CN1539016A

CN1539016A - 涉及植物半矮化的sd1基因和其应用

Info

Publication number: CN1539016A
Application number: CNA028153308A
Authority: CN
Inventors: 大河美保; 松冈信; 芦苅基行
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2001-06-19
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2004-10-20
Also published as: WO2003006655A1; AU2002306308B2; ATE311462T1; KR20040019016A; CA2451216C; DE60207714D1; KR100550960B1; EP1398382B9; US7138567B2; EP1398382B1; DE60207714T2; CN1896240A; EP1398382A1; JP2003000260A; CA2451216A1; BR0210452A; CN101440374A; US20040250315A1; EP1398382A4

Abstract

本发明人推测sd1基因是C20氧化酶基因，并且分离和鉴定了水稻的拟南芥C20氧化酶基因的对应物。结果显示水稻sd1基因编码新的C20氧化酶。进一步的研究显示该基因的突变导致植物半矮化。预计利用该植物sd1基因可以提高植物产量，尤其是有用农业作物和观赏植物等，通过矮化以赋予植物的审美价值，并且通过标记选择提高产量和有效培育矮化植物。

Description

涉及植物半矮化的sd1基因和其应用

技术领域

本发明涉及分离和鉴定植物半矮化的基因和利用该基因的植物半矮化。

背景技术

1956年在Taiwan，新的稻品种，台中本地1号(Taichung Native 1)具有在常规的籼稻品种中观察不到的高产量。“Taichung Native 1”由当地半矮化品种低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)和抗病菜园品种(Tsai-yuang-chung)杂交育成。在1960年后期，相同的半矮化品种低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)和印度尼西亚优质长秆(long-culm)稻品种“Peta”，于菲律宾国际水稻研究所(IRRI)，杂交育成。由于其显著改进了单位面积的产量，所以将该半矮化品种[IR8]称作“奇迹稻(miracle rice)”。“奇迹稻”播种的日益扩大拯救了亚洲的食物危机并且也引起了“绿色革命”。Taichung Native 1和IR8对高产贡献的基因是源于低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)的半矮化基因sd1。然而，时至今日，仅仅确定了sd1基因的大致染色体基因座(Maeda et al.，Breeding Science 47：317-320，1997)。

一般而言，植物，尤其是有用的农业作物例如水稻，如果想增加它们的产量则必须在非常肥沃的条件(即富集氮的条件)下种植。然而，在这种条件下植株会变得非常高使得其受台风等影响易于倒伏，结果是降低产量。解决该问题的一种方法是矮化植株并将它们在丰富的肥料条件下培养。sd1基因仅稍稍矮化植株，并没有因此而降低分蘖数和谷粒大小，或降低种子数。其还可以在丰富的肥料条件下抑制植物倒伏并改进株型。在这种情形下，sd1基因使表型不同于那些已知的矮化基因d1 and d61所诱导的表型(Ashikari M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，96：10284-10289，1999；Yamamuro C.et al.，Plant Cell，12：1591-1605，2000)。这种抗倒伏的改善使得植物能在肥沃的条件下种植；同样地，株型的改善增强物质的生产能力和向谷粒和种子同化产物的分配率。时至今日，利用这些特性，许多水稻品种，包括在世界范围内有最大种植面积的IR64，已经通过回交被赋予了由sd1基因诱导的表型以育出新的水稻品种。

另一方面，随着最近人***炸式的剧增，谷物产量需要进一步增加50％，因而迫切地需要培育出高产有用的作物品种。所以为了提高各种植物，特别是包括水稻(rice)的有用的农作物的产量，利用sd1基因诱导在肥沃条件下稳定地提高产量是有利的。然而，分离和鉴定包括水稻的植物的sd1基因尚未见报道。

发明公开

本发明是在这些情况下进行的。本发明的目的是提供一种涉及植物半矮化的sd1基因。此外，本发明另一目的是提供一种使用sd1基因使植物半矮化的方法。

赤霉素(GA)，一种植物激素，在许多生长进程中，例如萌发，茎/叶的延伸，以及花芽的形成中涉及到。GA合成途径已经被详细研究，并且编码催化GA合成的酶的基因已经从拟南芥，水稻，玉米，南瓜等中分离出(Heddenand Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：431-460，1997)。在涉及GA合成或遗传信息传递的基因变得异常时，植物不能将GA用于其生长，因而变得矮化。事实上，许多报道已经显示缺乏涉及GA合成或遗传信息传递的基因造成矮化突变(Hedden and Kamiya，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：431-460，1997)。因此，本发明人推测GA在水稻的半矮化中涉及到，并将GA应用于sd1突变的低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)以检测GA反应。结果，使用GA导致低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)茎/叶的延伸。此外，一种GA生物合成的酶，C20氧化酶，在GA生物合成途径中催化下面的步骤：GA53-GA44-GA19-GA20和GA12-GA15-GA24-GA9。现在C20氧化酶已经从南瓜，拟南芥和水稻中分离出来(Lange et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：8552-8556，1994；Phillips et al.，Plant physiol.108：1049-1057，1995；Xu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，92：6640-6644，1995；Toyomasu etal.，Physiol.Plant.99：111-118，1997)，并且据报道在拟南芥基因组中至少存在三种C20氧化酶基因(Phillips et al.，Plant Physiol.108：1049-1057，1995)。

