CN1569871A - 短小芽孢杆菌的基因启动子及其多核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用作在细菌中表达外源基因的启动子核苷酸序列。本发明还涉及含有该核苷酸序列的载体和宿主细胞。来自于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)的启动子Bp53被用于在细菌中高水平地表达导入的基因。启动子Bp53片段长184碱基对。

Description

短小芽孢杆菌的基因启动子及其多核苷酸序列

技术领域  本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明描述了短小芽孢杆菌的基因启动子及其多核苷酸序列。

背景技术  本实验室曾从成都市生活垃圾中分离筛选到一株碱性蛋白酶产生菌一短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BA(06)。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42是由野生菌株BA(06)诱变得到的胞外碱性蛋白酶高产菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)。BA(06)的碱性蛋白酶活性为500U/mL左右，突变株的蛋白酶产量比出发菌株高7倍，达到4000U/mL。由于该菌株产生的胞外蛋白酶的脱毛效果很好，且胶原水解活性很低，因此在皮革工业中有很好的应用前景。并且它只分泌一种蛋白酶到培养基中，因此该菌作为基因工程宿主菌来表达外源基因具有较大潜力。为了利用该菌株建立高效的碱性脱毛蛋白酶基因表达***，以及利用该菌作为基因工程宿主菌来表达其它外源基因，需要建立该菌高效的转化***和表达***，因此从该菌株基因组中分离强基因启动子元件就显得至关重要。

发明内容  鉴于以上所述，本发明的一个目的是提供这种短小芽孢杆菌的强基因启动子及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供这种短小芽孢杆菌的强基因启动子的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有这种短小芽孢杆菌的强基因启动子的多核苷酸的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供含有这种短小芽孢杆菌的强基因启动子的多核苷酸的基因工程化的宿主细胞。

本发明所说的产生脱毛蛋白酶的微生物、该酶的制造方法和该酶的理化特性在我们的一个相关发明专利(专利申请号：0012641.9，公开号：CN1361278A)中有详细描述。本专利公开从短小芽孢杆菌基因组中筛选到的强基因启动子的多核苷酸和经过DNA重组技术将此启动子在基因工程化的宿主细胞枯草杆菌WB600中启动脱毛蛋白酶基因表达的方法。

本发明涉及这样一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

具有SEQ ID No：1中1-184的多核苷酸；

与SEQ ID No：1中1-184的序列互补的多核苷酸；

与SEQ ID No：1中1-184的多核苷酸序列至少有70％相同性的多核苷酸。

本发明还涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体进行基因工程化的宿主细胞，包括转化的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和检测所表达的脱毛蛋白酶的方法及该酶的用途。

本发明其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA，它们可以是单链或双链，代表有义链或反义链。多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。所述改变可以包括核苷酸序列中核苷酸的缺失、***或替换。“缺失”是指在核苷酸序列中一个或多个核苷酸的缺失。“***”或“添加”是指在核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个核苷酸的增加。“替换”是指由不同的核苷酸替换一个或多个核苷酸。

“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互结合。

“相同性百分率”是指在两种或多种核苷酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergenesoftware package，DNASTAR，Inc.，Madison Wis.)，MEGALIGN程序。可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(Higgins D.G.，Sharp，P.M.，Gene，1988，73：237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将各簇以成对或成组分配。用本领域众所周知的方法如JotunHein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.，Methods in enzymology，1990，183：625-645)。

“反义”是指与特定的DNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸存在于活微生物细胞中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸同一些或全部在自然***中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。

如本发明所用“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸如从天然状态中间存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由具SEQ ID NO：1多核苷酸组成。本发明的多核苷酸是从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)中得到的包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列，全长为184个碱基。

本发明的多核苷酸是DNA形式。DNA形式包括基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或双链的。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有70％的同源性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可以杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上时才发生杂交。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用“核酸片段”的长度至少含有10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离本发明的具有SEQ ID No：1中1-184的多核苷酸。

本发明中的多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的特异的这种短小芽孢杆菌的基因启动子的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：用探针与基因组杂交以检出同源的多核苷酸序列。

本发明的DNA片段序列也能用以下方法得到：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述的具有SEQ ID No：1中1-184的多核苷酸序列的双链DNA。

