CN1570092A - 碱性蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供选自序列号1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相当于所述位点的氨基酸残基是下述氨基酸残基的碱性蛋白酶及其编码基因：(a)位点：丝氨酸、(b)位点：组氨酸、(c)位点：精氨酸、(d)位点：丝氨酸、(e)位点：酪氨酸、(f)位点：缬氨酸、(g)位点：丝氨酸。所提供的蛋白酶不仅对复合污渍具有良好的洗净效果还提高了耐热性。

Description

碱性蛋白酶
技术领域
本发明涉及碱性蛋白酶及其编码基因。
背景技术
蛋白酶早已在工业领域有所应用，由起初作为衣料洗涤剂到后来涉及纤维改性剂、皮革处理剂、化妆品、浴液、食品改性剂或医药用品方面的多种不同用途。其中，最大量工业化生产的是洗涤剂用蛋白酶，已知的例如：Alcalase、Savinase(注册商标；Novozymes)、Maxacal(注册商标；Genencor)、Blap(注册商标；Henkel)以及KAP(花王公司)等。
向洗涤剂中混入蛋白酶的目的在于分解附着于衣料上的蛋白质污渍，实际的污渍不仅是蛋白质，还有来自皮脂的脂质和固体颗粒等以及混入了有机物和无机物的含有多种成分的复合污渍，因此需要获得对这种复合污渍具有强洗净效果的洗涤剂。
基于这样的观点，本发明人发现了数种即使在高浓度脂肪酸存在下也可保持对酪蛋白具有充分分解活性的碱性蛋白酶，所述的碱性蛋白酶不仅对蛋白质，对混有皮脂等的复合污渍也具有良好的洗净性，分子量约为43,000，并已在先申请了专利(国际公开号99/18218)。这一组碱性蛋白酶在分子量、一级结构、酶学性质，特别是对氧化剂具有很强耐性的方面与现有技术中已知来自芽孢杆菌属细菌的属于丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶不同，经提议分为新的枯草杆菌蛋白酶亚科(Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，313-319，2000)。
为将这种蛋白酶与洗涤剂混合，将培养液浓缩后要有干燥、颗粒化工序而且需要注意防止其在洗涤剂的保存过程中失活。此外还发现改变编码这种蛋白酶的基因后所得的比活性和产量增加的突变体，与突变前相比耐热性下降了。即要解决上述问题需要提高酶的耐热性。
因此，本发明提供既对复合污渍具有良好洗净性、又提高了耐热性的碱性蛋白酶。
发明内容
本发明的发明人对既保持上述碱性蛋白酶的特性，又提高了耐热性的新的酶进行探索的过程中，发现对于某种碱性蛋白酶而言，其氨基酸序列中特定位点的特定氨基酸残基是必要的。
即，本发明提供选自序列号1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位，或相当于所述位点的氨基酸残基是下述氨基酸残基的碱性蛋白酶及其编码基因：
(a)位点：丝氨酸、
(b)位点：组氨酸、
(c)位点：精氨酸、
(d)位点：丝氨酸、
(e)位点：酪氨酸、
(f)位点：缬氨酸、
(g)位点：丝氨酸。
此外，本发明还提供含有该基因的载体、含有所述载体的转化子。
再有，本发明还提供含有该碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图的简要说明
图1是与序列号1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的蛋白酶氨基酸序列的排列图。
图2是显示本发明的碱性蛋白酶在硼酸缓冲液(pH10，50mM)中、70℃处理10分钟时耐热性提高示意图。
图3是显示本发明的碱性蛋白酶在2mM氯化钙中、80℃处理10分钟时耐热性提高示意图。
本发明的最佳实施方式
如上所述，本发明的碱性蛋白酶是在选自序列号1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位，或相当于所述位点的氨基酸残基是下述氨基酸残基的碱性蛋白酶：(a)位点：丝氨酸、(b)位点：组氨酸、(c)位点：精氨酸、(d)位点：丝氨酸、(e)位点：酪氨酸、(f)位点：缬氨酸、(g)位点：丝氨酸。
也就是说，本发明的碱性蛋白酶是指：由序列号1所示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中上述选自(a)～(g)位点的氨基酸残基、或其他碱性蛋白酶氨基酸序列中相应于上述位点的氨基酸残基是特定氨基酸残基的蛋白酶，野生型、野生型的突变体或人工突变体均可。
此处所述的“其他碱性蛋白酶”可以是野生型或野生型的突变体、耐氧化剂、优选通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)法测得的分子量为43,000±2,000，例如由与序列号1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶。特别优选与序列号1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的、能在pH8或更高的碱性环境下起作用、耐氧化剂、50℃pH10条件下处理10分钟时活性可残留80％或更高的、受二异丙基氟磷酸(DFP)和苯基甲磺酰氟化物(PMSF)的抑制、SDS-PAGE测定的分子量为43,000±2,000的酶。此处所述的耐氧化剂是指所述的碱性蛋白酶在含有50mM过氧化氢、5mM氯化钠的Britton-Robinson缓冲液(pH 10)中，30℃下放置20分钟后残留活性至少保持在50％以上。
此处所述的“由序列号1所示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶”例如KP43[来自芽孢杆菌-KSM-KP43(FERM BP-6532)、国际公开号99/18218]、“由与序列号1所示氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶”例如，蛋白酶KP9860(GenBank登录号AB046403)[来自芽孢杆菌种-KSM-9860(FERM BP-6534)、国际公开号99/18218]、蛋白酶9865(GenBank登录号AB084155)[来自芽孢杆菌种-KSM-9865(FERMP-1592)、特愿2002-002653]、蛋白酶E-1(GenBank登录号AB046402)[来自芽孢杆菌No.D-6(FERMP-1592)、特开昭49-71191号公报]、蛋白酶Ya(GenBank登录号AB046404)[来自芽孢杆菌种-Y(FERM BP-1029)、特开昭61-280268号公报]、蛋白酶SD521(GenBank登录号AB046405)[来自芽孢杆菌SD521(FERM P-11162)、特开平3-191781号公报]、蛋白酶A-1(GenBank登录号AB046406)[来自NCIB12289、国际公开号88/01293号]、蛋白酶A-2[来自NCIB12513、国际公开号98/56927号]、特开2002-218989号公报、特开2002-306176号公报记载的突变蛋白酶、序列号1所示的氨基酸序列中第251位分别被天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺替代的突变体、第256位分别被丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸或丙氨酸替代的突变体(特愿2001-329472号)、序列号1所示的氨基酸序列中第65位由脯氨酸替代的突变体、101位由天冬酰胺替代的突变体、273位分别由异亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸替代的突变体、320位分别由苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甘氨酸替代的突变体、359位分别由丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺替代的突变体、387分别由丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或组氨酸替代的突变体(特愿2002-304230号)、序列号1所示氨基酸序列的第163位由组氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或缬氨酸替代的突变体、第170位由缬氨酸或亮氨酸替代的突变体、第171位由丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、或苏氨酸替代的突变体(特愿2002-304231号)或与以上氨基酸序列具有80％或更高、优选87％或更高、较优选90％或更高、更优选95％或更高同源性的碱性蛋白酶。
此外，氨基酸序列的同源性根据Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)计算。
此外，确定“相应于该位点的氨基酸残基”的方法可以是，例如通过Lipman-Pearson法等公知的算法对氨基酸序列进行比较、得出与存在于各碱性蛋白酶氨基酸序列中的保守性氨基酸残基间的最大同源性。按上述方法排列蛋白酶氨基酸序列，不涉及氨基酸序列中的***、缺失，可以确定相同的氨基酸残基在不同蛋白酶序列中的位点。一般认为所述相同的位点也存在于三级结构中相同的位点，可以推定其具有与被研究的蛋白酶的相关特异功能类似的效果。
