分子/扩增产物的解链温度的一个温度，以允许将报道分子与扩增产物的单链区退火。在一个实施方案中，在将报道分子与单链突出区退火的步骤中，反应温度降低至约49℃或更低。退火的进行相似于本发明的其他实施方案，包括利用如上所述的其他报道分子和其他类型标记的实施方案。在另一个实施方案中，报道分子126在第一和第二引物106，108和扩增产物120的解链温度或该温度以上退火。当进行PCR扩增产物的“实时”检测时，这一实施方案是特别有用。

裂解

在本发明的一个实施方案中，在报道分子与扩增产物退火后，裂解事件发生，至少释放了一个报道分子片段。报道分子片段的释放是与如上所述的靶核酸的存在相关的。一旦报道分子与扩增产物的单链区退火，形成了通过裂解复合物释放报道分子片段的酶可识别的报道分子/扩增产物复合物。用于本实施方案中的酶通常能够识别各种报道分子/扩增产物复合物结构。例如，报道分子126的5’末端部分可以与扩增产物的序列交迭，形成单链突出区160(参见附图1D)。

在另一个实施方案中，报道分子126不含有交迭区形成单链突出区，而当它与扩增产物退火时报道分子形成切口样结构(参见附图5)。在这一实施方案中，在扩增产物中形成切口样结构，如附图5D所示。通常，在双链DNA中的一个“切口”是在一个链的两个邻接的核苷酸之间缺乏磷酸二酯键。如本文所用，当在报道分子126的5’末端核苷酸和扩增产物的链100a的3’末端核苷酸之间缺乏磷酸二酯键时，形成了“切口样”结构。有几个酶如大肠杆菌DNA聚合酶I，能够在双链DNA中利用切口作为起始点，从中双链的一个链可以降解，并且通过新材料的再合成来取代。

在这一实施方案中，报道分子210包括与扩增产物的非天然碱基114互补的非天然碱基216，染料212，和淬灭剂214。报道分子210与扩增产物的单链部分退火。所以，在非天然碱基216和扩增产物的邻接的核苷酸之间产生了一个切口。在这一实施方案中，聚合酶识别了在报道分子/扩增产物复合物中形成的切口样结构，并且在那个切口位点裂解报道分子。复合物的裂解释放了报道分子片段134，并且检测了信号。

尽管报道分子/扩增产物复合物形成的一些特定的结构将以一些细节讨论，其他报道分子/扩增产物复合物可以形成并达到如上所述的裂解。

参考附图1D所述的实施方案，在退火后报道分子126的5’末端160的部分是不与靶退火的，并且是单链。应该理解，假如保持了聚合酶的5’到3’核酸酶活性从扩增产物裂解退火的报道片段的能力，单链突出区160的碱基可以是任何长度。对于在附图1D中举例的实施方案中的检测，反应是在足够允许聚合酶的5’到3’核酸酶活性裂解退火的报道分子126的条件下继续的。报道分子126的裂解产生了然后可以检测(或者，余下的报道分子/扩增产物复合物可以检测)的裂解片段134，并且该片段是样品中靶核苷酸的存在的指示。在至少一些实施方案中，报道分子片段可以包括单，双和更大的核苷酸片段的混合物。

聚合酶的核酸酶活性裂解单链区160，释放报道分子片段134，如附图1E所示。在这一实施方案中，报道分子片段含有染料128。来自包括淬灭剂132的扩增产物的染料128的释放允许检测染料。所以，报道分子片段的释放允许在染料从淬灭剂的附近释放时检测染料。这依次允许将报道分子片段与靶核酸的存在相联系。或者，染料和淬灭剂的放置是可以逆转的，并且淬灭剂是用报道分子片段释放的，然后检测报道分子/扩增产物上的染料。

掺入

现在参考附图2，表示了本发明的或选的实施方案。在这一实施方案中，第二引物的第二区124含有非天然碱基124。与非天然碱基124互补的非天然碱基152利用适当的酶掺入了扩增产物。在这一实施方案中，报道分子的掺入与样品中的靶核酸的存在相关。

如附图2所示，本发明的方法利用了报道分子150；核酸聚合酶(没有显示)；第一引物106和第二引物108。PCR反应混合物也含有四个天然存在的核苷酸三磷酸(即，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP)以及作为报道分子150的一个或多个非天然核苷酸三磷酸(或一个含有非天然核苷酸三磷酸的寡核苷酸)。在所述的实施方案中，在反应混合物中的一个或多个非天然核苷酸三磷酸含有一个标记154。PCR可以是Fast-shot^TM扩增。

第一引物106含有与靶核酸100的一部分互补的序列并且可以与靶核酸100的该部分杂交。第二引物108具有第一区110和第二区112。第一区110含有与靶序列100的一部分互补的序列。第二引物108的第二区112具有非天然碱基114，这一第二区112是与靶核酸100不互补的。虽然，在第二区112中据叙述只有单个核苷酸，可以理解第二区可以包括其他的核苷酸。优选地，非天然碱基114是定位于第二引物108的第一区110和第二区112之间的连接点。在一些实施方案中，在第二寡核苷酸引物的第二区112中存在的非天然碱基114是iso-C或 iso-G。

除了第一引物106和第二引物108，样品与聚合酶接触(没有显示)，并且进行聚合酶链式反应。如果样品中存在靶核酸100，第一引物106的互补部分和第二引物108的互补部分110与靶核酸100的对应区102，104根据标准的碱基配对规则退火。与附图1所示的实施方案相似，当引物与靶退火时，第一引物106的3’末端核苷酸可以通过核苷酸的一个序列或一个“空位”，与第二引物108的3’末端核苷酸分隔开。在优选的实施方案中，设计第一和第二引物，使当与模板核酸退火时，PCR引物的3’末端之间存在模板核酸上的约0到约5个碱基的空位。

如附图2B和2C所示，利用聚合酶链式反应或修饰的Fast-shot^TM扩增，聚合酶用于合成来自每个引物的3’-OH的单链120a，120b，聚合酶链式反应允许进行需要数目的循环，以便得到附图2C所示的扩增产物120。

如附图2C所示，扩增产物120包括双链区122和单链区124。如示，单链区124具有第二引物108的非天然碱基114。虽然，单链区124显示出包括单个的非天然碱基，这一区可以包括一个以上的非天然碱基。

现在参考附图2D，然后，扩增产物120与报道分子150接触。报道分子150具有一个标记154和非天然碱基152。将报道分子150在非天然碱基114对侧掺入扩增产物。如附图2E所示。在一个实施方案中，报道分子150的非天然碱基152具有与扩增产物120的单链区124的非天然碱基114互补的核苷酸三磷酸碱基。在这一实施方案中，PCR反应包括存在已标记的非天然核苷酸三磷酸碱基，另外还有四个天然存在的核苷酸三磷酸碱基(即，dATP，dCTP，dGTP和dTTP)。在PCR反应中的非天然核苷酸三磷酸碱基的浓度可以例如在1μM到100μM的范围内。

在扩增产物120中掺入报道分子150的适当的酶包括例如聚合酶和连接酶。能够在延伸的引物链中掺入天然核苷酸的许多聚合酶也可以在扩增产物中互补的非天然碱基对侧掺入非天然碱基。通常，A类DNA聚合酶；如Klenow，Tfl，Tth，Taq，HotTub，和Bst能够比B类聚合酶；如Pfu，Tli，Vent exo-，T4，和Pwo更好地掺入非天然碱基。逆转录酶如HIV-1也可以用于在模板中的互补的非天然碱基相对的延伸引物中掺入非天然碱基。在这一实施方案中，聚合酶可以是缺乏核酸酶或具有降低的核酸酶的活性。尽管不打算限制本发明，核酸酶缺乏的聚合酶可以期望更强，因为核酸酶活性已经显示能够干扰一些PCR反应(Gene1992112(1)：29-35，Science1993260(5109)：778-83)。

样品中靶核酸的存在是通过联系扩增产物中报道分子的存来确定。适当的检测和显示方法用于检测靶核酸。在所述的情况中，例如通过荧光或其他显示方法检测标记154，可以确定靶核酸的存在。荧光极化例如可以用于检测在扩增产物中报道分子的掺入。

优选地，在这一实施方案中，在扩增产物120中掺入报道分子150之后和在检测之前进行洗涤步骤或分离步骤。这一洗涤或分离步骤将除去***中未结合的报道分子150，以致信号的检测取决于掺入的报道分子。本领域的一个普通技术人员将容易地理解任何已知的洗涤或分离步骤可以用于本发明，包括通过凝胶电泳等等进行大小分离。或者，当荧光的极化用作检测的方法时，不需要洗涤步骤。

用于这一实施方案的报道分子150至少具有一个非天然碱基152。报道分子的非天然碱基优选包括标记154。报道分子150的非天然碱基152能够在PCR扩增过程中由聚合酶掺入扩增产物中第二引物108的至少一个非天然碱基114对侧。

在另一个实施方案中，如附图6所示，报道分子170具有与第二个引物108的非天然碱基114互补的非天然碱基172和淬灭剂129。在这一实施方案中，第二引物108的非天然碱基114包括染料162。在这一实施方案中，报道分子170的掺入将淬灭剂129带入了染料162附近。这依次减少了染料162的信号输出，并且这一信号的减少是可以检测的并与靶核酸的存在相关。适当的染料—淬灭剂对如上讨论。或者，可以利用染料—染料对。当存在靶核酸时，PCR产生了将两个染料紧密相邻的双链产物，并且该标记的荧光输出改变。该变化是可以通过台式荧光平板读数器检测的。

用于本实施方案的聚合酶可以具有核酸酶活性，可能已经减少了核酸酶活性，或者可以是核酸酶缺乏的。优选地，聚合酶是热稳定聚合酶。

检测

利用本领域已知的任何方法可以完成报道寡核苷酸片段的检测和分析。许多方法可以用于检测含有任何上面列出的标记的核酸。例如，利用非同位素检测方法可以检测例如生物素标记的寡核苷酸，所述方法利用了抗生物素偶联物，如链霉抗生物素—碱性磷酸酶偶联物。利用荧光素成像仪可以检测荧光素标记的寡核苷酸。

在一个实施方案中，可以在PCR反应混合物中检测报道寡核苷酸，而不需要进一步的加工。例如，从未裂解的寡核苷酸可以分辨来自裂解的寡核苷酸的信号，而不需要物理分离。这可以通过荧光素极化分析完成，其中可以检测大小的变化和在荧光分子的溶液中旋转的速度。

在一个实施方案中，当存在靶时，产生了双链产物，该产物使第一和第二标记(例如，染料/染料对)紧密相邻。当两个标记紧密相邻时，报道分子标记的荧光输出改变。这种变化是可以通过大多数台式荧光平板读数器检测的。或者，该标记对含有紧密相邻的淬灭剂—标记对。在这一实施方案中，报道分子标记的荧光输出改变，该变化是可检测的。在本发明中也考虑了其他适当的检测方法。

在另一个实施方案中，在进一步加工后检测报道分子。同时认为可以利用用于分离寡核苷酸的本领域中已知的许多技术从反应中分离报道分子寡核苷酸片段。例如，报道寡核苷酸片段可以通过固相提取从反应混合物中分离。报道寡核苷酸片段可以通过电泳或电泳以外的方法来分离。例如，生物素—标记的寡核苷酸可以利用顺磁或磁珠，或用抗生物素(或链霉抗生物素)包衣的颗粒与反应混合物中存在的核酸分离。以这一方法，通过将复合物暴露于磁场，从混合物中的其他成分物理地分离生物素化的寡核苷酸/抗生物素—磁珠复合物。在一个实施方案中，通过质谱分析报道分子寡核苷酸片段。