上述提到的方法中，分离基因组DNA最常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法，可用常规方法从这些基因组文库中筛选本发明的基因启动子。这些方法包括(但不限于)：DNA-DNA杂交。在这种方法中，杂交所用的探针是与本发明的基因启动子的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸，此处所用的探针通常是在本发明的序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因启动子本身或者片段当然可以用做探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

应用PCR技术扩增DNA的方法(Saiki，et al.，Science，1985，230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因启动子。用于PCR的引物可根据本发明公开的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA片段。

如上述得到的本发明的基因启动子或各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧核苷酸链终止法(Sanger，et al.PNAS，1977，74：5463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。

本发明也涉及包含本发明的基因启动子的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体和基因工程方法来表达感兴趣的基因编码区序列的宿主细胞，以及经重组技术产生感兴趣蛋白质的方法。

本发明中，编码脱毛蛋白酶的多核苷酸序列可***到载体中，以构成含有本发明所述的基因启动子的多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在大肠杆菌中可复制的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.，Gene，1987，56：125)；大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体pSUGV4(刘成君，et al.，四川大学学报(自然科学版)，2001，38：243)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定遗传，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建包含本发明所述的基因启动子的多核苷酸和编码脱毛蛋白酶的DNA序列及合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，a Labororatory Nanual，Cold SpringHarbor Laboratory。New York，1989)。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶，新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等，或用于枯草杆菌和短小芽孢杆菌的卡那霉素抗性等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。

本发明中，含有该基因启动子的多核苷酸的重组载体可转化入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸的重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真核细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后获得，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用原生质体转化法，基因枪转化法、DNA转染法，磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984，224：1431)，利用本发明的基因启动子的多核苷酸序列来表达或生产重组的蛋白质。下面以脱毛蛋白酶为例说明实验步骤：

(1)得到本发明的基因启动子和编码脱毛蛋白酶的基因。

(2)用含有该基因启动子的多核苷酸和编码脱毛蛋白酶的多核苷酸的重组表达载体转化合适的宿主细胞；

(3)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(1)中，本发明的基因启动子和编码脱毛蛋白酶的基因可从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株(保藏号：CGMCC NO.0518)中克隆。克隆可通过熟知的方法进行。这些方法的实施例为：合成合适的引物，通过PCR克隆靶基因或靶序列的方法。

在步骤(2)中，为了制备包括该基因启动子的多核苷酸和编码脱毛蛋白酶基因的重组载体，所述的基因可重组到适于在目的宿主中进行基因表达的任意载体中，如大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体pSUGV4(刘成君，et al.，四川大学学报(自然科学版)，2001，38：243)。总之，只要能在宿主细胞内复制和稳定遗传，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

使用由此获得的重组质粒，通过诸如原生质体法或感受态细胞法等常规方法转化宿主。虽然对宿主没有具体的限制，但微生物是优选的。

在步骤(3)中，任何能够使产生脱毛蛋白酶的微生物生长并产生所说的脱毛蛋白酶的培养基都可以用于生产脱毛蛋白酶。

例如，可以使用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精作为碳源，使用无机氮化合物(如草酸铵、氯化铵、硝酸钾、磷酸氢二铵等)或有机氮化合物(如酪素、大豆饼、玉米浸液、黄豆粉等)作为氮源，此外还要加入矿物质，如磷酸盐、钾盐、镁盐和钙盐。培养基的初始pH值为7.5-10。在本发明中，将培养物在需氧的条件下培养，培养温度为37℃，培养时间为36-48小时，即可得到最大产量的酶。

在步骤(4)中，可以按照常规的分离和纯化方法，对通过以上过程获得的蛋白酶进行纯化。通过盐析沉淀蛋白质、喷雾干燥方法、冻干法等，将可溶性盐加入到所得的上清液或滤液(所说的上清液和滤液是通过离心或者过滤菌体细胞和培养基的固体剩余物而得到的)中，即可获得蛋白酶。也可以结合使用其它的纯化方法(如离子交换层析和凝胶过滤层析)来进一步纯化所说的酶。发明人把通过上述方式所获得的脱毛蛋白酶命名为DHAP。

通过下述方法测定蛋白酶的活性并测试它的脱毛活性。

1、蛋白酶活力的测定

1ml酶液在50℃，pH9.6条件下测定，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)。

2、脱毛活性的测试

用硼砂一氢氧化钠缓冲液(pH9.6)将发酵液调pH值为9.6，于250ml三角瓶内装发酵液50ml，放入清洗后的猪臀部盐腌皮(10×15cm)3块，37℃恒温摇床(转速160r/min)上脱毛，定时观察脱毛情况，根据手感判断脱毛效果。