即，根据用上述方法排列的氨基酸序列组成的图1，(a)序列号1所示的氨基酸序列中第63位的氨基酸残基是精氨酸残基，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶KP9860中第63位的精氨酸残基。优选该氨基酸残基是丝氨酸残基。
(b)序列号1所示的氨基酸序列中第89位的氨基酸残基是谷氨酰胺，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶E-1中第88位的谷氨酰胺残基。优选该氨基酸残基是组氨酸残基。
(c)序列号1所示的氨基酸序列中第120位的氨基酸残基是丝氨酸残基，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶A-2中第119位的丝氨酸残基。优选该氨基酸残基是精氨酸残基。
(d)序列号1所示的氨基酸序列中第63位和第187位的氨基酸残基天冬酰胺残基，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶SD-521中第63位的天冬酰胺残基和第186位的天冬酰胺残基残基。优选所述氨基酸残基都是丝氨酸残基。
(e)序列号1所示的氨基酸序列中第226位的氨基酸残基是苯丙氨酸残基，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶Ya中第225位的苯丙氨酸残基。优选该氨基酸残基是酪氨酸残基。
(f)序列号1所示的氨基酸序列中第296位的氨基酸残基是异亮氨酸残基，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶9865中第296位的异亮氨酸残基。优选该氨基酸残基是缬氨酸残基。
(g)序列号1所示的氨基酸序列中第304位的氨基酸残基是天冬酰胺残基，此处，相应于该位点的氨基酸残基用上述方法可以推定为，例如蛋白酶E-1中第303位的天冬氨酸残基。优选该氨基酸残基是丝氨酸残基。
(表1)显示出适用于上述“其他碱性蛋白酶”中的、相应于蛋白酶KP43的氨基酸序列(序列号1)的(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位和187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位的位点以及氨基酸残基的具体例子。
表1
位置                                      蛋白酶
KP43  KP9860  9865  E-1  Ya  SD-521  A-1  A-2
(a) Asn63  Asn63  Asn63  Asn63  Ser63  Asn63  Asn63  Asn63
(b) Gln89  Gln89  Gln89  Gln88  Gln88  Gln88  Gln89  Gln88
(c) Ser120  Ser120  Ser120  Asn119  Asn119  Asn119  Ser120  Ser119
(d) Asn63，Asn187  Asn63，Asn187  Asn63，Asn187  Asn63，Asn186  Asn63，Asn186  Asn63，Asn186  Asn63，Asn187  Asn63，Asn186
(e) Phe226  Tyr226  Phe226  Phe225  Phe225  Phe225  Phe226  Tyr225
(f) Ile296  Val296  Ile296  Val295  Val295  Val295  Ile296  Val295
(g) Asn304  Asn304  Asn304  Asp303  Asp303  Asp303  Asn304  Asn303
此外，在不使酶活性及酶学特性发生变化的范围内，优选本发明的碱性蛋白酶氨基酸序列中的(a)～(g)的选择在两个以上位点同时进行。两个位点以上同时进行的情况中的优选实例如下所示。
作为双重替代物的例子如Asn63Ser+Asn187Ser、Asn63Ser+Ile296Val、Asn187Ser+Ile296Val、Ser120Arg+Phe226Tyr等，特别优选Asn63Ser+Asn187Ser。三种或三种以上的组合也可以。
本发明的碱性蛋白酶是突变体时，作为突变前的碱性蛋白酶(往往称作亲代碱性蛋白酶)的是“由序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白酶”或上述的“其他碱性蛋白酶”所表示的蛋白酶，对这些蛋白酶的目的部位进行突变可得到本发明的碱性蛋白酶。例如蛋白酶KP43序列号1所示的氨基酸序列中前述(a)～(g)位点的氨基酸残基、或是碱性蛋白酶氨基酸序列中相应于上述位点的氨基酸残基被其他的氨基酸残基替代所得。
本发明的碱性蛋白酶也可由下述方法获得。即对所克隆的亲代碱性蛋白酶编码基因(序列号2：成熟酶区域，即序列号1的编码基因第619号密码子之后的部分所示的)进行突变，用所得的突变基因转化适当的宿主菌，培养经转化的宿主菌，再从培养物中收集所得。克隆亲代碱性蛋白酶的编码基因可以使用常规的基因转化技术，例如可以使用在国际公开号99/18218号、国际公开号第98/56927号中记载的方法。
有关对亲代碱性蛋白酶的编码基因的突变手段，通常应用的随机突变和定点诱变方法均可使用。更具体说来，可以使用例如“定点诱变***超突变表达Km试剂盒(Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit)”(Takara)。此外，也可以用重组体PCR(聚合酶链式反应)法(PCR方法，科学出版社，纽约，1990(PCR protocols，Academic press，New York，1990))、可将基因的任意序列用其他基因中与该任意序列相应的序列替代。
用所得的突变基因生产本发明的蛋白酶的方法，例如可采用将所述的突变基因与可使其稳定扩增的DNA载体相连，转化宿主菌，或将所述的突变体基因导入可使其稳定存在的宿主菌染色体DNA上等方法。满足上述条件的宿主菌例如：芽孢杆菌属的细菌、大肠杆菌、霉菌、酵母、放线菌等，将这些菌株接种到含同化碳源、氮源及其他必需营养元素的培养基中，通过常规方法培养。
按照常规的酶提取纯化方法从上述培养液中收集、纯化碱性蛋白酶。例如，将所述培养液离心分离、或过滤去除菌体，利用常规的纯化方法从上清液中收集目的酶。由上述方法所得的酶液可以直接使用，也可以通过公知的方法纯化、结晶化、粉末化或颗粒化。
所得的本发明的碱性蛋白酶具有耐氧化剂、对酪蛋白的分解活性不受高浓度的脂肪酸的抑制、SDS-PAGE测得的分子量43,000±2,000，在碱性环境下具有活性的同时，与亲代碱性蛋白酶相比获得了耐热性有提高的新性质。
因此，本发明的碱性蛋白酶可作为与各种洗涤剂组合物混合使用的酶。
向洗涤剂组合物中加入的本发明的碱性蛋白酶的混合量，只要可以显示出碱性蛋白酶活性，对所述的量没有特别地限制，每1kg洗涤剂组合物混合0.1～5000PU，从经济性等角度考虑优选500PU以下。
可将本发明的蛋白酶与其他的各种蛋白酶一起应用于本发明的洗涤剂组合物。例如水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶、连接酶、合成酶等。其中，优选本发明以外的蛋白酶、纤维素酶、角蛋白酶、酯酶、角质酶、淀粉酶、脂酶、支链淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、漆酶等，特别优选蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂酶。作为蛋白酶，例如市售的Alcalase、Esperase、Savinase、Everlase、Kannase(注册商标；Novozymes公司)、Properase、Purafect(注册商标；Genencor公司)以及KAP(花王公司)等。作为纤维素酶，例如Celluzyme、Carezyme(注册商标；Novozymes公司)、以及KAC、特开平10-313859号公报记载的芽孢杆菌种-KSM-S237菌株生产的碱性蛋白酶、特愿2002-116553号公报记载的突变碱性蛋白酶(以上为花王公司产品)。作为淀粉酶，例如Termamyl、Duramyl(注册商标；Novozymes公司)、Purastar(注册商标；Genencor公司)、以及KAM(花王公司)等。作为脂酶，例如Lipolase、Lipolase Ultra(注册商标；Novozymes公司)。
洗涤剂组合物中，与本发明的蛋白酶一起使用的本发明的蛋白酶之外的蛋白酶的混合量优选是每1kg洗涤剂组合物0.1～500PU。与纤维素酶共用时，根据特开平10-313859号公报第[0020]段中记载的酶活性测定方法确定的单位(KU)，优选每1kg洗涤剂组合物300～3000000KU。
与淀粉酶共用时，根据特开平11-43690号公报第[0040]段中记载的淀粉酶活性测定方法确定的单位(IU)、优选每1kg洗涤剂组合物50～500000IU。
与脂酶共用时，根据特表平8-500013号公报实施例1中记载的脂酶活性测定方法确定的单位(LU)，优选每1kg洗涤剂组合物10000～1000000LU。
可向本发明的洗涤剂组合物中混合公知的洗涤剂组分，所述的公知洗涤剂组分例如下述的物质。
(1)表面活性剂
向洗涤剂组合物中混入0.5～60质量％的表面活性剂、特别对粉末状洗涤剂组合物优选混入10～45质量％、对液体洗涤剂组合物优选混入20～50质量％。本发明的洗涤剂组合物作为漂白剂或自动餐具洗净机用洗涤剂时，其中的表面活性剂通常占1～10质量％，优选占1～5质量％。
