CN1563379A - 猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列 - Google Patents

Abstract

一种猪的5羟色胺4受体b亚型的基因序列。用于基因工程技术领域。从猪的结肠组织总RNA中扩增出的5羟色胺4受体b亚型基因的核苷酸序列，该基因全长1209bp，开放阅读框1bp－1209bp区段，编码有402个氨基酸的蛋白质，分子量为44960道尔顿，等电点pI为8.08。本发明猪5羟色胺4受体b亚型基因对猪胃肠运动功能调节有重要调控作用，是研究猪应激性腹泻以及进行猪分子标记辅助育种重要的候选基因。本发明的一方面可以通过制备该基因的蛋白，用于研究该基因在调节猪胃肠运动功能中的作用；另一方面可以为建立应激性腹泻的动物模型提供理论基础，并且能够为猪分子标记辅助育种起到指导性作用，因此本发明具有很大的应用价值。

Description

猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列

技术领域

本发明涉及的是一种用于基因工程技术领域的蛋白编码序列，特别是一种猪的5羟色胺4受体b亚型的基因序列。

背景技术

无论在人类医学还是动物医学上，应激性腹泻都是常见的临床病症，断奶仔猪腹泻即是动物应激性腹泻的一个典型实例。尽管对应激性腹泻的认识和研究已经历了一个多世纪，但目前对其病因、发病机理仍不甚清楚。近年来，国内外一些学者纷纷探索神经递质5羟色胺及5羟色胺4受体在介导应激性腹泻的生物学效应。

5羟色胺4受体(5-hydroxytryptamine receptor 4，5-HT4R)为神经递质5羟色胺的一类结合受体，其属于G蛋白耦联受体超家族，广泛分布在哺乳动物的中枢神经***和外周组织中。在消化***中其主要存在于肠肌丛神经元、平滑肌细胞与肠嗜铬细胞中，可与肠嗜铬细胞、肠神经元中的5羟色胺相结合，介导环状平滑肌束的舒张与收缩，引起小肠和结肠的液体分泌。5羟色胺4受体还可介导肠道中某些神经递质的释放，包括乙酰胆碱、P物质、血管活性肠肽以及刺激蠕动反射的降钙素基因相关肽，这些物质在调节胃肠道动力方面起着重要的作用。因而5羟色胺4受体与胃肠道动力调节有密切关系。5羟色胺4受体最先在豚鼠中发现(1988年)，在随后的研究中先后证明了5羟色胺4受体基因在不同物种中存在几种亚型，包括较为清楚的5羟色胺4受体a亚型、b亚型、c亚型、d亚型、e亚型、f亚型、g亚型、n亚型、h亚型等9种，几种亚型在不同组织中的表达量有较大差异。

在对现有技术文献的检索和分析中，虽然“FEBS Letters，1995，370：215-221”(Expression of serotonin receptor mRNAs in blood vessels，5羟色胺受体mRNA在血管中的表达)通过RT-PCR的方法克隆得到了猪的5羟色胺4受体的部分编码蛋白序列，并且分析了5羟色胺4受体基因在人、鼠、猪等不同物种上的表达规律，但至今尚未发现克隆获得猪5羟色胺4受体基因完整的编码蛋白序列以及对哺乳动物5羟色胺4受体基因进化规律研究的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列。使其一方面可以通过制备该基因的蛋白，对猪胃肠运动功能调节有重要调控作用；另一方面可以为建立应激性腹泻的动物模型提供理论基础，并且能够为猪分子标记辅助育种起到指导性作用，具有很大的应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因的cDNA序列是通过以猪的结肠组织中总RNA为模板，参考人、鼠的5羟色胺4受体b亚型基因的同源序列设计三对引物，进行反转录PCR，克隆获得三条新基因的部分序列。运用生物学软件DNASTAR，对三条部分序列的重叠区进行拼接，从而获得完整的新基因序列。获得的猪5羟色胺4受体b亚型基因cDNA序列见SEQ ID NO.7。将猪5羟色胺4受体b亚型基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.7。

