CN1546641A - 用于干细胞体外培养的生物反应器*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于干细胞体外培养的生物反应器***，至少包括：反应器，搅拌装置，混合气体和碱液入口，混合气体出口，设有上部出气口和下部出气口并与所说的混合气体出口相连通的通气管，培养液入口，培养液出口，细胞回流入口，细胞截留器，pH电极，溶氧浓度电极和控制装置。本发明的生物反应器在干细胞体外培养时，能模拟体内环境，反应器操作弹性大，***通过调节氮气或氧气来改变总进气中氧分压，培养环境的pH值和DO水平稳定。

Description

用于干细胞体外培养的生物反应器***

技术领域

本发明涉及一种生物反应器***，具体地说涉及一种用于干细胞体外培养的生物反应器***。

背景技术

干细胞的体外培养和扩增是干细胞生物工程的重点和难点之一，而要实现干细胞在体外的生长、扩增和定向分化诱导，则必需为其提供理想的培养环境，其中能满足干细胞培养要求的生物反应器***是实现这一目的的基础。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，从某种意义上说，生命体是通过干细胞的***来实现体内细胞的更新和持续生长的，新的分化细胞的不断产生以及由分化细胞组成而本身不能再***的细胞或组织，都要通过由干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量，因此干细胞在生命体中起着决定性的作用。

研究发现，人类胚胎干细胞可在体外培养，成体干细胞也可在体外横向分化为其它类型的细胞和组织，这就为干细胞的应用提供了基础。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，在体外分离、培养干细胞已成为可能，而且可以利用干细胞进一步构建各种细胞、组织、器官等，以此作为移植组织和器官的来源，这是干细胞应用的主要方向，目前利用干细胞生成或修复造血、皮肤、神经、软骨等组织的技术都取得了一定的成功。

但干细胞的数目很少，需要在体外对其进行增殖。在体内，干细胞的发育和增殖受到多种机制和微环境的影响。在体外培养时，同样需要进行干细胞与各类生长因子和***等辅助细胞的共培养；而且不同组织来源的干细胞，其培养条件也不尽相同，需要分别进行研究；另外，在应用前，需要根据靶组织的类型对所培养干细胞进行定向分化诱导，使其向所需细胞或组织方向分化。这些过程都要求对与干细胞发育相关的调节信号和微环境的影响进行详细的研究，在此基础上，模拟其体内微环境，给干细胞提供较理想的生长发育条件，以培养得到所需的细胞或组织产品。

干细胞体外培养的难点在于干细胞本身数量较少，适应环境能力差，其生长发育的调控机制也较复杂，因此，需要先进的培养装置，以使其分离得到的干细胞能快速适应培养环境，而且要求在此装置中可方便地进行模拟体内微环境的各项操作，满足干细胞生长发育的需要。

对于干细胞培养，前人也曾开发了一些静态培养的生物反应器***，如美国Aastrom公司开发的用于造血干细胞培养的平板式生物反应器，但由于培养环境不均一，培养基中pH、溶氧、营养物和代谢物存在浓度梯度，此浓度梯度还会由于初始条件如接种浓度、细胞类型的分布、培养基成分和培养样品的扩增程度不同而在各批培养之间造成很大的差异。而且，静态***没有操作弹性，不能实现三维培养，受底面积的限制，在细胞增殖到较高密度时细胞没有足够空间生长，而是相互叠加在底面上，因此造成生长的限制，而不能培养大量的细胞。另外静态培养***在实际应用过程中所遇到的细胞收获困难的问题一时也不能得到有效解决。

而另一方面，目前已有的搅拌式生物反应器一般都是针对成系细胞设计，并不适合于干细胞的培养，其不足之处主要在于：

(1)达到要求混合效果并使细胞悬浮的搅拌强度较高，一般至少在50rpm以上，且深层鼓泡是常用通气方式，但由于干细胞比成系细胞对剪切力更为敏感，因此这些反应器应用于干细胞培养往往会导致细胞受损而不能正常生长；

(2)干细胞在体外培养过程中要经历从体内环境到体外环境的适应过程，因此细胞本身对材料的生物相容性要求更高，而一般的生物反应器所用的材料只是针对成系细胞设计，对于干细胞的特殊要求未作考虑，培养结果并不理想；

(3)一般生物反应器的体积在1.5升以上，其最小工作体积至少也要500ml以上，其操作弹性不能满足干细胞培养的要求。成系细胞一般可通过种子细胞培养后再接种至反应器中，不存在种子细胞数量过少的问题。但对干细胞来说，其来源和数量十分有限，一次采集并纯化后获得的细胞数量严重不足，如果接种时初始培养体积过大，则接种密度会过低，不利于细胞的生存和生长；