作为用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂可以是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳离子表面活性剂中的一种或其组合，优选是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂。
作为阴离子表面活性剂优选碳原子数10～18的醇的硫酸酯盐、碳原子数8～20的醇的烷氧基化物的硫酸酯盐、烷基苯磺酸盐、链烷烃磺酸盐、α-链烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、α-磺基脂肪酸烷基酯盐或脂肪酸盐。在本发明中特别是，烷基链的碳原子数为10～14、优选12～14的直链烷基苯磺酸盐，作为抗衡离子优选碱金属盐或胺类、特别优选钠和/或钾、一乙醇胺、二乙醇胺。
作为非离子表面活性剂优选聚氧化烯烷基(碳原子数8～20)醚、烷基聚糖苷、聚氧化烯烷基(碳原子数8～20)苯基醚、聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸(碳原子数8～22)酯、聚氧化烯二醇脂肪酸(碳原子数8～22)酯、聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物。特别优选的非离子表面活性剂是碳原子数10～18的醇和4～20摩尔环氧乙烷、环氧丙烷等环氧化物加成[HLB值(Griffin法计算所得)10.5～15.0，优选11.0～14.5]所得的聚氧化烯基烷基醚。
(2)二价金属离子捕获剂
二价金属离子捕获剂的混合量为0.01～50质量％，优选5～40质量％。用于本发明洗涤剂组合物的二价金属离子捕获剂例如，三聚磷酸盐、焦磷酸盐、正磷酸盐等缩合磷酸盐、沸石等铝硅酸盐、合成层状结晶性硅酸盐、次氮基三乙酸盐、乙二胺四乙酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、聚醛缩羧酸盐等。其中特别优选结晶性铝硅酸盐(合成沸石)，A型、X型、P型沸石中特别优选A型。适于使用的合成沸石平均原始粒径0.1～10μm、特别适用的是0.1～5μm。
(3)碱性试剂
混合0.01～80％质量％、优选1～40质量％的碱性试剂。在粉末洗涤剂的情况下，可举出的例子如，统称为浓灰(dense ash)、轻灰的碳酸钠等碱金属碳酸盐，以及JIS 1号、2号、3号等非晶体碱金属硅酸盐。这些无机碱性试剂在洗涤剂干燥时对颗粒成形起作用，可以得到相对硬的流动性良好的洗涤剂。除此之外的碱例如，倍半碳酸钠、碳酸氢钠等。此外，三聚磷酸盐等也具有作为碱性试剂的作用。此外，作为用于液体洗涤剂的碱性试剂除上述之外也可以用氢氧化钠、以及单、二和三乙醇胺，也可以用作活性剂的抗衡离子。
(4)再污染抑制剂
混合0.001～10质量％、优选1～5质量％的再污染抑制剂。用于本发明的洗涤剂组合物的再污染抑制剂可举出的例如，聚乙二醇、羧酸类聚合物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。其中羧酸类聚合物除能防止再污染之外，还具有金属离子捕获功能，以及使固体颗粒污渍从衣料分散到洗涤液中的作用。适用的羧酸类聚合物是丙烯酸、异丁烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物，适用的共聚物是上述的单体和顺丁烯二酸的共聚物，分子量优选几千～10万。除上述的羧酸类聚合物之外，由于聚缩水甘油酸盐等聚合物、羟甲基纤维素等纤维素衍生物、以及聚天冬氨酸等氨基羧酸类聚合物也具有金属离子捕获剂、分散剂和防止再污染的功能，因此也是优选的。
(5)漂白剂
优选混入例如1～10质量％的过氧化氢、过碳酸盐等漂白剂。使用漂白剂时可混入0.01～10质量％的四乙酰乙二胺(TAED)、特开平6-316700中记载的漂白活化剂(活化因子)。
(6)荧光剂
可用于本发明洗涤剂组合物的荧光剂例如联苯型荧光剂(例如，TinopalCBS-X等)或二苯乙烯型荧光剂(例如DM型荧光染料等)。优选混入0.001～2质量％的荧光剂。
(7)其他组分
在本发明的洗涤剂组合物中可包含衣料用洗涤剂领域所公知的赋形剂、柔软剂、还原剂(亚硫酸盐等)、止泡剂(硅酮等)、香料以及其他的添加剂。
本发明的洗涤剂组合物可通过将经上述方法获得的本发明的蛋白酶与上述公知的洗净组分混合以常规的方法制造来获得。洗涤剂的形态可根据其用途来选择，例如液体、粉末、颗粒、糊浆、固体等。
所得的本发明的洗涤剂组合物可用作衣料洗涤剂、漂白剂、硬质表面用洗涤剂、排水管洗涤剂、假牙洗涤剂、医疗器具杀菌用洗涤剂。
实施例
实施例1
可以判断出来自芽孢杆菌种-KSM-KP43的碱性蛋白酶突变体Phe46Leu、Tyr195Gly以及Phe46Leu+Tyr195Gly对显著提高比活性是有效性的(特开2002-218989)。但是，将所述的突变体在70℃下处理15分钟时，亲本的碱性蛋白酶与处理前相比活性可残留70％-80％，而比活性提高的突变体活性仅残留5-25％。因此，对上述突变体的基因进行随机突变，获得耐热性提高的突变体。即，以导入了约2kb突变体结构基因的pKF18k(Takara)作为模板DNA(30ng)、Taq聚合酶(2.5U) BcaBEST测序引物RV-M和 BcaBEST测序引物M13-47(Takara；各20pmoL)、各种dNTP(各20pmoL)、Takara Taq扩增反应缓冲液、适量的硫酸镁和二甲亚砜进行PCR反应。PCR反应条件为94℃下使模板DNA变性1分钟后、94℃1分钟、55℃2分钟、72℃3分钟的一个循环后，再进行30个循环的反应，72℃下放置10分钟。
用高纯度PCR产物纯化试剂盒(罗氏公司)纯化导入了突变的PCR产物，然后用100μL无菌水溶解。用 BamHI、 XbaI(罗氏公司)对所得的2kbDNA片段进行酶切后，将其与用相同的酶处理的pKF18k混合，用DNA连接试剂盒(ver.2Takara)在16℃下进行12小时的连接反应。将反应液用乙醇沉淀回收DNA，转化大肠杆菌HB101。转化子在含有脱脂牛奶和卡那霉素的LB琼脂培养基上繁殖。
选择具有卡那霉素抗性且能形成脱脂牛奶溶解斑的转化子，接种到含有脱脂牛奶和卡那霉素的LB培养基中，37℃、72小时振荡培养。用合成基质法(后述)测定培养液上清的活性。即，对培养液上清经70℃处理15分钟所得的样品与未经处理的样品进行测定，研究经热处理后的残留活性。对与突变前相比耐热程度提高了10-50％的突变体进行PCR克隆，经基因扩增纯化后用Big DyeDNA测序试剂盒(Applied Biosystems)DNA测序仪377型(Applied Biosystems)确定碱基序列。结果获得了耐热性提高的突变体，在该突变体中63位的天冬酰胺被丝氨酸替代、89位的谷氨酰胺被组氨酸替代、120位的丝氨酸被精氨酸替代、187位的天冬酰胺被丝氨酸替代、226位的苯丙氨酸被酪氨酸替代、296位的异亮氨酸被缬氨酸替代、304位的天冬酰胺被丝氨酸替代、63位和187位的天冬酰胺被丝氨酸替代。
实施例2
将由实施例1所得的具有提高耐热性效果的突变位点分别导入序列号1所示的蛋白酶Kp43，为进行耐热性评价实施位点特异性突变。
用作导入突变的模板的质粒是通过：切割pKF18k多克隆位点中的 BamHI、XbaI位点，导入蛋白酶KP43的编码基因(序列号2)构建所得的。
用于导入位点特异性突变的PCR反应利用Takara LA Taq(Takara)进行。用于导入突变的5’末端磷酸化的选择引物(突变超表达Km试剂盒)以及引物1～7(序列号3～9)各20pmoL，模板质粒30ng进行导入突变的PCR反应。反应条件是：94℃下使模板DNA变性1分钟后，94℃1分钟、55℃1分钟、72℃4分钟的一个循环后，再进行30个循环的反应。纯化所得的PCR片段用作引物，与30ng模板质粒以及LA Tag再次进行PCR反应。反应条件为94℃1分钟、55℃2分钟、72℃4分钟的一个循环后，再进行30个循环的反应。纯化所得的PCR产物，经连接反应后转化大肠杆菌MV1184，获得导入突变的质粒。确定所得质粒中与碱性蛋白酶基因相关的碱基序列，确认突变部位。
此外，对各突变体的组合，可用上述突变体与引物1～7进行PCR制备二重突变体。
选择可在芽孢杆菌属细菌内复制的pHA64(特开2000-287687号公报：启动子64下游具有 BamHI、 XbaI切割位点)和芽孢杆菌种KSM-9865(FERM P-18566)作为适于生产及评价导入突变的碱性蛋白酶的体系。所得的导入了各种突变的质粒用 BamHI、 XbaI处理，与经同样的酶处理的pHA64混合后，用DNA连接试剂盒(ver.2 Takara)进行结合反应。乙醇沉淀后从连接反应液中回收DNA，即以后的转化用DNA。
KSM-9865菌株的转化子在含有脱脂牛奶的碱性琼脂培养基[脱脂牛奶(Difco)1％(w/v)、细菌用胰蛋白胨(Difco)1％、酵母抽提物(Difco)0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、碳酸钠0.05％、四环素15ppm]中繁殖，根据晕圈形成的情况判断是否导入了突变碱性蛋白酶基因。将转化子接种到5mL种子培养基中[6.0％(w/v)聚胨S、0.05％酵母抽提物、1.0％麦芽糖、0.02％的7水硫酸镁、0.1％的磷酸二氢钾、0.25％碳酸钠、30ppm四环素]，在30℃下振荡培养16小时。然后将1％的种子培养液(v/v)接种到30mL的主培养基[8％聚胨S、0.3％酵母抽提物、10％麦芽糖、0.04％的7水硫酸镁、0.2％的磷酸二氢钾、1.5％无水碳酸钠、30ppm四环素]在30℃下振荡培养3天。