本发明从猪的结肠组织总RNA中扩增出的5羟色胺4受体b亚型基因的核苷酸序列，该基因全长1209bp，开放阅读框lbp-1209bp区段，编码有402个氨基酸的蛋白质，分子量为44960道尔顿，等电点(pI)为8.08。由三个RT-PCR产物拼接而成，长度分别为445bp、407bp、952bp，电泳结果见附图1、2、3，cDNA拼接结果见附图4。在SEQ ID NO.7中，其中1-3位为起始密码子ATG，1207-1209位为终止密码子TAG，1-1209位为编码蛋白质区域(CDS)。

猪5羟色胺4受体b亚型基因的核甘酸序列如下：

1      ATGGACAAAC TTGATGCTAA TGGGAGTTCC AAGGAGGGTT TCGGGTCCGT GGAGAAGGTC

61     GTGTTGCTCA CGTTTGTCTC GGCGGTTATC CTCATGGCTG TCTTGGGGAA CCTGCTGGTG

121    ATGGTGGCTG TGTGCAGGGA CCGGCAGCTC AGGAAAATCA AAACCAATTA CTTCATTGTG

181    TCTCTTGCCT TTGCGGATCT GCTGGTGTCC GTGCTGGTGA TGCCCTTTGG AGCCATTGAG

241    CTGGTCCAGG ACGTCTGGAT TTATGGGGAG ATGTTCTGCC TCGTCCGGAC GTCTCTGGAT

301    GTCCTGCTCA CGACGGCATC GATTTTTCAC CTGTGCTGCA TCTCTCTGGA CAGGTACTAC

361    GCCATCTGCT GCCAGCCTCT GGTCTACAGG AACAAGATGA CCCCTCTGCG CGTGGCGGTG

421    CTGCTCGCAG GCTGCTGGGC CATCCCCGTG CTGATCTCCT TTCTCCCCAT AATGCAAGGC

481    TGGAATAACA TCGGCATAAC TGACCTGGAA AGGACATCCA AACCAAGACT GGGCCAGGAT

541    TTGCATGTGA TAGAAAAAAG GAAGTTCCAC CAGAATTCGA ACTCTACGTA CTGTATCTTC

601    ATGGTCAACA AGCCCTACGC CATCACCTGC TCTGTGGTGG CCTTCTACAT CCCGTTCCTC

661    CTCATGGTGC TGGCCTATTG GCGCATCTAC GTGACAGCTA AGGAGCACGC CCACCAGATC

721    CAGATGTTGC AACGGGCAGG GGCCCCCGCA GAGGGCAGGC CTCCGTCCGC AGACCAGCAC

781    AGCACCCATC GCATGAGGAC AGAGACCAAA GCAGCCAAGA CCCTGTGCGT CATCATGGGT

841    TGCTTCTGCC TCTGCTGGGC TCCGTTCTTC GTCACCAATG TCGTGGACCC TTTCGCAGAC

901    TACTCTGTCC CCGGGCAGGT GTGGACCGCT TTCCTCTGGC TCGGCTACAT CAATTCCGGG

961    TTGAACCCCT TTCTCTACGC CTTCCTGAAT AAGTCTTTCA GACGTGCCTT CCTCATCATC

1021   CTCTGCTGCG ATGATGAGCG CTACCGAAGA CCTTGCGTGG CGGGCCAGAC GGTCCCCTGT

1081   TCAACCACAA CCGTCAACGG ATCCACTCAT GTGCTAAGGG ATGCAGTGGA GTGTGGTGGC

1141   CAGTGGGAGA GTCAGTGCCA CCCGCCAGCA ACTTCTCCTT TGGTGGCTGC TCAGCCCAGT

1201   GACACTTAG

本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因编码402个氨基酸，分子量为44960道尔顿，等电点(pI)为8.08。