由此可见，本发明人推测sd1基因是涉及GA合成的基因，尤其是植物基因组中重复出现的C20氧化酶基因。如果如此，这就解释了为什么水稻sd1基因不诱导植株形状的显著矮化。因此，本发明人意欲首先分离和鉴定了拟南芥C20氧化酶的水稻对应物(couterpart)。

结果，本发明人成功地分离和鉴定了一种新的水稻GA C20氧化酶基因。此外，本发明人又研究该基因的染色体座位是否接近水稻sd1座位，以及在水稻半矮化品种中是否该新的水稻GA C20氧化酶基因突变。结果发现该基因的染色体基因座非常接近于水稻sd1的基因座。此外在确定和比较一些包含低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)和相应野生型的sd1突变体中GA C20氧化酶基因的核苷酸序列时，该GA C20氧化酶基因在所有的突变体中sd1发生突变。因此，第一次表明水稻sd1基因等同于编码新的C20氧化酶的基因，暗示植物sd1基因(C20氧化酶基因)的突变会诱导植物的半矮化。

植物sd1基因可通过标记选择而用于高效育种中。在利用常规杂交育种制备导有sd1基因的品种时，例如在将sd1基因导入日本最广泛种植的品种Koshihikari时，有必要通过将Koshihikari与IR64或具有sd1基因的品种杂交制备F1，接着将F1与Koshihikari重复回交直至除了sd1基因座的所有染色体被Koshihikari的那些所取代。由于利用sd1基因作为分子标记允许人们有效地选择Koshihikari取代的仅有sd1基因的个体，因而分离sd1基因节省了育种所需的大量时间和劳动，而且，植物sd1基因可以允许使用分子生物学技术诸如反义和RNAi方法制备植物转化体。还可预计促进有用农作物，包括谷物，诸如小麦，大麦，玉米，蔬菜和果树的产量提高，而且通过矮化增添赋予观赏植物，诸如观叶植物(foliage plants)的美学价值，培育新品种。

具体地，本发明涉及分离和鉴定植物半矮化的基因，和利用该sd1基因使植物半矮化，更具体的是提供下述的：

[1]用于半矮化植物的根据(a)到(c)中任一所述的DNA：

(a)编码与植物sd1基因转录产物互补的反义RNA的DNA；

(b)编码具有特异切割植物sd1基因转录产物的核酶活性的RNA的DNA；和

(c)编码通过共抑制效果抑制植物sd1基因表达的RNA的DNA；

[2][1]的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因；

[3]包含[1]或[2]的DNA的载体；

[4]保持[1]或[2]的DNA处于可表达状态的转化植物细胞；

[5][4]的转化植物细胞，其中所述植物是水稻；

[6]包含[4]或[5]转化植物细胞的植物转化体；

[7]一种植物转化体，其是[6]的植物转化体的后代或克隆；

[8][6]或[7]植物转化体，其中所述植物是水稻；

[9][6]到[8]中任一植物转化体的繁殖材料；

[10]制备[6]到[8]中任一植物转化体的方法，其中所述方法包括下述步骤：将[1]或[2]的DNA导入植物细胞，以及从所述植物细胞再生植物体；

[11]一种半矮化植物的方法，其中所述方法包括抑制植物细胞中内源sd1基因表达的步骤；

[12][11]的方法，其中表达的抑制通过将[1]或[2]的DNA导入植物实现；

[13][10]到[12]中任一项的方法，其中所述植物是水稻；和

[14]编码水稻sd1蛋白的DNA。

本发明揭示植物sd1基因的突变诱导植物半矮化。因此，在肥沃的条件下通过抑制植物sd1基因的表达有可能制备出能赋予稳定高产量的半矮化品种。

本发明所述的“植物半矮化”是指仅使植株的高度稍微矮化而没有降低分蘖数，谷粒大小及种子数。通过这种半矮化，植株被赋予了在肥沃的条件下抗倒伏并且其株型得以改善。结果，可以获得稳定的高产量。

在本发明中所述“植物sd1基因”指的是编码植物C20氧化酶的基因，并且包括水稻sd1基因(编码SEQ ID NOs：3和4的DNA)，拟南芥sd1基因(Phillips et al.，Plant physiol.108：1049-1057，1995)，和源于其它植物的sd1基因。

