CN102388803A

CN102388803A - 辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法

Info

Publication number: CN102388803A
Application number: CN2011102309798A
Authority: CN
Inventors: 王述彬; 刁卫平; 刘金兵; 潘宝贵; 戈伟
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2012-03-28

Abstract

辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法，涉及原生质体来源、分离、纯化及原生质体培养和愈伤组织形成，属于生物技术科学领域。1）利用辣椒细胞质雄性不育系无菌苗真叶为材料分离原生质体；2）切取幼嫩叶片放入含有纤维素酶、果胶酶和离析酶的CPW9酶解溶液中，置于27℃摇床上黑暗处理；3）用300目尼龙筛过滤酶解液，经离心洗涤后收集原生质体；4）将获得的原生质体培养于含有不同浓度激素的液体培养基中，期间定期添加新鲜培养基，直至愈伤组织形成。该发明利用辣椒雄性不育材料进行原生质体分离和培养，对进一步研究原生质体融合以及利用融合技术实现新型辣椒雄性不育系材料的创制具有重要的意义。

Description

辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法

技术领域

本发明属于生物技术科学领域，是一种利用辣椒细胞质雄性不育材料进行原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法，涉及原生质体来源、分离、纯化及原生质体培养和愈伤组织形成方法。

背景技术

原生质体是指采用机械或酶解方法去掉细胞壁的裸露细胞。由于没有细胞壁，原生质体在作物育种实践和遗传育种理论研究中均具有重要意义。在育种实践中，原生质体培养成功为开展体细胞杂交奠定了基础，可以通过不同类型的原生质体融合克服传统育种方法所面临的生殖障碍，创造新的种质材料，并且可以实现不同材料的核质基因重组。另外，由于原生质体在培养过程中能够产生体细胞无性系变异，可以从中选出具有优良性状的变异体，可成为农作物改良的重要遗传资源。在遗传育种理论研究中，原生质体可以作为遗传转化的受体进行转基因研究。此外，原生质体还可以为细胞生物学、发育生物学、细胞生理学、病毒学等学科的基础理论研究提供了理想的实验体系。

植物雄性不育是植物有性繁殖过程中不能产生正常可育雄性配体的遗传现象。按基因型可将雄性不育分为细胞核控制的雄性不育（GMS）、细胞质控制的雄性不育（CMS）和细胞核-细胞质共同控制的雄性不育（G-CMS）。细胞质雄性不育是植物杂种优势利用的一条十分重要的途径，目前，杂交种的应用已成为很多作物获得丰产、稳产和优质的一项重要措施，而利用细胞质雄性不育系进行杂交种生产，具有省去人工去雄、降低成本、提高种子纯度和保证种子质量等优点。然而，当前生产上利用CMS进行杂种优势育种中主要存在的问题是缺乏优良的CMS系。由于CMS性状为母性遗传，通过有性杂交再回交的方法转移该性状往往需要6~10年的时间，这无疑限制了CMS系的选育进程。而利用原生质体融合技术可以快速实现胞质基因的转移，获得更多基因型的杂种，进而缩短CMS性状转育时间。

建立稳定高效的原生质体提取体系，是进行原生质体基础理论研究和原生质体培养、融合的关键。在植物原生质体分离和培养中，所分离的原生质体产量和活力以及进一步发育，与分离材料来源、酶解液组成成分、酶解方法与条件、收集与纯化方法、培养基类型和培养等因素有密切关系。不同的植物，其细胞壁具有一定的差异性。即使是同一种植物或品种，其不同部位的细胞壁也不相同。而在原生质体进一步发育过程中，培养基种类和培养方式对原生质体再生能否取得成功起着至关重要的作用。因此，探索一条适于分离及培养同一类型，特别是同一种植物的原生质体的方法尤为重要。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种辣椒细胞质雄性不育系原生质体的分离纯化及愈伤组织形成的方法，有效地分离纯化辣椒细胞质雄性不育系原生质体，制备原生质体悬浮液，并进行原生质体离体培养获得愈伤组织。该方法可用于辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及培养，并进一步用于原生质体融合获得新型细胞质雄性不育系等辣椒新种质，也为其他作物的原生质体分离、纯化、原生质体培养融合及创制新雄性不育系新种质提供参考。

技术方案：本发明的目的是提供一种辣椒细胞质雄性不育系原生质体的分离纯化及愈伤组织形成的方法。具体步骤如下：

1）无菌苗准备利用辣椒细胞质雄性不育系21A（图2-A）相对应保持系21B的花粉对不育系进行授粉，50天后采收自然成熟果实。在超净工作台上，用75%vt酒精对果实表面进行消毒，将果实剖开取成熟种子接种到1/2MS固体培养基上，分别置于黑暗处及光照下萌芽和生长。培养温度（26±1）℃；光照强度2000~2500 lx，光照时间16h﹒d^-1。取培养30~40天无菌苗真叶作游离叶肉原生质体的材料。

