CN1571834A - 用于***的细胞疗法 - Google Patents

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Abstract

免疫***无应答的人的T细胞应答常常减弱。我们开发了一种分离、刺激和扩增针对抗原特异性效应细胞的原初细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)的方法，能够体内裂解肿瘤细胞。该活体外方法产生完全功能化的效应细胞。用人I类HLA分子和限定性辅助分子转染人工抗原提呈细胞(AAAPC；果蝇)，使用其刺激正常供体和癌症患者的CD8+T细胞。在果蝇细胞表面高密度表达的I类分子是空的，使得可以有效装载多种肽，这导致产生识别内源性表达特定肽的肿瘤细胞的多克隆应答。如果肽表位是确定的免疫原，则产生的应答是强烈的、抗原特异性的和可重复的应答。这种人工抗原表达***可适于治疗绝大多数人的大多数癌症。

Description

用于***的细胞疗法
本发明背景
尽管在癌症治疗方面取得了显著进步，但癌症仍然是严重的健康问题。标准治疗方案化疗、放疗、外科手术以及三者联合通常不能获得持久的痊愈。在许多情况下，进行治疗的癌症患者经常在一段时间后旧病复发，使病情进一步恶化，这些治疗方案对患者存在严重问题。
困扰癌症治疗进展的另一个因素是已经发现癌症不是由单一生物因素引起，而是由综合因素引起。与治疗集中于单一病原体或致病因子的大多数药物治疗不同，癌症治疗需要处理多种生物因素。
近年来，研究定位于开发利用患者自身免疫***的癌症疗法。过继免疫治疗是这类方法其中一种。过继免疫治疗需要利用患者自身细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来对抗肿瘤细胞或癌细胞。但是，该技术基本上仍未批准作为可行的临床治疗方案用于人类患者。除鉴定免疫产生CTL的合适表位的问题之外，现有技术不能提供一种将足够数目的不同表位提呈给APC以便充分靶向多种抗原从而有效治疗癌症的方法。本发明满足了这些未被满足的需求，并有其它有益之处。
本发明概述
本发明提供一种能同时提呈高达10个或更多个不同肽的非天然抗原提呈细胞(nnAPC)、生产nnAPC的方法、使用所述nnAPC治疗癌症的方法。
附图简述
图1：该图是CD8+细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞)和抗原提呈细胞或靶细胞(如果是肿瘤细胞的话)之间相互作用的示意图。
图2，图A和B：该图是淋巴细胞介导的细胞分解机制的两幅示意图。
图3：该图显示了用竞争性测定测试几种不同肽以鉴定肽结合物的实验结果，其中所述肽结合物可用于将多种肽装载到表达人空I类分子的果蝇细胞上。
图4，图A、B和C：该图显示了测试三种黑素瘤肽当作为单一表位加至果蝇细胞上时提高CTL能力的实验结果。在唯一的供体中，当将每种肽单独加至三种不同果蝇制备物上时激发出针对每种肽的CTL。与对照HBc肽(一种高亲和力结合物)比较应答特异性。
图5，图A、B和C：该图显示了一系列实验的结果，在这些实验中，将高达4种不同的肽加至单个果蝇细胞。在一个3周刺激方案之后观测每种所述肽的CTL活性，并在该图中图示说明。
图6，图A、B和C：该图显示了三种不同的初次体外刺激方案之后的CTL活性。
图7，图A和B：该图对比了在标准刺激方案之后果蝇细胞和树突细胞激发针对单个肽表位的CTL应答的能力。
图8：该图显示了当使用限定肽脉冲刺激细胞时，具有成熟或不成熟表型的树突细胞在激发特异性CTL应答方面没有果蝇细胞有效。
图9，图A、B和C：该图显示了单个供体对三种不同体外刺激方案提呈的4种肽产生的CTL活性。
图10：该图显示了针对组合装载至果蝇细胞的10种肽产生的CTL活性。
图11：该图显示了用人HLA-A2.1 I类分子转染的果蝇细胞上的HER-2肽(826、835、861和863)的肽结合能力。
图12：该图证实了对MART-1特异性效应细胞的抗肽和抗肿瘤反应。T2细胞装载MART-1肽或阴性对照(HBc)。Malme3M是黑素瘤细胞系，Malme3是非肿瘤细胞系。
图13，图A和B：该图显示两个不同供体的HER-2特异性CD8效应细胞的四聚体染色情况。
图14：该图显示相对于装载肽的T2细胞评价的HER-2效应细胞的抗肽反应。
图15，图A、B、C、D：该图证实当用HLA-A2.1转染时对卵巢肿瘤细胞系(HTB-77)的杀伤作用增强。
图16：该图显示了当用HLA-A2.1感染时对乳腺癌细胞系(HTB-133)的杀伤作用增强。
图17：该图显示需要IFNγ预处理来展示肿瘤细胞系HTB-77/A2.1的裂解。
图18，图A和B：该图证实HLA-A2和HER-2的表面表达未受两种细胞系(HTB-77和HTB-77/A2.1)中IFNγ诱导的影响。
图19：该图显示用IFNγ诱导后HTB-77/A2.1细胞中蛋白mRNA水平提升。
本发明详述
本发明提供一种治疗癌症患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的癌症相关肽分子，优选约10种不同肽分子，其中每种肽约6-12个氨基酸长，优选约8-10个氨基酸长，浓度范围约10nM至100μM；
b.由所述患者或合适供体收集CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞；
d.将所述CD8+细胞加入含细胞因子(例如1L-2、IL-7)的培养基中或条件生长培养基(CGM)中，优选IL-2或IL-2和IL-7联合应用；
e.将收集自所述患者或合适供体的非悬浮外周血单核细胞或者去除CD-8的外周血单核细胞和约10-50μg/ml的肽混合；
f.用剂量必须足以防止悬浮液中的这些细胞增殖的γ-射线照射所述外周血单核细胞悬浮液，例如约3,000-7,000rad的剂量，优选约5,000rad，或者可用细胞抑制剂(包括但不限于丝裂霉素C)处理外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约10ng/ml至10μg/ml的所述每种肽加入所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.可选地刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.可选地用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞悬浮液；
l.可选地测定CD8+悬浮液的合适CTL活性，并可选地测定CTL纯度、细菌含量和内毒素含量；以及
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
本发明的另一个实施方案提供一种治疗癌症患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的癌症相关肽分子，优选约10种肽，其中每种肽为8-10个氨基酸长；
b.收集所述患者的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞约6-7天；
d.用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞；
e.混合收集自所述患者的外周血单核细胞和约20μg/ml的每种肽；
f.用约5,000rad的γ-射线照射所述去除CD8的外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约10μg/ml所述表位加入所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的悬浮液；
l.测定CD8+悬浮液的合适CTL活性、纯度、细菌和内毒素含量；以及
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
本发明的另一个实施方案提供一种治疗黑素瘤患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的黑素瘤相关肽分子，优选约10种肽，其中每种肽为8-10个氨基酸长；
b.收集所述患者的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞约6-7天；
d.用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞；
e.混合收集自所述患者的外周血单核细胞和约20μg/ml的所述nnAPC可提呈的每种肽；
f.用约5,000rad的γ-射线照射所述去除CD8的外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约10μg/ml所述表位装载至所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的悬浮液；
l.测定CD8+悬浮液的合适CTL活性、纯度、无菌性和内毒素含量；以及
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
本发明的另一个实施方案是一种黑素瘤治疗方法，其中所述nnAPC提呈以下肽：酪氨酸酶369-377、酪氨酸酶207-216、gp100209-217、gp100154-162、MART-127-35、HER-2/neu789-797、HER-2/neu369-377、C-凝集素8-16、Pec6020-29和Pec6025-33。
本发明的另一个实施方案是一种疾病治疗方法，所述疾病导致通常与I类HLA分子相关的免疫应答不充分或不足够，其中所述治疗清除了感染或转化细胞，已经证实清除通过CTL实现。
本发明的另一个实施方案是一种疾病治疗方法，所述疾病导致通常与I类HLA分子相关的免疫应答不充分或不足够，其中通过以下方法处理显示对CTL清除敏感的感染或转化细胞，所述方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的所述疾病相关肽分子，优选约10种不同肽分子，其中每种肽约6-12个氨基酸长，优选约8-10个氨基酸长，浓度范围约10nM至100μM；
b.收集所述患者或合适供体的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞；
d.将所述CD8+细胞加入含细胞因子(例如IL-2、IL-7)的培养基或CGM中，优选CGM包含IL-2或IL-2和IL-7两种因子；
e.将收集自所述患者或合适供体的非悬浮外周血单核细胞或去除CD-8的外周血单核细胞与约10-50μg/ml的肽混合；
f.用剂量必须足以杀死悬浮液中所有细胞组分(需要的外周血单核细胞除外)的γ-射线照射所述外周血单核细胞悬浮液，例如约3,000-7,000rad的剂量范围，优选约5,000rad；
g.分离粘附的外周血单核细胞；
h.将约10ng/ml至10μg/ml所述每种肽装载至所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.可选地刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.可选地用培养基中的IL-2和IL-7刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的悬浮液；
l.可选地测定CD8+悬浮液的合适CTL活性，并可选地测定CTL纯度、无菌性和内毒素含量；以及
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
本发明提供一种非天然抗原提呈细胞(nnAPC)，该细胞得自用人I类HLA分子、结合分子和共刺激分子表达编码DNA转染的果蝇(Drosophila melanogaster)细胞，其中所述nnAPC能够提呈高达约15种不同的肽分子，优选10种肽分子。
本发明的另一个实施方案提供一种提呈肽的nnAPC，其中所述肽与增强患者治疗的各种需要功能相关。例如，除了与要治疗疾病相关的肽之外，nnAPC还可提呈与辅助分子相关的肽，例如增强细胞-细胞粘附或转导另外的细胞激活信号的淋巴细胞功能性抗原(LFA-1、LFA-2和LFA-3)、胞间粘附分子1(ICAM-1)、T-细胞共刺激因子(CD2、CD28、B7)。
本发明的另一个实施方案提供一种提呈几种类型癌症相关肽的nnAPC。例如，可提呈与乳癌相关多肽有关或由其衍生的肽(例如HER-2/neu)以及与黑素瘤相关多肽有关或由其衍生的肽(例如MART-1或MAGE)。
本发明的另一个实施方案提供一种生产能够同时提呈高达10种不同肽分子的非天然抗原提呈细胞(nnAPC)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.由果蝇卵制备昆虫细胞系；或者制备表达人MHC I类分子和共刺激粘附分子的昆虫细胞系；
b.用适于培养昆虫细胞的培养基培养所述昆虫细胞，所述培养基优选SchneiderTM果蝇培养基；