可以将本发明的基因启动子所表达的脱毛蛋白酶及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的添加剂组合后使用。这些添加剂可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合或其他一些用于制作蛋白酶酶制剂的添加剂。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

附图说明    图1利用启动子探针型载体pSUPV4筛选启动子的策略

            图2短小芽孢杆菌总DNA的部分酶切

            1-6：1，0.5，0.25，0.125，0.0625和0.03175U Sau3AI部分酶切

            7：未酶切总DNA     8：λ/HindIII marker

            图3Kanr重组子的限制酶切分析

            1：DL2000 marker

            2-12：不同重组子的HindIII酶切

            13：pSUPV4的HindIII酶切

            14：λ/EcoRI-HindIII marker

            图4Bp53片段的核苷酸序列

            TATA盒和GACA盒用下横线序列表示，ATG用加粗的黑体字母表示。

            图5Bp53片段与脱毛蛋白酶基因编码区PCR扩增

            1：脱毛蛋白酶基因信号肽+前肽+成熟肽编码序列

            2：Bp53片段

            3：λ/H marker

            图6重组子pMD-BpAp的酶切分析

            1-2：未酶切pUC18、pMD-BpAp

            3：pMD-BpAp的EcoRI酶切

            4：pMD-BpAp的BamHI-SalI酶切

            5：pUC18的BamHI-SalI酶切

            6：pMD-BpAp的HindIII酶切

            7：λ/H marker

            图7重组子pMD-BpAp中***片段的PCR分析

            1：λ/HindIII marker

            2-3：Bp53上游引物-Ap下游引物和Ap上游引物-Ap下游引物的扩增

            4-5：Bp53上游引物-Ap下游引物和Ap上游引物-Ap下游引物的负对照扩

            增

            6：λ/EcoRI-HindIII marker

            图8脱毛蛋白酶基因表达质粒pSU-BpAp的构建策略

        图9重组子pSU-BpAp的酶切分析

        1：λ/HinaIII marker 2-3：未酶切质粒pSUGV4和pSU-BpAp

        4-5：XbaI酶切的pSUGV4、pSU-BpAp、

        6-7：BamHI-SalI酶切的pSUGV4、pSU-BpAp

        8：λ/EcoRI-HindIII marker

        图10重组子pSU-BpAp中***片段的PCR分析

        1-2：Bp53片段扩增自pSU-BpAp、短小芽孢杆菌总DNA

        3.pSUGV4(负对照)

        4-5：脱毛蛋白酶基因编码区序列扩增自pSU-BpAp、短小芽孢杆菌总DNA

        6：pSUGV4(负对照)      7：λ/EcoRI-HindIII marker

        图11枯草杆菌WB600转化子在牛奶平板上的生长

        A：pSUGV4/WB600

        B：pSU-BpAp/WB600

        图12转化子pSU-BpAp/WB600的发酵上清液的SDS-PAGE分析

        M：Marker

        1：负对照：pSUGV4/WB600

        2：转化子：pSU-BpAp/WB600

        3：B.pumilis UN31-C-42

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的方法。

具体实施方式

实施例1  短小芽孢杆菌基因启动子的克隆(其克隆策略见附图1)pSUPV4的多克隆位点区和卡那霉素抗性基因编码区融合处的核苷酸序列是：5’ AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCG ATA CCG TCG ACCTCG AGG CCG CGA  3’