2）原生质体分离和纯化取无菌苗真叶约1g，用解剖刀将其切成1mm宽的细条，置于盛有10mL酶解液的50mL离心管中，Parafilm封口，在28℃黑暗条件下放置回旋摇床上酶解（50转/min）。酶解液组成为：CPW9（含9%wt甘露醇）+0.5%(w/v)纤维素酶+0.25%果胶酶(w/v)+0.1%离析酶(w/v)，CPW9为（CaCl₂﹒2H₂O 10mM，KH₂PO₄0.2mM，KNO₃ 1.0mM，MgSO₄﹒7H₂O 1.0 mM，CuSO₄﹒5H₂O 0.1um，KI 10um）。酶解4小时，将酶解后的混合物用300目无菌尼龙网过滤，滤液在50mL离心管中以800转/min转速离心5min，去上清液，用CPW9溶液悬浮底部沉淀的原生质体，洗涤离心2次，获得纯化好的原生质体（图2-B）。

3）原生质体悬浮培养以KM₈P培养基悬浮、洗涤2）中原生质体1次，用血球计数板统计原生质体产量，0.01%FDA检验原生质体活力。然后用含有植物激素6-BA、2,4-D和KT的KM₈P培养液悬浮原生质体1次，稀释成密度约10⁵个/mL原生质体进行液体浅层培养。

4）愈伤组织形成前3周进行暗培养，每隔1周添加1mL稀释培养基，3周后将培养物于漫射光下进行培养，当出现肉眼可见的愈伤组织时，将其转移至扩增培养基弱射光下培养。

有益效果

1）首次以辣椒细胞质雄性不育系为材料进行原生质体分离、纯化和培养研究，可用于辣椒种植资源保存，同时获得了愈伤组织可进一步用于突变体筛选及遗传转化等理论研究。

2）辣椒属茄科辣椒属，是我国第二大蔬菜作物。作为常异花授粉作物，辣椒具有很强的杂种优势，优良的杂交种比传统常规品种增产30~50％，杂交种的应用已成为辣椒获得丰产、稳产和优质的一项重要措施。而利用细胞质雄性不育系进行杂交种生产，具有省去人工去雄、降低成本、提高种子纯度和保证种子质量等优点。然而，当前我国辣椒生产上利用CMS进行杂种优势育种中主要存在的问题是缺乏优良的CMS系。由于CMS性状为母性遗传，通过有性杂交再回交的方法转移该性状往往需要6~10年的时间，这无疑限制了辣椒CMS系的选育进程。而利用原生质体融合技术可以快速实现胞质基因的转移，获得更多基因型的杂种，进而缩短CMS性状转育时间。应用本发明获得的愈伤组织可进一步用于原生质体培养再生植物的获得，并为将来开展原生质体融合创造新的辣椒细胞质雄性不育系奠定基础。

3）由于原生质体培养过程中能够产生体细胞无性系变异，因此利用离体变异技术对获得的愈伤组织进行诱导，可以加速突变体的获得，进而从中选出具有优良性状的变异体，获得重要的遗传资源。同时，从叶肉细胞分离原生质体，具有同一组织可以产生大量遗传上基本一致的原生质体，且由于去掉了细胞壁，原生质体更容易摄取外源遗传物质，便于基因遗传转化研究。

4）本发明是基于对辣椒细胞质雄性不育系叶肉组织原生质体分离、纯化方法及原生质体液体浅层培养方法的研究。本方法具有坚实的理论依据，科学性强，方法简易，易于操作和实际应用。

附图说明

图1 辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离、纯化及愈伤组织形成流程图；

图2为辣椒细胞质雄性不育系原生质分离、纯化及愈伤组织形成图；其中

图2-A 辣椒细胞质雄性不育系21A；

图2-B 辣椒细胞质雄性不育系保持系21B；

图2-C 纯化好的原生质体；

图2-D 原生质体第一次***；

图2-E 愈伤组织（微小）；

图2-F愈伤组织。

具体实施方式

原生质体培养在作物遗传理论研究和实际育种实践中具有重要意义和良好的应用前景。原生质体培养成功为开展体细胞杂交奠定了基础，可以通过不同类型的原生质体融合克服传统育种方法所面临的生殖障碍，创造新的种质材料，并且可以实现不同材料的核质基因重组。另外，由于原生质体在培养过程中能够产生体细胞无性系变异，可以从中选出具有优良性状的变异体，可成为农作物改良的重要遗传资源。此外，原生质体还可以为细胞生物学、发育生物学、细胞生理学、病毒学等学科的基础理论研究提供了理想的实验体系。