c.由pRmHa-1表达载体制备pRmHa-3质粒，其中所述pRmHa-3质粒包括金属硫蛋白启动子、金属效应共有序列和携有分离自果蝇的聚腺苷酸化信号的乙醇脱氢酶基因；
d.将人I类HLA分子A2.1、B7.1、B7.2、ICAM-1、β-2微球蛋白和LFA-3的互补DNA***所述pRmHa-3质粒中，其中A2.1可用任何人I类DNA序列取代；
e.用phshneo质粒和含互补DNA的所述pRmHa-3质粒转染所述昆虫细胞；以及
f.通过使所述昆虫细胞接触CuSO4以诱导转染基因在所述昆虫细胞中表达来产生nnAPC。
本发明的昆虫细胞在适于培养昆虫细胞的培养基中生长，下文称之为“昆虫生长培养基”。昆虫生长培养基可向许多厂商购买，例如SchneiderTM Drosophila Medium、Grace Insect Media和TC-100Insect Media。或者可由本领域一般技术人员制备昆虫生长培养基。通常所述培养基包括促进和维持昆虫细胞生长所必须的组分，例如无机盐(例如氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸钾、碳酸氢钠、氯化钠和磷酸钠)、氨基酸、各种糖和化学物质(Imogene Schneider，Exp.Zool.(1964)156(1)：91页)。另一方面，所述培养基还可包括维生素、矿物质和其它有助于昆虫细胞生长的组分。
以下是本发明使用的缩写和定义清单。
                     缩写
APC                  抗原提呈细胞
CD8+                CD8+T细胞
CTL                  细胞毒性T淋巴细胞
E                    效应细胞
Fas                  T细胞上的表位，也称为CD95
ICAM                 胞间粘附分子
IL                   白介素
LAK                  淋巴因子激活的杀伤细胞
LFA                  淋巴细胞功能抗原
MHC                  主要组织相容性复合体
nnAPC                非天然抗原提呈细胞
NP                   核蛋白
PBMC                 外周血单核细胞
PBS                  磷酸缓冲盐溶液
PCR                  聚合酶链反应
RPMI                 Roswell Park Memorial研究所
RWJPRI               R.W.Johnson药物研究所
T                    靶
TCR                  T细胞抗原受体
TIL                  肿瘤浸润淋巴细胞
下文是本说明书用于各种肽表位的简写清单。各个氨基酸残基按照本领域一般技术人员容易理解并使用的单字母编码区分。
氨基酸                     简写
                     3字母        1字母
丙氨酸               ala          A
缬氨酸               val          V
亮氨酸               leu          L
异亮氨酸             ile          I
脯氨酸               pro          P
苯丙氨酸             phe          F
色氨酸               tyr          W
甲硫氨酸             met          M
甘氨酸               gly          G
丝氨酸               ser          S
苏氨酸               thr          T
半胱氨酸             cys          C
酪氨酸               tyr          Y
天冬酰胺             asn          N
谷氨酰胺             gln          Q
天冬氨酸             asp          D
谷氨酸               glu          E
赖氨酸               lys          K
精氨酸               arg          R
组氨酸               his          H
肽表位缩写
本文使用的术语“酪氨酸酶369-377”或“酪氨酸酶369-377”是指氨基酸序列YMNGTMSQV(SEQ ID NO：1)。该定义还包括序列为YMDGTMSQV(SEQ ID NO：2)的肽，该肽由将序列YMNGTMSQV(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基“N”改变为“D”而获得氨基酸序列YMDGTMSQV(SEQ ID NO：2)的翻译后事件产生( Skipper等.，J.Exp.Med.(1996)183：527-534)。
本文使用的术语“酪氨酸酶207-216”或“酪氨酸酶207-216”是指氨基酸序列FLPWHRLFLL(SEQ ID NO：3)。
本文使用的术语“gp100 209-217”或“gp100209-217”是指氨基酸序列ITDQVPFSV(SEQ ID NO：4)。
本文使用的术语“gp100 154-162”或“gp100154-162”是指氨基酸序列KTWGQYWQV(SEQ ID NO：5)。
本文使用的术语“MART-1 27-35”或“MART-127-35”是指氨基酸序列AAGIGILTV(SEQ ID NO：6)。
本文使用的术语“HER-2/neu 789-797”或“HER-2/neu789-797”是指氨基酸序列CLTSTVQLV(SEQ ID NO：7)。
本文使用的术语“HER-2/neu 369-377”或“HER-2/neu369-377”是指氨基酸序列KIFGSLAFL(SEQ ID NO：8)。
本文使用的术语“C-凝集素8-16”或“C-凝集素8-16”是指氨基酸序列KMASRSMRL(SEQ ID NO：9)。
本文使用的术语“Pec60 20-29”或“Pec6020-29”是指氨基酸序列ALALAALLVV(SEQ ID NO：10)。
本文使用的术语“Pec60 25-33”或“Pec6025-33”是指氨基酸序列ALLVVDREV(SEQ ID NO：11)。
本文使用的术语“CD8肽59-70”或“CD8肽59-70”是指氨基酸序列AAEGLDTQRFSG(SEQ ID NO：12)。
术语和定义
本文使用的术语“过继免疫治疗”是指给予供体或自身T淋巴细胞治疗疾病，其中所述疾病导致一般与I类HLA分子有关的免疫应答不充分或不足够。过继免疫治疗适于任何已证实通过CTL实现感染或转化细胞清除的疾病的治疗。例如，疾病包括但不限于癌症和/或肿瘤，例如黑素瘤、***癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌、咽喉癌和颈癌、胰腺癌、子***、卵巢癌、骨癌、白血病和肺癌；病毒感染，例如乙肝病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷病毒感染；细菌感染，例如结核、麻风和李斯特菌病；以及异常细胞感染，例如疟疾。
本文使用的术语“B7.1”是指与抗原提呈细胞相关的共刺激分子。
本文使用的术语“BCNU”是指亚硝基脲氮芥，也称为1，3-双(2氯乙基)-1-亚硝基脲。
本文使用的术语“BSE”是指牛海绵状脑炎。
本文使用的术语“CD”是指根据抗原表位和功能分类的分化群、T淋巴细胞(初级细胞)、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞。
本文使用的术语“DTIC”是指氮烯唑胺，即5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺。
本文使用的术语“活体外”或“活体外治疗”是指这样的治疗方法：由患者或合适的替代来源(例如合适的供体)获得生物物质(通常是细胞)并进行修饰，以使修饰的细胞可用于治疗病理性疾病，其中所述疾病可通过长期或持续传送由修饰细胞产生的治疗作用而得到改善。治疗包括将得自患者或替代来源的修饰的生物物质再引入患者体内。活体外治疗的好处是能够提供给患者治疗利益，而不使患者处于治疗的不利副作用之下。例如，经常给予癌症或病毒感染患者细胞因子来刺激患者的CTL扩增。但是，细胞因子经常使患者产生流感样症状。在活体外方法中，细胞因子用于刺激CTL在患者体外扩展，患者避免了接触细胞因子以及随后的副作用。或者，在适宜以及患者可获得利益的合适情况或条件下，可用低水平剂量的γ干扰素、α干扰素和/或IL-2同时治疗患者。预期干扰素的作用是有可能使肿瘤细胞对抗原特异性CTL裂解敏感，而IL-2的作用是有可能增强抗原特异性CTL的持续性。
本文使用的术语“HEPES”是指N-2-羟乙基哌嗪-N′2-乙磺酸缓冲液。
本文使用的术语“HLA-A2.1”是指一种存在于大约45％的白种人中的I类HLA分子。
本文使用的术语“MART-1”或“T细胞-1识别的黑素瘤抗原”是指一种黑素瘤相关抗原。1999年11月30日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,994,523号、1999年2月23日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,874,560号和1998年12月1日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,884,075号公开了该抗原的氨基酸和核酸序列及其各种特征。具体地说，美国专利第5,994,523号在图1中分别以SEQ ID NO：1和SEQID NO：2公开了MART-1的全长核酸和氨基酸序列。上述图1通过引用结合到本文中。
本文使用的术语“MAGE”是指一种黑素瘤相关抗原。2000年10月31日颁发的题为“通过测定多种乳癌和黑素瘤相关抗原判定乳癌和黑素瘤的方法”的美国专利第6,140,050号、1998年6月2日颁发的题为“通过检测MAGE-XP基因的mRNA甄别癌症的方法”的美国专利第5,759,783号和1997年9月2日颁发的题为“使用合成肽表位诱导人的抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞”的美国专利第5,662,907号公开了该抗原的氨基酸和核酸序列及其各种特征。
本文使用的术语“MPC-10”是指一种磁性粒子浓缩器。
本文使用的术语“NK细胞”是指天然杀伤细胞。
本文使用的术语“OKT3”是指鼠抗CD3单克隆抗体ORTHOCLONE OKT3。
本文使用的术语“TAP-1，2”是指抗原加工相关性转运蛋白1，2。
本文使用的术语“Th细胞”是指T辅助细胞CD4+。
本文使用的术语“酪氨酸酶”是指一种黑素瘤相关蛋白( Brichard等，J.Exp.Med.(1993)178：489-495； Robbins等，Cancer Res.(1994)54：3124-3126)。1998年12月1日颁发的题为“P15和酪氨酸酶黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,843,648号在图7的图A-D中公开了与酪氨酸酶相关的抗原肽和相关的多聚核酸，上述图通过引用结合到本文中。1996年1月30日颁发的题为“检测不正常细胞上含人白细胞抗原A2(HLA-A2)分子和酪氨酸酶衍生肽的复合物的方法”的美国专利第5,487,974号在实施例9的表3中公开了与酪氨酸酶和黑素瘤相关的其它肽，上述表通过引用结合到本文中。
本文使用的术语“gp100”是指一种由肿瘤浸润淋巴因子(TIL)识别的黑素瘤抗原。识别gp100的TIL与体内肿瘤排斥有关( Bakker等，J.Exp.Med.(1994)179：1005-1009； Kawakami等，J.Immunol.(1995)154：3961-3968)。1999年11月30日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,994,523号、1999年2月23日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,874,560号和1998年12月1日颁发的题为“黑素瘤抗原及其在诊断和治疗方法中的应用”的美国专利第5,884,075号公开了与gp100相关的抗原肽。具体地说，美国专利第5,994,523号在图4和图5中分别公开了与GP100相关的核酸和氨基酸序列。还公开了所述氨基酸序列的衍生抗原肽，包括鉴定为SEQ ID NO：27、33、34、35、36、37、38、39、40和41的抗原肽。上述图4和图5的全部序列以及鉴定为SEQ ID NO的肽都通过引用结合到本文中。