(4)现有应用于成系细胞培养的生物反应器，在控制pH和溶氧(DO)浓度时采用二氧化碳、氧气、氮气独立脉冲进气再合并进入反应器的方式，对一般动物细胞培养过程而言可以不考虑气体间的相互干扰，但由于干细胞培养过程中气体流量较小，进气间的相互干扰会导致各气体分压的剧烈波动，进而造成pH和DO的大幅度波动，严重影响干细胞培养环境的稳定和均一。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种用于干细胞体外培养的生物反应器***，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足生物工程发展的需要。

本发明的技术方案：

一种用于干细胞体外培养的生物反应器***，至少包括：

一个圆柱状上端具有封盖的圆柱状反应器，高径比为2～4∶1；

一个设置在所述反应器中的搅拌装置；

一个设置在封盖上的混合气体和碱液入口；

一个设置在封盖上的混合气体出口；

一个设置在反应器内设有上部出气口和下部出气口并与所说的混合气体出口相连通的通气管；

一个设置在封盖上的培养液入口；

一个设置在封盖上的培养液出口；

一个设置在封盖上的细胞回流入口；

一个设有清液出口且入口与所说的培养液出口相连接的细胞截留器，截留器的出口与细胞回流入口相连接；

一个通过封盖设置在反应器内的pH电极；

一个通过封盖设置在反应器内的溶氧(DO)浓度电极；

一个与pH电极和溶氧浓度电极相连接并用于控制碱液和混合气体量的控制装置。

所说的混合气体包括CO₂、O₂、N₂和空气。

进一步，所说的搅拌装置的搅拌桨叶可采用20～40°斜叶提升式搅拌桨叶，并且桨叶直径与反应器直径比达到3～4∶5，确保低转速时有良好的混合效果，能有效悬浮细胞，并降低流体剪切。

本发明的反应器是这样操作的：

启动搅拌装置，调整转速控制范围，使反应器能在1-40rpm之间稳定运行。培养液通过培养液入口连续地送入预置有细胞的反应器，以补充营养物，混合气体通过混合气体和碱液入口连续地送入预置有细胞的反应器的上部和下部，混合气体通过混合气体出口排出反应器，含有细胞的培养液由培养液出口进入细胞截留器，活细胞与培养液通过细胞回流入口回流进入反应器，代谢副产物由细胞截留器清液出口排出，pH电极与溶氧浓度电极所测得的信号输入控制装置，以控制混合气体的输入量和比例，并同时控制碱液输入量，以调节反应器内培养液的pH值。

由上述公开的技术方案可见，本发明的生物反应器在干细胞体外培养时，pH、溶氧浓度等培养过程的相关参数采用自动检测控制技术，有利于实现体外培养过程优化和模拟体内环境，干细胞以悬浮培养方式取代传统静止或贴壁培养，便于细胞收获和维持培养环境的均一，有利于参数的检测、控制和优化；本发明针对干细胞的剪切敏感性，对通气和搅拌***进行了特殊设计，其中通气采用表面通气和深层鼓泡相结合的方式，搅拌桨采用30°斜叶提升式搅拌桨，并且桨叶直径与反应器直径比达到4/5，确保低转速时有良好的混合效果，能有效悬浮细胞，并降低流体剪切。针对干细胞来源有限数量不足的问题，反应器罐体设计采用较大的高径比，达到3/1，大大提高操作弹性，使反应器工作体积的操作范围达到0.1升至1.2升。在初始培养时由于干细胞数量偏少，可以采用小体积以提高细胞接种密度，使细胞在最短时间内适应体外培养环境。然后随着细胞生长和细胞密度的提高以及营养物消耗和代谢副产物结累，可以采用培养基流加的方式补充营养物，稀释细胞密度和代谢副产物浓度，同时使培养体积提高到反应器工作体积。在该生物反应器中干细胞培养过程能实现培养基连续灌注，取代现有间歇换液方式，有利于细胞培养环境的稳定和模拟体内微环境；

在pH和溶氧(DO)浓度控制方面，针对干细胞对培养环境参数波动十分敏感的特点，将pH和DO控制作为两个既独立又相关的控制***来进行设计，虽然它们有着各自独立的控制目标(即培养过程中的pH值和溶氧水平)，但由于四气体(空气、氮气、氧气及二氧化碳)之间的相互干扰而使两者之间又相互关联。为此该反应器采用了新颖的pH和DO四气体关联控制设计，通过分别调节空气、氮气、氧气及二氧化碳四气体的进气流量来改变总进气中氧和二氧化碳的分压比率，以实现精确控制pH和DO的目的。当***通过调节氮气或氧气来改变总进气中氧分压时，***会自动修正由此引起的二氧化碳分压变化，进而稳定培养环境的pH值(±0.02)；当***通过调节二氧化碳气体来改变总进气中二氧化碳的分压时，***也会自动修正由此引起的氧分压变化，使培养环境DO水平实现稳定(±1％)。

