CN1565171A - 三七不定根的组织培养及生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七不定根的组织培养及生产方法。其包括：三七愈伤组织的诱导；三七愈伤组织的扩增与继代培养；三七不定根的诱导；三七不定根的扩繁与继代培养；三七不定根不同根系的筛选和活性成分的测定及扩繁；和三七不定根的反应器培养等多个步骤。本发明提供的三七不定根是利用反应器来进行三七的不定根培养，其增殖倍数可达到100倍以上，具有不受地理位置、季节和时间的限制、生长时间短及增殖率高等优点，非常适合于三七不定根的生长，因此为三七这种名贵中药材资源的大规模生产开辟了一条产业化的新途径，从而可从根本上解决三七药源受自然条件限制的问题，因此经济和社会效益显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的不定根组织培养及生产方法，特别是涉及一种三七不定根的组织培养及生产方法。
背景技术
三七为我国最常用的中药材之一，同时也是国际市场上的畅销植物药。其可以作为滋补品直接食用，还是许多保健品和药品的重要原料，如血塞通、云南白药和丹参滴丸等。由于该药材受地理条件的限制，所以其栽培面积有限，主要分布在我国云南省文山州一带范围很窄的地区，而且还受到“栽培的土地不能重复利用的影响”。由于“老七地”问题不能解决，所以栽培三七的土地只能靠不断砍伐山林，侵占农田来扩充，这就会造成当地大量的水土流失和生物多样性的严重破坏。目前，我国适宜于栽培三七的土地正在逐年减少，而随着我国制药企业的不断扩大，人民生活保健用药的需求量逐年增多，三七的大田栽培越来越难以满足市场的需要。另外，栽培三七需要三年的时间，在此期间内每年都要使用大量的农药、化肥，而且还要投入大量的人力物力，这样就会造成农药及重金属残留和成本较高等问题，因而这就使得三七的供应无论从数量上还是质量上都不能满足日益增长的市场需求，因此短时间内大量繁殖无污染且有效成分含量高的三七就成为中药资源开发和利用的当务之急。产业化规模的药用植物组织培养可以解决这些问题。组织培养是一项在人工培养基上离体培养植物的器官或细胞和原生质体并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。其中不定根培养是80年代发展起来的一项新技术。不定根是由植物的愈伤组织诱导出来的根，和药用植物的悬浮细胞相比，其次生代谢物的含量稳定；和大田生长的植物根相比，其生长速度要快上千百倍。因此，比较适合药用植物的组织培养以获取有效成分或作为替代原料，特别是大多数药用植物的用药部位为其根部。我国从事药用植物组织培养工作大多停留在培养皿和摇瓶阶段，到目前为止，三七不定根的离体诱导、培养及利用生物反应器技术来培养离体诱导的三七不定根方面的技术在国内外仍未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种工艺操作简单、重复性好、规模生产快速、方便且生产成本低廉的三七不定根的组织培养及生产方法。
为了达到上述目的，本发明提供的三七不定根的组织培养及生产方法包括按下列顺序进行的步骤：步骤一，三七愈伤组织的诱导：将三七根消毒后切成小片，并接种于事先准备好的固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周后可见愈伤组织的形成；步骤二，三七愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；步骤三，三七不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-4周后可见到不定根的形成；步骤四，三七不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-4周；步骤五，三七不定根不同根系的筛选和活性成分的测定及扩繁：对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优的不定根根系，并接种于不同体积的三角瓶中进行扩繁，培养周期为3-4周；步骤六，三七不定根的反应器培养：将在步骤五中扩繁后的三七不定根接种于气升式反应器的液体培养基中，并加入植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养6-12周后即制成本发明的三七不定根。
本发明提供的三七不定根是利用反应器来进行三七的不定根培养，其增殖倍数可达到100倍以上，具有不受地理位置、季节和时间的限制、生长时间短及增殖率高等优点，非常适合于三七不定根的生长，因此为三七这种名贵中药材资源的大规模生产开辟了一条产业化的新途径，从而可从根本上解决三七药源受自然条件限制的问题，因此经济和社会效益显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的三七不定根的组织培养及生产方法进行详细说明。
实施例1
用HCl和NaOH溶液将100mL MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好、无病虫害的三七根，分别用自来水、蒸馏水和洗涤剂冲洗消毒10分钟，然后用蒸馏水洗净，并用70％的乙醇浸泡3分钟，之后采用1％次氯酸钠(加入几滴表面活性剂Tween-20)消毒30分钟，最后用蒸馏水洗涤3-5次，即可获得无菌三七根。将消毒后的三七根用消毒过的解剖刀切成小片，接种于事先准备好的MS固体培养基上，在25℃及避光条件下进行三七愈伤组织的诱导，培养4周后可见愈伤组织的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂2，4-D，浓度为1mg/L，在23℃及避光条件下进行三七愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为4周。用HCl和NaOH溶液将100mL MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，在25℃及避光条件下进行三七不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在25℃及避光条件下进行三七不定根的扩繁与继代培养，培养周期为4周。对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，采用HPLC法进行活性成分的测定，检测三七中人参皂苷Rb1、Rg1的含量，检验多糖的含量，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优的不定根根系，并接种于200mL的三角瓶中进行扩繁，内装50mL含有3％蔗糖的MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将筛选出最优的不定根根系接种于该三角瓶中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在100rpm速度的摇床上、25℃及避光条件下进行培养，周期为3周；采用1000L气升式反应器，内装500L含有3％蔗糖的MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将扩繁后的三七不定根接种于该反应器中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在0.1vvm的供气速度、25℃及避光条件下进行培养，8周后即可获得本发明的三七不定根。
实施例2