本文使用的术语“黑素瘤”是指(但不限于)黑素瘤、转移性黑素瘤、由黑素细胞或黑素细胞相关性痣细胞产生的黑素瘤、黑肉瘤、黑癌、黑素上皮癌、原位浅表扩散性黑素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤、扩散性黑素瘤或家族性非典型痣和黑素瘤(FAM-M)综合症。染色体异常、退行性生长和发育异常、促有丝***剂、紫外辐射(UV)、病毒感染、基因在不适当组织表达、基因表达改变和影响细胞的致癌因子可使哺乳动物出现这样的黑素瘤。上述黑素瘤可通过本申请描述的方法诊断、评价或治疗。
本文使用的术语“C-凝集素”是指一种发现与卵巢癌相关的肽。
本文使用的术语“主要组织相容性复合体”或“MHC”是一个总称，其含义包括在各种物种中描述的组织相容性抗原***，包括人白细胞抗原(HLA)。
本文使用的术语“表位”、“肽表位”、“抗原性肽”和“免疫原性肽”是指得自能够引起哺乳动物细胞免疫应答的抗原的肽。所述肽还可与用该肽免疫的动物的抗体反应。所述肽可为约5-20个氨基酸长，优选约8-15个氨基酸长，最优选约9-10个氨基酸长。
本文使用的术语“Pec60”是指一种发现其与卵巢癌和乳癌相关的肽。
本文使用的术语“类似物”包括任何其氨基酸残基序列与本发明序列大致相同的多肽，本文特别列出了其中一个或多个残基用功能相似的残基保守取代的多肽或表现出本文所述的本发明功能方面的多肽。保守取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个非极性残基，一个极性(亲水性)残基取代另一个极性残基，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的取代，一个碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个碱性残基，或者一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个酸性残基。
本文使用的术语“保守取代”还包括使用化学衍生残基取代非衍生残基。
本文使用的术语“化学衍生物”是指其一个或多个残基通过功能性侧基反应而化学衍化的多肽。这种衍生化分子的实例包括例如其中游离氨基衍化形成盐酸胺、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁基氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的分子。游离羧基可衍生化形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍化形成N-im-苄基组氨酸。化学衍生物还包括那些包含20种标准氨基酸的一种或多种天然氨基酸衍生物的蛋白或肽。例如：4-羟脯氨酸可取代脯氨酸、5-羟赖氨酸可取代赖氨酸、3-甲基组氨酸可取代组氨酸、高丝氨酸可取代丝氨酸以及鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明的蛋白或多肽还包括相对于本发明对应核酸序列的编码多肽序列来说具有一个或多个添加和/或缺失残基的任何多肽，前提是要保持需要的活性。
本文使用的术语“Her-2/neu”是指一种癌基因，其表达或过表达一种或多种膜结合受体样癌基因蛋白。已经发现与Her-2/neu表达或过表达相关的癌症有乳癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌和胰腺癌。Her-2/neu癌基因是癌基因酪氨酸蛋白激酶家族的一员，和表皮生长因子受体(EGFR)具有高度同源性。已经表明，Her-2/neu对细胞生长和/或分化起作用。Her-2/neu似乎通过定量机制诱发恶性癌症，该机制由基本正常的基因产物表达增加或下调引起。2000年6月13日颁发的题为“诊断和治疗Her-2/neu癌基因相关恶性肿瘤的Her-2/neu蛋白免疫反应性”的美国专利第6,075,122号在第12栏31行至第13栏第7行以SEQ ID NO号命名的序列公开了激发CD8+T细胞反应的肽，这些序列通过引用结合到本文中。
Her-2/neu(p185)是Her-2/neu癌基因的蛋白产物。Her-2/neu基因和Her-2/neu蛋白在各种各样的癌症(包括乳癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和***癌)中扩增和过表达。Her-2/neu与恶性肿瘤转化有关。其可见于50-60％的管型原位癌和所有乳腺癌的20-40％，并可见于大部分卵巢、***、结肠和肺腺癌。Her-2/neu不仅与恶性表型密切相关，而且与恶性肿瘤侵蚀有关，其可见于全部浸润性乳癌的1/4。Her-2/neu过表达与乳癌和卵巢癌的预后不佳相关联。Her-2/neu是一种相对分子量为185kd、长度大约为1255个氨基酸的跨膜蛋白。其具有一个大约645个氨基酸的与表皮生长因子受体(EGFR)大约40％同源的胞外结合结构域、一个高度疏水的跨膜锚式结构域(TMD)，以及一个大约580个氨基酸的与EGFR80％同源的羧基末端胞质结构域(CD)。
正在进行的癌基因相关研究鉴定了至少40个在恶性肿瘤细胞中有效并且负责转化或与转化相关的癌基因。根据推定的其基因产物(例如癌基因表达的蛋白)的功能或位置将癌基因分为不同的类别。据信癌基因对正常细胞生理的某些方面是必须的。
尽管在癌症治疗方面取得了显著进步，但癌症仍然是严重的健康问题。标准治疗方案化疗、放疗、外科手术以及三者联合通常不能获得持久的痊愈。在许多情况下，进行治疗的癌症患者经常在一段时间后旧病复发，使病情进一步恶化，这些治疗方案对患者存在严重问题。就黑素瘤来说，使用常规化疗还没有治愈转移性黑素瘤。据报道，组合化疗的Dartmouth方案(DTIC、顺铂、BCNU和他莫西芬)的反应率为35％-50％，但生存时间维持在6-10个月。已经报道了强烈“高剂量强度”化疗自体骨髓移植增强造血的缓解率高。尽管如此，存活的平均时间长度短暂，大约为4个月。
Rosenberg和同事尝试使用活化淋巴细胞输注治疗各种癌症。最初，使用由IL-2活体外激活的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和后期癌症浸润淋巴细胞(TIL)，但有效的证据不可靠。实际上，对照临床实验未显示出使用活体外激活细胞超越直接给予患者IL-2的优势。因此，LAK和TIL治疗的利益是最低限度的，副作用通常非常严重，以至于许多实验过早停止。
小鼠肿瘤模型研究已证明，肿瘤抗原特异性T细胞体内免疫的过继免疫治疗非常有效，毒性最小。应用该策略治疗人肿瘤的主要障碍是鉴定使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的杀伤敏感的免疫原性抗原。由黑素瘤患者分离肿瘤反应性T细胞引致鉴定出某些CTL直接针对的肿瘤抗原(表位)。这些表位包括酪氨酸酶( Brichard等，J.Exp.Med.(1993)178：489-495； Robbins等，Cancer Res.(1994)54：3124-3126)、MART 1/Melan A( Kawakami等，J.Exp.Med.(1994)180：347-352)、gp 100( Bakker等，J.Exp.Med.(1994)179：1005-1009；和 Kawakami等，J.Immunol.(1995)154：3961-3968)和MAGE( Gaugler等，J.Exp.Med.(1994)179：921-930)。其中，酪氨酸酶和MART-1几乎普遍表达于黑素瘤，因此它们是过继免疫治疗的必然选择。
近些年，人们注意到小百分比的进行免疫治疗的黑素瘤患者几年来的存活率显著改善。这包括用“癌症疫苗”主动特异性免疫治疗以及利用免疫***非特异性增强剂，例如IL-2、α-干扰素和γ-干扰素之类的细胞因子。但是，经常伴随细胞因子使用出现的副作用(例如恶心、发烧)降低了细胞因子的利益。
细胞溶解T细胞(CD8+)是对抗病毒感染的主防御线。CD8+淋巴细胞特异性识别和杀伤感染病毒的宿主细胞。理论上讲，应当有可能利用免疫***抗击其它类型的疾病(包括癌症)。但是，几乎不能获得特异性激活CTL的体外/活体外方法。现在，鉴定出以上提及的关键黑素瘤抗原和以下描述的特异性体外激活CTL的方法使得可以验证过继免疫治疗转移性黑素瘤这个想法。
所有原初T细胞都需要两个活化信号来激发免疫应答。对于CD8+淋巴细胞(CTL)来说，第一个信号赋予特异性，包括将抗原的免疫原性肽片段(表位)提呈给CD8+细胞，所述表位与存在于抗原提呈细胞(APC)表面的MHC I类(HLA)复合体结合。该复合体由在胞内传递信号的T细胞抗原受体(TCR)特异性识别。
结合T细胞受体对于诱导T细胞活化是必须的，但并不足够，通常不能使细胞增殖或分泌细胞因子。完全激活需要用于进一步增强活化级联的第二个共刺激信号。在抗原提呈细胞上的共刺激分子中，B7和细胞粘附分子(整合素)如ICAM-1分别通过结合T细胞上的CD28和LFA-1参与该过程。在存在合适共刺激分子作用的情况下，CD8+细胞与携带结合MHC I类分子的免疫原性肽(表位)的抗原提呈细胞相互作用，此时CD8+细胞成为完全活化的溶细胞型T细胞。
淋巴细胞介导的细胞杀伤作用包括一系列生物事件，起始事件是CD8+CTL通过上述T细胞活化的识别方法结合携带抗原的靶(肿瘤)细胞。
图1图示了上述CD8+细胞与抗原提呈细胞或靶(肿瘤)细胞之间的相互作用。该相互作用起始于与APC或靶细胞上的MHC I类分子相接的抗原结合T细胞抗原受体(TCR)。辅助分子如淋巴细胞功能性抗原(LFA-1、LFA-2和LFA-3)、胞间粘附分子1(ICAM-1)、T细胞共刺激因子(CD2、CD28、B7)增强细胞-细胞粘附或转导另外的细胞活化信号。
在细胞-细胞作用后，CTL通过活化可溶性溶细胞介导物(储存在T细胞胞质颗粒中的穿孔素和粒酶)和CTL表面分子(Fas配体)杀伤靶细胞。在溶细胞攻击后，靶细胞死于坏死(膜穿孔和细胞器损坏)或凋亡(染色质凝聚、DNA片段化和膜起泡)。
图2图示了淋巴细胞介导的溶细胞机制。在图2的图A中，在结合靶细胞后，CTL中的胞质颗粒再次快速定向于靶细胞，以将含穿孔素和粒酶的颗粒释放到胞间隙。这些蛋白水解酶在靶细胞的胞质膜上形成孔，最终导致细胞坏死。在图B中，在结合靶细胞后，CTL上Fas配体的表达水平增加。Fas配体和靶细胞上Fas受体的相互作用导致凋亡。CPP32之类的蛋白酶和与IL-1b-转化酶(ICE)有关的其它酶参与诱导凋亡。天然抗原提呈细胞(例如树突细胞、巨噬细胞、自身肿瘤细胞)有可能用于CD8+活化。但是，遵循该方法的活化效率低。这是因为I类天然APC分子在肿瘤表位旁包含许多其它类型的肽表位。这些肽有许多来自正常无毒细胞蛋白，导致将实际上可有效抗肿瘤的活性天然APC数量稀释( Allison等，Curr.Op.Immunol.(1995)7：682-686)。
解决该问题更直接有效的方法是仅用与对抗特定疾病(例如癌症)有关的那些表位或肿瘤特异性抗原(例如黑素瘤特异性抗原)特异性激活CD8+细胞。为此，通过在果蝇细胞中表达MHC I类分子产生人工抗原提呈细胞。因为果蝇不具有免疫***，所以不存在参与将肽表位运载至I类分子上的TAP-1，2肽转运蛋白。因此，I类分子作为空壳出现在果蝇细胞表面。通过将这些转染果蝇细胞与结合I类分子的外源肽(例如癌症或肿瘤特异性表位，包括但不限于黑素瘤特异性抗原)温育，有可能用所述肽占据每个I类分子。在这些果蝇APC中高密度表达含单个肽的I类分子使得可以体外产生细胞毒性CD8+ T细胞，其对所述抗原肽是完全特异性的。1996年6月25日颁发的题为“使用表达人MHC I类分子和β2-微球蛋白的昆虫细胞体外活化细胞毒性T细胞”的美国专利第5,529,921号和1994年5月24日颁发的题为“表达MHC I类抗原和β2-微球蛋白编码基因并能够装配空复合物的果蝇细胞系及所述细胞系的制备方法”的美国专利第5,314,813号讲述了果蝇细胞的制备方法和步骤。具体地说，美国专利第5,529,921号在第26栏56行至第28栏22行公开了分离和/或富集前体细胞培养物的各种方法。
另外，该特征消除了对用高剂量的各种细胞因子体内刺激免疫***的需要。由此产生一种避免了由细胞因子引起的副作用的治疗方法。或者，在适宜以及患者可获得利益的合适情况或条件下，可用低水平剂量的α干扰素、γ干扰素和/或IL-2同时治疗患者。
消除对用细胞因子体内刺激的需要使患者治疗质量提高。包括给予患者细胞因子的治疗方案经常导致患者出现流感样症状，例如恶心、呕吐和发烧。尽管在已经很虚弱的患者身上发生的特别严重的反应可能危及生命，但这些副反应一般不致命。另一个考虑是这种副反应对其它有益治疗方案的患者接受度和适应性有不利影响。消除细胞因子体内刺激的需要产生的治疗方案改善了患者的舒适性，并提供给临床医师一种其患者更愿意服从的有效治疗方案。