可以利用杂交(Southern et al.，Journal of Molecular Biology 98：503，1975)和聚合酶链式反应(PCR)(Saiki et al.，Science 230：1350-1354，1985；Saiki etal.，Science 239：487-491，1988)技术实施鉴定未知“植物sd1基因”。也就是，本领域的技术人员可以分离与来自其它目的植物的sd1基因高度同源的DNAs，并测定它们的序列，例如通过水稻sd1基因核苷酸序列(编码SEQ IDNOs：3和4的DNA)，或其部分，用作探针，或通过特异与sd1基因核苷酸序列杂交的寡核苷酸用作引物。

杂交反应通常在严谨条件下进行以分离该DNA，严谨的杂交条件包括诸如下面的条件：6M尿素，0.4％ SDS，0.5x SSC；和那些有类似严谨度的条件。分离具有更高同源性的DNAs可以通过更高严谨度条件下实施杂交而达到，例如，6M尿素，0.4％SDS，和0.1x SSC。可以将分离的DNAs通过已知的方法测序。

是否所分离的DNA是编码sd1蛋白的DNA通常可以通过序列间的同源性程度而判断。使用诸如BLASTN(核酸序列水平)或BLASTX(氨基酸序列水平)的程序测定(Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。该程序基于Karlin和Altschul所述的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)。在根据BLASTN分析核苷酸序列时，参数设置为例如得分(score)＝100和字段长(word length)＝12。另一方面，为了通过BLASTX分析氨基酸序列，参数设置为例如得分＝50和字段长＝3。此外，在氨基酸序列使用Gapped BLAST程序分析时，分析可以按照Altschul等所述进行(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。利用BLAST和Gapped BLAST程序时使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体技术在本领域是已知的(see http：// www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

本发明中，并不对通过抑制sd1基因的表达而赋予半矮化性状的植物进行具体限定。因此，任何植物可以被半矮化，尽管优选的是使用有用的农作物或观赏植物。有用的农作物包括，例如，单子叶植物，诸如水稻，玉米，小麦和大麦，以及双子叶植物诸如油菜，大豆，棉花，蕃茄，马铃薯。观赏植物(ornamental plant)包括花卉植物，诸如菊花，玫瑰，康乃馨(carnation)，和仙客来(cyclamen)。

根据本发明的方法制备半矮化的植物时通过下述方法得到：将抑制sd1基因表达的DNA***合适的载体，将该载体导入植物细胞，然后再生所得的转化的植物细胞。术语“抑制sd1基因的表达”指的是抑制sd1基因转录和抑制翻译到蛋白质。它还不仅包括DNA表达的停止还包括这种表达的降低。

植物中特定内源基因的表达通过使用本领域技术人员普遍使用的反义技术的方法而得以抑制。Ecker等首先证实使用瞬时基因表达的方法通过电穿孔将反义RNA导入植物细胞的反义效果(Ecker and Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5372)。其后，据报道靶基因的表达通过表达反义RNAs而在烟草和矮牵牛花中降低(Krol et al.(1988)Nature 333：866)。反义技术现在已经被确立为抑制植物中基因表达的一种方法。通过反义核酸多重因素导致把基因表达受到抑制。这些包括：由三链形成抑制转录的起始；在RNA聚合酶已经形成局部开放环结构的位点处形成杂交而导致抑制转录；和不断继续合成的RNA形成杂交而转录抑制；由在内含子和外显子交接处形成杂交抑制拼接；由在剪接体形成的位点形成杂交导致抑制剪接；和mRNA形成杂交而抑制mRNA由核向细胞质的移动；在加帽位点或添加polyA的位点形成杂交而抑制拼接；对于翻译起始因子在结合位点形成杂交而抑制翻译的起始；在起始密码子附近的与核糖体结合位点形成杂交而抑制翻译；在mRNA的翻译区中或在多核糖体结合的位点形成杂交而抑制肽链的延长；和在核酸和蛋白质相互作用的位点形成杂交而抑制基因表达。这些因素通过抑制转录，剪接，和/或翻译过程而抑制靶基因的表达(Hirashima andInoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(New Biochemistry ExperimentationLectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression of genes)”，Nihon Seikagakukai(The JapaneseBiochemical Society)(ed.)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。

因此，本发明的反义序列可以通过上述机制而抑制靶基因的表达。在一实施方案中，如果将反义序列设计成与接近该基因mRNA的5’末端的非翻译区互补，将会有效地抑制基因的翻译。还可能使用与编码区或3’侧非翻译区互补的序列。因此，本发明所用反义DNA包括具有基因非翻译区和翻译区反义序列的DNA。将所要使用的反义DNA连接到合适启动子的下游，并且，优选的是，将包含转录终止信号的序列连接到3’侧。