猪5羟色胺4受体b亚型的氨基酸序列如下：

1     MDKLDANGSS KEGFGSVEKV VLLTFVSAVI LMAVLGNLLV MVAVCRDRQL RKIKTNYFIV

61    SLAFADLLVS VLVMPFGAIE LVQDVWIYGE MFCLVRTSLD VLLTTASIFH LCCISLDRYY

121   AICCQPLVYR NKNTPLRVAV LLAGCWAIPV LISFLPIMQG WNNIGITDLE RTSKPRLGQD

181   LHVIEKRKFH QNSNSTYCIF MVNKPYAITC SVVAFYIPFL LMVLAYWRIY VTAKEHAHQI

241   QMLQRAGAPA EGRPPSADQH STHRMRTETK AAKTLCVIMG CFCLCWAPFF VTNVVDPFAD

301   YSVPGQVWTA FLWLGYINSG LNPFLYAFLN KSFRRAFLII LCCDDERYRR PCVAGQTVPC

361   STTTVNGSTH VLRDAVECGG QWESQCHPPA TSPLVAAQPS DT

本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因在GenBank核苷酸数据库中搜寻同源序列，发现该基因编码蛋白的核苷酸序列(CDS)同其它哺乳动物的同源基因具有高度的同源性。同GenBank中已知的两个猪5羟色胺4受体基因的部分CDS序列同源性均为100％(Z48176、Z48175)；同人的5羟色胺4受体b亚型CDS序列同源性为91％(AJ278980)；同大鼠的同源性为79.49％(U20907)；同小鼠的同源性为84.53％(Y09585)；同狗的同源性为89.99％(AX068008)；同豚鼠的同源性为84.86％(Y13585)。

本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因在GenBank蛋白质数据库中搜寻同源序列，发现该基因编码的氨基酸序列同其它哺乳动物的同源基因的氨基酸序列同样具有高度的同源性。同人的5羟色胺4受体b亚型氨基酸序列同源性为88.81％(CAC22249)；同大鼠的同源性为80.95％(AAC52233)；同小鼠的同源性为86.07％(CAA70773)；同豚鼠的同源性为88.31％(CAA73912)；同狗的同源性为90.55％。

本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因在NCBI数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人5羟色胺4受体b亚型基因(AJ278980)在核苷酸水平上具有91％的相同性，详见附表1；在氨基酸水平上，它与人5羟色胺4受体b亚型基因(CAC22249)也有88％的相同性，详见附表2。由此可见，猪5羟色胺4受体b亚型基因与人5羟色胺4受体b亚型基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。人5羟色胺4受体b亚型基因(AJ278980)已经被证明具有明显的调节胃肠运动的作用，可以认为猪5羟色胺4受体b亚型基因在调节猪的胃肠运动功能上也具有相似的作用。

本发明中的猪5羟色胺4受体b亚型基因在同人、鼠、豚鼠等物种的5羟色胺4受体b亚型基因核苷酸序列的比较中发现，在猪5羟色胺4受体b亚型的核苷酸序列第507位点***一个含有42个碱基的外显子，其氨基酸序列第169位***14个氨基酸。猪的这一结构与狗相同，这种结构的变化可能会导致蛋白质功能的变化。

在本发明中，通过对哺乳动物6个物种的18条5羟色胺4受体基因的编码蛋白序列进行聚类分析，结果表明本发明获得的SEQ ID NO.7符合5羟色胺4受体基因的进化规律，间接证明了所得到的序列确为5羟色胺4受体基因家族成员。