已经使用作为APC的转染果蝇细胞和来自T细胞受体(TCR)转基因小鼠2C系的CD8+细胞在小鼠中证明了该方法对肿瘤过继免疫治疗有用。在该***中，纯化的CD8+2C细胞对还携带有共刺激分子B7-1和ICAM-1的MHC I类分子(Ld)转染的果蝇细胞体外提呈的肽高度起反应。转染的果蝇细胞作为确定最小刺激需要的探测物用于刺激未激发CD8+T细胞( Cai等，P.N.A.S.USA(1996)93：14736-14741)。或者，当使用未分离的小鼠脾细胞代替纯化的2C细胞作为应答物时，不需要使用共刺激分子。在此情况下，脾细胞群中的CD8+细胞接受活化B细胞的“旁观者”共刺激。利用此发现，有可能证明MHC I类分子(Ld)转染的果蝇细胞能够诱导正常的DBA/2小鼠脾细胞在没有加入淋巴因子的情况下体外对同源P815肥大细胞瘤特异性肽产生应答。将这些CTL注射入患P815肥大细胞瘤的DBA/2小鼠中导致肿瘤快速退化( Sun等，Immunity(1996)4：555-564)。
从程序上讲，体外培养正常DBA/2小鼠脾细胞和装载P1A.35-43肽的MHC I类分子(Ld)转染的果蝇细胞，P1A.35-43肽是一种得自DBA/2产生的P815肥大细胞瘤细胞系的肿瘤特异性表位。5天后由培养物收集淋巴细胞，其显示出对P815肿瘤细胞的强体外细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，但不能裂解P1024(一种不表达P1A.35-43的P815成熟细胞系)，如图3的图A所示。当这些CTL注射到3天前接种P815细胞的DBA/2小鼠中时，第一周肿瘤生长未受阻碍，但随后在第二周中肿瘤消除，如图3的图B所示。当用不相关抗原(例如病毒核蛋白肽)体外免疫CTL时，对P815生长没有任何作用，这证明了特异性，如图3的图B所示。总之，主要组织相容性复合体I类分子(Ld)转染的果蝇细胞诱导正常的DBA/2小鼠脾细胞在没有加入淋巴因子的情况下体外对同源P815肥大细胞瘤特异性肽产生应答。将这些CTL注射入带有P815肥大细胞瘤的DBA/2小鼠中导致肿瘤快速退化( Wolfel等，J.Exp.Med.(1993)178：489-495)。
体外人体研究
体外对健康测试者的人CTL进行抗酪氨酸酶免疫。在仅用果蝇细胞初次刺激后，以测试的全部CTL效应细胞对JY靶细胞的比率证实携带酪氨酸酶的JY细胞特异性裂解。使用全刺激/再刺激方法诱导健康受试者的酪氨酸酶特异性CTL，并测试其杀伤Malme 3M黑素瘤细胞系的能力。除了一个或两个可能的例外，在所有供体中都不同程度地诱导出抗Malme 3M的特异性CTL活性。一般来说，针对对照Malme 3肿瘤细胞的反应性最小。还对黑素瘤患者的细胞进行体外抗酪氨酸酶表位免疫，以产生针对健康志愿者细胞的相似活性和特异性的CTL。
使用任何天然或人工抗原提呈细胞(APC)***体外产生细胞毒性T淋巴细胞受限于这些***能够产生的抗原特异性。
利用以下的APC***产生针对单个表位的抗原特异性CTL：1)用限定肽脉冲刺激人树突细胞(DC)；2)用肽脉冲刺激由原淋巴细胞产生的外周血单核细胞(PBMC)；3)其中的天然肽用酸萃取并装载目的肽的类淋巴母细胞系(LCL)；4)工程为表达空I类分子的果蝇细胞；用人I类分子和共刺激分子转染的小鼠3T3细胞(J.B.Latouche和M.Sadelain，Nature Biotech(2000)18：405-409)。
人们认为树突细胞(DC)是人体中提呈触发抗原的细胞***，因为其作为触发抗原提呈细胞广泛应用。自体或外源蛋白在DC中加工。产生的肽表位由HLA分子提呈，并转运至DC表面。但是，已发现DC不能始终如一地在体外产生抗4种不同肽的CTL。这应当提供对4种肽每一种都具有活性的CTL。另外，还发现在肽脉冲刺激时DC表型成熟或不成熟不影响结果。
另外，果蝇细胞刺激经常产生抗高达10种不同类型肽的CTL。这提供了对10种肽的每一种都有活性的CTL。
按照对每种肽的标准刺激方案，开始评价果蝇细胞和DC激发针对单个肽表位的CTL应答的能力。为了对比DC和转染的果蝇细胞，在IL-4和GM-CSF存在下通过培养自体单核细胞1周产生不成熟DC。在收获前24小时通过向培养基中加入TNFα，由不成熟DC获得成熟DC。收获(成熟或不成熟)DC，用肽脉冲刺激，按照用于刺激CD8细胞和肽脉冲刺激的果蝇细胞的方法将DC与纯化的CD8细胞混合。当对酪氨酸酶肽表位689评价时，发现一般来说果蝇细胞是比DC更好的刺激物，如图7所示。此外，当使用限定肽脉冲刺激APC时，显示出不成熟或成熟表型的DC(图8)在激发特异性CTL应答方面没有果蝇细胞有效。这特别令人惊奇，因为DC在免疫***中起主要作用。进行了一个使用1个供体的对比研究，如图9所示。当使用果蝇细胞作为刺激物时，产生抗4种不同肽的特异性杀伤作用，而不成熟DC产生微量的特异性杀伤作用，成熟DC产生仅针对用于刺激的4种肽中的一种的特异性杀伤作用。
制备细胞毒性淋巴细胞
通过用抗CD8抗体正选择由去除白细胞的样品中分离CD8+细胞，用表达人I类分子(HLA-A2.1)、B7.1、ICAM-1、LFA-3和B7.2的果蝇细胞提呈的4种不同黑素瘤相关肽刺激CD8+细胞。在IL-2和IL-7存在下，用装载所述肽表位的自体单核细胞再刺激CD8+细胞两轮。用OKT3和IL-2非特异性扩增CTL。检测抗Malme 3M细胞的CTL活性，并通过流式细胞仪测定CD8+T细胞的纯度。
按照GLP和GMP实施生产工艺和步骤。“GLP”和“GMP”是由美国FDA制订的实验室和生产管理标准，本领域技术人员很容易理解。监测CTL的特性、生存能力、CTL活性、无菌性和内毒素含量。
以下表1显示了适用于本发明的乳癌和卵巢癌治疗方法的肽表位清单。对本领域一般技术人员来说显而易见的是，除了以下表1列出的那些肽表位之外，还有各种各样的肽表位适用于本发明的乳癌和卵巢癌治疗方法，只要这种肽是T细胞表位。
                               表1
   鉴定的作为乳癌和卵巢癌靶的肿瘤相关抗原的HLA-A2.1限制性表
                              位
靶(残基)      名称    PRI# AKA 序型(SEQ ID NO：)    HLA肽- 结合预测
Her-2/neu
789-787                                              826            E90                   CLTSTVQLV                      160(SEQ ID NO：7)48-56                                                827            D113                  HLYQGCQVV(SEQ ID NO：13)369-377                                              835            E75                   KIFGSLAFL                      481(SEQ ID NO：8)654-662                                              837            GP2                   IISAVVGIL(SEQ ID NO：14)650-658                                              838            GP1                   PLTSIISAV(SEQ ID NO：15)773-782                                              861                                  VMAGVGSPYV(SEQ ID NO：16)851-859                                              862            E89                   VLVKSPNHV                      118(SEQ ID NO：17)971-979                                              863            C85                   ELVSEFSRM(SEQ ID NO：18)
AES                       断裂Notch的氨基增强物
G128-135                                             893            G76                   GPLTPLPV(SEQ ID NO：19)
MUC-1                     粘蛋白
950-958                                              908            1.1                   STAPVHNV(SEQ ID NO：20)
CEA                       癌胚抗原
571-579                                              879            CAP-1                 YLSGANLNL(SEQ ID NO：21)
FBP    叶酸结合蛋白
191-199                914     E39   EIWTHSYKV(SEQ ID NO：22)
C-凝集素  MESM、RELP
8-16                   C8   KMASRSMRL        CTL活性(SEQ ID NO：9)77-86                  C77  SILSLKEAST       CTL活性(SEQ ID NO：23)
NY-ESO-1
157-165C             894     SLLMWITQC         天然(SEQ ID NO：24)157-165V             906     SLLMWITQV         修饰(SEQ ID NO：25)155-163              913     QLSLLMWIT(SEQ ID NO：26)
Pec60
20              P20    ALALAALLVV       CTL活性(SEQ ID NO：10)25              P25    ALLVVDREV        CTL活性(SEQ ID NO：11)
CA-125
157-165         900     YLETFREQV        38(SEQ ID NO：27)255-263         902     VLLKLRRPV        88(SEQ ID NO：28)337-345         901     GLQSPKSPL        21(SEQ ID NO：29)546-554         903     ELYIPSVDL        5(SEQ ID NO：30)898-906         899     KALFAGPPV        13(SEQ ID NO：31)414-422         910     FMWGNLTLA        315
  (SEQ ID NO：32)
MAGE-3
271-279       909    FLWGPRALV(SEQ ID NO：33)
端粒酶  hTRT
540-548               907    ILAKFLHWL(SEQ ID NO：34)865-873               911    RLVDDFLLV(SEQ ID NO：35)
G250
245-262    912     HLSTAFARV(SEQ ID NO：36)
提供以下的实施例是为了阐述本发明，但本发明不限于实施例的内容。
                        实施例1
                 生产果蝇抗原提呈细胞
按照公开的方法由果蝇(Oregon-R)卵制备Schneider S2细胞系，并已将其保藏在ATCC(CRL 10974)。用补加10％胎牛血清的市售Schneider果蝇培养基培养S2细胞。
在S2细胞中表达MHC I类分子和共刺激蛋白的pRmHa-3质粒载体得自如文献所述构建的pRmHa-1表达载体。该载体含有金属硫蛋白启动子、金属效应共有序列和携带有分离自果蝇的聚腺苷酸化信号的乙醇脱氢酶基因。
如下制备于转染的互补DNA：
HLA-A2.1和 β-2微球蛋白：使用衍生自公开序列的引物由K562细胞反转录PCR
B7.1：使用衍生自公开序列的引物由K562细胞反转录PCR