实施例3
将培养物上清液分别在硼酸缓冲液(pH10.5：2mM氯化钙添加或不添加)、50mM tris-HCl缓冲液(pH7：2mM氯化钙添加或不添加)、或2mM氯化钙水溶液中60～80℃下处理10分钟，用酪蛋白法测定残留活性。求得相对于热处理前的活性残留率，任何一种突变体在上述各种条件下均比亲代碱性蛋白酶的残留活性提高，确定了其耐热性得以提高。结果如图2和3所表示的蛋白酶在一定温度下活性半衰期(残留活性达到50％的时间)，由此可以判断出在各种情况下其半衰时间均比亲代碱性蛋白酶提高了1.2～7倍。
上述所得的突变体、即碱性蛋白酶突变体除耐热性提高之外，保持了亲代碱性蛋白酶的特性，即具有耐氧化性、对酪蛋白的分解活性不受高浓度脂肪酸存在的影响、根据SDS-PAGE确定的分子量为43,000±2,000，在碱性条件下具有活性。
参考例
<碱性蛋白酶活性的测定方法(合成基质法)>
将0.05mL酶液添加到含有0.05mL 6mM合成基质(Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA：肽研究所)的100mM硼酸缓冲液(pH10.5)中开始反应。反应在微量培养板计数器(iEMS reader MF：LABSYSTEMS)内进行，30℃、15分钟恒温。以414nm下吸光度增加作为活性指标，以上述条件下吸光度每分钟增加0.001所需酶量作为1蛋白酶单位。
<蛋白酶活性测定法(酪蛋白法)>
1mL含酪蛋白(Hammerstein法：Merck公司)1％(w/v)的50mM硼酸缓冲液(pH10.5)在30℃下恒温5分钟后，添加0.1mL的酶液开始反应。反应15分钟后加入2mL的反应终止液(0.11M三氯乙酸/0.22醋酸钠/0.33M醋酸)。在室温下放置30分钟后用Waterman No1号滤纸过滤沉淀物。用Lowry等的方法对分解产物进行定量。即，向0.5mL的滤液中加入2.5mL的碱性铜溶液(1％Rochelle盐∶1％5水硫酸铜∶2％碳酸钠/0.1氢氧化钠＝1∶1∶100)30℃恒温10分钟后，加0.25mL苯酚试剂(关东化学)[市售的苯酚试剂在去离子水中稀释两倍所得的溶液]，充分搅拌，在30℃下放置30分钟。然后测定660nm下的吸光值。在上述反应条件下，1分钟内生成相当于1mmoL酪氨酸的酸可溶性蛋白质酸所需的酶量作为蛋白酶1单位(1PU)。
实施例4
(1)洗涤剂的配制
向带有搅拌翼的1m3混合槽中加入465kg水，当水温达到55℃后加入135g40％(w/v)的聚丙烯酸钠水溶液。搅拌15分钟后添加120kg碳酸钠、60kg硫酸钠、9kg亚硫酸钠、3kg荧光染料。再搅拌15分钟后，加入300kg沸石，再搅拌30分钟后可得到匀质的浆料(浆料中的水分为50质量％)。所述的浆料经设置于喷雾干燥塔塔顶附近的压力喷雾管嘴喷雾得到基质颗粒(向喷雾干燥塔提供的高温气体从塔下部225℃输入、从塔顶105℃排出)。
然后向Lodige mixer(松阪技研公司制造、容量20L、附套管)中投入100质量份的上述基质颗粒，在主轴搅拌下(150rpm)3分钟内投入20质量份非离子表面活性剂、22质量份的直链烷基(碳原子数10～13)苯磺酸钠、4质量份的脂肪酸钠(碳原子数14～18)、2质量份的聚乙二醇、4质量份的水的混合液，再搅拌5分钟。然后向搅拌器中投入20质量份的结晶性硅酸钠和10质量份的沸石，获得进行表面被覆的洗涤剂基质。
向99质量％的洗涤剂基质中混入0.5质量％的本发明的蛋白酶颗粒和0.5质量％的香料获得最终的颗粒状洗涤剂A。
(2)使用的原料
非离子表面活性剂：环氧乙烷平均加成摩尔数8.5的Emulgen 108KM(花王公司制造)
聚丙烯酸钠水溶液：平均分子量10000(按照特公平2-24283号公报中记载的实施例中所述方法制造)。
碳酸钠：浓灰(セントラル硝子公司制造)
沸石：平均粒径3.5μm的4A型沸石(东ソ一公司制造)
聚乙二醇：K-PEG6000(平均分子量8500，花王公司制造)
结晶性硅酸钠：粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)
本发明的蛋白酶颗粒：由图2和3中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品按照特开昭62-257990号公报中实施例1所述的方法制备成的颗粒化物(6PU/g)。
荧光染料：Tinopal CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)。
实施例5
(1)洗涤剂的配制
将固形物占50质量％的料浆用250℃的热风喷雾干燥，获得聚丙烯酸钠(质量平均分子量10000)7质量％、碳酸钠26质量％、硫酸钠20质量％、氯化钠6质量％、荧光染料0.5质量％、沸石40质量％、水0.5质量％的基质颗粒。
然后向Lodige mixer(松阪技研公司制造、容量20L、附套管)中投入100质量份的上述基质颗粒，在主轴搅拌下(150rpm)3分钟内投入20质量份的非离子表面活性剂、22质量份的直链烷基(碳原子数10～13)苯磺酸钠、4质量份的脂肪酸钠(碳原子数14～18)、2质量份的聚乙二醇、4质量份的水的混合液，再搅拌5分钟。然后向搅拌器中投入20质量份的结晶性硅酸钠和10质量份的沸石，获得进行表面被覆的洗涤剂基质。
向95质量％的洗涤剂基质中混入2.8质量％的漂白剂颗粒、1.2质量％的漂白活性剂颗粒、0.5质量％的本发明的蛋白酶颗粒和0.5质量％的香料获得最终的颗粒状洗涤剂B。
(2)使用的原料
非离子表面活性剂：环氧乙烷平均加成摩尔数8.5的Emulgen 108KM(花王公司制造)
聚丙烯酸钠水溶液：平均分子量10000(按照特公平2-24283号公报中记载的实施例中所述方法制造)。
碳酸钠：浓灰(セントラル硝子公司制造)
沸石：平均粒径3.5μm的4A型沸石(东ソ一公司制造)
聚乙二醇：K-PEG6000(平均分子量8500，花王公司制造)
结晶性硅酸钠：粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)
本发明的蛋白酶颗粒：由图2和3中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品按照特开昭62-257990号公报中实施例所述的方法制备成的颗粒化物(6PU/g)。
荧光染料：Tinopal CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)。
漂白剂颗粒：碳酸钠.过氧化氢加成物(与特开2000-256699号公报中第[0019]段中所记载的漂白剂颗粒同样地制备)。
漂白活性剂颗粒：月桂酰氧基苯磺酸钠颗粒化物(与特开2000-256699号公报中第[0019]段中所记载的漂白剂颗粒同样地制备)。
实施例6
配制如表2所示的洗涤剂组合物(洗涤剂C和洗涤剂D)。
表2
成分 洗涤剂C(质量％) 洗涤剂D(质量％)
非离子表面活性剂1) 25.0 -
非离子表面活性剂2) 5.0 -
非离子表面活性剂3) 10.0 -
非离子表面活性剂4) - 9.0
非离子表面活性剂5) - 9.0
非离子表面活性剂6) - 2.5
阴离子表面活性剂7) 1.0 -
硅酮8) - 0.8
羧酸类聚合物9) 2.0 -
聚合物10) - 0.8
柠檬酸 0.2 -
氯化钙 0.05 -
单乙醇胺 4.0 -
三甘醇苯基醚 3.0 -
丙二醇 3.0 -
乙醇 2.0 2.0
亚硫酸钠 0.2 -
本发明的蛋白酶11) 0.5 1.0
香料 0.5 0.5
水 剩余 剩余
合计 100 100
使用浓度 20g/30L 40g/30L
洗净液pH 10.5 7.3
1)来自碳原子数12～14的仲醇的带有烷基的聚氧乙烯(平均7摩尔加成)烷基醚(Softanol 70，日本催化剂化学工业公司制造)
2)来自碳原子数12～14的仲醇的带有烷基的聚氧乙烯(平均12摩尔加成)烷基醚(Softanol 120，日本催化剂化学工业公司制造)
3)碳原子数10～14的直链伯醇与平均5摩尔EO、平均2摩尔PO、平均3摩尔EO顺次嵌段加成的产物。
4)环氧乙烯月桂基醚与平均8摩尔的EO加成的产物
5)环氧乙烯月桂基醚与平均11.5摩尔的EO加成的产物
6)Narrow range聚氧乙烯烷基(sec-C12/C13)醚
7)碳原子数10～14的直链烷基苯磺酸钠
8)酰胺/醚变性硅酮聚合物(东レ.ダゥコ一ニングシリコ一ン公司制造，BY16-906)
9)按照特开平10-60476号公报的第11页第6行～13行记载的方法合成的苯氧基聚乙二醇、丙烯酸、顺丁烯二酸共聚物(质量平均分子量10000、固形物占51.2％)
10)戊烯/顺丁烯二酸(50/50摩尔比)共聚物的钠盐(质量平均分子量7000)
11)图2和3所记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品(15PU/mL)
实施例7
下述表3所示的组成中，一边搅拌混合过碳酸钠和碳酸钠(浓灰)，一边添加聚丙烯酸钠40％水溶液，和直链烷基苯磺酸钠、或非离子表面活性剂、或月桂酰氧基苯磺酸钠。然后添加按照特开昭62-257990号公报的实施例1中记载的方法制备的本发明的碱性蛋白酶颗粒，搅拌至全部均一的程度，配制漂白剂。
表3
成分 漂白剂E(质量％) 漂白剂F(质量％)