在一些实施方案中，当进行扩增和在热循环过程中能够读荧光的仪器上检测时，可以区分非特异的PCR产物与目的PCR产物。当模板核酸量有限时，可以形成目的产物以外的扩增产物。这可能是由于引物二聚体的形成，其中第二引物108与本身或第一引物106形成引物二聚体。在引物二聚体形成过程中，两个引物的3’末端杂交并且通过核酸聚合酶延伸到包含的每个引物的5’末端。这产生了一个底物，使得当形成的是对于参与的引物是一个理想的底物时，在随后的扩增循环中以指数方式产生更多的该非特异产物。所以，引物的二聚体的最初的形成不必需是有利的相互作用，因为即使是一个非常稀有的事件，扩增过程可允许二聚体产物进行该反应，特别是当模板核酸有限或缺乏时。当在这一产物中掺入第二寡核苷酸引物106时，一个已标记的非标准碱基170正交地放置到第二引物106非标准碱基114。这导致了在在报道分子的标记129和第二引物的162之间相互作用，这给出了与如附图6E中所示的目的产物120的形成相同的荧光输出变化。引物二聚体产物通常在长度上比目的产物更短，所以解链温度更低。如附图6E所示，由于跨双链体的标记紧密相邻，可以分离两条链的事件将扰乱标记的相互作用。使含有反应产物的反应的温度增加到引物二聚体的双链体DNA和目的产物的T_m之上，将使产物的DNA双链体解链并且破坏标记的相互作用，产生可测量的荧光改变。通过测量荧光改变，同时逆渐增加扩增和信号产生后的反应温度，确定目的产物以及非特异产物的T_m是可能的。

嵌套式PCR

利用本发明的方法可以进行嵌套式PCR。例如，利用第一，第二和第三引物(或更多)可以进行嵌套式PCR。第二引物具有与靶序列互补的第一区和与报道寡核苷酸互补的第二区。第一和第三引物可以在比第二引物更高的温度下与靶杂交。在进行几个PCR循环之后可以产生第一扩增产物，其中变性和退火温度之间的循环允许第一和第三引物，但不是第二引物与靶核酸退火。PCR退火温度随后可以减少到允许第二引物的第一区与第一扩增产物杂交。在降低的退火温度下的PCR的几个循环可以在第一和第二引物之间产生第二扩增产物。该温度可以降低到允许报道寡核苷酸与第二引物的第二区杂交。

在DNA多态性的检测中的用途

本发明的方法可用于在核酸序列中检测序列变异。如本文所用，“序列变异”指在两个核酸之间的核酸序列的差异。例如，通过存在一个或多个核苷酸的单个碱基的取代，或缺失或***，野生型基因和该基因的突变体形式可能有序列的变异。该基因的这两个形式据说序列相互不同。序列变异的一个例子是DNA的多态性。在附图7所示的一个实施方案中，叙述了利用PCR并且除将PCR反应平板放置于荧光平板读数器上以外不需要进一步的样品操作而检测单核苷酸多态性(SNP)的过程。利用了含有等位基因特异标记的等位基因特异报道分子或引物。例如，两个等位基因***可以包括带有具有不同颜色的标记的等位基因特异报道分子或引物。样品中存在任意一种颜色指示样品中该等位基因的存在，两种颜色的组合指示样品中存在两种等位基因。

在这一实施方案中，如下设计引物检测单核苷酸多态性。优选地，利用的一个引物具有等位基因特异引物。优选地，引物中的一个具有非天然碱基。在一个实施方案中，通过单个引物提供了这两个特征。或者，等位基因特异引物是一个与具有非天然碱基的引物不同的引物。

如本文所用，“等位基因特异引物”指在怀疑含有SNP的区域中与靶核酸完全互补的一个引物。

设计可以用于辨别SNP等位基因的等位基因特异PCR引物使其与每个等位基因互补，以便使需要的多态碱基定位于该引物的3’末端。高水平的等位基因辨别部分地是通过限制聚合酶延伸引物的能力而完成的，该引物在3’末端与靶DNA的3’末端具有一个核苷酸错配，即引物非特异的对应的等位基因。另外，可以通过在等位基因特异引物的其他位置放置该错配来进行等位基因的辨别。通常，等位基因特异位置可以是引物内的任何地方，前提是只要存在错配聚合酶就不能有效地延伸该引物。优选地，选择引物使等位基因错配足够使在选定的PCR条件下，等位基因特异引物与不同的等位基因的靶核酸序列的杂交充分去稳定。在一个实施方案中，等位基因特异位置是从引物的3’末端开始的约5个碱基内。例如，等位基因特异位置可以在引物的3’端碱基。引物中的等位基因特异位置的这些交替的位置可以用于以两个主要方法达到选择性扩增：方法1)通过降低引物的T_m使其在聚合酶延伸的热循环过程中在模板DNA上不杂交，或方法2)产生聚合酶将不延伸的不利的引物/模板结构。利用Fast-shot^TM扩增循环可以达到增强的特异性，其中延伸的终止时间以及退火和解链的终止时间缩短或不存在。在一个这样的实施方案中，在约90-100℃和约50-65℃之间快速循环反应，在每个温度最多保持1秒，从而留给聚合酶少量的时间延伸错配引物。在举例的实施方案中，在约95℃和约58℃之间循环反应，在每个温度保持约1秒。可能通过生产最短的可能的PCR产物来进行快速循环，其中通常在PCR引物的3’碱基之间，在模板核酸上留下了约0到约5个碱基的空位。优选地，设计引物使其具有最短的序列可能和约55-60℃的T_m。在一个包括对基因组DNA样品进行SNP分析的实施方案中，总共约37个循环足够检测少至30个靶分子。

附图7中叙述了等位基因特异性测定方法的一个例子。可以认识到，本文讨论的其他测定可以用于或经修饰而用于等位基因特异测试。参考附图7A，怀疑样品中含有靶核酸100，它包括第一部分102和第二部分104。如附图所示，靶核酸100是链100a和100b组成的双链分子。

参考附图7B，将样品与两个或更多的等位基因特异第一引物106a，106b 和所述的第二引物108接触。等位基因特异第一引物106a中的一个是与靶核酸100的第一部分102互补的。其他等位基因特异引物(106b)与靶核酸100的第一部分102不完全互补。第二引物108包括第一区110和第二区112，第一区110具有与靶核酸100的第二部分104互补的一个序列。第二引物108的第二区112包括非天然碱基114。第二区112是与靶核酸100不互补的。

除了第一引物和第二引物，样品也可以与聚合酶接触，进行如本文所述的聚合酶链式反应(PCR)。如果样品中存在靶核酸100，等位基因特异第一引物106a的互补部分和第二引物108的互补部分根据标准碱基配对规则与靶核酸100的对应的区102和104退火。

如附图7B所示，利用PCR，或Fast-shot^TM扩增使用该聚合酶从每个引物106a，108的3’-OH末端合成单链。即，利用等位基因特异第一引物106a合成与靶核酸100的链100a的至少一个部分互补的链120a，并且用第二引物108合成与靶核酸100的链100b的至少一部分互补的链120b。等位基因特异的第一引物106a基本上不延伸，因为它与靶核酸100不完全互补。聚合酶链式反应允许进行需要数目的循环得到附图7C所示的扩增产物120。然后按附图1所述进行测定。

试剂盒

本发明的方法中利用的试剂可以包装成诊断试剂盒。诊断试剂盒包括标记的报道分子，第一引物，和第二引物。在一些实施方案中，试剂盒包括能够通过聚合酶掺入延伸的寡核苷酸中的非天然碱基。在一个实施方案中，已标记了非天然碱基。如果，寡核苷酸和非天然碱基是未标记的，特异性标记的试剂也可以包括在试剂盒。试剂盒也可以含有其他适当包装的扩增需要的试剂和材料，例如缓冲液，dNTPs，或聚合酶，以及检测需要的试剂和材料，例如酶和固相萃取剂。

用于本发明的方法的试剂可以储存在溶液中或可以冻干。当冻干时，为了在重构成时容易使用，一些或所有试剂可以容易地储存在微量滴定板的孔中。应该注意，本领域已知的任何冻干试剂的方法都将适用于制备用于本发明的方法的干燥的试剂。

本文引用的所有专利，专利申请，临时申请和公开物，以全文引入作为参考，引入的程度是它们与本申请阐明的教导不会不一致。

下面是叙述用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应该构成对本发明的限制。所有的百分数是重量百分数，除非特别说明，所有溶剂混合物的比例是体积比。

实施例1

引物设计

在核酸成分的序列中表示的符号如下：A＝脱氧腺苷酸；T＝脱氧胸苷酸；C＝脱氧胞苷酸；G＝脱氧脱氧鸟苷酸；X＝脱氧-异-胞嘧啶(d-isoC)；Y＝脱氧-异-鸟嘌呤(d-isoG)；P＝与靶核酸中的多态核苷酸互补的第一引物的核苷酸；B＝通过在起作用封闭聚合酶的3’末端加入生物素TEG CPG(GlenResearch，Sterling，VA)和延伸报道分子对报道核酸的3’修饰，Q＝信号淬灭元件(5’-5’[N-4’-羧基-4’(二甲基氨基)-偶氮苯]-氨基己基-3’-丙烯酰亚氨基)-2’-脱氧尿苷(Dabcyl dT；Glen Reserarch，Sterling，VA)，该淬灭元件是通过加入5’-二甲氧基三苯甲基氧(dimethoxytrityloxy)-5’-[N-4’-羧基-4-(二甲基氨基)-偶氮苯]-氨己基-3’-丙烯酰亚氨基]-2’-脱氧尿苷-3’-[(2’-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]—亚磷酰胺(Dabcyl dT；Glen Research，Sterling，VA)而掺入报道分子；FAM＝信号产生元件(6-羧基荧光素(6-FAM)；Glen Research，Sterling，VA)。下面划线的表示的是与模板不互补的核酸成分的部分。

核酸成分的设计表示如下：

核酸成分	序列	SEQIDNO
			报道分子	5’-FAM-TYQCCTGTCTGCB-3’	SEQIDNO：1
第一引物	5’-GGCCAGCATAAGCCP-3’	SEQIDNO：2
			第二引物	3’-GTTGCTTTTGTCGACTACC<u>AXAGGACAGACG</u>-5’	SEQIDNO：3

第一引物设计成具有约60℃的T_m。第二引物设计成具有约61℃的Tm。利用各种已知的技术包括Peyret等人，生物化学，38，3468-77(1999)，来估计T_m，在此引入本文作为参考。

杂交条件如下：

成分	浓度
		Na<sup>+</sup>	0.04mol/L
Mg<sup>+</sup>	0.002mol/L
		第一引物	0.2μmol/L
第二引物	4.0μmol/L

由于Taq聚合酶延伸G错配的趋势，在设计等位基因特异引物中避免了3’G。

第二引物的第一区或3’末端是与靶核酸序列的第二区或下游区互补的。在靶核酸序列上的第二引物的定位提供了在第一和第二引物的3’末端之间的可以是0到约5个核苷酸的靶核酸的一个空位或一个区。在合成第二引物中，在引物的第二区中的异胞苷的掺入是利用标准DNA合成条件进行的。

实施例2

等位基因特异PCR

在基于荧光的PCR反应中利用了如下的核酸成分：

核酸成分	序列	SEQ IDNO
			报道分子	5′-FAM-TYQCCTGTCTGCB-3′	SEQ IDNO：1
第一引物，C特异性	5′-GGCCAGCATAAGCCC-3′	SEQ IDNO：4
			第一引物，A特异性	5′-GGCCAGCATAAGCCA-3′	SEQ IDNO：5
第二引物	3′-GTTGCTTTTGTCGACTACCAXAGGACAGACG-5′	SEQ IDNO：3
			模板G	3′-GGGAATGCAGTTCGATCAGTGAAACGAACGTTCTGACCTTTAAGT-5′5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCACTTTGCTTGCAAGACTGGAAATTCA-3′	SEQ IDNO：6SEQ IDNO：7
模板A	3′-GGGAATGCAGTTCGATCAGTTAAACGAACGTTCTGACCTTTAAGT-5′5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCAATTTGCTTGCAAGACTGGAAATTCA-3′	SEQ IDNO：8SEQ IDNO：9

[0201] 如下显示了PCR反应中各成分对于各个20μlPCR反应体积的工作浓度(1X)：

成分	浓度
		Tris pH8.0	10mM
牛血清白蛋白	0.01％
		Triton<sup>TM</sup>X-100	0.01％
鲱鱼***DNA	0.1μg/ml
		乙酸钾	40mM
MgCl<sub>2</sub>	2mM
		Amplitaq Gold<sup>TM</sup>DNA聚合酶	1U/rxn
dATP	50μM
		dGTP	50μM
dCTP	50μM
		dTTP	50μM
第一引物	0.2μM
		第二引物(A或B)	0.2μM
报道分子	0.4μM

所有成分是在冰上解链的，并且温和地混合在一起。制备10X PCR缓冲液，并且由100mM Tris pH8.0，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，1mg/ml已降解的鲱鱼***DNA(Sigma D-3159)，400mM乙酸钾，和20mM的MgCl₂组成。主混合物和等位基因特异混合物是通过加入如下比例的试剂制备的：