基于SEQ ID NO：3的DNA的序列信息，例如通过硫代磷酸法，制备反义DNA(Stein，Nucleic.Acid.Res.16：3209-3221，1988)。将所制得的DNA通过已知的方法转染至目的植物。反义DNA的序列优选的是与要转化的植物的内源基因或其部分互补的序列，然而并不需要100％的互补，只要其可以有效地抑制基因表达。转录RNA优选的是90％或更高，甚至是更优选的是95％或更高地与靶基因的转录产物互补。为了有效地通过反义序列抑制靶基因的表达，反义DNA应至少长为15核苷酸序列甚至更长，优选的是100核苷酸或更多，更优选的是500核苷酸或更长。通常所用的反义DNA一般是短于5kb，更优选的是短于2.5kb。

编码核酶的DNA可用于抑制抑制内源基因的表达。核酶是指具有催化活性的RNA分子。RNA虽然具有各种核酶活性，但是对核酶作为切割RNA的酶的研究使得能够设计特异位点切割RNA的目的核酶。而诸如I组内含子类型和包含于RnaseP中的MIRNA核酶可以是大的，具有400个核苷酸或更多，也有更小的，包括具有约40个核苷酸活性结构域的锤头型和发夹型(Koizumi and Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)35：2191)。

锤头型核酶自我切割结构域切割在序列G13U14C15的3’侧C15处切割。在U14和在第九位的A之间形成的核苷酸对被认为对于核酶的活性是重要的。而且，显示在第15位的核苷酸是A或U而不是C时，切割也可以发生(Koizumi et al.(1988)FEBS Lett.228：225)。如果核酶的底物结合位点被设计为与靶位点临近的RNA序列互补，可以生成能识别靶RNA内序列UC，UU或UA限制酶样RNA切割核酶(Koizumi et al.(1988)FEBS Lett.239：285；Koizumi and Ohtsuka(1 990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，35：2191；Koizumi et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7059)。

发夹型核酶也可以用于本发明中。例如烟草环斑病毒卫星RNA负链中可以发现发夹型核酶(Buzayan(1986)Nature 323：349)。该酶也显示靶特异性地切割RNA(Kikuchi and Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.19：6751；Kikuchi(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry and Biology)30：112)。

设计成切割靶的核酶与启动子诸如花椰菜花叶病毒35S启动子以及转录终止序列融合，以使得其在植物细胞中转录。然而，如果将额外序列添加到转录RNA的5’末端或3’末端，就会失去核酶活性。在这种情况下，可以将附加的修饰(trimming)的核酶，其是顺式作用以行使在核酶部分5’侧或3’侧的修饰，以自包含核酶的转录RNA精确地切割核酶部分(Taira et al.(1990)Protein Eng.3：733；Dzaianott and Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4823；Grosshands and Cech(1991)Nucleic.Acids.Res.19：3875；Tairaet al.(1991)Nucleic.Acid.Res.19：5125)。靶基因内的多位点可以通过将这些结构单元串联而被切割以获得更大的效果(Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271(1992))。使用这种核酶，就有可能特异地切割本发明靶基因的转录产物，由此以致该基因的表达。

内源基因的表达也可通过共抑制，用具有与靶基因序列相同或相似序列的转化而得以抑制。“共抑制”指的是这种现象，其中将具有与靶内源基因序列相同或相似序列的基因通过转化导入植物，导入的外源基因和靶内源基因的表达被抑制。尽管详细的共抑制的机制还未被完全理解，然而其在植物中被经常观察到(Curr.Biol.7：R793，1997；Curr.Biol.6：810，1996)。例如，如果希望获得其中sd1基因被共抑制的植物体，所研究的植物体可用载体DNA进行转化，所述载体DNA为被设计成表达sd1基因或具有类似序列DNA，以在所得的植物体中选择具有sd1突变体特性的植物体，即半矮化植物体。用于共抑制的该基因不需要完全与靶基因相同，然而，其应该至少有70％或更多，优选80％或更多，更优选90％或更多(例如95％或更多)序列同一性。

此外，本发明内源基因的表达也可通过用具有靶基因显性阴性表型的基因转化植物而得以抑制。具有显性阴性表型的基因指的是通过基因表达，能够消除或降低植物野生型内源基因活性的基因。

本发明还提供包含能抑制上述内源基因表达DNA的载体，保持该DNA在可表达状态的转化植物细胞，包含该转化植物体细胞的植物转化体，上述植物转化体的后代的或克隆的植物转化体，和植物转化体的繁殖材料。