ICAM-1：使用衍生自公开序列的引物由K562细胞反转录PCR
B7.2：使用衍生自公开序列的引物由HL-60细胞(ATCC CCL-240)反转录PCR
LFA-3：使用衍生自公开序列的引物由HL-60细胞(ATCC CCL-240)反转录PCR
分别将互补DNA***到pRmHa-3载体中。使用磷酸钙沉淀法，用HLA-A2.1、B7.1和ICAM-1质粒DNA和phshneo质粒的混合物转染S2细胞。通过用含遗传霉素的Schneider培养基培养选择稳定转染的细胞。使用前24小时，通过加入CuSO4诱导转染基因表达。使用抗HLA-A2.1、抗B7.1和抗ICAM-1的抗体，通过流式细胞仪测定表达水平。细胞的HLA表达超过30％对CD8+淋巴细胞的体外有效活化是必须的。
分离人CD8 + 细胞
使用DynabeadsTM分离法(Dynal)，通过正选择分离去除白细胞样品中的CD8+细胞。将抗人CD8小鼠单克隆抗体(50μg/ml的人γ球蛋白溶液[Gammagard])加入到已清洗细胞的Dulbecco PBS溶液中，Dulbecco PBS溶液中补加有1％人血清白蛋白(Baxter-Hyland)和0.2％柠檬酸钠。温和搅拌下于4℃温育45分钟后，清洗细胞，并重悬浮在相同的缓冲液中，该缓冲液含有1∶1珠/细胞比率的Dynal磁珠，磁珠上包被有绵羊抗小鼠IgG。将细胞和珠放入无菌试管中，于4℃温和搅拌45分钟。搅拌结束时，使用MPC-1分离器，按照生产商(Dynal)的说明，以磁力取出结合抗体的细胞。在CD8肽59-70(AAEGLDTQRFSG；SEQ ID NO：12)存在下，通过于37℃温育45分钟解离CD8细胞-珠复合物。以磁力去除游离的珠，通过流式细胞仪计数并分析CD8细胞，以评价纯度。CD8+细胞的回收率通常超过80％。表2概述了通过抗CD-8抗体正选择由正常人PBMC制品分离的14种CD8+制品的细胞组成。
                           表2
        以流式细胞仪分析正选择的CD8+细胞的纯度
细胞类型         PBMC平均％  (范围)       选择后平均％  (范围)
CD8 T细胞   15％    (7-24)   82％    (56-95)
CD4 T细胞   36％    (14-52)   2％     (0.1-10)
CD14单核细胞   15％    (7-26)   0.8％   (0.2-2)
CD15嗜中性粒细胞   12％    (8-21)   0.6％   (0.1-3)
CD19 B细胞   2％     (0.4-7)   3％     (0.5-9)
CD56 NK细胞   6％     (2-17)   6％     (0.1-20)
体外免疫纯化的人CD8+细胞
初次刺激
将转染的果蝇S2细胞在补加10％胎牛血清和CuSO4的Schneider培养基(106细胞/ml)中于27℃培养24小时。收获细胞，用含100μg/ml人酪氨酸酶369-377的昆虫X-press培养基(BioWhittaker)清洗并重悬浮。于27℃温育3小时后，以1∶10的比率在补加10％自体血清的RPMI培养基(Gibco)中混合S2细胞和CD8+细胞。将细胞混合物于37℃温育4天，在此期间果蝇细胞相继死亡。在第5天，加入IL-2(20U/ml)和IL-7(30U/ml)选择性扩增酪氨酸酶特异性CTL群。
再刺激
将去除白细胞时获得的冷冻自体CD8缺失PBMC解融，用含10％自体血清(作为β2微球蛋白源)和20μg/ml酪氨酸酶369-377的RPMI培养基清洗以106细胞/ml重悬浮。γ辐射(5,000rad)后于37℃温育细胞2小时。通过用Dulbecco PBS清洗去除未粘附细胞。通过在含10％自体血清和10μg/ml酪氨酸酶369-377的Hepes缓冲的RPMI培养基中温育90分钟使粘附单核细胞装载酪氨酸酶表位。去除上清液，以10CD8+细胞/1粘附单核细胞比率加入果蝇细胞-活化CD8+细胞悬浮液(3×106细胞/ml补加10％自体血清的RPMI培养基)。于37℃培养3-4天后，加入IL-2(20U/ml)和IL-7(30U/ml)改变培养基，以选择性扩增酪氨酸酶特异性CTL群。
非特异性扩增
通过用补加自体血清、抗CD3单克隆抗体(OKT3)、IL-2和γ辐射的自体PBMC的RPMI培养基培养效应细胞对其进行非特异性扩增。
活性和纯度测定
CTL测定
Malme 3M细胞在51Cr释放测定中用作靶细胞。用0.1mCi 51Cr于37℃对在含4％胎牛血清、1％HEPES缓冲液和0.25％庆大霉素的RPMI培养基中的5×106Malme 3M细胞标记1小时。用含10％胎牛血清(HyClone)的RPMI清洗细胞4次并稀释至105细胞/ml。以100∶1、20∶1和4∶1(效应细胞∶靶细胞)的比率将100μl效应CTL和100μl装载肽的51Cr标记的Malme 3M靶细胞混合在一个96孔微量滴定板中。以20∶1(K562∶Malme 3M)的比率加入K562细胞，以降低天然杀伤细胞的基础裂解。使用非肿瘤HLA-A2.1成纤维细胞系Malme 3评价非特异性裂解。平行测定包括检测51Cr自发释放和最大释放的对照。于37℃温育6小时后，离心滴定板，并计数上清液，以检测51Cr释放。
使用以下等式计算特异性裂解百分比：
流式细胞仪
在体外激活之前和之后，使用荧光单克隆抗体和FACS分析对CD8+细胞的众多细胞表面标记进行分析。表3显示了使用健康供体细胞的典型激活方案的结果。
                    表3
    体外激活CD8+细胞的流式细胞仪分析
标记/细胞类型   激活前平均％   激活后平均％
CD8 T细胞   98   99
TCRαβT细胞受体   98   92
CD44***归巢受体   91   99
CD45RO记忆T细胞   58   88
CD45RA   41   31
CD62L HEV归巢受体   24   38
CD56 NK细胞   1   11
CD25激活T细胞   0.1   29
除了活性和纯度以外，还测定CTL制品的无菌性和内毒素含量。
                                    试剂
试剂    供应商 级别 备注
rh IL-2   Chiron 美国药典 无菌溶液
rh IL-7   Genzyme 研究级 冻干无菌溶液
人酪氨酸酶369-377 研究级
DynabeadsM-450   Dynal GMP 绵羊抗小鼠IgG磁珠
人血清白蛋白   Baxter 美国药典 无菌无热源无肝炎病毒，25％溶液
胎牛血清   Gemini 研究级 无菌、无BSE、无内毒素、无支原体
Gammagard   Baxter 美国药典 无菌注射用人免疫球蛋白溶液
抗CD8抗体 研究级 小鼠抗人CD8单克隆抗体
CD8肽59-70 研究级 由磁珠释放CD8+细胞
W6/32   ATCC 研究级 小鼠抗人HLA-A、B、C单克隆抗体
                        细胞系
细胞系    供应商 注释
果蝇S2   ATCC CRL 10974
M3   UCSD 非HLA-A2.1人黑素瘤
Malme 3   ATCC 黑素瘤患者的正常皮肤成纤维细胞
Malme 3M   ATCC 肺转移性黑素瘤(和Malme 3为同一患者)
M14   UCSD HLA-A2.1人黑素瘤
K562   ATCC 人红白血病细胞系；NK细胞靶
JY细胞   ATCC EBV转化的表达HLA-A2.1和B7的人B细胞系
P815和P1024   ATCC  DBA/2小鼠肥大细胞瘤细胞系
Jurkat A2.1   ATCC 用人HLA-A2.1转染的急性T细胞白血病
ATCC：美国典型培养物保藏中心
                     实施例2
         抗黑素瘤的细胞毒性T细胞输注试验
试验目的
本实施例讲述了细胞毒性T细胞输注治疗黑素瘤的效果，其评价根据以下因素：
1.体外免疫后再输注自体CTL的安全性和耐受性；
2.在有限稀释分析中输注的CTL在体循环分解中的动力学；
3.放射性闪烁照相法测定的CTL全身分布；
4.免疫组织学检测的活组织结节的细胞组成(CTL、TH、NK、B细胞)；和
5.两个月中可检测病灶的消退和反应时程。
患者群
适合治疗需要的患者具有历史记录的、不可切除的、可检测或可评价的恶性黑素瘤以及HLA-A2单倍型。治疗前评价包括通过MRI或CT扫描放射性评价大脑，胸部和腹部CT扫描以及物理检查尤其是皮肤和***。治疗的患者总数是15人(9男6女)。年龄由33岁至75岁，平均58岁。转移性肿瘤的平均病程为1.5年。对14/15的患者进行治疗前皮试，以测定是否存在无变应性状态，对于评价的全部7种普通抗原，5/14的患者测试为阴性。通过采用HLA-A2特异性单克隆抗体(BB7.2)的FACS分析筛选患者的HLA-A2单倍型。通过PCR分析进行再分类。除了1名患者之外，其他全部患者都是HLA-A*0201，例外者(患者08)是HLA-A*0205。
用活体外产生的自体CTL治疗
按照该临床方案治疗15名患者。所有患者都接受至少1次自体CTL输注。表1概述了给予每名患者的轮次和细胞剂量。体外产生的细胞数取决于与患者相关的因素，例如由回输血方法分离的PBMC数和每个PBMC群中存在的CD8+T细胞数。因为全部体外产生的细胞都回输入供者体内，所以给予每名患者的剂量必然有所不同。在对患者之间给予剂量归一化的尝试中，记录每种剂量的理论“效力”得分。通过将细胞总数乘以由装载肽的靶细胞获得的溶细胞活性获得该值。T细胞输注剂量由最小的4×107(患者08)至最大的3.2×109(患者13)。患者根据其在每轮治疗末期的临床状态进入第2、3或4轮治疗。由回输血样品获得的PBMC数在进行另外轮次治疗的患者中往往较低，特别是如果随后轮次治疗紧接着前一轮次治疗结尾的话。这要归因于在先前轮次治疗过程中由于给予IFNα-2b而产生的持久性淋巴细胞减少。分离的原初天然CD8+T细胞总数取决于其在每个PBMC群中的百分比。患者中CD8+T细胞的百分比在8％-31％之间变化。所获得的扩增率也影响最终细胞数，其在0.1-6.0倍之间变化。以上的说明书和实施例1讲述了活体外产生CTL的方法。
上调I类分子和黑素瘤相关抗原对IFNα-2b的应答
在增强抗原特异性CTL体内溶解黑素瘤细胞能力的尝试中，在CTL输注之前连续5天给予低剂量IFNα-2b，再以每周3次给予4周。检测对细胞因子体内应答的一种方式是通过用特异性抗体阳性染色的免疫组织化学分析评价在连续时间点获得的活组织切片。由1名多皮肤病灶患者(患者04)获得连续活组织切片，以评价I类分子和抗原表达。活组织切片检查表明，在任一治疗前I类分子和MART-1表达为弱阳性(活组织切片A)。皮下注射10MU/m2 5天后，观察到这两个标记物急剧增加(活组织切片B)。对于酪氨酸酶和gp100来说，治疗前样品(活组织切片A)的免疫组织化学染色分别是阴性和弱阳性。最初的5天IFNα给药以及13次追加给药之后，染色组织样品中的后期抗原表达增加(活组织切片C)。
活体外产生的CTL的抗原特异性
如果可获得活组织物质建立细胞系，则在释放当天评价所有患者产生的抗装载肽的T2靶、HLA-A2黑素瘤细胞系(Malme3M)和自体黑素瘤系的CTL。评价每种制备剂量细胞的溶细胞活性。使用单独提呈每种肽或同时提呈全部4种肽的装载肽的T2细胞测定每名患者产生的CTL应答的特异性。评价HLA-A2匹配细胞系或自体肿瘤系溶解携带内源表达的黑素瘤相关抗原的细胞的能力。除了溶细胞活性之外，用已确立的检测在特定肽刺激物作用下产生的胞内γ干扰素产量的方法评价抗原特异性。通过该方法评价活体外方法结束时产生的CTL。分别记录对每种肽特异性的细胞百分比。通过加上T细胞群中检测的每种肽的特异性计算患者13的每批CD8培养物的特异性细胞数。每个连续治疗周期都可检测到特异性细胞总数增加。
检测CTL治疗后CD8和CD4细胞浸润性肿瘤活组织切片
理想的是治疗前、中、后全部患者的活组织切片样品。但是，实验条件使得活组织切片样品仅限于一定数量的患者。由研究登记的15名患者中的5人获得肿瘤组织。在T细胞治疗后第5和第6周分别获得两名患者(患者08和13)的活组织检查样品。组织样品检测揭示，同时存在浸润性CD8和CD4细胞。其中一个肿瘤样品取自头皮枕骨区域的皮肤病灶，该病灶在T细胞第2次输注后4周，即到随后的检测时其尺寸增加。活组织切片检查揭示淋巴细胞严重浸润的组织坏死。其它活组织切片得自臀移植手术过程中取出得大腿骨顶部。患者08的皮肤病灶一般性I类分子和特异性HLA-A2标记都是强阳性(4+)。酪氨酸酶和gp100是弱阳性(分别是1+和2+)，而同一样品中的MART-1是阴性。患者13的活组织切片区也坏死，外源染色更多；不同肿瘤细胞群的HLA-A2.1以及一种或多种MAA表达缺乏。但是，完整组织区显示强I类分子(4+)和全部黑素瘤相关抗原。后一样品中的淋巴细胞浸润似乎环绕在肿瘤块周围，而不是深深地浸润在肿瘤中。但是，与肿瘤直接相关的最高百分比细胞是CD8细胞。这两名患者没有治疗前活组织样品阻碍了对治疗前组织样品中相似类型浸润细胞的验证。