反应的最终体积是20μL。将5μL的靶核酸加入15μL的合并的主混合物和第一引物中。靶核酸体积可以根据最后的使用者的需要通过调节加入主混合物中的水的量来增加或下降。5μL是用多管移液器递送的常规体积。如下所示制备了等位基因特异混合物：

如下制备了测试用的平板：15μl等位基因特异混合物(如上定义)等分进96孔的测定平板。(可以制备等位基因特异混合物，制备是为了待用于测试中的每个特异的第一引物而进行的)。在含有等位基因特异混合物的每个孔中，以5μl的体积双倍地加入靶核酸样品。保留了一定数目的孔作为对照；阴性对照(没有靶核酸)应该与等位基因特异混合物一起进行。在加入了靶核酸后，用20μl矿质油覆盖反应，将测定平板转移到DNA热循环器中。这一方法的时间的控制可以利用多管的移液器来大量减少。

测定平板的热循环参数如下：

循环号	步骤温度时间
		1	1 95℃ 12分钟
2-38	1 95℃ 1秒2 58℃ 1秒
		39	1 49℃ 20分钟

在PCR循环反应后，测试了测定平板的荧光信号发射。将测定平板转移到PerSeptive Biosystems Cytofluor^TM4000荧光平板读数器，仪器设置为从平板的顶端开始读数。平板读数器的参数如下：激发滤器设置在485±10nm；发射滤器设置在530±12.5nm，PMT放大设置在50。然后读样品。

表1表示了利用等位基因特异引物得到的读数。

表1

RFU＝相对荧光单位

实施例3

“Fast-shot^TM”扩增与SNP检测中的标准PCR的比较

这一实施例通过在三个数量级上改变靶的水平，来显示“Fast-shot^TM”扩增和传统的PCR循环参数之间的等位基因辨别的相对水平。Fast-shot^TM扩增包括在引物的变性和退火温度之间循环，在这些温度保持非常短的时间(例如，1秒)。

下面的核酸成分可以利用：

核酸成分	序列	SEQ IDNO
			第一引物，C特异性	5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCAC-3′	SEQ IDNO：10
第一引物，A特异性	5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCAA-3′	SEQ IDNO：11
			第二引物	3′-ACGAACGTTCTGACCTTTAAGT-FAM-5′	SEQ IDNO：12
模板G	3′-GGGAATGCAGTTCGATCAGTGAAACGAACGTTCTGACCTTTAAGT-5′5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCACTTTGCTTGCAAGACTGGAAATTCA-3′	SEQIDNO：6SEQ IDNO：7
			模板A	3′-GGGAATGCAGTTCGATCAGTTAAACGAACGTTCTGACCTTTAAGT-5′5′-CCCTTACGTCAAGCTAGTCAATTTGCTTGCAAGACTGGAAATTCA-3′	SEQ IDNO：8SEQ IDNO：9

模板核酸浓度是在attomol范围的。对于各个20μLPCR反应体积，PCR反应中的成分的工作浓度(1X)如下所示。

成分	1X浓度
		Tris pH8.0	10MM
牛血清白蛋白	0.01％
		Triton<sup>TM</sup>X-100	0.01％
鲱鱼***DNA	0.1μg/ml
		乙酸钾	40mM
MgCl<sub>2</sub>	2mM
		Amplitaq<sup>TM</sup>Gold或Amplitaq<sup>Tm</sup>StoffelDNA聚合酶	1U/rxn
dATP	50μM
		dGTP	50μM
dCTP	50μM
		dTTP	50μM
第一引物	0.2μM
		第二引物(A或B)	0.2μM
报道分子	0.4μM

利用如实施例2所述的相同方法制备PCR反应。

对于“fast-shot”PCR利用了下面的PCR参数：

循环#	步骤温度时间
		1-25	1 95℃ 1秒2 61℃ 1秒

对于传统的PCR利用了下面的PCR参数：

循环#	步骤温度时间
		1-25	1 95℃ 30秒2 61℃ 30秒

Amplitaq^TMGold是5’-3’外切核酸酶阳性Taq聚合酶，Amplitaq^TMStoffel是5’-3’外切核酸酶缺乏的Taq聚合酶。

表2中所示的数据通过在三个数量级上改变靶核酸水平，显示在“Fast-shot^TM”扩增和传统PCR循环参数之间的等位基因辨别的相对水平。通过特异反应(C-引物/G-靶，和A-引物/T-靶)和错配反应(C-引物/T-靶，和A—引物/G-靶)的带密度的比较，可以确定等位基因辨别的水平。表2概括了在这些实验中可以看见的辨别的水平。

表2

如结果中所示，一些3’错配更容易通过核酸聚合酶延伸。在这种情况中，在传统PCR参数下，通过含有Amplitaq^TMGold的5’-3’外切核酸酶和5’-3’外切核酸酶缺陷的Amplitaq ^TMStoffel DNA聚合酶C/T错配延伸到比A/G错配更高的程度。通过利用“Fast-shot^TM”扩增，利用一个酶就可以达到两个等位基因之间的1∶1000的辨别水平。

实施例4

PCR和报道分子退火

将下面的核酸用于基于荧光的PCR反应：

核酸成分	序列	SEQ IDNO
			报道分子A	5′-FAM-TYQCCTGTGTGCB-3′	EQ IDNO：1
报道分子B	5′FAM-XYQCCTGTCTGCB-3′	EQ IDNO：13
			第一引物	5′CTCATGGACCCCCATAC-3′	SEQ IDNO：14
第二引物A	3′-GGTGCGAGGTCAATCG<u>AXAGGACAGACG</u>-5′	SEQ IDNO：15
			第二引物B	3′-GGTGCGAGGTCAATCG<u>YXAGGACAGCG</u>-5′	SEQ IDNO：16
模板	5′-CCTCATGGACCCCCATACATATTGTCCACGCTCCAGTTAGC-3′	EQ IDNO：17

利用了在2μg/ml的鲱鱼***DNA中的2fM的合成模板对照，和2mM的MOPSpH7.0。

如下表示了下面的反应的反应成分：

成分	1X浓度
		Tris pH8.0	10mM
牛血清白蛋白	0.01％
		Triton<sup>TM</sup>X-100	0.01％
鲱鱼***DNA	0.1μg/ml
		乙酸钾	40mM
MgCl<sub>2</sub>	2mM
		Amplitaq<sup>TM</sup>Gold DNA聚合酶	1U/rxn
dATP	50μM
		dGTP	50μM
dCTP	50μM
		dTTP	50μM
第一引物	0.2μM
		第二引物(A或B)	0.2μM
报道分子	0.4μM

从Perkin Elmer得到AMPLITAQ GOLD^TM5U/μl。

解冻试剂，并且温和地混合，制备两个主混合物。一个主混合物(A)含有第二引物A和报道分子A。另一主混合物(B)含有第二引物B和报道分子B。如下所示制备主混合物。

反应的最终体积是20μl。在15μl的合并的主混合物和第一引物中加入5μl靶核酸。靶核酸体积可以根据最后使用者的需要通过调节在主混合物中加入的水的量来增加或降低。

如下制备了测定平板：在96孔的测定平板(Low Profile Multiplate^TM96孔； MJ Research，MLL-9601)的孔中等分地加入15μl的主混合物。在含有主混合物的孔中，以5μl的体积双份地加入靶核酸。在一些孔中，5μl水，而不是靶核酸，作为阴性对照加入。在靶核酸或阴性对照加入后，用20μl矿物油Mineral Oil覆盖反应(微白色的油，Sigma，M-3516)，并且将测定平板转移到DNA热循环器中。

测定平板的热循环参数如下所示：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 12分钟
2-38	1 95℃ 1秒2 58℃ 1秒
		39a.	1 49℃ 20分钟
39b.	1 51℃ 20分钟
		39c.	1 53℃ 20分钟
39d.	1 55℃ 20分钟
		40.	1 4℃ 保持

作为额外的对照，一些样品不进行PCR热循环。

在PCR循环反应之后，测试测定平板中荧光信号的发射。将测定平板转移到PerSeptive Biosystems Cytofluor^TM4000荧光平板读数器，将仪器设置为从平板的顶部开始读数。平板读数器的参数如下：激发滤器设置在485±10nm；发射滤器设置在530±12.5nm，PMT放大设置在50。然后将样品读数。在PCR扩增之前，也对测定平板的荧光信号的发射进行测试作为对照。

随后，在10％的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上跑样品，接着通过溴化乙锭染色，检测扩增产物的存在和证实从测定平板中取得的荧光读数。

表3显示了靶核酸模板的荧光检测结果。扩增产物也在PAGE之后通过溴化乙锭染色来检测。在表3中，(-)表示了没有，(+)表示了存在模板或进行热循环。表3中的数字表示了相对荧光单位(RFUs)。

主混合物	A	A	A	A	A	A	B	B	B	B	B	B
													靶	+	+	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-
热循环	+	+	+	+			+	+	+	+	-	-
													T＝0	198	203	208	206	205	208	170	173	172	173	166	170
49℃	1272	1440	234	243	240	235	470	494	382	398	264	267
													51℃	1543	1725	248	252	257	244	603	644	387	403	279	273
53℃	1540	1666	250	253	255	250	718	773	382	403	283	284
													55℃	1590	1724	261	263	273	264	806	866	380	399	285	287

如表3所示，几个第二引物和报道分子可以成功地用于检测样品中存在的靶核酸序列的存在。第二引物/报道分子/在主混合物A中的组合产生了比主混合物B中的第二引物/报道分子的组合更强烈的信号。(也将认识到，主混合物A包括了比主混合物B更多的PCR产物，这解释了信号强度的一些差别)。信号强度的差别似乎是在更低的温度时更强。但是，主混合物B中的第二引物和报道分子在所有保持的温度下产生了高于本底的一个信号，所以足够检测和定量靶核酸序列。

PCR产物是通过PAGE分离的，并且用溴化乙锭染色，或利用MolecularDynamics(Sunnyvale，CA)595Fluoroimager^TM扫描荧光素荧光。对于主混合物A和主混合物B的反应，在对应于含有模板的反应的泳道中(+)，在PAGE后通过溴化乙锭染检测扩增产物。在对应于不含有核酸模板的反应的泳道中(-)未看到扩增产物。这些结果证明，在上面的测定中检测到的增强的荧光信号是由于样品中存在核酸靶序列导致的。

主混合物A的第二引物/报道分子组合和主混合物B的第二引物/报道分子组合之间的信号强度的差异似乎是反应过程中非天然碱基，isoC的降解导致的。非天然碱基，isoC趋向于在含有亲核物质的溶液，如含有Tris缓冲液的溶液中，在高温下降解。但是，上面出现的结果确实显示，isoC是适于在高温下，在Tris缓冲液中使用的。

为了使本发明的方法的效率最佳化，当利用非天然碱基，isoC时，应该利用不需要热起始激活的聚合酶和非亲核性质的缓冲液。

实施例5

制备干燥平板

为了方便储存和容易使用，可以干燥本发明的方法中需要的一些或所有试剂。例如，反应可以设置成含有40mM乙酸钾，20mM MgCl₂，50μM的dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1单位/反应的AMPLITAQ GOLD^TM聚合酶，如下所述的糖，和8μM的报道分子的主混合物。然后，可以将主混合物等分进96孔微量滴定板的孔中，并且在SPEEDVAC^TM(Savant仪器，Holbrook，New York)中干燥45-50分钟(不加热)。在干燥后，可以用MICROSEAL A^TM(Trocken德国)薄膜覆盖平板，放置于带有IDESIPAK^TM(Trocken，德国)的真空袋中，可以用氩气填充该袋，用FOOD SAVER^TM(Tilia，旧金山，CA)封口。可以利用各种浓度(1重量％，2重量％，5重量％，和10重量％)的各种糖(甘露糖，棉子糖，蔗糖和海藻糖(Sigma，St.Louis，MO))。

可以在含有核酸靶，第一引物，第二引物，或者报道分子的水中重构反应混合物。然后，可以将反应混合物进行PCR。

在这一方法中，可以容易地重构干燥的试剂，并且成功地PCR用于测试。这样的冻干试剂可以储存在室温下一个较长的时期。可以干燥一些或所有试剂。本发明的给定方法中需要的一些或所有冻干试剂可以储存在微量滴定板的孔中，在重构后使用。