                               表1

91％ identity in 609nt overlap

Query：548  tgatagaaaaaaggaagttccaccagaattcgaactctacgtactgtatcttcatggtca 607

            |||||||||| ||||||||| ||||||| || ||||||||||||||| ||||||||||||

Sbjct：512  tgatagaaaagaggaagttcaaccagaactctaactctacgtactgtgtcttcatggtca 571

Query：608  acaagccctacgccatcacctgctctgtggtggccttctacatcccgttcctcctcatgg 667

            |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||

Sbjct：572  acaagccctacgccatcacctgctctgtggtggccttctacatcccatttctcctcatgg 631

Query：668  tgctggcctattggcgcatctacgtgacagctaaggagcacgcccaccagatccagatgt 727

            ||||||||||||  |||||||| || |||||||||||||| ||||| |||||||||||||

Sbjct：632  tgctggcctattaccgcatctatgtcacagctaaggagcatgcccatcagatccagatgt 691

Query：728  tgcaacgggcagaggcccccgcagagggcaggcctccgtccgcagaccagcacagcaccc 787

            | ||||||||||| ||| || | ||| ||||||||| ||| ||||||||||| ||||| |

Sbjct：692  tacaacgggcaggagcctcctccgagagcaggcctcagtcggcagaccagcatagcactc 751

Query：788  atcgcatgaggacagagaccaaagcagccaagaccctgtgcgtcatcatgggttgcttct 847

            ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

Sbjct：752  atcgcatgaggacagagaccaaagcagccaagaccctgtgcatcatcatgggttgcttct 811

Query：848  gcctctgctgggctccgttcttcgtcaccaatgtcgtggaccctttcgcagactactctg 907

            ||||||||||||| || ||||| ||||||||| | ||||| ||||||  ||||||| |||

Sbjct：812  gcctctgctgggcaccattctttgtcaccaatattgtggatcctttcatagactacactg 871

Query：908  tccccgggcaggtgtggaccgctttcctctggctcggctacatcaattccgggttgaacc 967

            |||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||

Sbjct：872  tccctgggcaggtgtggactgctttcctctggctcggctatatcaattccgggttgaacc 931

Query：968  cctttctctacgccttcctgaataagtctttcagacgtgccttcctcatcatcctctgct 1027

            | ||||||||||||||| ||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：932  cttttctctacgccttcttgaataagtcttttagacgtgccttcctcatcatcctctgct 991

Query：1028 gcgatgatgagcgctaccgaagaccttgcgtggcgggccagacggtcccctgttcaacca 1087

            | ||||||||||||||||||||||||| | |   ||||||||| ||||| ||||||||||

Sbjct：992  gtgatgatgagcgctaccgaagaccttccattctgggccagactgtcccttgttcaacca 1051

Query：1088 caaccgtcaacggatccactcatgtgctaagggatgcagtggagtgtggtggccagtggg 1147

            ||||| | || |||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：1052 caaccattaatggatccacacatgtactaagggatgcagtggagtgtggtggccagtggg 1111

Query：1148 agagtcagtgccacccgccagcaacttctcctttggtggctgctcagcccagtgacactt 1207

            |||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：1112 agagtcagtgtcacccgccagcaacttctcctttggtggctgctcagcccagtgacactt 1171

Query：1208 ag 1209

            ||

Sbjct：1172 ag 1173

Query：猪5羟色胺4受体b亚型的核苷酸序列

Sbjct：人5羟色胺4受体b亚型的核苷酸序列(AJ278980)