T细胞治疗后CT扫描证实目的应答
CT扫描是治疗前筛选标准和治疗后跟踪检查的一部分。患者10在治疗前扫描(99年6月23日)后5周(99年7月27日)接受单剂8×108CTL输注，输注后1个月(8/27/99)重复胸部CT扫描时，观测到肺病灶尺寸急剧减小。同样，患者14在首次输注6.6×108细胞(99年10月5日)前3.5周进行胸部CT扫描(99年9月1 0日)，作为登记过程的一部分。第2次输注11.5×108细胞后1个月的后续CT扫描(99年1月7日)揭示三个单独的病灶急剧收缩。根据CT扫描前和扫描后的检测，患者13也具有目的应答。I期治疗后气管旁腺病由7.8cm2(研究前)变为4.4cm2，并在II期治疗后消失。
无变应态存在不妨碍产生CTL的能力或阻碍临床反应
按照该方案治疗的大多数患者以前均接受了医学治疗。进行治疗前皮试来测定对一组7种普通抗原的无变应性反应是否与不能活体外产生CTL有关，或预防记录到的临床反应。活体外产生CTL的能力与患者的治疗前皮试结果无关。应当指出的是，患者03和04(都是混合反应者)在第二轮治疗开始之前重复进行了皮试，仍有无变应性反应。
                      实施例3
产生能够溶解乳癌和卵巢癌细胞的HER-2/neu特异性CTL
我们感兴趣的是将我们的CTL生产技术应用于其它类型的肿瘤，以确定是否可用该方法治疗所有形式的癌症。HER-2/neu是一种与EGFR同源的原癌基因，在许多人类癌症(主要是***、卵巢和结肠的腺癌)中扩增和过表达。其经常与侵袭性疾病有关，并可能是预后不佳的指标。已经有几个以这些类型的癌症作为可能标靶的临床实验对其进行了研究。
在20世纪90年代早期，或者通过计算机辅助性肽结合算法，或者通过分离自卵巢癌患者腹水的CTL作图，鉴定了HER-2/neuHLA-A2.1限制性肽表位(表3)。
                                        表3
                             HLA-A2.1限制性HER-2/neu肽
  HER-2/neu肽    PRI#    其它ID#    位置    序列(SEQ ID NO)    参考文献
  48-56   827   D113   EC   HLYQGCQVV(SEQ ID NO 13)    Disis等，1994
  369-377   835   E75   EC   KIFGSLAFL(SEQ ID NO 8)    Fisk等，1995
  650-658   838   GP1   TM   PLTSIISAV(SEQ ID NO 15)    Fisk等，1995
  654-662   837   GP2   TM   IISAVVGIL(SEQ ID NO 14)    Peoples等，1995
  773-782   861   N/A   IC   VMAGVGSPYV(SEQ ID NO 16)    Lustgarten等，1997
  789-797   826   E90   IC   CLTSTVQLV(SEQ ID NO 7)    Disis等，1994
  851-859   862   E89   IC   VLVKSPNHV(SEQ ID NO 17)    Disis等，1994
  971-979   863   C85   IC   ELVSEFSRM(SEQ ID NO 18)    Fisk等，1995
合成所有的肽，赋予编号(PRI#)，并使用和我们用于黑素瘤相关T细胞肽表位的相同方法评价其活体外产生CTL的能力。由正常供体分离CD8细胞，以测定装载已知CTL肽表位的果蝇细胞活体外常规生产CTL的能力。肽826、835、861和863的CTL产生频率最高(表4)。
                                表4
                  正常供体的HER-2/neu CTL产生频率
供体   826   827   835   837   838   861   862   863
193   +   +
194   +   -   +   -   -   +   -   +
195   +   +   +   +
196   +   -   +   -   -   +
197   +   -   +   -   +   +   -   +
198   -   -   +   -   +   +   -   +
207   +   +   +   +
212   +   +   +   +
218   +   +   +   +
232   -   +   +   -
233   +   +   +   +
241   -   +   +
243   -   +   +
尽管转染的果蝇细胞具有独特的提呈高达10种不同肽表位的能力(图10)，但我们选择4种HER-2肽826、835、861和863，原因是活体外产生针对这些肽的CTL的频率。这4种不同的HER-2肽代表弱至中等的HLA-A2.1(存在于转染的果蝇细胞表面)结合物。我们倾向于包括弱的A2结合物，因为我们在使用黑素瘤相关肽方面的经验提示，如果肿瘤细胞确实是天然T细胞表位，则弱的I类结合物一般产生有效识别该肿瘤细胞的CTL。我们作为靶的大部分肿瘤相关蛋白是自身抗原，因此，预期用病毒肽可观测到它们对I类分子具有高亲和力。低至中等的结合物一般产生非常有效溶解肿瘤细胞的CTL。这可由MART-1肽得到证实，MART-1肽是果蝇细胞上的一种低亲和力结合物(图3)，还是一种常规生产能够有效溶解装载肽的靶细胞(T2)或更重要的黑素瘤细胞(Malme3M)(图12)的CTL的表位。
HER-2/neu是EGF-R家族一员，起生长因子受体作用。HER-2蛋白在人胎儿发育时表达。在成年人中，在许多正常组织的上皮细胞中可微弱检测出该蛋白。正常细胞中HER-2基因以单拷贝存在。在许多人类癌症中都鉴定出该基因扩增和/或相关蛋白过表达，包括乳癌、卵巢癌、子宫癌和肺腺癌。HER-2和EGF-R受体之间的序列差异示于表5。我们评价的4种HER-2肽中的3种在两种蛋白之间具有三个或更多个氨基酸变化。单氨基酸改变足以区分两种蛋白。
                           表5
                    HER-2/neu与EGF-R
   蛋白    肽# 序列(SEQ ID NO)   #改变
  HER-2/neuEGFR   835 KIFGSLAFL(SEQ ID NO：8)SISGDLHII(SEQ ID NO：37)  5
  HER-2/neuEGFR   861 VMAGVGSPYV(SEQ ID NO：16)VAASVDNPHV(SEQ ID NO：38)  5
  HER-2/neuEGFR   863 ELVSEFSRM(SEQ ID NO：18)ELIIEFSKM(SEQ ID NO：39)  3
  HER-2/neuEGFR   826 CLTSTVQLV(SEQ ID NO：7)CLTSTVQLI(SEQ ID NO：40)  1
  HER-2/neuEGFR   689-697 RLLQETELV(SEQ ID NO：41)RLLQERELV(SEQ ID NO：42)  1
一旦在4周的活体外刺激方案之后产生了CTL，我们就评价使用免疫肽制备的HLA-A2.1四聚体分子是否提呈肽特异性细胞。如图13所示，产生肽特异性CTL的能力是供体依赖性的。在图A(供体261)中，供体对肽835产生强CTL应答(37.55％)。在图B(供体262)中，用835和861四聚体分子可检测到肽特异性CTL(分别为3.6％和15.1％)。这支持在刺激方案结束时使用多种肽来保证肽特异性CTL。该活体外方案使得人们可以相对较容易地产生多种特异性CTL。
抗肽和抗肿瘤反应
完成全部活体外方案之后，评价产生的CTL的抗原特异性。为产生CTL，在第0天使果蝇细胞装载组合的4种HER-2肽。在4周活体外刺激方案结束时，评价整批CD8培养物的抗原特异性。装载每种免疫性肽的T2细胞用作靶细胞。在图14中，图示了典型的反应。整批培养物含有对4种HER-2肽每一种的特异性。用卵巢肿瘤细胞系(ATCC；HTB-77)评价抗肿瘤反应。当靶细胞系不是HLA-A2.1限制性细胞系时，我们将细胞系转染为具有+/-测定***。当将HLA-A2.1转染入HTB-77细胞系中时，观测到CD8效应细胞的杀伤作用增强(图15，图A-D)。评价代表各个肽的HER-2特异性效应细胞，以证实将每种肽表位都提呈至该肿瘤细胞系。
还评价了用HLA-A2.1转染的乳腺癌细胞系(ATCC，HTB-131)显示HER-2特异性肽效应细胞溶解肿瘤的能力。当用HLA-A2.1转染时，肽861特异性CTL可以溶解该肿瘤细胞系(图16)。
肿瘤细胞裂解需要IFNγ处理
HTB-77/A2.1细胞系需要用IFNγ预处理，以显示肽特异性裂解。在51Cr-释放测定开始前24小时用500U/ml IFNγ(比活25ng/ml)处理细胞。在图17中，加入IFNγ导致HLA-A2.1转染细胞系的裂解增强。为测定该剂量IFNg对HLA-A2.1和HER-2二者表面表达的影响，进行FACS分析，以测定诱导24小时和48小时后这些分子的水平。图18的图A和B显示了FACS分析结果。在图A中，用IFNg诱导后24和48小时HTB-77细胞表面上的HER-2分子没有增加。在HLA-A2.1转染细胞中，在相似处理方法之后HER-2和HLA-A2.1的表面表达水平都没有显示增加。要注意的是，当通过微阵列DNA芯片分析评价mRNA水平时(图19)，TAP-1以及HLA-DM和HLA-DR、组织蛋白酶S和D以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶5(Caspase 5)的表达水平增加。这应当可以解释为什么HTB-77/A2.1细胞的杀伤作用在IFNγ存在下增强。这种特殊分子的上调导致HER-2分子的加工更有效，使得可以更好地提呈目的肽。
肽
使用肽合成仪(Gilson Company，Inc.)，通过标准Fmoc化学制备合成肽。通过C-8柱反向HPLC将所有肽都纯化至大于95％纯度。使用电喷离子化质谱确定纯度和身份。黑素瘤相关肽包括：MART-1特异性的肽819(AAGIGILTV SEQ ID NO：6)、都是gp100肽的肽817和853(分别为ITDQVPFSV SEQ ID NO：4和KTWGQYWQV SEQ IDNO：5)、酪氨酸特异性的肽689和792，其中肽689是天然序列(YMNGTMSQV SEQ ID NO：1)，肽792是天然序列的翻译后修饰型(YMDGTMSQV SEQ ID NO：2)。肽826(CLTSTVQLV SEQ ID NO：7)和835(KIFGSLAFA SEQ ID NO：8)分别代表p185蛋白胞内和胞外结构域的HER-2/neu序列。Pec6020(ALALAALLVV SEQ ID NO：10)和Pec6025(ALLVVDREV SEQ ID NO：11)是重叠序列，代表在卵巢肿瘤细胞系中检测到的粘蛋白。C-凝集素也是一种在卵巢肿瘤细胞系中检测到的蛋白，由其序列获得的肽(C-凝集素8)以KMASRSMRL SEQ ID NO：9表示。
体外细胞毒性测定
进行标准51Cr-释放测定，以确定T2细胞上装载的黑素瘤相关肽表位的CTL效应细胞识别情况。使收获的3×106T2细胞在RPMI+10％FBS(培养基)中生长。加入0.1mCi的51Cr，在37℃水浴中温育。将标记细胞加入到10ml 4％清洗液(RPMI+4％FBS)和沉淀中，再清洗两次，用培养基重悬浮至终浓度为0.2×106/ml，记录自发裂解细胞/去污剂裂解细胞的放射性。用合适的肽以20μg/ml、30分钟脉冲刺激细胞。在96孔板的每个孔中加入50μl，每个孔含有10、2、0.4和0.08×106/ml的CD8效应细胞，将该板于37℃温育6小时，离心收获上清液。
流式细胞仪和四聚体染色
采用缀合FITC或PE的单克隆抗体，通过在FACS缓冲液(1％BSA、0.02％NaN3的PBS溶液)中于4℃温育30分钟，接着用相同缓冲液清洗，标记细胞。用0.5％甲醛固定细胞，然后用FACScan流式细胞仪(Becton Dickison)及其CellQuest软件进行数据采集和分析。用用于标记纯化一抗的相同二抗检测非特异性染色，或者当一抗为直接标记时用同种型匹配的对照检测非特异性染色。用作为阴性对照的具有序列SLYVTVATL SEQ ID NO：43的HLA-A2.1特异性HIVgag四聚体分子(Beckman Coulter)进行四聚体染色。制备的HER-2特异性四聚体肽序列为CLTSTVQLV(826 SEQ ID NO：7)、KIFGSLAFL(835 SEQ ID NO：8)或VMAGVGFSPYV(861 SEQ IDNO：16)。如包装说明书所述，PE标记的四聚体HLA-A2.1-肽复合物和异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的抗人CD8a(BD PharMagin)单克隆抗体联合用于染色表位特异性CD8+T细胞。用Becton DisckensonFACScan的双色流式细胞仪分析样品，并检测选通的CD8+T细胞的四聚体HLA-A2.1-肽复合物染色情况。
