CN1548149A - 重组α干扰素在防治呼吸***感染制药中的应用 - Google Patents

Abstract

α干扰素现主要用于慢性病毒性感染。本发明利用冠状病毒或鼻病毒感染的人***细胞(HELA)作为评价模型，观察不同α干扰素对引起呼吸***感染的常见病毒的抑制效果，表明α干扰素可用于防治由冠状病毒和鼻病毒引起的疾病，包括严重的急性呼吸道综合症(SARS)，其中集成干扰素及其突变体和干扰素α1b对新型SARS病毒有更好的抑制作用。

Description

重组α干扰素在防治呼吸***感染制药中的应用

一、技术领域

本发明属生物制药领域，主要涉及重组α干扰素(recombinant αInterferon)在制备用于防治由冠状病毒、鼻病毒等引发的疾病中的应用

二、背景技术

干扰素具有广泛的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，其作用机理是通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内复制，增强NK细胞活性及其他免疫调节作用，有效地遏制病毒侵袭和感染的发生，并有抑制肿瘤细胞生长、清除早期病变细胞等多方面的作用。由于干扰素具有上述重要作用，因此人们对它的研究也在不断深入，并有新的干扰素分子被不断发现，目前已知的干扰素分子主要有一下9种：干扰素-α：属I型干扰素，约有23个变种，较详细研究的有约13种亚型。分子量为19-26kDa，由156-166个氨基酸残基组成，在115-151之间为保守序列；干扰素-β：属I型干扰素，主要由成纤维细胞所产生，由166个氨基酸残基组成，其中Cys31/141之间的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。它在DNA水平上与干扰素α有30％的同源性；干扰素-γ：属II型干扰素，由T细胞和NK细胞刺激所产生。由143个氨基酸残基组成，与干扰素α和β无明显的同源性；干扰素-ω：属I型干扰素，是人白细胞干扰素的自然成分，与干扰素-α高度同源。干扰素ω结合于与干扰素-α和β同样的细胞受体；干扰素-τ：属I型干扰素，由172个氨基酸残基组成。它在反刍动物识别母体和建立孕体上起有重要作用；干扰素-δ：属I型干扰素，由149个氨基酸残基组成；干扰素-λ(1-3)：包括干扰素-λ-1、2和3，它们通过同一组受体***进行信号传递；干扰素-κ：属I型干扰素，207个氨基酸，N端27个氨基酸是信号肽，与I型干扰素的其它成员有约30％的同源性；干扰素-ε：属I型干扰素，由189个氨基酸残基组成，N端21个氨基酸为信号肽，有一个分子内二硫键和一个游离的半胱氨酸残基。

在上述干扰素分子中，临床应用最广泛的为α家族干扰素，主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、慢性粒细胞白血病、慢性***、毛细胞白血病等近40种疾病。除了早期开发成功的干扰素α1b、α2a、α2b之外，目前在临床上使用的还有集成干扰素(IFN-con)。集成干扰素并不是自然界中存在的天然分子，它是通过比较十几种α亚型的干扰素分子，并选取其中的保守序列人工组合而成的一种分子。我单位对集成干扰素进行了系列突变体的筛选，并已申报专利(新型α干扰素突变体及其制备方法，申请号：02159950.5)。

尽管α干扰素已用于多种疾病的治疗，但主要适应症为病毒引发的慢性疾病，还没有文献报道可用于由病毒引发的急性疾病，例如SARS(severe acute respiratory syndrome)等。

SARS译为严重性急性呼吸道综合症，在我国又称为“非典型性肺炎”。2002年11月起在我国广东省发现病例，在2003年2月底，在香港发生流行，并很快传播到北美、欧洲和其它亚洲国家。经过全球科学家的共同努力，认为SARS疾病是由一种(+)链有膜的RNA病毒引起，经过形态鉴定和遗传信息分析，认为该病毒属新型冠状病毒，接近第2组。

本发明的目的在于研究用α干扰素预防和治疗包括SARS在内的由冠状病毒和鼻病毒等引发的呼吸***疾病。

三、发明内容

由于本发明使用的干扰素的纯化方法在文献上均有详细描述，在此不予重复。另外，本发明使用的药物制剂为干扰素与可作为药物的载体、佐剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂一起组成的药物制剂。其中稀释剂包括各种具有一定的pH值和离子强度范围的稀释剂；载体为人血白蛋白等；增溶剂包括吐温、聚乙二醇等；防腐剂包括硫汞撒、间甲苯酚、苯甲醇等。由于上述内容均为本领域技术人员所公知，在此亦不予详述。