此外本发明涉及制备前述植物转化体的方法，包括：将能抑制内源基因表达的DNA导入植物细胞；自植物细胞再生植物体。

本发明的DNA可通过本领域已知的方法导入植物细胞，例如，农杆菌介导的转移方法，电穿孔的方法和粒子轰击的方法。

如上所述的农杆菌的方法，例如可以使用Nagel等的方法(Microbiol.Lett.67：325，1990)。根据该方法，将重组载体转化入农杆菌细胞，然后将转化的农杆菌通过已知的方法例如叶盘法(leaf disk method)导入植物细胞。上述载体，例如，包括在其导入植物体后允许本发明的DNA在植物体中表达的启动子。一般而言，本发明的位于所述启动子的下游，而且终止子位于该DNA的下游。本领域的技术人员可以根据转化的方法和植物类型合适的选择用于所述转化的重组载体。前述启动子包括例如，衍生自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和玉米遍在蛋白的启动子(Unexamined PublishedJapanese Patent Application No.(JP-A)Hei2-79983)。

此外，上述的终止子包括衍生自花椰菜花叶病毒的和烟碱合成酶基因的。然而，本发明并不限于此，在植物体中起功能的任何启动子和终止子都可以应用。

此外，导入本发明DNA的植物体可以是外植体移植。或者，由这些植物培养的细胞，并且这种DNA可以被导入培养细胞。本文中，术语“植物细胞”包括，例如，植物细胞来自叶，根，茎，花，以及种子中的盾片，愈伤组织，和培养细胞悬浮物。而且，为了有效选择通过导入本发明DNA转化的植物细胞，上述重组载体优选地是包含合适的选择标记基因，或优选的是和包含这种选择标记基因的质粒一起导入植物细胞。本文所用的选择标记基因，例如，抗生素潮霉素的潮霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素或庆大霉素有抗性的新霉素磷酸转移酶基因，对除草剂，膦丝菌素有抗性的乙酰转移酶基因。

将用重组载体导入的植物细胞进行涂平板并在已知包含合适筛选药物的选择培养基培养，所述药物根据导入选择标记基因而变化。结果，可以得到转化植物培养细胞。

植物体由本发明DNA转化的植物细胞而得以再生。依据植物细胞的类型提高已知的方法实施植物体再生(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.100：1503-1507)。例如，转化和再生水稻植株的方法包括：(1)使用聚乙二醇将基因导入原生质体，并再生植物体(适合籼稻品种(indica))(Datta et al.，(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I and Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)使用电脉冲将基因导入原生质体，并再生植物体(适合粳稻品种(japonica))(Toki et al.(1992)Plant Physiol.100：1503-1507)；(3)通过粒子轰击将基因直接导入细胞，并再生植物体(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9：957-962)；和(4)使用农杆菌将基因导入原生质体，并再生植物体(Hiei et al.(1994)Plant J.6：271-282)。这些方法已经得以确立并在本领域中广泛利用。因此，这些方法可适合用于本发明中。

由转化细胞再生的植物体然后在条件培养基上培养。在驯化的再生植物体随后培养在通常的培养条件下而得到半矮化植物体，然后成熟并结实而形成种子。

本文中，所存在的导入的外源基因可以通过已知的PCR或Southern杂交方法，或通过植物体中DNA的核苷酸序列分析在已经再生并如上培养的植物体转化体中得以证实。

在这种情况下，根据已知的J.Sambrook等方法由植物转化体进行DNA提取(Molecular Cloning，2^nd ed，Cold Spring Harbor Laboratort Press，1989)。

在使用PCR方法分析存在于再生植物体的包含本发明DNA的外源基因时，使用如上所述自再生植物体提取的DNA为模板，实施扩增反应。而且，根据本发明DNA或由本发明修饰的DNA合适地选择核苷酸序列的合成寡核苷酸可以用作引物以在反应溶液中实施扩增反应，该反应溶液包括这种寡核苷酸混合物的反应溶液。在扩增反应中，包含本发明DNA序列DNA片段的扩增产物可通过重复变性，退火，和DNA的延伸反应进行几十次。在包含扩增产物反应溶液是，例如，在经琼脂糖凝胶上电泳时，各种扩增的DNA片段分级分以证实DNA片段如何对应于本发明的DNA。

一旦获得其中导入本发明DNA染色体的转化体植物，就有可能通过有性或无性繁殖(sexual or vegetative propagation)该种植物体的后代。或者，植物可由该转化植物以及其后代或克隆获得的育种材料(例如种子，果实，穗(ears)，块茎，块根(tubercles)，单株(tubs)，愈伤组织和原生质体)而大规模制备。转有本发明DNA的植物细胞，植物体包括这些植物的细胞，后代，和克隆以及由这些植物获得的育种材料，其后代和克隆，都包括在本发明中。

本发明中植物半矮化如上所述可以通过抑制sd1基因的表达而诱导。由本发明方法制得的半矮化植物预计是有用的例如作为农作物，其可以稳定提供高产量，以及赋予观赏植物新的审美价值。