                                                    R    P   R

其中，有下划线部分为多克隆位点区；其余部分为卡那霉素抗性基因编码区及其相应的氨基酸序列。

短小芽孢杆菌基因启动子的克隆策略见附图1。将短小芽孢杆菌的总DNA用Sau3AI部分酶切，使酶切片段主要集中在0.5-5Kb之间(见附图2)。启动子探针型载体pSUPV4(见附图1)用BamHI完全酶切后脱磷酸化，再与上述部分酶切所得的DNA片段以适当比例连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。转化细胞先涂布在氨苄青霉素(100μg/mL)平板上，共得到约10000个转化子，随机挑选了1000余个转化子点在卡那霉素(25μg/mL)平板上，共获得83个阳性菌落，依次命名为pSU-Bpl......pSU-Bp83。从中又随机挑取了32个抗性菌落分离质粒DNA，经HindIII酶切和琼脂糖电泳分析，表明各质粒均有大小不等的DNA***片段，大小在200-2500bp之间(见附图3)。片段大小与卡那霉素抗性水平高低没有相关性(见表1)。将获得的83个阳性菌落分别接种在400，800，1000和1500μg/mL的卡那霉素平板上，检查其抗性水平。实验表明，随卡那霉素浓度的增高，阳性克隆数减少，其中转化子pSU-Bp3，pSU-Bp14，pSU-Bp19，pSU-Bp21，pSU-Bp53，pSU-Bp55，pSU-Bp57，pSU-Bp62，pSU-Bp70，pSU-Bp71可抗1000μg/mL的卡那霉素。进一步实验表明：pSU-Bp53，pSU-Bp57，pSU-Bp21可在1500μg/mL的卡那霉素平板上很好地生长，pSU-Bp53甚至可在2000μg/mL的卡那霉素平板上生长。

表1部分重组子中***片段的大小与其卡那霉素抗性水平的关系

***片段的样

                  Bp3       Bp14         Bp19       Bp21      Bp38     Bp53       Bp54    Bp57     Bp70

品编号

***片段大小

                  200       1600         2200       220       700      180        1100    540      300

(bp)

卡那霉素抗性      100

                            1000         1000       1500      800      2000       400     1500     1000

(μg/mL)          0

实施例2  Bp53启动子片段的序列测定和分析

对Bp53启动子片段进行了序列测定，结果如附图4所示。Bp53启动子片段较小，仅有184bp。在38bp处有一个类似于TATA盒的序列TATTTT，在17bp处有一个与TTGACA盒相似的序列TTAACA，在112bp处有一个与核糖体结合位点类似的富含AG的序列AGGAAAG。该片段3’末端有一个起始密码子ATG，在其上游48bp处还有一个相位一致的密码子ATG。根据起始密码子与核糖体结合位点的距离多在9-14bp之间，我们推测131bp处的ATG为起始密码子。起始密码子ATG下游多出的16个氨基酸与卡那霉素抗性基因编码区进行融合后，后者的阅读框架没有发生改变。以上研究表明，卡那霉素抗性基因编码区5’端能作较大改变而不影响其生物活性。将此序列与Genebank中的已知序列进行同源性比较，没有发现与其具有同源性的序列。此序列为新的DNA序列。

该启动子片段与载体中卡那霉素抗性基因编码区融合处的核苷酸序列为：5’TGTCATCTTATTAAGTGATGAGATG GATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATA CCGTCGACCTCGAGGCCGGAC 3’。

其中，有下划线部分为载体中多克隆位点区的核苷酸序列；其余部分为启动子片段Bp53的核苷酸序列。

实施例3  PCR扩增短小芽孢杆菌基因启动子Bp53片段

由于Bp53启动子片段的序列已测定，因此设计了一对引物：

Bp53上游引物：5’-CCG GGATCCTCATTTAGTCAGCTTTAACAT-3’(见SEQ ID NO：2)

                    BamHI

Bp53下游引物：5’-CCG TCTAGACATCTCATCACTTAAGAT-3’(见SEQ ID NO：3)

                     XbaI

利用此对引物直接从短小芽孢杆菌(B.pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)基因组中进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃ 3min，30×(94℃ 30sec，59℃ 30sec，72℃ 30sec)，72℃ 5min，扩增出大小为184bp的一条特异性的带(见附图5)。PCR产物经试剂盒纯化，然后用XbaI进行酶切，酶切后电泳回收。

实施例4  PCR扩增脱毛蛋白酶基因编码区序列

由于脱毛蛋白酶基因编码区序列已测定，因此设计了另一对引物：

Ap上游引物：5’-CCG TCTAGAATGTGCGTGAAAAAGAAAAAT-3’(见SEQ ID NO：4)

                    XbaI

Ap下游引物：5’-CGC GTCGACGGCATCAAGAACCGTGCAGC-3’(见SEQ ID NO：5)