过碳酸钠1) 72.0 72.0
碳酸钠(浓灰) 20.0 20.0
阴离子表面活性剂2) 2.0 -
非离子表面活性剂3) - 2.0
聚丙烯酸钠4) 1.0 1.0
月桂酰氧基苯磺酸钠 4.0 4.0
本发明的碱性蛋白酶5) 1.0 1.0
1)粒径500～700μm
2)碳原子数12～14的直链烷基苯磺酸钠
3)聚氧乙烯烷基醚(烷基的碳原子数12～14、EO的平均加成摩尔数12)
4)平均分子量8,000
5)图2和3中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品按照特开昭62-257990号公报中实施例1所述的方法制备成的颗粒化物(6PU/g)。
实施例8
配制如下述表4所示的全自动餐具清洗机用洗涤剂组合物(洗涤剂G、和H)。
表4
成分 洗涤剂G(质量％) 洗涤剂H(质量％)
Pluronic L-611) - 4.0
Softanol EP-70852) 4.0 -
柠檬酸三钠 - 30.0
三聚磷酸钠 30.0 -
过碳酸钠 20.0 20.0
碳酸钠 20.0 20.0
非结晶硅酸盐3) 10.0 10.0
AA-MA4) 4.0 4.0
硫酸钠 10.0 10.0
α-淀粉酶5) 1.0 1.0
本发明的碱性蛋白酶6) 1.0 1.0
1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2,000)
2)碳原子数12～14的仲醇的7摩尔环氧乙烯、和8.5摩尔的环氧丙烯加成物。
3)JIS 2号硅酸钠
4)丙烯酸-顺丁烯二酸共聚物
5)Duramyl 60T(注册商标；Novozymes公司制造)
6)图2和3中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品按照特开昭62-257990号公报中实施例所述的方法制备成的颗粒化物(6PU/g)。
实施例9
用下述表5中所示的各组分配制硬质表面用洗涤剂组合物(洗涤剂J)。
表5
成分 洗涤剂J(质量％)
阴离子表面活性剂1) 15.0
非离子表面活性剂2) 5.0
非离子表面活性剂3) 5.0
两性表面活性剂4) 7.5
两性表面活性剂5) 4.0
柠檬酸 1.0
聚丙二醇6) 2.0
乙醇 5.0
本发明的蛋白酶7) 1.0
香料、水、其他/pH调节剂 54.5
合计 100.0
1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸酯钠
2)聚氧乙烯(EOP＝8)烷基(C12)醚
3)烷基(C12)聚葡糖苷(缩合度1.3)
4)单长链叔烷基(C12)二甲基氧化胺
5)烷基(C12)羟基二甲基磺基甜菜碱
6)分子量10000
7)图2和3中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品(15PU/mL)。
实施例10
由上述的洗涤剂A(参照实施例2)所得的下述表6中记载的颗粒状洗涤剂。
表6
成分(质量％) 洗涤剂K 洗涤剂L 洗涤剂M 洗涤剂N
基于实施例2的洗涤剂基质 98.4 98.3 98.5 97.2
香料 0.5 0.5 0.5 0.5
本发明的蛋白酶1) 0.5 0.5 0.5 0.5
原有的蛋白酶2) 0.6 0.6
纤维素酶3) 0.7 0.7
脂酶4) 0.5 0.5
1)由表2中记载的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化样品按照特开昭62-257990号公报中实施例1所述的方法制备成的颗粒化物(6PU/g)。
2)基于特开昭62-257990号公报的实施例1中记载的方法，将特开平5-25492号公报中记载的蛋白酶K-16定为5PU/g。
3)KAC-500(注册商标，花王公司制造)
4)Lipolase 100T(注册商标，Novozymes公司制造)
本发明可以提供即使在高浓度脂肪酸存在下也具有充分分解活性、且耐热性提高了的碱性蛋白酶，所述的碱性蛋白酶不仅对蛋白质、对混有皮脂等的复合污渍也具有良好的洗净性。
                               序列表
<110>花王公司
<120>碱性蛋白酶
<130>P
<150>JP 2003-106708
<151>2003-04-10
<160>8
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>434
<212>PRT
<213>芽孢杆菌KSM-KP43
<400>1
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1                 5                  10                  15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
             20                  25                  30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
         35                  40                  45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
     50                  55                  60
Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly
 65                  70                  75                  80
Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
                 85                  90                  95
Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
            100                 105                 110
Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
        115                 120                 125
Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
    130                 135                 140
Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala
145                 150                 155                 160
Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
                165                 170                 175
Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
            180                 185                 190
Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
        195                 200                 205
Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
    210                 215                 220
Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe
225                 230                 235                 240
Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
                245                 250                 255
Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
            260                 265                 270
Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
        275                 280                 285
Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
    290                 295                 300
Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
                325                 330                 335
Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
            340                 345                 350
Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
        355                 360                 365
Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
    370                 375                 380
Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu
385                 390                 395                 400
Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
                405                 410                 415
Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
            420                 425                 430
Val Asn
<210>2
<211>1923
<212>DNA
<213>芽孢杆菌KSM-KP43
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1920)
<223>
<220>
<221>sig_肽
<222>(1)..(618)
<223>
<220>
<221>mat_肽
<222>(619)..()
<223>
<400>2
atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca        45
Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala
    -205                -200                -195
gcg att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt        90
Ala Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly
    -190                -185                -180
gca agg aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act        135
Ala Arg Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr
    -175                -170                -165
gat gct aaa ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct        180
Asp Ala Lys Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala
    -160                -155                -150
ttt ctg gtg gaa tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag        225
Phe Leu Val Glu Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln
    -145                -140                -135
aag aag ctt gaa aca gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc        270
Lys Lys Leu Glu Thr Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile
    -130                -125                -120
caa ttc aat gga cca att tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa        315
Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu
    -115                -110                -105
aaa aca ggg gca aag att ctc gac tac ata cct gat tat gct tac att    363
Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile
-100                    -95                 -90
gtc gag tat gag ggc gat gtt aag tca gca aca agc acc att gag cac    411
Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His
-85                 -80                 -75                 -70
gtg gaa tcc gtg gag cct tat ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag    459
Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln
                -65                 -60                -55
ctt ttc aca aaa ggg gca tca gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat    507
Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp
            -50                 -45                 -40
aca aag cag aaa aat aaa gag gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc    555
Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile
        -35                 -30                 -25
gca caa ttc gca ata agc aat gat gtg cta tat att acg gca aag cct    603
Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro
    -20                 -15                 -10
gag tat aag gtg atg aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat    651
Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp
-5              -1  1               5                   10
gtg gct cag agc agc tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg    699
Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala
            15                  20                  25
gtt gcc gat aca ggg ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat    747
Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His
        30                  35                  40
gaa gcc ttc cgc ggg aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg    795
Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr
    45                  50                  55
aat aat gcc aat gat acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc    843
Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser
60                  65                  70                  75
gta tta gga aac ggc tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat    891
Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn
                80                  85                  90
cta gtc ttc caa tct atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta    939
Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu
            95                  100                 105
cct tcg aat ctg caa acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc    987
Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala
        110                 115                 120
aga att cat aca aac tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca    1035
Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr
    125                 130                 135
aca gat tcc aga aat gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg    1083
Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr
140                 145                 150                 155
atc ctt ttc gct gcc ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt    1131
Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser
                160                 165                 170
gca cca ggc aca gct aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac    1179
Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn
            175                 180                 185
ctc cgc cca agc ttt ggg tct tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca    1227
Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala
        190                 195                 200
cag ttc tct tca cgt gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat    1275
Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp
    205                 210                 215
gtc atg gca ccg gga acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca    1323
Val Met Ala Pro Gly Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala
220                 225                 230                 235
ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg    1371
Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met
                240                 245                 250
ggt gga acg tcc atg gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag    1419
Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln
            255                 260                 265
ctt cgt gag cat ttt gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct    1467
Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser
        270                 275                 280
cta tta aaa gcg gca ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc    1515
Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly
    285                 290                 295
tac ccg aac ggt aac caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc    1563
Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser
300                 305                 310                 315
ctg aac gtt gcc tat gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa    1611
Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln
                320                 325                 330
aaa gcg acg tac tcg ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc    1659
Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile
            335                 340                 345
tcc ctg gta tgg tct gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg    1707
Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr
        350                 355                 360
ctt gtc aat gat ctg gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag    1755
Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln
    365                 370                 375
tat gta gga aat gac ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc    1803
Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly
380                 385                 390                 395