表1为本发明的猪5羟色胺4受体b亚型与人5羟色胺4受体b亚型的核苷酸序列的同源比较表。

                                  表2

88％identity in 357aa overlap，93％similarity in 374aa overlap

Query：1   MDKLDANGSSKEGFGSVEKVVLLTFVSAVILMAVLGNLLVMVAVCRDRQLRKIKTNYFIV 60

           MDKLDAN SS+EGFGSVEKVVLLTF+S VILMA+LGNLLVMVAVC DRQLRKIKTNYFIV

Sbjct：1   MDKLDANVSSEEGFGSVEKVVLLTFLSTVILMAILGNLLVMVAVCWDRQLRKIKTNYFIV 60

Query：61  SLAFADLLVSVLVMPFGAIELVQDVWIYGEMFCLVRTSLDVLLTTASIFHLCCISLDRYY 120

           SLAFADLLVSVLVMPFGAIELVQD+WIYGE+FCLVRTSLDVLLTTASIFHLCCISLDRYY

Sbjct：61  SLAFADLLVSVLVMPFGAIELVQDIWIYGEVFCLVRTSLDVLLTTASIFHLCCISLDRYY 120

Query：121 AICCQPLVYRNKMTPLRVAVLLAGCWAIPVLISFLPIMQGWNNIGITDLERTSKPRLGQD 180

           AICCQPLVYRNKMTPLR+A++L GCW IP  ISFLPIMQGWNNIGI DL

Sbjct：121 AICCQPLVYRNKMTPLRIALMLGGCWVIPTFISFLPIMQGWNNIGIIDL----------- 169

Query：181 LHVIEKRKFHQNSNSTYCIFMVNLPYAITCSVVAFYIPFLLMVLAYWRIYVTAKEHAHQI 240

              IEKRKF+QNSNSTYC+FMVNKPYAITCSVVAFYIPFLLMVLAY+RIYVTAKEHAHQI

Sbjct：170 ---IEKRKFNQNSNSTYCVFMVNKPYAITCSVVAFYIPFLLMVLAYYRIYVTAKEHAHQI 226

Query：241 QMLQRAGAPAEGRPPSADQHSTHRMRTETKAAKTLCVIMGCFCLCWAPFFVTNVVDPFAD 300

           QMLQRAGA +E RP SADQHSTHRMRTETKAAKTLC+IMGCFCLCWAPFFVTN+VDPF D

Sbjct：227 QMLQRAGASSESRPQSADQHSTHRMRTETKAAKTLCIIMGCFCLCWAPFFVTNIVDPFID 286

Query：301 YSVPGQVWTAFLWLGYINSGLNPFLYAFLNKSFRRAFLIILCCDDERYRRPCVAGQTVPC 360

           Y+VPGQVWTAFLWLGYINSGLNPFLYAFLNKSFRRAFLIILCCDDERYRRP + GQTVPC

Sbjct：287 YTVPGQVWTAFLWLGYINSGLNPFLYAFLNKSFRRAFLIILCCDDERYRRPSILGQTVPC 346

Query：361 STTTVNGSTHVLRDAVECGGQWESQCHPPATSPLVAAQPSDT 402

           STTT+NGSTHVLRDAVECGGQWESQCHPPATSPLVAAQPSDT

Sbjct：347 STTTINGSTHVLRDAVECGGQWESQCHPPATSPLVAAQPSDT 388

Query：猪5羟色胺4受体b亚型的氨基酸序列

Sbjct：人5羟色胺4受体b亚型的氨基酸序列(CAC22249)

表2为本发明的猪5羟色胺4受体b亚型与人5羟色胺4受体b亚型的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

目前，在猪5羟色胺4受体基因的研究中只有部分的CDS序列(GenBank Z48176和Z48175)。本发明首次克隆出全长CDS序列。

Kohtaro等针对外周组织中5羟色胺4受体在胃肠***中的功能进行了研究。结果表明5羟色胺4受体在胃肠***中主要参与调节胃肠运动的功能，并且随着受体活性的增强往往导致应激性腹泻(J Gastroenterol 2000； 35：575-582)。

本发明具有实质性特点和显著进步，本发明猪5羟色胺4受体b亚型基因对猪胃肠运动功能调节有重要调控作用，是研究猪应激性腹泻以及进行猪分子标记辅助育种重要的候选基因。本发明的一方面可以通过制备该基因的蛋白，用于研究该基因在调节猪胃肠运动功能中的作用；另一方面可以为建立应激性腹泻的动物模型提供理论基础，并且能够为猪分子标记辅助育种起到指导性作用，因此本发明具有很大的应用价值。