实施例6

包括PCR掺入非天然碱基的测定

下面的实施例说明了通过淬灭第二引物上的标记的信号监测PCR产物积累的方法，该方法包括在第二引物的标记附近的一个位置在DNA双链体中位点特异地掺入(SSI)核苷酸三磷酸已标记的核苷酸三磷酸是在PCR延伸过程中掺入到延长的第一引物中的。在标记的核苷酸三磷酸上的标记能够淬灭第二引物上的标记。或者，在第二引物的标记(供体染料)和报道分子的标记(受体染料)之间可以观察到荧光能量转移(FRET)。通过激发供体染料和读出掺入的受体染料的发射可以观察到PCR产物的检测。

下面核酸成分用于PCR反应：

核酸成分	序列	SEQ IDNO
			第一引物	5′GTYATYTGCG-c3-TCGTGCGGTGCGTC-3′	SEQ IDNO：18
第二引物A	3′-TGTGTCGTGTCGTCCGAT-FAM-5′	SEQ IDNO：19
			第二引物B	3′-TGTGTCGTGTCGTCCGXT-FAM-5′	SEQ IDNO：20
模板	5′-TCGTGCGGTGCGTCACACAGCACAGCAGGC-3′	SEQ IDNO：21

“c3”表示的是在第一引物的合成过程中，化学地装配的取代核苷酸的丙基间隔基。用于第一引物的合成中的亚磷酰胺是3-O-二甲基三苯甲基-丙基-1-[2-氰乙基]-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(间隔基亚磷酰胺C3；Glen Research，Sterling，VA)。任选地，含有相同核苷酸序列，包括核苷酸修饰，但没有丙基间隔基的寡核苷酸可以用作PCR反应中的第一引物的替代物。

在这些***的设计中，优选地，已标记的核苷酸三磷酸与靠近第二引物A或B的标记的碱基互补。当利用被标记的天然存在的核苷酸碱基时，只可能在有限的情况中在第二引物A或B的标记附近掺入这样一个互补碱基。这是因为所有四种天然存在的核苷酸碱基似乎是都掺入在其他的位点。利用已标记的非天然碱基，如已标记的isoG和isoC，已标记的非天然碱基将仅掺入互补的非天然碱基对侧，它可以位于第二引物A或B的标记的附近。

利用已标记的非天然碱基和天然存在的核苷酸三磷酸的***在测定中利用了标记淬灭剂染料(QSY7^TM)的天然存在的核苷酸(dTTP)，以检测或定量样品中存在的靶核酸(模板)的量。在这一实施例中，在第二引物A的标记(FAM)对侧和附近的位置，在进行PCR延伸的过程中，将已标记的，天然存在的核苷酸掺入第一引物中。在测定中，也利用了位于淬灭剂染料(QSY7^TM)标记的非天然碱基，IsoG(dG_isoTP)的***检测或定量分析样品中存在的靶核酸(模板)的量。在这一实施例中，在第二引物B的标记(FAM)附近的isoC(X)对侧的位置上，在PCR延伸过程中，在第一引物中掺入已标记的，非天然核苷酸。下面显示了QSY7^TMdTTP和dG_isoTP的化学结构。

Figure DEST_PATH_S01812665019960327D000441

通过在PCR中位点特异地掺入来进行PCR反应以证实荧光淬灭。PCR条件：在25μl反应体积中有02μmol/L第一引物，0.2μM第二引物A，0.4pM模板核酸，50μM dATP，dGTP和dCTP，10mM Tris pH8，0.1％BSA，0.1％Triton^TMX-100，0.1μg/μl已降解的鲱鱼***DNA，40mM KAc，2mM MgCl₂，1个单位的Klentaq^TMDNA聚合酶(Ab肽，St/Louis，MO)，和0或3.9μM的QSY7^TM dTTP。

利用的PCR条件如下。

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 2分钟
2-36	1 95℃ 1秒2 60℃ 1秒
		37.	1 70℃ 6秒

[0273] 在Cytofluor^TM4000荧光平板读数器上(485nm激发波长/530nm发射波长)和通过凝胶电泳分析反应的荧光。在70℃，利用6秒的持续时间得到准确的荧光读数。结果表示在表4。

在利用Typhoon^TM荧光扫描仪(分子动力学，Sunnyvale，CA)，在10％的天然聚丙烯酰胺凝胶上扫描6FAM以分辨PCR反应。在产物带中含有的相对荧光单位(RFU)对于(+)QSY7^TMdTTP反应是1,325,644，对于(-)QSY7^TMdTTP反应是41，462，945。聚丙烯酰胺凝胶也可以用溴化乙锭(在10mM Tris-HCl，1mM EDTA中50μg/ml)染色。对来自溴化乙锭染色的产物带定量发现，对于(+)QSY7^TM dTTP反应是21，993RFU，对于(-)QSY7^TMdTTP反应是25，537RFU。

表4显示了在35个循环的PCR之前和之后，在PCR反应的孔中的净RFU读数。

表4

PCR循环	(+)QSY7<sup>TM</sup>	(-)QSY7<sup>TM</sup>
			0	3726	3836
35	1200	4490

这些结果显示，当在PCR过程中，将已标记的核苷酸三磷酸(QSY7^TMdTTP)掺入双链体第二引物的荧光素标记(FAM)对侧时，荧光强度降低27倍。

在这一实施例中的核酸成分也用于通过位点特异掺入(SSI)证明“实时”监测PCR产物的积累。

PCR条件如下：在15μl的反应体积中有0.2μM第一引物，0.2μM的第二引物A，0.33pM的模板，50uM的dATP，dGTP和dCTP，10mM的Tris pH8，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，0.1μg/μl已降解的鲱鱼***DNA，40mM KAc，2mM MgCl₂，1单位的Klentaq^TMDNA聚合酶(Ab肽，St/Louis，MO)，和0或3μM的QSY7^TMdTTP。

PCR条件：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 2分钟
2-X.<sup>*</sup>	1 95℃ 1秒2 60℃ 1秒
		X<sup>*</sup>+1	1 70℃ 6秒

(*X＝6，11，16，21，26，31，或36)

在Cytofluor^TM4000的荧光平板读数器(PEBiosystems公司，Foster City，CA) 上(485nm激发波长/530nm发射波长)和通过凝胶电泳分析反应的荧光。附图14表示了结果。

附图14表示了相对荧光和PCR循环数的关系。也通过凝胶电泳(在10％的天然的聚丙烯酰胺凝胶上的5μl)检测了含QSY7^TMdTTP的反应。用溴化乙锭(10mM Tris-HCl，1mMEDTA中50μg/ml)染色凝胶显示了期望的产物的积累。凝胶分析发现含有QSY7^TMdTTP的反应的荧光与PCR产物的出现和积累是一致的。这些结果也表明，将PCR循环数与靶浓度淬灭进行关联可以定量样品中存在的靶的量。例如，存在的靶越多，发生的淬灭越快。

在70℃持续6秒可用于在如上所述的实施例中准确地测量荧光。这样的持续时间不是跨越引物之间的空位和跨越该引物掺入的需要碱基数所必需的。如果不测量荧光，不需要在70℃持续时间。如果获得荧光读数，或任何其他适当的测量需要持续时间，优选地，持续温度是第一引物可以有效杂交于靶序列的温度以上的温度。在一个实施方案中，持续温度大于第一引物的解链温度以上10℃。

实施例7

已标记的非天然碱基的合成

适于本发明的方法和试剂盒的已标记的非天然碱基可以通过各种方法制成。对于已标记的脱氧异鸟苷5’-三磷酸提供了两个合成计划：方法A表示在附图15，方法A的化合物(化合物1-8，包括8_a-8_d)表示在A部分；方法B表示在附图16，方法B的化合物(化合物9-18)表示在B部分。

A部分

下面的化学反应中，包括利用方法A合成已标记的脱氧异鸟苷5’-三磷酸，Sephadex^TMDEAE纤维素，Ω氨基丁基琼脂糖和三丁基焦磷酸铵盐是从Sigma购买的；生物素2-硝基苯酯，6-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯，和6-羧基四甲基罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯是从Berry&Associates购买的；QSY7^TMN-羟基琥珀酰亚胺酯是从Molecular Probes购买的；所有其他化学物是从AldrichChemical公司，或Fisher Chemical公司购买的，不需要进一步纯化就可以使用。在4

的分子筛上干燥溶剂。在烘箱干燥的玻璃***中，在干的氩气下进行反应。“蒸发”是指用膜泵除去易挥发的溶剂。用硅凝胶(230-425网格)进行柱层析。

6-(6-氨基己基)-氨基-2-氯嘌呤2‘-脱氧-3’，5’-二-甲苯甲酰核苷2：

在室温下，向在200ml的DMF中已搅拌40分钟的六亚甲基二胺的溶液(20当量.，100mmol，11.60g)中，加入已溶解于DMF(100ml)的2，6-二氯-2’-脱氧-3’，5’-二-甲苯甲酰核苷(I当量，5mmol，2.705g)。在50℃搅拌溶液2.5小时，然后，冷却到室温，浓缩，萃取残留物(水/乙酸乙酯)。用水(5X50ml)洗涤有机层，干燥(Na₂SO₄)，并且蒸发溶剂得到泡沫形式的2.673g(4.308mmol，86％)产物2。

6-(6-氨基己基)-氨基-2-氯嘌呤2’-脱氧核苷3：

将上面得到的化合物2(4.308mmol，2.673g)溶解于20ml甲醇，在0℃用氨饱和，放置于密封的管中。在80℃加热1小时并冷却到0℃。打开管子，在膜泵真空下蒸发溶剂。用***/己烷处理残留物3次，在真空中干燥得到的粉末，用于下面的步骤而不进一步纯化。

6-(6-氨基己基)-氨基-2-苯氧基嘌呤2’-脱氧核苷4：

将上面得到的粉末(最大量.4.308mmol)溶解于DMF(15ml)，加入NaH(12当量，51.69mmol，2.068g矿物油中60％的分散体)的苯甲醇(43ml)溶液。在100℃搅拌2小时，冷却到室温。然后，加入乙酸(12当量)中和反应混合物。在Celite^TM过滤得到的溶液，蒸发过滤物，得到的残留物可以在下面的步骤中利用，而不需要进一步的纯化。

6-(6-三氟乙酰基酰氨基己基)-氨基-2-苯氧基嘌呤2’-脱氧核苷5：

在甲醇(30ml)/三氟乙酸乙酯(30ml)的混合物中溶解上面得到的产物，在室温下搅拌24小时。通过蒸发除去溶剂和过量的三氟乙酸乙酯，通过柱层析，用氯仿中1.5％的甲醇然后氯仿中17.5％甲醇的一步梯度纯化残留物。产量：626mg(3步1.134mmol，26％)。

6-(6-三氟乙酰基酰氨基己基)-氨基-3-苯氧基嘌呤2’-脱氧核苷5’-三磷酸6：

在0.5ml的乙腈/4.5当量三乙胺(0.585mmol，0.081ml)的混合物中溶解1，2，4-***(4.5当量，0.585mmol，40mg)，将烧瓶放置于冰浴上。加入磷氧氯(1.5当量，0.195mmol，0.018ml)，在室温下搅拌30分钟。过滤，用最小量的乙腈洗涤固体，将过滤物加入化合物5(1当量，0.13mmol，72mg)。在室温下搅拌30分钟，然后，加入DMF(2ml)中的三丁基焦磷酸铵(89mg)溶液，连续搅拌19小时。然后，加入水(1ml)水解其余的***基团。在搅拌30分钟后，在真空中，30℃浓缩反应混合物，并且在DEAE纤维素上用0.05M-0.5M TEAB缓冲液的梯度柱层析纯化。产物在0.4-0.5M的缓冲液浓度洗脱。在30℃蒸发含有该产物的级分，并且进一步利用。

N⁶-(6-氨基己基)-2’-脱氧异鸟苷5’-三磷酸7：

用甲醇蒸发上面得到的化合物，并且溶解于甲醇中(5ml)。加入Pd/C(10重量％，10mg)和HCOONH₄(63mg)，在回流下搅拌45分钟。然后，冷却到室温，过滤除去催化剂，用热水洗涤催化剂(60℃，3ml)，在真空中合并浓缩的过滤物。在28％的氢氧化铵水溶液(3ml)中溶解残留物，在室温下搅拌3小时，在真空中浓缩，用0.05M-0.5MTEAB缓冲液的梯度，在DEAE纤维素上柱层析纯化。产物在0.3-0.4M的缓冲液浓度洗脱。蒸发含有产物的部分，进一步使用。