cgc aat aac gta gaa aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg    1851
Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr
                400                 405                 410
tat aca att gag gta cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc    1899
Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr
            415                 420                 425
ttc tcg ttg gca att gtg aat taa                                    1923
Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn
        430
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cggacgaata atgccagtga tccgaatggt cat 33
<210>4
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aaaggaatgg cgcctcatgc gaatctagtc ttc 33
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ttcagccaag catacagtgc tggtgccaga att 33
<210>6
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gtcggagcta cggaaagcct ccgcccaagc ttt 33
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atggcaccgg gaacgtacat actatcagca aga 33
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gccggtgcag ctgacgtcgg ccttggctac ccg 33
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ggctacccga acggtagcca aggatgggga cga 33
KS0758(P2003-0163)
1
1
8

Claims (7)

1.选自序列号1所示氨基酸序列中(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相当于所述位点的氨基酸残基是下述氨基酸残基的碱性蛋白酶：
(a)位点：丝氨酸、
(b)位点：组氨酸、
(c)位点：精氨酸、
(d)位点：丝氨酸、
(e)位点：酪氨酸、
(f)位点：缬氨酸、
(g)位点：丝氨酸。
2.由序列号1所示氨基酸序列或与之具有80％或更高同源性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶，其中选自(a)63位、(b)89位、(c)120位、(d)63位及187位、(e)226位、(f)296位、(g)304位或相当于所述位点的氨基酸残基是下述氨基酸残基：
(a)位点：丝氨酸、
(b)位点：组氨酸、
(c)位点：精氨酸、
(d)位点：丝氨酸、
(e)位点：酪氨酸、
(f)位点：缬氨酸、
(g)位点：丝氨酸。
3.如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶的编码基因。
4.含有如权利要求3所述的基因的重组载体。
5.含有如权利要求4所述载体的转化子。
6.如权利要求5所述的转化子，其宿主是微生物。
7.含有如权利要求1或2所述的碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842371A (zh) * 2011-08-26 2014-06-04 农业研究发展局（公共组织） 基于丝的生物活性寡肽合成物和其制造工艺
CN109312323A (zh) * 2016-06-09 2019-02-05 花王株式会社 突变碱性蛋白酶

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999018218A1 (fr) * 1997-10-07 1999-04-15 Kao Corporation Protease alcaline
US7368273B2 (en) * 2002-03-22 2008-05-06 Kao Corporation Alkaline protease
WO2006032278A1 (en) 2004-09-21 2006-03-30 Novozymes A/S Subtilases
WO2006032277A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Novozymes A/S Subtilases
US7473544B2 (en) * 2004-10-08 2009-01-06 Kao Corporation Alkaline protease
JP2008212084A (ja) * 2007-03-06 2008-09-18 Kao Corp アルカリプロテアーゼ
JP2009034062A (ja) * 2007-08-03 2009-02-19 Kao Corp アルカリプロテアーゼ
US8060492B2 (en) * 2008-11-18 2011-11-15 Yahoo! Inc. System and method for generation of URL based context queries
US8778650B2 (en) 2009-04-30 2014-07-15 Kao Corporation Alkaline protease variants
WO2010134435A1 (ja) 2009-05-22 2010-11-25 独立行政法人物質・材料研究機構 強磁性トンネル接合体およびそれを用いた磁気抵抗効果素子
JP5230549B2 (ja) * 2009-07-06 2013-07-10 花王株式会社 医療器具の洗浄方法
WO2012090306A1 (ja) 2010-12-28 2012-07-05 花王株式会社 医療器具の洗浄方法
JP6067409B2 (ja) 2012-04-10 2017-01-25 花王株式会社 アルカリプロテアーゼの溶解性向上方法
JP6088282B2 (ja) * 2013-02-19 2017-03-01 花王株式会社 アルカリプロテアーゼの生産方法
JP6289711B2 (ja) 2016-06-09 2018-03-07 花王株式会社 変異アルカリプロテアーゼ
JP7245676B2 (ja) 2019-03-11 2023-03-24 花王株式会社 変異プロテアーゼ

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63502959A (ja) * 1986-02-12 1988-11-02 ジェネックス、コ−ポレ−ション 突然変異誘発及びスクリ−ニング方法並びに生成物
US5891701A (en) * 1997-06-12 1999-04-06 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding a polypeptide having protease activity
CN1148444C (zh) * 1997-08-29 2004-05-05 诺沃奇梅兹有限公司 蛋白酶变体及组合物
WO1999018218A1 (fr) 1997-10-07 1999-04-15 Kao Corporation Protease alcaline
AU2001291649A1 (en) * 2000-10-02 2002-04-15 Novozymes A/S Nucleic acids encoding polypeptides having proteolytic activity
US6803222B2 (en) * 2000-11-22 2004-10-12 Kao Corporation Alkaline proteases
US7101698B2 (en) * 2002-06-26 2006-09-05 Kao Corporation Alkaline protease

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842371A (zh) * 2011-08-26 2014-06-04 农业研究发展局（公共组织） 基于丝的生物活性寡肽合成物和其制造工艺
CN109312323A (zh) * 2016-06-09 2019-02-05 花王株式会社 突变碱性蛋白酶

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