附图说明

图1猪5羟色胺4受体b亚型基因RT-PCR第一段产物电泳图

图中电泳条带经过凝胶成像***分析大小为445bp。

图2猪5羟色胺4受体b亚型基因RT-PCR第二段产物电泳图

图中电泳条带经过凝胶成像***分析大小为407bp。

图3猪5羟色胺4受体b亚型基因RT-PCR第三段产物电泳图

图中电泳条带经过凝胶成像***分析大小为952bp。

图4猪5羟色胺4受体b亚型基因CDS序列拼接图

图中三条部分cDNA序列重叠区拼接后得到完整的CDS序列，大小为1209bp。

图5猪同其它物种5羟色胺4受体基因编码序列聚类分析图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

猪5一羟色胺4受体b亚型基因cDNA序列的克隆

1.组织分离(Isolation)

在猪场屠宰30日龄杜长大商品仔猪，取结肠组织样，迅速放入液氮中，冷冻后保存于实验室-70℃冰箱中，准备提取组织总RNA。

2.总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1)提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3％的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1％的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5％的SDS处理。

Tip头、EP管用0.1％的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。

(2)组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol(trizal reagent，invitrogenBRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4℃12000g离心10分钟。吸取上清液，15-30℃温育5分钟。加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30℃温育2-3分钟。4℃12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30℃温育10分钟，4℃12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗涤RNA，4℃7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNasefree)中分装，-70℃保存。

(3)组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：

电泳槽用RNA清洗液(100mM NaOH，1mM EDTA)浸泡4-5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在10ul上样缓冲液(2×TBE，13％菲可，0.1％溴酚兰，7M尿素)中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2-3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。

3.全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)

(1)引物设计及合成

根据GenBank发表的人(AJ278980，NM000870)、大鼠(NM008313)、小鼠(NM012853)，豚鼠(Y13585)等物种的5羟色胺4受体基因CDS同源序列，设计六条引物[BP001(SEQID NO.1)、BP002(SEQ ID NO.2)、BP003(SEQ ID NO.3)、BP004(SEQ ID NO.4)、BP005(SEQ ID NO.5)、BP006(SEQ ID NO.6)]用于以猪cDNA为模版的PCR扩增。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海华诺生物技术有限公司合成。

(2)反转录反应(RT)

按大连宝生物反转录试剂盒(RNA PCR Kit Ver.2.1)要求进行反转录。反转录反应液组成：2ul 10×RNA PCR Buffer，4ul 25Mm MgCl，2ul dNTP Mixture，0.5ul RnaseInhibitor(40U/ul)，1ul AMV Reverse Transcriptase(5U/ul)，1ul Oligo dTPrimer，1ul RNA Sample，8.5ul Rnase Free dH₂O，总体系为20ul。反转录反应条件：30℃5分钟，42℃30分钟，99℃5分钟，5℃5分钟。

(3)PCR反应

用RT产物为模板进行PCR反应。其反应参数为：95℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到445bp cDNA片段(见附图1)、PCR[BP003(SEQ ID NO.3)+BP004(SEQ ID NO.4)]得到407bp cDNA片段(见附图2)、PCR[BP005(SEQ ID NO.5)+BP006(SEQ ID NO.6)]得到952bp cDNA片段(见附图3)。

(4)克隆测序

将PCR产物回收后同PMD 18-T Vector(TaKaRa)相连接，转化到感受态的大肠杆菌JM109中。经过菌株PCR和双酶切鉴定后的菌株在LB培养基37℃培养过夜，取酋液10ml送交生物技术公司测序。

(5)全长cDNA的拼接

运用生物学软件DNAMAN分析三次RT-PCR的测序结果，得到三条猪5羟色胺4受体b亚型基因部分CDS序列，长度分别为445bp、407bp、952bp。通过DNASTAR的SeqManII工具，将三条部分CDS序列的重叠区进行拼接，获得猪5羟色胺4受体b亚型基因完整的CDS序列，拼接结果见附图4。

实施例2

猪5羟色胺4受体b亚型基因序列分析和同源性比较

1、猪5羟色胺4受体b亚型基因序列分析

本发明新的猪5羟色胺4受体b亚型基因cDNA的长度为1029bp，详细序列见SEQ ID NO.7，其中开放读框位于1-1029位核苷酸(1029个核苷酸)。根据cDNA推导出猪5羟色胺4受体b亚型的氨基酸序列，共402个氨基酸残基，分子量为44960道尔顿，等电点(pI)为8.08。详细序列见SEQ ID NO.7。