N⁶-(6-Tamra-酰胺基己基)-2’-脱氧异鸟苷5’-三磷酸8a：

在0.2ml0.1M的TEAB缓冲液中溶解化合物7(约1mg它的三乙铵盐形式)，加入溶解于DMF(0.2ml)的6-羧基四甲基罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯(10mg)。在35℃搅拌3小时，然后加入Ω-氨基丁基琼脂糖，以结合过量的Tamra^TM，再搅拌一小时，将反应混合物加载到DEAE纤维素柱上，用0.05M-0.5MTEAB缓冲液洗脱。产物在0.4M的缓冲液浓度洗脱。在30℃蒸发含有该产物的级分。

分别利用6-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯和QSY7^TMN-羟基琥珀酰亚胺酯，而不是6-羧基四甲基罗丹明N-羟基琥珀酰亚胺酯，以和化合物8a同样的方法制备化合物8b和8d。

N⁶-(6-生物素酰胺基己基)-2’-脱氧异鸟苷5’-三磷酸8c：

在0.2ml的水中溶解化合物7(约1mg它的三乙铵盐形式)，加入溶解于DMF(0.2ml)中的生物素2—硝基苯酯(10mg)。溶液表现为浅黄色。在35℃搅拌1小时，然后加入Ω-氨基丁基琼脂糖，结合过量的生物素，再搅拌1小时，将反应混合物加载到DEAE纤维素柱上，用0.05M-0.5MTEAE缓冲液梯度。产物在0.4M的缓冲液浓度洗脱。在30℃蒸发含有该产物的级分。

B部分

对于下面的化学反应，包括利用A方法合成已标记的脱氧异鸟苷5’-三磷酸，三丁基焦磷酸铵是从Sigma购买的；生物素N羟基琥珀酰亚胺酯是从Pierce化学公司购买的；QSY7^TMN-羟基琥珀酰亚胺酯和DabcylN-羟基琥珀酰亚胺是从Molecular Probes购买的；所有其他化学品是从Aldrich化学公司或Fisher化学公司购买的。这些化学品使用时不需要进一步纯化。在

Figure DEST_PATH_S01812665019960327D000491

的分子筛上干燥溶剂。在烘箱干燥的玻璃器中，在干的氩气下进行反应。用硅凝胶(230-425网格)进行柱层析。

下面是所用的缩写：Ac₂O(乙酸酐)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；DMAP(4，4’-二甲基氨基吡啶)；DMT(4，4’-二甲氧基三苯甲基)；Et₃N(三乙胺)；MeCN(乙腈)；MeOH(甲醇)；Tol(p-甲苯甲酰基)。

1-(p，p’-二甲氧基三苯甲基)-六亚甲基二胺(9)

用吡啶共蒸发六亚甲基二胺(10当量.，375mmol，43.5g)两次，溶解于100ml的吡啶中。加入DMAP(0.1当量，3.75mmol，457mg)，将反应烧瓶放置于冰浴上。在2小时中逐滴加入溶解于100ml的吡啶中的DMT氯化物(1当量.，37.5mmol，12.69g)。在室温搅拌4小时，加入MeOH(5ml)，浓缩反应混合物，用NaHCO₃/乙酸乙酯萃取剩余的残留物。用NaHCO₃水溶液洗涤有机层两次，干燥和蒸发溶剂。在下面的步骤中利用得到的产物，不需要进一步纯化。

产量：14.895g(35.634mmol，95％)粘稠油。

2-氯-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脱氧-3’5’-二甲基苯基核苷(10)

用DMF共蒸发化合物9(1.3当量.，31.916mmol，13.34g)，溶解于100ml的DMF中。加入溶解于100ml的DMF的二异丙基乙胺(3.9当量，95.748mmol，16.65ml)，在室温下搅拌3小时。浓缩，用NaHCO₃/乙酸乙酯水溶液萃取残留物，干燥有机层，蒸发溶剂。用醚研磨残留物两次，在真空中干燥后可进一步利用得到的固体产物而不需要进一步纯化。

2-苄氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脱氧核苷(11)

在DMF(25ml)中溶解化合物10(1当量，19.23mmol，17.74g)，然后加入到NaH(10当量，192.3mmol，7.69g在矿质油中的60％的分散体)的苯甲醇(128ml)溶液中。加热反应混合物(120℃，6小时)，然后在Celite^TM上过滤之前，在室温下搅拌(15小时)，蒸发过滤物，萃取残留物(乙酸乙酯/水)，洗涤有机层(NaHCO₃-溶液)，干燥，蒸发溶剂，用醚/己烷1∶10研磨残留物5次。TLC：CHCl₃/10％MeOHR_F＝0.26。

产量：10.280g(13.562mmol，70.5％，2步)泡沫。

2-苄氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脱氧-5’-O-p，p’-二甲氧基三苯甲基核苷(12)

用吡啶共蒸发化合物11(14.7388mmol，11.172g)，溶解于150ml吡啶和加入DMAP(0.25当量，3.6847mmol，450mg)。将烧瓶放置于冰浴中，在2小时中慢慢加入DMTCl(1.5当量，22.108mmol，7.484g)。在室温下搅拌22小时，然后，加入MeOH(1ml)，浓缩反应混合物，萃取残留物(氯仿/NaHCO₃水溶液)。干燥有机层，蒸发溶剂，用***/己烷1∶1研磨残留物，除去过量的DMT，干燥不溶的固体产物，不再进一步纯化即使用。

产量：14.890g(14.047mmol，95％)微棕色泡沫。

2-苄氧基-6-(6-p，p’-二甲氧基三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基-2’-脱氧-5’-O-p，p’-二甲氧基三苯甲基核苷(13)

用吡啶共蒸发化合物12(14.047mmol，14.89g)，溶解于200ml的吡啶中，加入DMAP(0.25当量，3.5117mmol，428mg)，Et₃N(5当量，70.235mmol，9.7ml)和Ac₂O(2.5当量，35.1175mmol，3.582g)。在室温下搅拌4.5小时，然后加入MeOH(2ml)，浓缩反应混合物，萃取残留物(乙酸乙酯/NaHCO₃水溶液)。干燥有机层，蒸发溶剂，用乙酸乙酯/己烷/Et₃N30∶60∶1，然后65∶35∶3的一步梯度柱层析纯化残留物。产量：5.93g(5.385mmol，38％)黄色泡沫。

2-苄氧基-6(6-氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基-2’-脱氧核苷(14)

在50ml的乙腈/2ml的水中溶解化合物13(2.471mmol，2.723g)，加入Ce(NH₄)₂(NO₃)₃(0.3当量.，0.74mmol，406mg)。回流45分钟。然后加入0.15当量Ce(NH₄)₂(NO₃)3(0.37mmol，205mg)，继续回流1小时。然后，蒸发，用醚研制残留物除去DMT，干燥不溶的产物，不再纯化，进一步使用。

2-苄氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基-2’-脱氧核苷(15)

将上面得到的化合物14(最大量5.385mmol)溶解于30ml的MeOH/50ml三氟乙酸乙酯/5ml Et₃N中，在室温下搅拌反应混合物21.5小时。TLC(氯仿/17.5％MeOH)∶R_F＝0.72)显示完全转化。蒸发，萃取残留物(盐水/乙酸乙酯)，干燥有机层，蒸发溶剂，用氯仿/1.5％MeOH，然后17.5％MeOH的一步梯度，通过硅凝胶柱层析纯化残留物。产量：2.80g(4.714mmol，87％)泡沫。

2-苄氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙基-5’-三磷酸-2’-脱氧核苷(16)。

将咪唑(61当量，306mg，4.5mmol，重结晶)溶解于乙腈(3.6ml)中，冷却(0℃)。然后加入POCl₃(19当量，0.128ml)，和三乙胺(61当量.，0.633ml)，在加入-部分(0.309ml)到15(1当量，0.074mmol，44mg)之前搅拌混合物(0℃，0.5小时)。在加入含有三丁基焦磷酸铵(2当量，0.16mmol，73mg)的DMF(1.5ml)之前搅拌混合物(r.t.，0.5小时)。然后，在24小时后淬灭反应(2ml，10％NH₄COO)，并且冻干。利用20％的MeCN和(NH₄)₂CO₃/20％MeCN的梯度，通过离子交换层析(DionexProPac^TMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)纯化产物。重复冻干回收的产物以除去过量的盐。产量为0.007mmol(10％)，白色固体。

6-(6-氨己基)-氨基嘌呤-5‘-三磷酸-2‘-脱氧核苷(7)

在加入Pd/C(10％，5mg)和NH₄COO(0.05mmol，31mg)之前，将化合物16(0.007mmol)溶解于甲醇(2.5ml)中。在过滤掉催化剂之前回流(1小时)悬浮液，并且蒸发溶剂。然后，在干燥反应物之前，用28％的氢氧化铵(1.5ml，3小时，室温)处理残留物，利用20％的MeCN和(NH₄)₂CO₃/20％MeCN的梯度，通过阴离子交换层析(Dionex ProPac^TMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)纯化产物。重复冻干收集的产物，以除去过量的盐。产量为0.0063mmol(90％)，白色固体。

6-(6-生物素酰氨基己基)-氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脱氧核苷(8c)，

6-(6-dabcyl酰氨基己基)-氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脱氧核苷(17a)，

6-(6-QSY7^TM酰氨基己基)-氨基嘌呤-5’-三磷酸-2’-脱氧核苷(17b)。

在7(0.88μmol，三乙铵盐)的水溶液(40μl)中加入硼酸钠(10.5μL，1M，pH8.5)，接着加入DMF(216ml)，其中含有生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯，dabcylN-羟基琥珀酰亚胺酯，或QSY7^TM-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2.6μmol，3当量)。在用20％的MeCN稀释之前，进行反应(3小时，55℃)，利用20％MeCN和(NH4)₂CO₃/20％MeCN梯度，通过阴离子交换层析(Dionex ProPac^TMSAX-10；Dionex，Sunnyvale，CA)纯化产物。产率50-80％。

实施例8

通过位点特异地掺入淬灭荧光的非标准脱氧核苷酸三磷酸“实时”监测PCR 扩增

在PCR反应的循环中进行PCR反应的荧光的监测。PCR反应包括第一和第二引物，第二引物在它的5’末端含有与荧光团偶联的核苷酸(FAM-dT)。在模板核酸的扩增过程中，与荧光淬灭化合物(Dabcy或QSY7^TM)偶联的标准核苷三磷酸(反应A，dTTP)或isoG核苷三磷酸(反应B；dGisoTP)掺入在第二引物的荧光团偶联核苷酸(FAM-dT)的对侧和邻接处，减少了PCR反应中的荧光信号。

在这一实施例中，在PCR反应中利用了下面的核酸：

“c3”表示了在第一引物的合成过程中，化学地装配的代替核苷酸的丙基间隔基。在第一引物的合成中利用的亚磷酰胺是3-O-二甲基三苯甲基-丙基-1-[2-氰乙基]-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(间隔基亚磷酰胺C3；Glen Research，Sterling，VA)。任选地，含有相同核苷酸序列，包括核苷酸修饰，但没有丙基间隔基的寡核苷酸，可以用作PCR反应中的第一引物的替代物。

以下成分(基本的PCR反应成分)存在于所有PCR反应，浓度如下：

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-PH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
牛血清白蛋白	0.1μg/μl	Sigma，St，Louis，MO
			Tween<sup>TM</sup>20	0.1％	EMSciences，Gibbstown，NJ
d-Trehalose	37.5mM	Aldrich，Milwaukee，WI
			乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
MgCl<sub>2</sub>	3mM	Sigma，St，Louis，MO
			Klen-Taq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.1单位/μL	AbPeptides，St，Louis，MO
dATP	50μM	Promega，Madison，WI
			dGTP	50μM	Promga，Madison，WI
dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
			第一引物	0.2μM
模板	0.4μM

[0345] 制备上面表示的成分。

第二引物A，第二引物B，dTTP，Dabcyl dTTP(Glen Research，Sterling，VA)，Dabcyl dGisoTP，和QSY7^TMdGisoTP是下面的PCR反应中的可变成分。这些成分加入在如下所示的PCR反应A到J，浓度如下：