                      实施例4
用该活体外刺激方法产生其它的乳癌和卵巢癌特异性CTL
我们证实了对不同肿瘤来源的几种肿瘤抗原的所有已知HLA-A2.1-限制性肽表位产生CTL应答的能力。我们最初的研究集中于黑素瘤，对于黑素瘤我们能够证明在用CTL治疗的患者中产生目标临床应答，其中所述CTL对4种不同的肽表位是特异性的，具体为MART-1、gp100和酪氨酸酶、黑素瘤相关蛋白[ Richards等，Amer.Soc.Clin.Oncol.，San Francisco，California(2001年5月)]。
为将该能力扩展至产生针对在各种各样的其它肿瘤中存在的其它肿瘤抗原的CTL，我们选择了公开序列和新序列为几种不同类型肿瘤共有的肿瘤抗原。这些抗原包括AES、MUC-1、CEA、FBP、C-凝集素、NY-ESO-1、Pec60、CA-125、MAGE-3、端粒酶和G250。表7描述了这些抗原、其表达频率和表达这些抗原的癌症。用我们的活体外刺激方法产生的针对这些肽的应答频率列于表6。
                                                            表6
                                           正常供体对***和卵巢肽表位的应答频率
供体 879 893 894 899 900 901 902 903 906 907 908  909 910 911 912 913 914
248 + + +
249 + + +
250 + - +
251 - - +
252 + - +
253 - - + +
254 + - + +
255 - + + - + + + +
256 + - + + + + - +
257 + + +
259 + - -
260 - - - - +
261 + + + +
262 + + - + -
265 + + + + - - - - + + + -
                                 表7
                            肿瘤抗原描述
抗原 描述
CA-125 癌症抗原125是一种由卵巢瘤和某些卵巢细胞系表达的上皮细胞标记。大约85％的卵巢癌患者血清CA125增加，因此CA125通常用作血清肿瘤标记(Cancer Letters(1999年10月)145(1-2)133-141页)
MUC-1 粘液素是一种在正常和恶性上皮都表达的跨膜糖蛋白。未糖基化形式的MUC-1在许多人腺癌(例如乳癌和卵巢癌)以及血液恶性病(多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤)的细胞表面过表达(Blood(1999年6月)93(12)4309-4317页)
G250 一种肾细胞癌相关抗原，在85％的RCC中表达，但不在正常的肾
组织中表达。它与肿瘤相关性抗原MN/CAIX相同，MN/CAIX在大约50％的侵袭性乳癌中表达(Cancer Research(1999年11月)；59(21)5554-5559页)
FBP 叶酸结合蛋白是一种参与叶酸转运的受体。其在超过90％的卵巢肿瘤和20-50％的乳癌中过表达(Anticancer Research(1999年7-8月)19(4B)2907-2916页)
HER-2/neu 一种编码跨膜蛋白(序列和结构类似于EGF-R)的原癌基因(HER-2)。HER-2/neu在乳癌和卵巢肿瘤中过表达，是正常组织的200倍。其还可见于肾细胞癌和肺癌(J.Exp.Med.(1995年6月)181卷2109-2117页)
NY-ESO-1 一种癌症-睾丸抗原，可见于30％的乳癌、***癌和卵巢癌、肺癌、膀胱癌、头颈癌和黑素瘤。具有表达该种抗原的肿瘤的癌症患者通常也具有对抗其的循环抗体(J.Immunology(2000)165卷948-955页)
CEA 癌胚抗原是一种肿瘤相关抗原，经常在上皮肿瘤(结肠、***、肺)中表达。血清中CEA水平可能与病况有关，其用于监测疾病的治疗和复发(Human.Immunology(1998)59卷1-14页)
MAGE-3 一种癌症-睾丸抗原，在70-80％的转移性黑素瘤病灶和细胞系中表达。其是黑素瘤相关蛋白或MAGE蛋白家族一员。另外，MAGE-3可见于20-60％的上皮肿瘤(结肠癌、乳癌、肺癌、胃癌)。(Human.Immunology(1998)59卷1-14页)
AES 剪接蛋白氨基增强物是由剪接基因增强子编码的一组翻译抑制物的一部分。在卵巢癌和乳癌的肿瘤相关淋巴细胞中鉴定出该肿瘤抗原。(Molecular.Immunology(1998)35(17)1121-1133页)
HTR 端粒酶(hTR)是一种特定类型的反转录酶(hTRT或hTERT)，其催化端粒DNA的合成和延伸。该酶的活性在所有人类肿瘤的大约90％中升高，包括乳癌、甲状腺癌、膀胱癌、子***、***癌、结肠癌、胰腺癌和胃癌。(Cancer Research(2001年12月)61(23)8366-8370页)
                                序列表
<110>Moriarty，Ann
    Leturcq，Didier
    Degraw，Juli
    Heiskala，Marja
    Peterson，Per
    Jackson，Michael
<120>用于***的细胞疗法
<130>ORT-1557
<160>42
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>1
Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val
1               5
<210>2
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>2
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1               5
<210>3
<211>10
<212>蛋白
<213>人
<400>3
Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu
1               5                   10
<210>4
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>4
Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val
1               5
<210>5
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>5
Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val
1               5
<210>6
<211>8
<212>蛋白
<213>人
<400>6
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1               5
<210>7
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>7
Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val
1               5
<210>8
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>8
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1               5
<210>9
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>9
Lys Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu
1               5
<210>10
<211>10
<212>蛋白
<213>人
<400>10
Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Val Val
1               6                   10
<210>11
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>11
Ala Leu Leu Val Val Asp Arg Glu Val
1               5
<210>12
<211>12
<212>蛋白
<213>人
<400>12
Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly
1               5                   10
<210>13
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>13
His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
1               5
<210>14
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>14
Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
1               5
<210>15
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>15
Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val
1               5
<210>16
<211>10
<212>蛋白
<213>人
<400>16
Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val
1               5                   10
<210>17
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>17
Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val
1               5
<210>18
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>18
Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met
1               5
<210>19
<211>8
<212>蛋白
<213>人
<400>19
Gly Pro Leu Thr Pro Leu Pro Val
1               5
<210>20
<211>8
<212>蛋白
<213>人
<400>20
Ser Thr Ala Pro Val His Asn Val
1               5
<210>21
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>21
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu
1               5
<210>22
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>22
Glu Ile Trp Thr His Ser Tyr Lys Val
1               5
<210>23
<211>10
<212>蛋白
<213>人
<400>23
Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr
1               5                   10
<210>24
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>24
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1               5
<210>25