2、5羟色胺4受体b亚型基因同源性比较

将猪5羟色胺4受体b亚型基因cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人5羟色胺4受体b亚型基因(AJ278980)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表1)；在氨基酸水平上，它与人5羟色胺4受体b亚型基因(CAC22249)也有88.81％的相同性(附表2)。由此可见，猪5羟色胺4受体b亚型基因与人5羟色胺4受体b亚型基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。人5羟色胺4受体b亚型基因(AJ278980)已经被证明具有明显的调节胃肠运动的作用，可以认为猪5羟色胺4受体b亚型基因在调节猪的胃肠运动功能上也具有相似的作用。

3、5羟色胺4受体基因编码序列聚类分析

在GenBank上搜索并获得人、鼠、狗等5个物种的17条5羟色胺4受体基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.7序列，利用分子生物学软件PHYLIP构建了聚类分析图(见附图5)。结果显示：5羟色胺4受体基因进化同物种进化规律相一致；本发明获得的SEQ ID NO.7符合5羟色胺4受体基因的进化规律，间接证明了所得到的序列确为5羟色胺4受体基因家族成员。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：18bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.1

TTCCTCCTCATGGTGCTG

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：21bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.2

CGTTGACGGTTGTGGTTGAAC

(3)SEQ ID NO.3的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：19bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.3

AGACCAAAGCAGCCAAGAC

(4)SEQ ID NO.4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：19bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.4

TCAGCCCAGTGACACTTAG

(5)SEQ ID NO.5的信息

(i)序列特征：

    (A)长度：18bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.5

ATGGACAAACTTGATCCT

(6)SEQ ID NO.6的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：19bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