本发明重点研究了干扰素α1b、α2a、α2b和集成干扰素在细胞模型上对SARS冠状病毒和鼻病毒的抑制作用。我们分别用病人体内分离得到的SARS病毒(新型冠状病毒)、鼻病毒攻击人***细胞(HELA)系，同时给予不同浓度的上述干扰素，观察细胞病变的抑制情况。实验结果显示，α1b、α2a、α2b在抑制由冠状病毒、鼻病毒引起的细胞病变时，效果基本相同，但集成干扰素与三者相比，在产生相同抑制效果的情况下，用量明显偏低。另外，集成干扰素对SARS病毒有较强的抑制作用，干扰素α1b对SARS病毒的抑制效果略高于干扰素α2a和α2b。

上述结果提示，α干扰素可用于治疗由SARS病毒(冠状病毒)和鼻病毒引起的疾病，其中集成干扰素和干扰素α1b对SARS病毒有更好的抑制作用。这说明，α干扰素可用于防治由冠状病毒、鼻病毒引起的呼吸***疾病，尤其是SARS病，而相同观点未见文献报道。

四：具体实施方式

在HELA细胞培养内，采用细胞病变抑制法(CPE)法，观察不同浓度的重组干扰素对冠状病毒和鼻病毒的抑制作用。

1.材料

1)药物：重组人干扰素α1b、重组集成干扰素α及突变体(为申请号为02159950.5中的多个分子)、干扰素α2a和α2b。

2)阳性对照药物：注射用更昔洛韦。

3)细胞：人***细胞(HELA)。

4)病毒：冠状病毒9号(SARS病人咽拭子分离株)和鼻病毒(普通感冒病人咽拭子分离株)。

2.实验方法

1)干扰素对HELA细胞的毒性测定方法

HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO₂培养24小时，加入干扰素，干扰素倍比稀释为25mg/ml～1.0ug/ml，更昔洛韦为6000ug/ml～11.7ug/ml。每浓度接种3孔，每孔100ul，同时设正常细胞对照，37℃、5％CO₂培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)。

2)在HELA细胞培养内对冠状病毒或鼻病毒的毒力测定方法(病毒CPE法)

HELA细胞以每毫升40万浓度接种96孔板，37℃、5％CO₂培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10^-1～10^-8，8个浓度，每浓度3孔，每孔100ul，设正常细胞对照，37℃、5％CO₂培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID₅₀。

3)干扰素在HELA细胞培养内对冠状病毒和鼻病毒的抑制实验

观察不同浓度的重组干扰素在HELA细胞培养内对冠状病毒和鼻病毒的预防作用，试验采用细胞病变抑制法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)，判断药效。

HELA细胞以40万/毫升浓度接种96孔板，37℃、5％CO₂培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入不同浓度的重组干扰素，药物选用对细胞最大无毒浓度(TD₀)，2倍稀释10个浓度，阳更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即375ug/ml～0.73ug/ml；每浓度3孔，置37℃、5％CO₂吸附2.5小时，加入100TCID₅₀的冠状病毒或鼻病毒，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO₂培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++～++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)，判断疗效，试验重复三次。

3.试验结果

用最小有效浓度(MIC)来评价不同干扰素对病毒的防治效果，结果见下表：

               不同α干扰素抑制细胞病变的作用结果

病毒种类	最小有效浓度(MIC)(ug/ml)
						集成干扰素α	集成干扰素α突变体	干扰素α1b	干扰素α2a	干扰素α2b
	冠状病毒9株	2.2±0.2	1.8±0.6	7.3±0.5	9.3±0.6						9.1±0.7
鼻病毒						1.6±0.1	1.9±0.4	5.4±0.3	6.8±0.5	8.6±0.5

由上表可以看出，α干扰素可用于防治由冠状病毒、鼻病毒引起的相关疾病，其中集成干扰素及其突变体和干扰素α1b有更好的抑制作用。

Claims (5)

1.重组人α干扰素在制药中的应用，其特征在于应用于防治冠状病毒和鼻病毒等引起的呼吸***感染性疾病。

2.如权利要求1所述，其特征在于重组α干扰素为重组人干扰素αlb。

3.如权利要求1所述，其特征在于重组α干扰素为重组集成干扰素(IFN-con)及其突变体。

4.如权利要求1所述，其特征在于病原体为冠状病毒、鼻病毒。

5.如权利要求1所述，其特征在于所指的疾病为SARS病(severeacute respiratory syndrome：严重的急性呼吸道综合症)和普通感冒。