PCR反应	可变的PCR成份(除了基本成分以外)：
		A	0.2μM第二引物B，和50μM dTTP
B	0.2μM第二引物A，和1μM Dabcyl dTTP
		C	0.2μM第二引物B，和1μM Dabcyl dGiso TP
D	0.2μM第二引物B，和50μM dTTP
		E	0.2μM第二引物B，和5μM Dabcyl dTTP
F	0.2μM第二引物B，50μMdTTP，和5μM DabcyldGisoTP
		G	0.2μM第二引物B，50μMdTTP，和5μM QSY7<sup>TM</sup>dGiso TP
H	0.2μM第二引物A，和50μM dTTP
		I	0.2μM第二引物A，和5μM Dabcyl dTTP
J	0.2μM第二引物A，50μMdTTP，和5μM QSY7<sup>TM</sup>dGisoTP

反应的终体积是25μl。反应混合物加载在25μl的Smart Cycler PCR管中(Cepheid，Sunnyvale，CA)。在微型离心机中离心PCR管6秒，使液体进入反应腔。然后，将进行PCR反应的管放置于Smart Cycler^TM(Cepheid，Sunnyvale，CA)，以便能在整个PCR反应过程中提供恒定的荧光检测。

热循环参数：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 5分钟
2-41	1 95℃ 1秒2 58℃ 1秒3<sup>*</sup> 72℃ 10秒

*在循环2-41的步骤3中，激活了Smart Cycler^TM的光学***，允许测定PCR反应管中的荧光。

在41个PCR扩增的循环后，将PCR反应产物进行解链曲线分析，方法是在荧光监测光下将PCR管的温度从60℃增加到95℃，增加的速度是每秒0.2℃。

来自PCR反应A，B和C的PCR反应产物的荧光淬灭表示在附图17A，这些PCR产物的解链曲线分析表示在附图17A。这些结果证明，PCR反应的荧光是在样品中淬灭的，样品包括淬灭化合物偶联的标准核苷三磷酸或淬灭化合物偶联的isoG核苷三磷酸和含有偶联荧光的标准核苷的第二引物或含有非标准核苷的第二引物。解链曲线的数据表明，通过从结合淬灭化合物的核酸链分离结合荧光团的核酸链可以恢复反应产物中的荧光。

附图18A中表示了来自PCR反应D，E，F和G的PCR反应产物的荧光淬灭。附图18B中表示了来自PCR反应H，I和J的PCR反应产物的荧光淬灭。

实施例9

实时定量分析基因组DNA

在PCR反应的循环和从基因组DNA样品扩增核酸模板的过程中进行PCR反应的荧光的监测。PCR反应包括含有两个非标准核苷酸(iso-G和iso-C)的第一和第二引物；将引物设计成可以杂交和扩增小鼠基因组DNA的一个区域。PCR反应也包括含有非标准核苷酸(iso-G)的报道核酸，与荧光淬灭化合物偶联的核苷酸(Dabcyl dT)，和与报道分子的5’碱基(T)结合的荧光团(6FAM)。报道分子核酸与扩增产物的退火，包括非标准核苷酸的配对可以引起通过核酸聚合酶活性从含有与荧光淬灭化合物偶联的核苷酸的报道核酸裂解荧光团。

在这一实施例中，在PCR反应中利用了下面的核酸：

核酸成分	序列	SEQ IDNO：
			报道分子	5′-FAM-TYQCCTGTCTGCCTGTB-3′	SEQ IDNO：22
第一引物A	5′-GATAATCAGTAGCTTTGTAACCCTG-3′	SEQ IDNO：23
			第一引物B	5′-GTGGCACAAGATTGATGGAAT-3′	SEQ IDNO：24
第二引物A	3′-CATGTCATTTGTCAACCACCC<u>YXAGGACAGACGGACAGCAC-5′</u>	SEQ IDNO：25
			第二引物B	3′-CAATGACGTCGTTCCAGGA<u>YXAGGACAGACGGACA-5′</u>	SEQ IDNO：26
模板A	小鼠基因组DNA；株：A/J(靶基因座L11316，染色体3-9.679P)
			模板B	小鼠基因组DNA；株：C57BL/6J(靶基因座R75378，染色体10-41.5F)

从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)得到了小鼠基因组DNA，并且在1mMMOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀释。对于模板A，将小鼠株A/J的基因组DNA系列地稀释到5ng/μl，2.5ng/μl，1.25ng/μl，0.63ng/μl，0.31ng/μl，和0.16ng/μl的浓度。对于模板B，将小鼠株C57BL/6J的基因组DNA系列地稀释到20ng/μl，2ng/μl，0.2ng/μl，20pg/μl，2pg/μl，和0.2pg/μl的浓度。将基因组DNA稀释系列煮沸5分钟，放置于冰上5分钟，储存在-20℃。

合成引物用于PCR扩增和检测小鼠基因组中的特异靶核酸序列。选择最初的靶核酸序列，来评价利用A/J小鼠基因组DNA，基因座L11316，染色体3-9.679P(设计A)的这一过程的活力。选择用于进一步的基因组DNA定量的靶序列是小鼠株C57BL/6J，基因座R75378，染色体10-41.5F(设计B)。设计第一引物A和第一引物B，使它们的Tm在60.0-63.0℃之间。设计第二引物A和第二引物B，使其Tm在61.0-63.0℃之间。利用Macintosh的Oligo4.0^TM软件(NationalBiosciences，Minneapolis，MN)评价所有的引物二级结构的形成。

下面的成分(基本的PCR反应成分)出现在这一实施例的所有PCR反应中，浓度如下所示。

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷PH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
牛血清白蛋白	0.1μg/μL	Sigma，St，Louis，MO
			Tween<sup>TM</sup>20	0.1％	EM Sciences，Gibbstown，NJ
d-Trehalose	37.5mM	Aldrich，Milwaukee，WI
			乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
MgCl<sub>2</sub>	2mM	Sigma，St，Louis，MO
			Klen-Taq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.025单位/μL	Applied Biosystems，Foster City，CA
dATP	25μM	Promega，Madison，WI
			dGTP	25μM	Promega，Madison，WI
dCTP	25μM	Promega，Madison，WI
			dTTP	25μM	Promega，Madison，WI
第一引物(A或B)	0.2μM
			第二引物(A或B)	0.2μM
报道分子	0.4μM

制备了含有上面列出的成分的主混合物A(第一引物A和第二引物A)，浓度为1.04X，最终反应体积是25μl。

制备了含有上面列出的成分的主混合物B具有(第一引物B和第二引物B)，浓度为1.25X，最终反应体积为25μl。

通过在含有24uL的PCR A主混合物的25μl的Smart Cycler^TMPCR管中加入1uL的A/J基因组靶DNA的5ng/μl，2.5ng/μl，1.25ng/μl，0.63ng/μl，0.31ng/μl，和0.16ng/μl的稀释液制备了设计A的反应混合物。在微型离心机上旋转离心管6秒，使液体进入反应腔室。各个PCR管子含有5ng，2.5ng，1.25ng，630pg，30pg，和160pgA/J基因组靶DNA，对应的核酸靶数目分别是1500，750，375，188，94和47个单倍体等同物。

在含有20uL的PCR主混合物B的热循环平板的孔中或特异于各个实时热循环的管中加入5uL的C57BL/6J基因组靶DNA的20ng/μl，2ng/μl，0.2ng/μl，20pg/μl和2pg/μl的稀释液制备设计B的反应混合物。各个PCR管或孔含有100ng，10ng，1ng，100pg，和10pg的C57BL/6J的基因组靶DNA，对应的核酸靶的数目分别是30,000个靶，3,000个靶，300个靶，30个靶和3个靶。当反应在微量滴定板中进行时，为了防止蒸发样品体积，在热循环之前在每个孔中加入15uL的矿物油覆层。

在Smart Cycler^TM中加入设计A的反应混合物，并在下面的条件下循环：

循环#	步骤温度时间
		1	1 90℃ 30分钟
2-16	1 90℃ 1秒2 56℃ 1秒
		17-51	1 90℃ 1秒2<sup>*</sup> 56℃ 11秒

*在循环#17-51的步骤2的过程中，激活了Smart Cycler^TM的光学***，允许测定PCR反应管中的荧光，产生了动力学图线。

附图19表示了这些反应的荧光读数。

将设计B的反应混合物单个放置于下面的实时PCR热循环仪中：

1)利用Smart Cycler^TM25uL管(Cepheid；Sunnyvale，CA)的SmartCycler^TM(Cepheid；Sunnyvale，CA)

2)利用Light Cycler^TM管(Roche；瑞士巴塞尔)的LightCycler^TM(Roche；瑞士巴塞尔)

3)利用96孔微量滴定板(MJ Research Inc.；Waltham，MA)的iCycler^TM(BioRad；Hercules，CA)

4)利用MicroAmp^TM光学96孔反应平板孔(Applied Biosystemsl；Foster City，CA)的7700(Applied Biosystems；Foster City，CA)

并且在下面的条件下循环：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 5分钟
2-46	1 95℃ 5秒2 56℃ 10秒3<sup>*</sup> 60℃ 10秒

在循环#2-46的步骤3的过程中，激活实时PCR热循环器仪的光学***以便读出FAM产生的荧光，允许确定PCR反应管中的荧光，产生动力学曲线。

通过临界循环(Ct)和变异关联(Cv)方法分析荧光读数。临界循环是***开始在对数线性阶段检测与PCR产物指数生长相关的信号的增长的时候。对数线性阶段的斜率反应了扩增效率，斜率中的拐点，即对数线性期开始时生长曲线上的点，表示了真实的扩增。这一点也代表沿着生长曲线的最大的变化速度。核酸的量是与Ct相关的，其中核酸的起始量越大，Ct值越低。Ct应该放置于任何基线活性之上，并且在指数生长时期内。

实施例10

实时定量RNA

在PCR反应的循环和从RNA样品扩增核酸模板的过程中进行PCR反应的荧光的监测。合成DNA引物用于检测和定量人β肌动蛋白mRNA。cDNA/第一引物与人β肌动蛋白mRNA的5’区上的序列杂交并且利用逆转录酶启动cDNA的合成。然后利用含有两个非标准核苷酸(iso-C和iso-G)的cDNA/第一引物和第二引物，使用cDNA作为模板扩增人β-肌动蛋白序列。PCR反应也包括含有非标准核苷酸(iso-G)的报道核酸，与荧光淬灭化合物偶联的核苷酸(Dabcyl dT)，和与报道分子的5’碱基(T)偶联的荧光团(6FAM)。报道核酸与扩增产物的退火，包括非标准核苷酸的配对可以导致核酸聚合酶活性从与荧光淬灭化合物偶联的报道核酸裂解荧光团。

在这一实施例中，在逆转录PCR(RT-PCR)中利用了下面的核酸：

核酸成分	序列	SEQIDNO：
			报道分子	3＇<sup>-</sup>BTGTCCGTCTGTCCQYT-FAM<sup>-</sup>5＇	SEQIDNO：27
cDNA/第一引物	3＇-CTACTATAGCGGCGCG-5＇	SEQIDNO：28
			第二引物	5＇-CACGACAGGCAGACAGGAXYCGCCAGCTCACCATG-3＇	SEQIDNO：29
模板	人心脏RNA(单一供体)

从Clontech(Palo Alto，CA)得到来自单个供体的总的人心脏RNA。

将RNA样品在5mM Bis-Tris-丙烷pH8.9，0.1mM EDTA，100ng/ml酵母tRNA(Sigma，St.Louis，MO)和100ng/ml的已剪切的鲱鱼***DNA(Sigma，St.Louis，MO)组成的缓冲液中稀释到20ng/μl，2ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2pg/μl和0.2pg/μl。

在所有的PCR反应中存在下面的成分(基本的PCR反应成分)，浓度如下所示：

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷pH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
牛血清白蛋白	0.1μg/μL	Sigma，St，Louis，MO
			Tween<sup>TM</sup>20	0.1％	EM Sciences，Gibbstown，NJ
d-Trehalose	37.5mM	Aldrich，Milwaukee，WI
			乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
MgCl<sub>2</sub>	3mM	Sigma，St，Louis，MO
			Klen-Taq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.05单位/μL	Applied Biosystems，Foster City，CA
逆转录酶(AMV)	0.05单位/μL	Promega，Madison，WI
			dATP	50μM	Promega，Madison，WI
dGTP	50μM	Promega，Madison，WI
			dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
dTTP	50μM	Promega，Madison，WI
			cDNA/第一引物	0.2μM
第二引物	0.2μM
			报道分子	0.2μM