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>25
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1               5
<210>26
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>26
Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr
1               5
<210>27
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>27
Tyr Leu Glu Thr Phe Arg Glu Gln Val
1               5
<210>28
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>28
Val Leu Leu Lys Leu Arg Arg Pro Val
1               5
<210>29
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>29
Gly Leu Gln Ser Pro Lys Ser Pro Leu
1               5
<210>30
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>30
Glu Leu Tyr Ile Pro Ser Val Asp Leu
1               5
<210>31
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>31
Lys Ala Leu Phe Ala Gly Pro Pro Val
1               5
<210>32
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>32
Phe Met Trp Gly Asn Leu Thr Leu Ala
1               5
<210>33
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>33
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1               5
<210>34
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>34
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu
1               5
<210>35
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>35
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val
1               5
<210>36
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>36
His Leu Ser Thr Ala Phe Ala Arg Val
1               5
<210>37
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>37
Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Ile
1               5
<210>38
<211>10
<212>蛋白
<213>人
<400>38
Val Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val
1               5                   10
<210>39
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>39
Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met
1               5
<210>40
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>40
Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile
1               5
<210>41
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>41
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val
1               5
<210>42
<211>9
<212>蛋白
<213>人
<400>42
Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val
1               5

Claims (23)

1.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的所述癌症相关肽分子，其中所述肽分子每个约6-12个氨基酸长
b.收集所述患者或合适供体的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞；
d.将所述CD8+细胞加入含选自IL-2、IL-7的细胞因子的培养基中或条件生长培养基(CGM)中，其中所述细胞因子可单独或组合使用；
e.将收集自所述患者或合适供体的非悬浮外周血单核细胞或者去除了CD-8的外周血单核细胞与1-50μg/ml的一种所述nnAPC可同时提呈的所述肽混合；
f.用剂量必须足以杀死悬浮液中需要的外周血单核细胞除外的所有组分的γ-射线照射所述外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约1μg/ml至50μg/ml的所述每种肽装载至所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.用CD8+悬浮液接种所述患者。
2.权利要求1的方法，其中所述nnAPC能够提呈高达约10种肽分子。
3.权利要求1的方法，其中所述肽分子约8-10个氨基酸长。
4.权利要求1的方法，其中所述肽分子的浓度范围为约10nM至100μM。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞因子组分是IL-2。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞因子组分是联合应用的IL-2和IL-7。
7.权利要求1的方法，其中所述γ-辐射的剂量约为3,000-7,000rad。
8.权利要求1的方法，其中所述γ-辐射的剂量约为5,000rad。
9.一种治疗癌症患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的所述癌症相关肽分子；
b.收集所述患者的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞约6-7天；
d.用含IL-2和IL-7的培养基刺激所述CD8+细胞；
e.混合收集自所述患者的外周血单核细胞和约20μg/ml的每种肽；
f.用约5,000rad的γ-射线照射所述去除了CD8的外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约1μg/ml至50μg/ml的所述表位装载至所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.用含IL-2和IL-7的培养基刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的悬浮液；
l.测定CD8+悬浮液的合适CTL活性、纯度、无菌性和内毒素含量；
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
10.权利要求9的方法，其中每种肽约8-10个氨基酸长。
11.一种治疗黑素瘤患者的方法，该方法包括：
a.制备一种非天然抗原提呈细胞系(nnAPC)，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约15种不同的所述黑素瘤相关肽分子，其中每种肽为8-10个氨基酸长；
b.收集所述患者的CD8+细胞；
c.用所述nnAPC细胞系刺激所述CD8+细胞约6-7天；
d.用含IL-2和IL-7的培养基刺激所述CD8+细胞；
e.混合收集自所述患者的外周血单核细胞和约20μg/ml的所述nnAPC可提呈的每种肽；
f.用约5,000rad的γ-射线照射所述去除了CD8的外周血单核细胞悬浮液；
g.分离粘附外周血单核细胞；
h.将约1μg/ml至50μg/ml的所述表位装载至所述粘附外周血单核细胞；
i.以约10个CD8+细胞/1个外周血单核细胞的比率混合所述CD8+细胞和所述粘附外周血单核细胞；
j.刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的混合悬浮液约6-7天；
k.用含IL-2和IL-7的培养基刺激所述CD8+细胞和外周血单核细胞的悬浮液；
l.测定CD8+悬浮液的合适CTL活性、纯度、无菌性和内毒素含量；
m.用CD8+悬浮液接种所述患者。
12.权利要求11的方法，其中所述nnAPC提呈10种肽。
13.权利要求12的方法，其中所述肽是酪氨酸酶369-377、酪氨酸酶207-216、gp100209-217、gp100154-162、MART-127-35、HER-2/neu789-797、HER-2/neu369-377、C-凝集素8-16、Pec6020-29和Pec6025-33。
14.一种非天然抗原提呈细胞(nnAPC)，该细胞得自用表达人I类HLA分子、结合分子和共刺激分子的核酸感染的果蝇(Drosophilamelanogaster)细胞，其中所述nnAPC能够同时提呈高达15种不同的由所述核酸编码的肽分子。
15.权利要求14的非天然抗原提呈细胞nnAPC，其中所述nnAPC能够同时提呈高达约10种不同的肽分子。
16.权利要求15的非天然抗原提呈细胞nnAPC，其中所述nnAPC同时提呈以下10种肽分子：酪氨酸酶369-377、酪氨酸酶207-216、gp100209-217、gp100154-162、MART-127-35、HER-2/neu789-797、HER-2/neu369-377、C-凝集素8-16、Pec6020-29和Pec6025-33。
17.一种生产能够同时提呈高达15种肽分子的非天然抗原提呈细胞(nnAPC)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用果蝇卵制备昆虫细胞系；
b.使所述昆虫细胞在适于培养昆虫细胞的培养基中生长，所述培养基优选SchneiderTM果蝇培养基；
c.用pRmHa-1表达载体制备pRmHa-3质粒，其中所述pRmHa-3质粒包括金属硫蛋白启动子、金属效应共有序列和携带有分离自果蝇的聚腺苷酸化信号的乙醇脱氢酶基因；
d.将人I类HLA分子A2.1、B7.1、B7.2、ICAM-1、β-2微球蛋白和LFA-3的互补DNA***到所述pRmHa-3质粒中，其中A2.1可用任何人I类DNA序列取代；
e.用phshneo质粒和所述含互补DNA的pRmHa-3质粒转染所述昆虫细胞；
f.通过使所述昆虫细胞接触CuSO4以诱导转染基因在所述昆虫细胞中表达来制备nnAPC。
18.权利要求17的方法，其中所述nnAPC能够提呈高达10种肽。
19.权利要求17的方法，其中所述昆虫细胞系的制备方法是培养细胞12天、用能够鉴定目的细胞的肽选择目的细胞并用OKT3和IL-2扩增所述目的细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述能够鉴定所述目的细胞的肽是四聚体。
21.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)的肽分子选自具有SEQID NO：1-42氨基酸序列的肽。
22.权利要求9的方法，其中所述步骤(a)的肽分子选自具有SEQID NO：1-42氨基酸序列的肽。
23.权利要求17的方法，其中所述步骤(a)的肽分子选自具有SEQID NO：1-42氨基酸序列的肽。
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