附图说明

图1为用于干细胞体外培养的生物反应器***的结构示意图。

图2控制装置结构示意图。

参见图1，本发明用于干细胞体外培养的生物反应器***，包括：

一个圆柱状上端具有封盖1的圆柱状反应器2，高径比为2～4∶1，优选的高径比为3∶1；

一个设置在所述反应器2中的搅拌装置3；

一个设置在封盖1上的混合气体和碱液入口4；

一个设置在封盖1上的混合气体出口5；

一个设置在反应器2内设有上部出气口6和下部出气口7并与所说的混合气体出口5相连通的通气管8；

一个设置在封盖1上的培养液入口9；

一个设置在封盖1上的培养液出口10；

一个设置在封盖1上的细胞回流入口11；

一个设有清液出口12且入口13与所说的培养液出口10相连接的细胞截留器14，截留器14的出口15与细胞回流入口11相连接，该截留器14为一种本领域常规的装置，如可采用“王兆伟、谭文松：ZL00116518.6细胞灌注培养过程中的细胞截留分离方法及其装置”专利公开的技术；

一个通过封盖1设置在反应器2内的pH电极16；

一个通过封盖1设置在反应器2内的溶氧浓度电极17；

一个与pH电极16和溶氧浓度电极17相连接的控制装置18，控制装置18的输出端分别与碱液泵22、CO₂气源23上的CO₂流量控制阀、空气气源24上的空气流量控制阀、N₂气气源25上的N₂气流量控制阀和O₂气气源26上的O₂气流量控制阀相连接，用于控制碱液和混合气体量，碱液泵22、CO₂气源23、空气气源24、N₂气气源25和O₂气气源26与混合气体和碱液入口4相连通。图中虚线表示电气连接。

所说的搅拌装置2的搅拌桨叶27可采用20～40°斜叶提升式搅拌桨，并且桨叶27直径与反应器2直径比为3～4∶5。

由图2可见，所说的控制装置18包括pH控制仪表19和溶氧浓度控制仪表20；

pH控制仪表19与pH电极16相连接，pH控制仪表19由SIEMENS公司S7系列S7-226型的可编程序控制器构成；pH控制仪表19的输出端与碱液泵22、CO₂气源23上的控制阀相连接；

溶氧浓度控制仪表20与溶氧浓度电极17相连接，溶氧浓度控制仪表20的输出端分别与N₂气、O₂气和空气气源上的控制阀相连接，溶氧浓度控制仪表20由SIEMENS公司S7系列的S7-226型可编程序控制器构成。

Claims (6)

1.一种用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，包括：

一个圆柱状上端具有封盖(1)的圆柱状反应器(2)；

一个设置在所述反应器(2)中的搅拌装置(3)；

一个设置在封盖(1)上的混合气体和碱液入口(4)；

一个设置在封盖(1)上的混合气体出口(5)；

一个设置在反应器(2)内设有上部出气口(6)和下部出气口(7)并与所说的混合气体出口(5)相连通的通气管(8)；

一个设置在封盖(1)上的培养液入口(9)；

一个设置在封盖(1)上的培养液出口(10)；

一个设置在封盖(1)上的细胞回流入口(11)；

一个设有清液出口(12)且入口(13)与所说的培养液出口(10)相连接的细胞截留器(14)，截留器(14)的出口(15)与细胞回流入口(11)相连接；

一个通过封盖(1)设置在反应器(2)内的pH电极(16)；

一个通过封盖(1)设置在反应器2内的溶氧浓度电极(17)；

一个与pH电极(16)和溶氧浓度电极(17)相连接的控制装置(18)，控制装置(18)的输出端分别与碱液泵(22)、CO₂气源(23)上的CO₂流量控制阀、空气气源(24)上的空气流量控制阀、N₂气气源(25)上的N₂气流量控制阀和O₂气气源(26)上的O₂气流量控制阀相连接，碱液泵(22)、CO₂气源(23)、空气气源(24)和N₂气气源(25)与混合气体和碱液入口(4)相连通。

2.根据权利要求1所述的用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，反应器(2)高径比为2～4∶1。

3.根据权利要求2所述的用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，反应器(2)高径比为3∶1。

4.根据权利要求1、2或3所述的用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，所说的搅拌装置(2)的搅拌桨叶(27)采用20～40°斜叶提升式搅拌桨。

5.根据权利要求4所述的用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，桨叶(27)直径与反应器(2)直径比为3～4∶5。

6.根据权利要求1所述的用于干细胞体外培养的生物反应器***，其特征在于，所说的控制装置(18)包括pH控制仪表(19)和溶氧浓度控制仪表(20)；

pH控制仪表(19)与pH电极(16)相连接，pH控制仪表(19)的输出端分别与碱液泵(22)、CO₂气源(23)上的控制阀相连接；

溶氧浓度控制仪表(20)与溶氧浓度电极(17)相连接，溶氧浓度控制仪表(20)的输出端分别与N₂气、O₂气和空气气源上的控制阀相连接。

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