此外，本发明提供编码水稻sd1蛋白的DNA。sd1 DNA可以用于促进植物生长，尤其是促进茎/叶的延伸。使用编码水稻sd1蛋白的DNA制备植物转化体可通过上述的方法实施。也就是，这种制备可以通过将DNA***前述的载体，将所得的载体导入植物细胞，由该转化体植物细胞再生植物体而实施。而且，基于本发明编码水稻sd1蛋白的DNA序列，可能制备出编码反义RNA的DNA，编码具有核酶活性RNA的DNA，以及进一步编码具有共抑制效果RNA的DNA等，用于抑制植物sd1基因的表达。由此制备的DNAs可用于诱导植物半矮化。

本发明的“水稻sd1蛋白”不仅包括SEQ ID NO：4的蛋白而且包括与该蛋白功能等价源于水稻的蛋白。这种蛋白包括人工制备的和水稻中内源存在的。本文中术语“功能等价”表示目的蛋白具有GA合成的活性和当导入植物体内时具有茎/叶延伸的活性。这种蛋白包括突变体，同系物和根据SEQ IDNO：4蛋白变体。

与水稻sd1蛋白功能等价的蛋白质可使用例如本领域技术人员已知的用于在蛋白质氨基酸序列中导入突变的方法定点诱变的方法(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology edit.Publish.Jhon Wily & Sons Section8：1-8.5，1987)]制备。此外，在自然界中由氨基酸突变产生(arising nature)制得的水稻内源蛋白质可基于SEQ ID NO：3的DNA使用杂交技术，基因扩增技术(PCR)等进行分离。

具有其中一个或多个氨基酸被取代，缺失，***和/或添加的SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质，包括在本发明之内，只要它们具有与水稻sd1蛋白具有相同的功能。蛋白中总的突变的数目典型的是30个氨基酸或更少，优选的是10个氨基酸或更少，更有选的是5个氨基酸或更少(例如，3个氨基酸或更少)。然而，对突变的数目和位点并不限制只要该蛋白的功能能够得以保持。就保持蛋白质功能方面，用于取代的氨基酸优选的是与要取代的氨基酸具有类似的性质。例如，由于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe和Trp均归类为非极性氨基酸，它们可能相互具有类似的性质。此外不带电荷的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。而且，酸性氨基酸由Asp和Glu为例，碱性氨基酸通过Lys，Arg和His举例。

本发明中，对编码水稻sd1蛋白DNAs的类型并不具体限制，只要它们能够编码上述的蛋白。它们可以是基因组DNAs，化学合成的DNAs或cDNA，其形式不限。此外，本发明的DNAs包括具有那些基于遗传密码简并性的任意核苷酸，只要它们能够编码水稻sd1蛋白。本发明编码水稻sd1蛋白可以如上述通过使用诸如SEQ ID NO：3的DNA序列或其部分作为探针的杂交技术和使用基于这种DNA序列设计引物的基因扩增方法进行分离。这些探针或引物本领域技术人员利用已知技术根据本发明编码水稻sd1蛋白的DNAs可以容易地制备。

附图简述

图1是显示低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)，Calrose 76和黎明(Reimei)中sd1基因突变位点的图。

实施发明的最佳模式

以下，本发明进一步具体地利用实施例进行描述。然而，然而并不构成对本发明的限制。

实施例1

基于拟南芥C20氧化酶基因的序列，设计引物OsC20U(5’-ccgctcgccgagaagcgccg-3’/SEQ ID NO：1)和OsC20L(5’-atgaaggtgtcgccgatgtt-3’/SEQ ID NO：2)。利用日本晴(Nipponbare)水稻基因组为模板实施PCR，以分离水稻GA C20氧化酶基因。结果得到618bp的扩增产物，测序显示其是新的水稻GA氧化酶基因。GAC20属于2-氧化戊二酸依赖型双加氧酶(2-ODD)家族，保守用于结合2-氧化戊二酸的功能必需结构域(NYYPXCXXP)。此外，GAC20还保留三个组氨酸残基以结合Fe离子和涉及GA结合的LPWKET结构域。水稻GAC20基因显示与拟南芥有50％的同源性。

实施例2

使用BIL(1998；TAG 96：997-1003，Mapping quantitative trait locicontrolling seed dormancy and heading date in rice，Oryza sativa L.，usingbackcross inbred lines.)对新的GAC20氧化酶基因染色体基因座进行连锁分析显示该基因位于水稻第1染色体上约155cM。该基因座非常接近sd1基因座，事实很有力地暗示水稻C20氧化酶基因可能等同于sd1基因。

实施例3

由野生型日本晴(Nipponbare)构建基因组库，利用噬菌斑杂交方法分离包含GAC20氧化酶基因的基因组克隆以测定该基因的全部核苷酸序列(SEQID NO：3)。所推导出的GAC20氧化酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中显示。