用无核酸酶的水，将含有表X列出的试剂的RT-PCR主混合物制备成终体积25μl，浓度为1.25X。在25μl的Smart Cycler^TMPCR管中的5uL的各个稀释的 RNA样品中加入20μl的1.25X的RT-PCR主混合物来制备RT-PCR反应混合物。然后，在微型离心机中旋转离心管6秒，使液体进入反应腔室。

在离心后，将反应混合物立即放入Smart Cycler^TM并且在下面的条件下循环：

循环#	步骤温度时间
		1	1 60℃ 1分钟
2	1 95℃ 5分钟
		3-52	1 94℃ 1秒2<sup>*</sup> 60℃ 10秒

*在循环#3-52的步骤2中，激活实时PCR热循环器的光学***，以读出产生FAM的荧光，允许测定PCR反应管中的荧光，生成动力学曲线。结果表示在附图20。

实施例11

通过位点特异掺入已标记的非标准碱基实时定量检测RNA

在PCR反应的循环过程中进行PCR反应的荧光的检测，和从RNA样品扩增核酸模板。合成DNA引物用于检测和定量分析人β-肌动蛋白mRNA。cDNA/第一引物与人β-肌动蛋白mRNA的5’区上的序列杂交，并且利用逆转录酶启动了cDNA合成。然后，利用cDNA作为模板，将cDNA/第一引物和含有与报道分子的5’碱基(T)偶联的荧光团(6FAM)和5’倒数第二个非标准核苷酸(iso-dC)的第二引物用于人β-肌动蛋白序列的扩增。在模板核酸的扩增过程中，在PCR反应中存在荧光淬灭化合物偶联的非标准核苷三磷酸(Dabcyl-d-isoGTP)，并且掺入第二引物的非标准核苷酸(iso-dC)的对侧，该核苷酸与荧光团偶联的5’核苷酸(FAM-dT)邻接，减弱了PCR反应中的荧光信号。

在这一实施例中，将下面的核酸用于RT-PCR反应中：

核酸成分	序列	SEQ IDNO：
			cDNA/第一引物	3′-CTACTATAGCGGCGCG-5′	SEQ IDNO：28
第二引物	5′-FAM-TXCGCCAGCTCACCATG-3′	SEQ IDNO：30
			模板	人心脏RNA(单一供体)

[0399] 从Clontech(Palo Alto，CA)得到来自单一供体的总的人心脏RNA。

在5mMBis-Tris-丙烷pH8.9，0.1mM EDTA，100ng/ml酵母tRNA(Sigma，St.Louis，MO)和100ng/ml的已剪切的鲱鱼***DNA组成的缓冲液中将RNA样品稀释到20ng/μl，2ng/μl，200pg/μl，20pg/μl，2pg/μ1和0.2pg/μl。

下面的成分(基本的PCR反应成分)出现在所有的PCR反应中，浓度如下所示：

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷pH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
牛血清白蛋白	0.1μg/Ml	Sigma，St，Louis，MO
			Tween<sup>TM</sup>20	0.1％	EMSciences，Gibbstown，NJ
d-Trehalose	37.5mM	Aldrich，Milwaukee，WI
			乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
MgCl<sub>2</sub>	3mM	Sigma，St，Louis，MO
			Klen-Taq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.025单位/μL	Abpeptides，St，Louis，MO
逆转录酶(AMV)Maloney-小鼠白血病病毒 (M-MLV-RT)	0.5单位/μL	Ambion，Austin，TX
			dATP	50μM	Promega，Madison，WI

dGTP	50μM	Promega，Madison，WI
			dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
dTTP	50μM	Promega，Madison，WI
			Dabcyl-d-isoGTP	2μM	EragenBiosciences，Madison，WI
cDNA/第一引物	0.2μM
			第二引物	0.2μM

利用无核酸酶的水，将RT-PCR主混合物制备成25uL的最终反应体积，浓度为1.25X。在25μl的Smart Cycler^TM25μl管(Cepheid，Sunnyvale，CA)中的5μl的各个稀释的RNA样品中加入20uL的1.25X的RT-PCR主混合物以制备RT-PCR反应混合物。然后，在微型离心机中旋转离心管6秒，使液体进入反应腔室。

在离心后，将反应混合物立即放置于Smart Cycler^TM(Cepheid，Sunnyvale，CA)中，在下面的条件下循环：

循环#	步骤温度时间
		1	1 60℃ 1分钟
2	1 95℃ 5分钟
		3-22	1 94℃ 1秒2<sup>*</sup> 60℃ 1秒
23-52	1 94℃ 1秒2 60℃ 1秒3<sup>*</sup> 72℃ 6秒

在循环#23-52的步骤3中，激活Smart Cycler^TM的光学***，以读出产生FAM的荧光，允许检测PCR反应管中的荧光，生成附图21所示的动力学曲线。

实施例12

多重的等位基因特异PCR

进行多重的基于荧光的PCR反应，测定来自各种小鼠株的单核苷酸多态性小鼠STS序列27.MMHAP25FLA6的序列。在这一实施例中，多重PCR反应包括与靶核酸上的下游非多态序列杂交的共用第一引物和两个上游的第二引物，第二引物A和第二引物B，每个第二引物特异于等位基因，其中的特异性是通过不同的3’核苷酸确定的。第二引物A和第二引物B也具有不同的5’区，这些5’区对靶核酸的杂交没有作用，但分别允许与报道分子A和报道分子B杂交。每个报道核酸含有5’倒数第二个非标准核苷酸和荧光淬灭化合物偶联的核苷酸，每个含有5’核苷酸，该5’核苷酸具有与5’核苷酸偶联的不同的荧光团(FAM或HEX)。不同的荧光团在激发时发射不同波长的光。报道核酸与扩增产物的退火，包括非标准核苷酸的配对可以导致通过核酸聚合酶活性从淬灭化合物偶联的报道核酸中裂解一个或多个荧光团。特异于等位基因的核酸靶的优势导致荧光团从裂解的报道分子发射特定的荧光。

在这一实施例中，RT-PCR反应中利用了下面的核酸：

核酸成分	序列	SEQ IDNO：
			报道分子A	5′-HEX-TYQGGACAGACGB-3′	SEQ IDNO：31
报道分子B	5′-FAM-TYQCCTGTCTGCB-3′	SEQ IDNO：l
			第一引物	3′-CAGTGACTGGCTGACGAG-5′	SEQ IDNO：32
第二引物A	5′-<u>CGTCTGTCCAXY</u>GAGCTAGCGGAGGCC-3′	SEQ IDNO：33
			第二引物B	5′-<u>GCAGACAGGAXY</u>GGAGCTAGCGGAGGCT-3′	SEQ IDNO：34
模板1	小鼠基因组DNA；株：A/J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
			模板2	小鼠基因组DNA；株：AKR/J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′TT′)
模板3	小鼠基因组DNA；株：BALB/cByJ±(靶：定位于小鼠染色体2上的27。MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
			模板4	小鼠基因组DNA；株：C3H/HeJ±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
模板5	小鼠基因组DNA；株：C57BL/6J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′TT′)
			模板6	小鼠基因组DNA；株：DBA/2J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
模板7	小鼠基因组DNA；株：AB6F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)
			模板8	小鼠基因组DNA；株：AKD2F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)

[0412]

模板9	小鼠基因组DNA；株：B6C3F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)
		模板10	小鼠基因组DNA；株：B6D2F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)
模板11	小鼠基因组DNA；株：CByB6F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)
		模板12	小鼠基因组DNA；株：C3D2F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
模板13	小鼠基因组DNA；株：CByD2F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)

±＝近交株。**＝F1杂交株

从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购买了小鼠gDNA样品。所有的gDNA样品在1mM的MOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀释到2ng/μl。

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷pH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
			MgCl<sub>2</sub>	2mM	Sigma，St，Louis，MO
AmpliTaq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.5U/rxn	Applied Biosystems，Foster City，CA
			dATP	50μM	Promega，Madison，WI
dGTP	50μM	Promega，Madison，WI
			dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
dTTP	50μM	Promega，Madison，WI
			第一引物	0.2μM
第二引物A	0.2μM
			第二引物B	0.15μM
报道分子A	0.2μM
			报道分子B	0.2μM

制备含有上面列出的成分的主混合物，浓度是2X，最终反应体积是10uL。将5μl的主混合物等分到测定平板的各个孔中，在各个孔中加入5μl 的靶DNA(10ng)。为阳性对照(完全匹配的模板)和阴性对照(错配的模板或没有模板)准备了PCR反应。在加入模板核酸后，用15μl的矿物油覆盖各个孔，并且短暂地离心。在进行PCR反应之前，扫描测定平板的荧光信号的强度，在530和580nm处确定基线荧光。

利用了下面的PCR参数：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 5分钟
2-38	1 95 1秒2 58℃ 1秒
		39	1 49℃ 60分钟
40	1 4℃ 保持

在PCR循环反应后，测试测定平板中的荧光信号的发射。将测定平板转移到Cytofluor^TM4000荧光平板读数器(Applied Biosystems，Foster City，CA)，仪器设置成从平板的顶部开始读数。平板读数器的参数如下：(6FAM荧光检测)激发滤器设置在485±10nm；发射滤器设置在530±12.5nm，PMT放大设置到50，(HEX荧光检测)，激发滤器设置在530±12.5nm；发射滤器设置在580±25nm，PMT放大设定到50。

实施例13

因子V基因型的多重PCR分析

进行基于多重荧光的PCR反应确定人基因组DNA的因子V基因中特异于等位基因的核苷酸变异。用于这一实施例中的方法是与实施例12中利用的方法相似的。

核酸成分	序列	SEQ IDNO：
			报道分子A	5′-HEX-TYQGGACAGACGB-3′	SEQ IDNO：31
报道分子B	5′-FAM-TYQCCTGTCTGCB-3′	SEQ IDNO：1

第一引物	5′-ATTTCTGAAAGGTTACTTCAAGGACA-3′	SEQ IDNO：35
			第二引物A	3′-ACGGACAGGTCCCTAGAYXACCTGTCTGCCTGT-5′	SEQ IDNO：36
第二引物B	3′-GCGGACAGGTCCCTAGYXAGGACAGACGGACA-5′	SEQ IDNO：37
			模板1	合成因子V野生型靶 5′-ATTTCTGAAAGGATTACTTCAAGGACAAAATACCTGTATTCCTCGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGA-3′	SEQ IDNO：38
模板2	合成因子V突变型靶 5′-ATTTCTGAAAGGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTATTCCTTGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGA-3′	SEQ IDNO：39
			模板3	包括因子V野生型靶的人基因组DNA
模板4	包括因子V突变型靶人基因组DNA

通过自动化的DNA合成制备了合成的因子V靶。从Comell/NIGMS人遗传细胞库(Camden，NJ)得到了包括因子V靶的人基因组DNA。将所有的gDNA样品在1mM MOPS pH7.5，0.1mM EDTA中稀释到1或5ng/μl，煮沸5分钟，然后，在PCR之前放置于冰上。将合成的靶在1mM Tris pH8.0(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)和0.1μg/ml的鲱鱼***DNA(St.Louis，MO)中系列稀释到1或10fM。

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷pH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
			MgCl<sub>2</sub>	2.5mM	Sigma，St，Louis，MO
AmpliTaq<sup>TM</sup>DNA聚合酶	0.5U/rxn	Applied Biosystems，Foster City，CA
			dATP	50μM	Promega，Madison，WI
dGTP	50μM	Promega，Madison，WI
			dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
dTTP	50μM	Promega，Madison，WI
			第一引物	0.4μM
第二引物A	0.4μM
			第二引物B	0.2μM
报道分子A	0.4μM
			报道分子B	0.4μM

制备含有上面列出的成分的主混合物，其最终反应体积为10uL，浓度为2X。将5μl的主混合物等分到测定平板(Low Profile Multiplate^TM，96孔；MJResearch，Waltham，MA)的各个孔中，在各个孔中加入5μl的靶DNA。在孔中加入5或50zmol(约3000或30,000分子)的突变的，野生型的或杂合的合成靶。在孔中加入5或25ng的杂合的，或野生型的人基因组DNA。将不含有靶DNA的孔用作对照。在加入模板核酸后，用15μl的矿质油覆盖各个孔，短暂地离心。在进行PCR反应之前，扫描测定平板的荧光信号的强度，在530nm和580nm处确定基线荧光。

利用了下面的PCR参数：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 5分钟
2-38	1 95℃ 1秒2 58℃ 1秒
		39	1 49℃ 60分钟