                    SalI

以短小芽孢杆菌(B.pumilus)(保藏号：CGMCC NO.0518)的总DNA为模板，将脱毛蛋白酶基因的信号肽+前肽+成熟肽编码区序列(即Ap片段)用PCR方法扩增出，PCR扩增条件：94℃ 5min，30×(94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃60sec)，72℃ 10min，大小为1365bp(见附图5)。其上游引物含有XbaI位点，下游引物含有SalI位点。PCR产物经试剂盒纯化后，用XbaI进行酶切，酶切后电泳回收。

实施例5  Bp53片段与脱毛蛋白酶基因编码区相连

将上述两个回收产物相连后再电泳，然后回收预期大小的DNA片段，再将其***TaKaRa公司(大连宝生物工程公司)的pMD18T载体中，构建了重组子pMD-BpAp。通过蓝白色菌落选择，挑选阳性克隆。重组子pMD-BpAp的酶切分析见附图6，重组子pMD-BpAp的PCR验证见附图7。

为了确保两个DNA片段融合处核苷酸序列正确，对重组子pMD-BpAp进行测序。测得的连接处序列与预期结果相符。

ATCTTTAATAACAATGTCATCTTATTAAGTGATGAGATG  TCT AGA ATG TGC GTG AAA AAG AAA

AAT GTG ATG ACA AGT GTT TTA TTG GCT GTC CCT CTT CTG TTTTCA GCA GGG TTT

GGA

序列中的第一个ATG为Bp53片段上的起始密码子，第二个ATG为AP基因信号肽的第一个氨基酸，并且保证了Bp53片段上的起始密码子与AP基因信号肽的第一个氨基酸密码子的相位一致。TCTAGA为XbaI的识别序列。

实施例6  表达载体pSU-BpAp的构建

将上述重组子pMD-BpAp用BanHI和SalI双酶切，分离纯化1.5Kb的BpAp DNA带。大肠杆菌-枯草杆菌的穿梭质粒pSUGV4(见附图8)用BamHI和SalI双酶切，并脱磷酸化处理，再与BpAp基因片段以适当比例连接，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，获得了重组子(命名为pSU-BpAp)。pSU-BpAp的构建路线见附图8，重组子pSU-BpAp的酶切分析结果见附图9，PCR验证结果见附图10。

实施例7  脱毛蛋白酶基因在枯草杆菌WB600中的表达

将重组子pSU-BpAp用感受态转化法转入到了枯草杆菌WB600中，获得转化子(命名为pSU-BpAp/WB600)。该转化子不仅能够在牛奶平板上产生透明的水解圈(见附图11B)，而且在转化子的发酵上清液中检测到了脱毛蛋白酶的酶活。原载体pSUGV4转入到枯草杆菌WB600后则检测不到水解圈(见附图11A)和蛋白酶的活性。转化子pSU-BpAp/WB600的保藏号为：CGMCC NO.0956。

实施例8  pSU-BpAp/WB600的发酵上清液的SDS-PAGE分析

如图12所示：转化子pSU-BpAp/WB600的发酵上清液和原出发菌短小芽孢杆菌(B.pumilis UN-31-C-42)的发酵上清液在SDS-PAGE中都显示出一条大约为31KD的蛋白质带。根据本实验室已有的结果，纯化的蛋白酶分子量大约为31KD。由此证明：脱毛蛋白酶基因在枯草杆菌WB600中得到了表达。转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液则没有显示出31KD的蛋白质带(见附图12第1道)。

实施例9  转化子pSU-BpAp/WB600发酵液的酶活测定

脱毛蛋白酶活力测定按照轻工部部颁标准进行(酶活(U/ml)＝O.D._500nm×稀释倍数×斜率)。发酵条件：种龄24h，接种量1％，100ml LB置于250ml三角瓶中，卡那霉素含量20μg/ml，37℃摇床培养，转速200r/min。从接种4h后开始，每4h取样一次，共12次。酶活测定表明，该菌株在发酵20h后开始产酶，在48h达到高峰，其酶活测定结果如表2所示：转化子pSU-BpAp/WB600表达出了有活性的脱毛蛋白酶。

表2pSU-BpAp/WB600转化子发酵不同时间的蛋白酶酶活测定

样品编号       1      2      3       4         5        6          7         8        9        10        11       12

发酵时间

               8      12     16      20        24       28         32        36       40       44        48       52

(h)

                                                                                                                  19.