本实例以辣椒细胞质雄性不育系21A（图2-A）为材料，采用本发明方法获得了纯化的原生质体和愈伤组织。文中所述w/v的单位是g/mL，实施过程如下：

1）无菌苗准备：利用辣椒细胞质雄性不育系21A相对应保持系21B（图2-B）的花粉对不育系进行授粉，50天后采收自然成熟果实。在超净工作台上，用75%vt酒精对果实表面进行消毒，将果实剖开取成熟种子接种到1/2MS固体培养基上，分别置于黑暗处及光照下萌芽和生长。培养温度（26±1）℃；光照强度2000~2500 lx，光照时间16h﹒d^-1。取培养30~40天无菌苗真叶作游离叶肉原生质体的材料。

2）原生质体分离和纯化：取无菌苗真叶约1g，用解剖刀将其切成1mm宽的细条，置于盛有10mL酶解液的50mL离心管中，Parafilm封口，在28℃黑暗条件下放置回旋摇床上酶解（50转/min）。酶解液组成为：CPW9（含9%wt甘露醇）+0.5%(w/v)纤维素酶+0.25%果胶酶(w/v)+0.1%离析酶(w/v)，CPW9为（CaCl₂﹒2H₂O 10mM，KH₂PO₄0.2mM，KNO₃ 1.0mM，MgSO₄﹒7H₂O 1.0 mM，CuSO₄﹒5H₂O 0.1um，KI 10um）。酶解4小时，将酶解后的混合物用300目无菌尼龙网过滤，滤液在50mL离心管中以800转/min转速离心5min，去上清液，用CPW9溶液悬浮底部沉淀的原生质体，洗涤离心2次。

3）原生质体悬浮培养：以KM₈P培养基悬浮、洗涤2）中原生质体1次，用血球计数板统计原生质体产量，0.01%FDA检验原生质体活力。然后用含有植物激素0.5~2.0mg/L 6-BA、0.5~2.0mg/L 2,4-D和0.5~2.0mg/L KT的KM₈P培养液悬浮原生质体1次，稀释成密度约10⁵个/mL原生质体进行液体浅层培养，培养1天后陆续取培养液进行镜检，7天左右可见到细胞进行第一次分离（图2-C）。

4）愈伤组织形成：前3周进行暗培养，每隔1周添加1mL步骤3）所用的含有不同激素的KM₈P培养基，3周后将培养物于漫射光下进行培养，当出现肉眼可见的愈伤组织时（图2-D、E），将其转移至扩增培养基弱射光下培养。

Claims

1.辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成方法，其特征在于包含以下步骤：

1）无菌苗准备：利用辣椒细胞质雄性不育系相对应保持系的花粉对不育系进行授粉，50天后采收自然成熟果实；在超净工作台上，用75%vt酒精对果实表面进行消毒，将果实剖开取成熟种子接种到1/2MS固体培养基上生长，取培养30~40天健壮无菌苗的真叶作游离叶肉原生质体的材料；

2）原生质体分离和纯化：取无菌苗真叶1g，将其切成1~2mm宽的细条，置于盛有10mL酶解液的50mL离心管中，封口膜封口，在28℃黑暗条件下放置回旋摇床上酶解；酶解液组成为：含9%wt甘露醇的CPW9+0.5%~1%纤维素酶(w/v)+0.25%~0.5%果胶酶(w/v)+0.1%~0.2%离析酶(w/v)；酶解2~6小时，将酶解后的混合物用300目无菌尼龙网过滤，滤液在50mL离心管中以500~1000转/min转速离心3~8min，去上清液，用CPW9溶液悬浮底部沉淀的原生质体，洗涤离心2次；

3）原生质体悬浮培养：以KM₈P培养基悬浮、洗涤2）中原生质体，用血球计数板统计原生质体产量，0.01%FDA检验原生质体活力；然后用含有植物激素0.5~2.0mg/L 6-BA、0.5~2.0mg/L 2,4-D和0.5~2.0mg/L KT的KM₈P培养液悬浮原生质体1次，稀释成密度约10⁵个/mL原生质体进行液体浅层培养；

4）愈伤组织形成：前3周进行暗培养，每隔1周添加1mL步骤3）所用的含有不同激素的KM₈P培养基，3周后将培养物于漫射光下进行培养，当出现肉眼可见的愈伤组织时，将其转移至扩增培养基弱射光下培养。