用HCl和NaOH溶液将100mL 1/2MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好、无病虫害的三七根，分别用自来水、蒸馏水和洗涤剂冲洗消毒10分钟，然后用蒸馏水洗净，并用70％的乙醇浸泡3分钟，之后采用1％次氯酸钠(加入几滴表面活性剂Tween-20)消毒30分钟，最后用蒸馏水洗涤3-5次，即可获得无菌三七根。将消毒后的三七根用消毒过的解剖刀切成小片，接种于事先准备好的1/2MS固体培养基上，在24℃及避光条件下进行三七愈伤组织的诱导，培养5周后可见愈伤组织的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL 1/2MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的1/2MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂IAA，浓度为1mg/L，在25℃及避光条件下进行三七愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为5周。用HCl和NaOH溶液将100mL1/2 MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的1/2MS固体培养基上，在24℃及避光条件下进行三七不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL1/2MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的1/2MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂NAA，浓度为1mg/L，在24℃及避光条件下进行三七不定根的扩繁与继代培养，培养周期为4周。对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，采用HPLC法进行活性成分的测定，检测三七中人参皂苷Rb1、Rg1的含量，检验多糖的含量，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优的不定根根系，并接种于200mL的三角瓶中进行扩繁，内装50mL含有3％蔗糖的MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将筛选出最优的不定根根系接种于该三角瓶中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在100rpm速度的摇床上、25℃及避光条件下进行培养，周期为4周；采用1000L气升式反应器，内装500L含有4％蔗糖的1/2MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将扩繁后的三七不定根接种于该反应器中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在0.1vvm的供气速度、18℃及光照条件下进行培养，12周后即可获得本发明的三七不定根。
实施例3
用HCl和NaOH溶液将100mL 3/4MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好、无病虫害的三七根，分别用自来水、蒸馏水和洗涤剂冲洗消毒10分钟，然后用蒸馏水洗净，并用70％的乙醇浸泡3分钟，之后采用1％次氯酸钠(加入几滴表面活性剂Tween-20)消毒30分钟，最后用蒸馏水洗涤3-5次，即可获得无菌三七根。将消毒后的三七根用消毒过的解剖刀切成小片，接种于事先准备好的3/4MS固体培养基上，在25℃及避光条件下进行三七愈伤组织的诱导，培养5周后可见愈伤组织的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL 3/4MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的3/4MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂激动素，浓度为1mg/L，在25℃及避光条件下进行三七愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为4周。用HCl和NaOH溶液将100mL 3/4MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的3/4MS固体培养基上，在25℃及避光条件下进行三七不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用HCl和NaOH溶液将100mL3/4MS固体培养基调至pH6.0，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌15分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的3/4MS固体培养基上，并加入植物生长调节剂激动素，浓度为1mg/L，在24℃及避光条件下进行三七不定根的扩繁与继代培养，培养周期为4周。对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，采用HPLC法进行活性成分的测定，检测三七中人参皂苷Rb1，Rg1的含量，检验多糖的含量，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优的不定根根系，并接种于200mL的三角瓶中进行扩繁，内装50mL含有3％蔗糖的MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将筛选出最优的不定根根系接种于该三角瓶中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在100rpm速度的摇床上、25℃及避光条件下进行培养，培养周期为3周；采用1000L气升式反应器，内装500L含有5％蔗糖的3/4MS液体培养基，在121℃、1.2kg/cm-2的压力下灭菌20分钟备用；将扩繁后的三七不定根接种于该反应器中，并加入植物生长调节剂IBA，浓度为1mg/L，在0.1vvm的供气速度、20℃及光照条件下进行培养，10周后即可获得本发明的三七不定根。
Claims (6)
1、一种三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：所述的三七不定根的组织培养及生产方法包括按下列顺序进行的步骤：步骤一，三七愈伤组织的诱导：将三七根消毒后切成小片，并接种于事先准备好的固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周后可见愈伤组织的形成；步骤二，三七愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；步骤三，三七不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-4周后可见到不定根的形成；步骤四，三七不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-4周；步骤五，三七不定根不同根系的筛选和活性成分的测定及扩繁：对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优的不定根根系，并接种于不同体积的三角瓶中进行扩繁，培养周期为3-4周；步骤六，三七不定根的反应器培养：将在步骤五中扩繁后的三七不定根接种于气升式反应器的液体培养基中，并加入植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养6-12周后即制成本发明的三七不定根。
2、根据权利要求1所述的三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：所述的固体和液体培养基均为MS基。
3、根据权利要求1所述的三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：在三七不定根的扩增与继代培养中，所述的植物生长调节剂为2，4-D，IAA和激动素中的任一种。
4、根据权利要求1所述的三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：在三七不定根的扩繁与继代培养中，所述的植物生长调节剂为IBA、NAA和激动素中的任一种。
5、根据权利要求1所述的三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：在三七不定根的反应器培养中，所述的液体培养基含有3％-5％的蔗糖。
6、根据权利要求1所述的三七不定根的组织培养及生产方法，其特征在于：所述的植物生长调节剂的浓度均为1mg/L。
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