酶活(U/ml)     0      0      0       5.4       8.3      11.8       12.6      15.5     18.1     20.4      21.2

                                                                                                                  7

转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液中检测不到脱毛蛋白酶的酶活。

实施例10  转化子pSU-BpAp/WB600发酵液的脱毛实验

取转化子pSU-BpAp/WB600的48h发酵液，用硼砂一氢氧化钠缓冲液(pH9.6)调发酵液的pH值为9.6，于250ml三角瓶内装发酵液50ml，放入清洗后的猪臀部盐腌皮(10×15cm)3块，37℃恒温摇床(转速160r/min)上脱毛，定时观察脱毛情况，根据手感判断脱毛效果。结果表明，转化子pSU-BpAp/WB600发酵液可以脱毛，且对皮革胶原没有损伤。脱毛效果如表3所示：

         表3pSU-BpAp/WB600转化子发酵液的脱毛实验

序号           1       2      3      4      5      6       7       8     9

处理时间(h)    8       12     16     20     24     28      32      36    48

脱毛效果       -       -      -      -      +      +       +       ++    ++

注：“-”表示不能脱毛；“+”表示能够脱毛，但效果一般；“++”表示能够脱毛，且效果很好。

用相同pH值的缓冲液为负对照转化子pSUGV4/WB600的发酵上清液进行脱毛，未检测到脱毛效果。

由实验结果表明：转化子pSU-BpAp/WB600中Ap片段所产生的碱性蛋白酶能够独立完成生皮的脱毛，且对皮革胶原没有损伤。由此进一步证明了我们从短小芽孢杆菌中分离得到的基因启动子片段Bp53在枯草杆菌WB600中能够有效地启动同样来自于短小芽孢杆菌的脱毛蛋白酶基因编码区Ap片段的表达。表明我们所分离得到的基因启动子片段Bp53在革兰氏阳性菌和革兰阴性菌中都具有启动功能，在表达载体的构建以及利用革兰氏阳性菌作为宿主菌表达外源蛋白方面都有着广泛的应用前景。因此利用该启动子来构建枯草杆菌和短小芽孢杆菌的高效表达载体中的表达单元是可行的，也可以用来构建同时适用于大肠杆菌、枯草杆菌和短小芽孢杆菌间的穿梭质粒中的标记基因。此研究工作也为进一步以枯草杆菌和短小芽孢杆菌作为宿主菌来建立能够高效地表达碱性脱毛蛋白酶基因的工程菌奠定了良好的基础。

                             序列表

(1)一般信息：

  (i)发明名称：短小芽孢杆菌的基因启动子及其多核苷酸序列

  (ii)序列数目：5

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：184bp

    (B)类型：核酸

    (C)链性：双链

    (D)拓补类型：线性

    (E)(1)...(130)Promoter

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：1：

1   TCATTTAGTC AGCTTTAACA TGTTAAAATG ATAAAAGTAT TTTTTTAATA

51  AAGTATGATA GATTAAAATG AGAACGTTAC ATTTTCTCTG GATTTTCTTC

101 TTTAGGATTG TAGGAAAGTG GGTGATCTAA ATGAAAATCA AAAAAATCTT

151 TAATAACAAT GTCATCTTAT TAAGTGATGA GATG

(3)SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：30碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链性：单链

    (D)拓补结构：线性

    (E)PCR引物

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：2

CCGGGATCCTCATTTAGTCAGCTTTAACAT

(4)SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：27碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链性：单链

    (D)拓补结构：线性

    (E)PCR引物

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：3

CCGTCTAGACATCTCATCACTTAAGAT

(5)SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：30碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链性：单链

    (D)拓补结构：线性

    (E)PCR引物

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：4

CCGTCTAGAATGTGCGTGAAAAAGAAAAAT

(6)SEQ ID NO：5的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：29碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链性：单链

    (D)拓补结构：线性

    (E)PCR引物

  (ii)分子类型：寡核苷酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：5

CGCGTCGACGGCATCAAGAACCGTGCAGC

Claims (6)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的片段、类似物、衍生物的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或

(c)与(a)或(b)至少有70％相同性的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含有SEQ ID NO：1中1-130位的序列。

4.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求1-3中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒或其他载体构建而成的重组载体。

5.一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：(a)用权利要求4所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或

(b)用权利要求1-3中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

6.在细菌中高水平地表达外源基因的方法，其特征在于在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中，在权利要求1-3中的任一权利要求所述多核苷酸序列的调控下表达外源基因。

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