(iii).序列描述：SEQ ID NO.6

TGATGTAGCCGAGCCAGAG

(7)SEQ ID NO.7的信息

<110>上海交通大学

<120>猪5-羟色胺4受体b亚型基因蛋白编码序列

<140>

<141>2004-03-12

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1209

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<400>1

1      ATGGACAAAC TTGATGCTAA TGGGAGTTCC AAGGAGGGTT TCGGGTCCGT GGAGAAGGTC

61     GTGTTGCTCA CGTTTGTCTC GGCGGTTATC CTCATGGCTG TCTTGGGGAA CCTGCTGGTG

121    ATGGTGGCTG TGTGCAGGGA CCGGCAGCTC AGGAAAATCA AAACCAATTA CTTCATTGTG

181    TCTCTTGCCT TTGCGGATCT GCTGGTGTCC GTGCTGGTGA TGCCCTTTGG AGCCATTGAG

241    CTGGTCCAGG ACGTCTGGAT TTATGGGGAG ATGTTCTGCC TCGTCCGGAC GTCTCTGGAT

301    GTCCTGCTCA CGACGGCATC GATTTTTCAC CTGTGCTGCA TCTCTCTGGA CAGGTACTAC

361    GCCATCTGCT GCCAGCCTCT GGTCTACAGG AACAAGATGA CCCCTCTGCG CGTGGCGGTG

421    CTGCTCGCAG GCTGCTGGGC CATCCCCGTG CTGATCTCCT TTCTCCCCAT AATGCAAGGC

481    TGGAATAACA TCGGCATAAC TGACCTGGAA AGGACATCCA AACCAAGACT GGGCCAGGAT

541    TTGCATGTGA TAGAAAAAAG GAAGTTCCAC CAGAATTCGA ACTCTACGTA CTGTATCTTC

601    ATGGTCAACA AGCCCTACGC CATCACCTGC TCTGTGGTGG CCTTCTACAT CCCGTTCCTC

661    CTCATGGTGC TGGCCTATTG GCGCATCTAC GTGACAGCTA AGGAGCACGC CCACCAGATC

721    CAGATGTTGC AACGGGCAGG GGCCCCCGCA GAGGGCAGGC CTCCGTCCGC AGACCAGCAC

781   AGCACCCATC GCATGAGGAC AGAGACCAAA GCAGCCAAGA CCCTGTGCGT CATCATGGGT

841   TGCTTCTGCC TCTGCTGGGC TCCGTTCTTC GTCACCAATG TCGTGGACCC TTTCGCAGAC

901   TACTCTGTCC CCGGGCAGGT GTGGACCGCT TTCCTCTGGC TCGGCTACAT CAATTCCGGG

961   TTGAACCCCT TTCTCTACGC CTTCCTGAAT AAGTCTTTCA GACGTGCCTT CCTCATCATC

1021  CTCTGCTGCG ATGATGAGCG CTACCGAAGA CCTTGCGTGG CGGGCCAGAC GGTCCCCTGT

1081  TCAACCACAA CCGTCAACGG ATCCACTCAT GTGCTAAGGG ATGCAGTGGA GTGTGGTGGC

1141  CAGTGGGAGA GTCAGTGCCA CCCGCCAGCA ACTTCTCCTT TGGTGGCTGC TCAGCCCAGT

1201  GACACTTAG

<210>2

<211>402

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

1     MDKLDANGSS KEGFGSVEKV VLLTFVSAVI LMAVLGNLLV MVAVCRDRQL RKIKTNYFIV

61    SLAFADLLVS VLVMPFGAIE LVQDVWIYGE MFCLVRTSLD VLLTTASIFH LCCISLDRYY

121   AICCQPLVYR NKMTPLRVAV LLAGCWAIPV LISFLPIMQG WNNIGITDLE RTSKPRLGQD

181   LHVIEKRKFH QNSNSTYCIF MVNKPYAITC SVVAFYIPFL LMVLAYWRIY VTAKEHAHQI

241   QMLQRAGAPA EGRPPSADQH STHRMRTETK AAKTLCVIMG CFCLCWAPFF VTNVVDPFAD

301   YSVPGQVWTA FLWLGYINSG LNPFLYAFLN KSFRRAFLII LCCDDERYRR PCVAGQTVPC

361   STTTVNGSTH VLRDAVECGG QWESQCHPPA TSPLVAAQPS DT

Claims (4)

1、一种猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列，其特征在于，从猪的结肠组织总RNA中扩增出的5羟色胺4受体b亚型基因的核苷酸序列，该基因全长1209bp，开放阅读框1bp-1209bp区段，编码有402个氨基酸的蛋白质，分子量为44960道尔顿，等电点pI为8.08。

2、根据权利要求1所述的猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列，其特征是，该基因编码蛋白的核苷酸序列CDS同其它哺乳动物的同源基因具有高度的同源性，同GenBank中已知的两个猪5羟色胺4受体基因的部分CDS序列同源性均为100％(Z48176、Z48175)；同人的5羟色胺4受体b亚型CDS序列同源性为91％(AJ278980)；同大鼠的同源性为79.49％(U20907)；同小鼠的同源性为84.53％(Y09585)；同狗的同源性为89.99％(AX068008)；同豚鼠的同源性为84.86％(Y13585)。

3、根据权利要求1或者2所述的猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列，其特征是，该基因编码的氨基酸序列同其它哺乳动物的同源基因的氨基酸序列同样具有高度的同源性，同人的5羟色胺4受体b亚型氨基酸序列同源性为88.81％(CAC22249)；同大鼠的同源性为80.95％(AAC52233)；同小鼠的同源性为86.07％(CAA70773)；同豚鼠的同源性为88.31％(CAA73912)；同狗的同源性为90.55％。

4、根据权利要求1或者2所述的猪5羟色胺4受体b亚型的基因序列，其特征是，在同人、鼠、豚鼠等物种的5羟色胺4受体b亚型基因核苷酸序列的比较中发现，在猪5羟色胺4受体b亚型的核苷酸序列第507位点***一个含有42个碱基的外显子，其氨基酸序列第169位***14个氨基酸。

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