实施例4

测定在sd1突变体低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)和相应野生型鸟尖(Woo-gen)中GAC20氧化酶基因核苷酸序列以比较。由此，发现自第一外显子到第二外显子延伸的386 bp核苷酸序列在低脚鸟尖(Dee-geo-woo-gen)中缺失。还在其它sd1突变体中测定了GAC20氧化酶基因核苷酸序列。结果，在sd1突变体Calrose 76中，在第二外显子中一碱基(胞嘧啶)被胸腺嘧啶取代，并且在氨基酸序列水平上，亮氨酸被苯丙氨酸取代。类似的，在sd1突变体Reimei中，在第三外显子中一碱基(鸟嘌呤)改变为胞嘧啶，在氨基酸序列水平上，天冬氨酸被组氨酸取代(图1)。

工业实用性

本发明提供一种植物sd1基因和利用该基因的方法。很高的期望是利用植物sd1基因能促进植物的产量，尤其是有用农业作物和观赏植物，通过矮化以提高观赏作物审美价值，并且通过标记选择提高产量和有效培育矮化植物。

序列表

<110>本田技研工业株式会社(HONDA MOTOR CO.，LTD.)

<120>涉及植物半矮化的sd1基因和其应用

<130>H3-A0101P

<140>

<141>

<150>JP 2001-185128

<151>2001-06-19

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成引物序列

<400>1

ccgctcgccg agaagcgccg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成引物序列

<400>2

atgaaggtgt cgccgatgtt 20

<210>3

<211>5575

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>3

gtatatttac tagttaacga catcatgtat taaaaatcgg aggaggtata gaagtatgtt 60

ctcctttctt gtaaacatag gttgatctgt atatttgttt ttgtcttatt ttgttttttc 120

attgatctca ccattaaaca ggtggcctcc aaaaatgcat gcagccatgt atcttcccag 180

tccatgaaat taatcttgaa ttattataaa ttaaaaacat attaggattt gatatatgaa 240

aggtataatg gtagcagatc tatcatagaa aacctataac acgtagatga ccgagtagag 300

aaaaaagata tacccaacat aatcaagtac cttgttaatt agtaagaagt aagaaamcca 360

tataaataca agcatttggg tgaagctaga atgggaacta tattaccatg tatcccatac 420

atatctatta cgcacttaat acctgaatta ttcgtgtaac gaagaacatg ctttggtaaa 480

aaataaaata tttggaccgt ataccatgcg gttatcgcag ttatcacgtg cggtaatatt 540

ctcagttttt caaaccgcgg tataacttgc aataaccgcg tggttttcgc ggtaaccacc 600

aaaccgtggg gctgtggtaa ccccacctaa aacgatttgg taaaccctag tcagagctag 660

cttgatcgtg gctccgccct ctgcatctcc tcatggtcac aagatcaatt tagaacctct 720

tataagctgt tgaaccatca gtactacagt cccaagatta acatattttt taaaatatca 780

aaattgctca tgatgaattg attaccgttc atgtgcctgt atggtgcatg ggtggtatag 840

tgcaccgtga cctgtactgt gctagatgtt ccttccaacc ttagtacttc acgaaaagga 900

gaggaaccat ttccctgtca ccttcctgca acatggtcag gcataaacca aacacgatcg 960

aagcgaatcg gcgataccac acaatagccg cgcgtcgcaa acaacaattc cgcggctagc 1020

tacttccgac ctccgaaact actgcgagcc caagtgggta cggttttagt gcaaataggg 1080

taagtcttgt ttacatcata tcggtttcat tttggtacac gaatggagaa gaaatgaaag 1140

agatcgaaaa aaggaagagc tcgctgtgta tctgtctcgt aacagccccg gtgttacacg 1200

tgctctaaga gagattaatt aaatcgataa gctaccagag gtttagtttt ccacgtgtta 1260

attagattgg aaagcgagag aaattaaaaa tagcgagtaa aaatagagat aaccttattg 1320

ctattttgtt ttttttccag caacaaactt atctttcagg ctagtttagg cgatcgctta 1380

gattccgcat cgtccttttc actatttttt ttctgtcagt gacaatgtga aaatttattg 1440

gacagacgac tagcttgtgg tactagctag gaaattccct atcctcgata tgaacaactt 1500

actcaactca gtagagtagc aaatgcccaa gaaagcccga gtcaatctat ttggaaatcc 1560

aatctatttt ctcgtattcg tgtgggaaat caagctatac tagttgaaat tcaccggaag 1620

aaatgcacgg cacttcaata taccaaaatt gcaaaggaga atcattcgat taacagtgga 1680

attcaaccaa gaaatgaaaa ggtatatata ggaaatgcac tccaaccacc aaccaataag 1740

tgattccggg caatcaattc tatccgcgag ttgtgggtct gttcagattc attatattag 1800

aacgcgtcac gtaatggatg gagtattata caacaccatt ggttttgcca ctagtgttaa 1860