在PCR循环反应后，测试测定平板中荧光信号的发射。将测定平板转移到Cytofluor^TM4000荧光平板读数器(Applied Biosystems，Foster City，CA)，将仪器设置成从平板的顶部开始读数。平板读数器的参数如下：(6FAM荧光检测)，激发滤器设置在485±10nm；发射滤器设置在530±12.5nm，PMT放大设置到50，(HEX荧光检测)激发滤器设置在530±12.5nm；发射滤器设置在580±25nm，PMT放大设置到50。HEX和FAM荧光的相对荧光单位(RFU)分别显示在Y和X轴，结合进行的每个多重PCR反应，表示在附图22。

实施例14

利用外切核酸酶缺陷的核酸聚合酶和Flap内切核酸酶作为裂解剂进行多重的实时等位基因特异性PCR

将来自各个小鼠株的基因组DNA的STS序列27.MMHAP25FLA6中的单核苷酸多态性的序列进行多重的基于荧光的PCR反应。在这一实施例中，多重的PCR反应包括与靶核酸上的下游的非多态序列杂交的共用第一引物和两个上游的第二引物，第二引物A和第二引物B，每个第二引物是特异于等位基因的，其中的特异性是通过不同的3’核苷酸来确定的。第二引物A和第二引物B也具有不同的5’区，这些5’区对靶核酸的杂交没有作用，但分别允许与报道分子A和报道分子B杂交。每个报道核酸含有5倒数第二个非标准核苷酸和一个与荧光淬灭化合物偶联的核苷酸，但含有具有与5’核苷酸偶联的不同荧光团(FAM或HEX)的5’核苷酸。不同的荧光团在激发时发射出不同波长的光。报道分子核酸与扩增产物的退火，包括非标准核苷酸的配对可以引起flap内切核酸酶-1(FEN-1)酶活性从淬灭化合物偶联的报道核酸裂解一个或多个荧光团。特异于等位基因的核酸靶的优势导致荧光团从裂解的报道分子发射特定的荧光。

在这一实施例中的RT-PCR反应中利用了下面的核酸：

核酸成分	序列	SEQ ID NO：
			报道分子A	5′-HEX-TYQGGACAGACGB-3′	SEQ ID NO：31
报道分子B	5′-FAM-TYQCCTGTCTGCB-3′	SEQ ID NO：1
			第一引物	3′CAGTGACTGGCTGACGAG-5′	SEQ ID NO：32
第二引物A	5′-TGTCCGTCTGTCCAXYGAGCTAGCGGAGGCC-3′	SEQ ID NO：40
			第二引物B	5′-ACAGGCAGACAGGAXYGGAGCTAGCGGAGGCT-3′	SEQ ID NO：41
模板1	小鼠基因组DNA；株：A/J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CC′)
			模板2	小鼠基因组DNA；株：AB6F1<sup>**</sup>(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′CT′)
模板3	小鼠基因组DNA；株：C57BL/6J±(靶：定位于小鼠染色体2上的27.MMHAP25FLA6.序列：序列变异：′TT′)

±＝近交朱，**＝F1杂交株。

从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购买小鼠gDNA样品。将所有的gDNA样品在1mM的MOPS pH7.5，0.01mM EDTA中稀释到20ng/μl，加热到95℃5分钟，在冰上快速冷却。

成分	1X浓度	供应商和地址
			Bis-Tris-丙烷pH8.9	10mM	Sigma，St，Louis，MO
乙酸钾	40mM	Sigma，St，Louis，MO
			MgCl<sub>2</sub>	2mM	Sigma，St，Louis，MO
dATP	50μM	Promega，Madison，WI
			dGTP	50μM	Promega，Madison，WI
dCTP	50μM	Promega，Madison，WI
			dTTP	50μM	Promega，Madison，WI
第一引物	0.2μM
			第二引物A	0.2μM
第二引物B	0.15μM
			报道分子A	0.2μM
报道分子B	0.2μM
			Mja FEN-1 詹氏甲烷球菌	25.1 fmol/rxn
Platinum<sup>TM</sup>GenoTYPE<sup>TM</sup>TspDNA聚合酶	1.0U/rxn	LifeTechnologies，Rockville，MD

[0438] 根据引入本文作为参考的Hosfield等人，生物化学杂志(1998)273：27154-61所述的稍作修改的方法纯化和表达Mja FEN-1。含有Mja FEN-1序列的GenBank登记号是U67585。在美国专利号5,843,669，和Bult等人，科学(1996)273：1058-1073中叙述了Mja FEN-1，两个文献都引入作为参考。将含有詹氏甲烷球菌FEN-1基因的质粒转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)，加入异丙基硫代吡喃半乳糖苷(Sigma，St.Louis，MO)到终浓度0.4mM，以便在对数期诱导蛋白质的过度表达。在再生长2小时后，以3000Xg沉淀细胞，再悬浮于缓冲液1(10mM Tris，pH7.5(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，150mM NaCl(Sigma，St.Louis，MO)，10mM咪唑(Aldrich，Milwaukee，WI))，短暂地超声波处理，在75℃加热裂解45分钟，然后，快速在冰上冷却到0℃。这一方法裂解了细胞，沉淀了大部分污染性嗜中温的天然大肠杆菌蛋白质。以25,000Xg离心得到的溶液，用缓冲液1预平衡的TALON^TM金属亲和树脂(Clontech，Palo Alto，CA)结合上清液，加载在重力流柱中，用缓冲液1充分洗涤。然后，用调节到含有逐步咪唑梯度100mM，200mM，350mM和500mM的缓冲液1洗脱FEN-1。收集含有FEN-1的级分，用含有10mM Tris，pH7.5(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，150mMKCl，和1mM EDTA的缓冲液充分透析。将已透析的物质调节到50％的甘油(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，0.5％20(EM Sciences，Gibbstown，NJ)，和0.5％Nonidet^TMP-40(Roche，Indianapolis，IN)。

制备含有上面列出的成分的主混合物，其浓度为上面的终浓度的1.5倍。将15μl的这些混合物等分到测定平板的各个孔中，在各个孔中加入5μl的靶DNA(100ng)，通过抽吸混合。制备PCR反应的阳性对照(完全匹配的模板)，阴性对照(错配的模板或没有模板)，和杂合的样品(匹配和错配的模板)。在加入模板核酸后，用20uL的矿质油覆盖每个孔，短暂地离心。

将测定平板转移到iCycler iO实时PCR检测***(BioRad，Hercules，CA)，并且利用上面列出的参数循环。用于信号检测的滤器的设定包括：(6FAM)-激发滤器490±10nm，发射滤器5301±15nm；(HEX)激发滤器530±15nm，发射滤器575±10nm。

利用了下面的PCR参数：

循环#	步骤温度时间
		1	1 95℃ 3分钟
2-26	1 95 1秒2 59℃ 1秒
		27-41	1 95℃ 1秒
	2<sup>*</sup> 59℃ 2分钟
		42	1 4℃ 保持

^*在循环#27-42的步骤2中，激活iCycler iO^TM实时PCR检测***的光学***，读出FAM和HEX生成的荧光，允许测定PCR反应管中的荧光，以便生成动力学曲线。结果表示在附图23A-B。

实施例15

淬灭荧光的PCR扩增产物和淬灭荧光的PCR扩增产物的解链曲线的分析

含有被具有淬灭化合物的SSI淬灭的荧光团的PCR反应产物的解链曲线分析可以用于检测掺入淬灭剂的引物/二聚体的存在。掺入淬灭剂的引物/二聚体通常在低于掺入淬灭剂的PCR产物的解链温度时解链。如果两者都是作为PCR扩增后的产物存在的，解链曲线分析可以显示荧光在掺入淬灭剂的引物/二聚体和掺入淬灭剂的PCR产物的解链点增加。

利用Smart Cycler^TM(Ceoheid，Sunnyvale，CA)对来自实施例11的PCR扩增产物进行解链曲线分析。当以每秒0.1℃的速度逐步增加PCR反应产物的温度时，检测荧光的变化。目的产物(掺入淬灭剂的PCR产物)以及非特异的产物(掺入淬灭剂的引物/二聚体)的Tm说明在附图25。含有起始量1pg的RNA模板的RT-PCR反应的解链分析显示，明显量的非特异产物的Tm约为71℃，目的产物的Tm约为79℃。含有100ng的RNA模板的反应的解链分析显示，只形成了Tm79℃的目的产物。一旦目的产物的Tm已知，可以考虑通过在非特异产物的Tm以上的温度进行反应的荧光测量，以便特异地观察目的产物产生的信号，在目的产物的Tm以下观察也是有用的。附图24表示了来自解链曲线分析的结果。

Claims

1.以下物质在制备用于检测靶核酸的试剂盒中的用途：

(i)核酸聚合酶；

(ii)含有与靶核酸的第一部分互补的序列的第一寡核苷酸引物；

(iii)含有第一区和第二区的第二寡核苷酸引物，其中第一区含有与靶核酸的第二部分互补的序列，第二区含有一个非天然碱基；和

(iv)含有一个标记和一个与第二寡核苷酸引物的第二区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子，

其中所述检测的步骤包括：

a)如果样品中存在靶核酸，利用第一和第二寡核苷酸引物扩增靶核酸，产生扩增产物；

b)将包含非天然碱基的标记的报道分子酶促掺入扩增产物中非天然碱基对侧；和

c)将报道分子的掺入与样品中的靶核酸的存在相关联。

2.根据权利要求1所述的用途，其中报道分子包括非天然碱基的核苷酸三磷酸。

3.根据权利要求1所述的用途，其中报道分子基本由非天然碱基的核苷酸三磷酸组成。

4.根据权利要求1所述的用途，其中步骤b)包括利用核酸聚合酶，酶促掺入所述标记的报道分子。

5.根据权利要求1所述的用途，其中步骤b)包括利用连接酶，酶促掺入所述标记的报道分子。

6.根据权利要求1所述的用途，其中的标记包括荧光团。

7.根据权利要求1所述的用途，其中第二寡核苷酸引物的第二区进一步包含一个标记，并且报道分子和第二寡核苷酸引物的第二区的标记包括(i)一个信号产生信号淬灭对；或(ii)一对荧光团，其中一个荧光团的发射刺激另一个荧光团的发射。

8.根据权利要求7所述的用途，其中报道分子的标记包括淬灭剂。

9.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)包括确定扩增产物的解链温度

10.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)是在靶核酸扩增过程中发生。

11.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)是在靶核酸扩增后发生。

12.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)包括在靶核酸扩增过程中监测扩增的荧光。

13.根据权利要求1所述的用途，其中步骤c)包括在靶核酸扩增后监测扩增的荧光。

14.根据权利要求1所述的用途，其中第二寡核苷酸引物的第二区的标记包含相互作用的标记。

15.根据权利要求1所述的用途，其中扩增反应包含几个不同的第二引物。

16.根据权利要求1所述的用途，其中扩增反应包含多重扩增反应。

17.根据权利要求1所述的用途，其中第一寡核苷酸引物包含非天然碱基。

18.根据权利要求1所述的用途，其中第二寡核苷酸引物的第二区进一步包含一个标记，并且报道分子和第二寡核苷酸引物的第二区的标记包括一对荧光团，其中一个荧光团的发射刺激另一个荧光团的发射。

19.根据权利要求1所述的用途，其中第二寡核苷酸引物的第二区包含至少一个另外的碱基。

20.一种用于检测靶核酸的试剂盒，包括：

a)核酸聚合酶；

b)含有与靶核酸的第一部分互补的序列的第一寡核苷酸引物；

c)含有第一区和第二区的第二寡核苷酸引物，第一区含有与靶核酸的第二部分互补的序列，第二区含有一个非天然碱基；和

d)含有一个标记和一个与第二寡核苷酸引物的第二区的非天然碱基互补的非天然碱基的报道分子。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中报道分子包含具有非天然碱基的寡核苷酸。

22.根据权利要求20所述的试剂盒，其中的报道分子不包含除非天然碱基以外的任何碱基。

23.根据权利要求20所述的试剂盒，其中第二寡核苷酸引物的第二区进一步包含一个标记，并且报道分子和第二寡核苷酸引物的第二区的标记包括一对荧光团，其中一个荧光团的发射刺激另一个荧光团的发射。

24.根据权利要求20所述的试剂盒，其中第二寡核苷酸引物的第二区进一步包含一个标记，并且报道分子和第二寡核苷酸引物的第二区的标记包括一个信号产生元件和一个信号淬灭元件。