ctctaataca tgggggttag ttttaccttt aaacttggtc taaaaggatg gacatatggc 1920

aatgcaattg catgggggtc attgattcga ccatcatgtc tgtccagtgg caaccccctc 1980

cctcatcccc tgtggtgggc cccccacggc gctcgtcttc tcccctgtta caaatacccc 2040

accctcctgc ccagacagct cgccctgcac acacacacac actcacactc acacacgctc 2100

tcaactcact cccgctcaac acagcgctca cttctcatct ccaatctcat ggtggccgag 2160

caccccacgc caccacagcc gcaccaacca ccgcccatgg actccaccgc cggctctggc 2220

attgccgccc cggcggcggc ggcggtgtgc gacctgagga tggagcccaa gatcccggag 2280

ccattcgtgt ggccgaacgg cgacgcgagg ccggcgtcgg cggcggagct ggacatgccc 2340

gtggtcgacg tgggcgtgct ccgcgacggc gacgccgagg ggctgcgccg cgccgcggcg 2400

caggtggccg ccgcgtgcgc cacgcacggg ttcttccagg tgtccgagca cgggcgtcga 2460

cgccgctctg gcgcgcgccg cgctcgacgg cgccagcgac ttcttccgcc tcccgctcgc 2520

cgagaagcgc cgcgcgcgcc gcgtcccggg caccgtgtcc ggctacacca gcgcccacgc 2580

cgaccgcttc gcctccaagc tcccatggaa ggagaccctc tccttcggct tccacgaccg 2640

cgccgccgcc cccgtcgtcg ccgactactt ctccagcacc ctcggccccg acttcgcgcc 2700

aatggggtaa ttaaaacgat ggtggacgac attgcatttc aaattcaaaa caaattcaaa 2760

acacaccgac cgagattatg ctgaattcaa acgcgtttgt gcgcgcagga gggtgtacca 2820

gaagtactgc gaggagatga aggagctgtc gctgacgatc atggaactcc tggagctgag 2880

cctgggcgtg gagcgaggct actacaggga gttcttcgcg gacagcagct caatcatgcg 2940

gtgcaactac tacccgccat gcccggagcc ggagcggacg ctcggcacgg gcccgcactg 3000

cgaccccacc gccctcacca tcctcctcca ggacgacgtc ggcggcctcg aggtcctcgt 3060

cgacggcgaa tggcgccccg tcagccccgt ccccggcgcc atggtcatca acatcggcga 3120

caccttcatg gtaaaccatc tcctattctc ctctcctctg ttctcctctg cttcgaagca 3180

acagaacaag taattcaagc ttttttttct ctctcgcgcg aaattgacga gaaaaataag 3240

atcgtggtag gggcggggct ttcagctgaa agcgggaaga aaccgacctg acgtgatttc 3300

tctgttccaa tcacaaacaa tggaatgccc cactcctcca tgtgttatga tttatctcac 3360

atcttatagt taataggagt aagtaacaag ctactttttt catattatag ttcgtttgat 3420

tttttttttt taaagttttt ttagttttat ccaaatttat tgaaaaactt agcaacgttt 3480

ataataccaa attagtctca tttagtttaa tattgtatat attttgataa tatatttatg 3540

ttatattaaa aatattacta tatttttcta taaacattat taaaagccat ttataatata 3600

aaatggaagg gagtaattaa tatggatctc ccccgacatg agaatatttt ccgatggtgt 3660

gacgacgcca tgtaagcttc ggtgggcctg gacggccaga ggtgccaaca gccacgtcca 3720

acaacccctg ggtccccccc taacactcca aacagtagtg agtagtgtct cgtcgcgttt 3780

tagtatttga tgacaaacaa agtgtgagtt gagttagcca ccaccaactt gcacacgagc 3840

acatacattt gtgtccattc tcgccagtca cttccatctc tagtcctaac tcctatctag 3900

cgatgtaagc ggataatttc atcatccgta tataaacctg tttgttatag ttaatttcct 3960

atataatact ataacagtat acattttaaa agaaaacaaa attaggataa acaggccctg 4020

ctcctatcca tccatggcac ttggaaggac cagactcggt catgccatgc caagccaaga 4080

tatgggttat ggaagagtag agaagaggag agatgagaga taagcatgcg ttctcctcct 4140

cgttggatgt gtattttgga gggatttgtg tagtagtagc agcggcgccg cggggacgga 4200

tgcggatggt ggcgctttcg gtggcgtttt cccggggggg ttttggtttg gcgcttgggg 4260

gggatggcat ggcgcggcgt gcggctgcac gccacacaca cgcgcgcgca cgcacgtacg 4320

tcgtcgtcgc cgcgggcgga cggtagctta gggtggtgtg ttccgcgcgc gggcgcggat 4380

tgttccatgc cgatcgattt ggcgccaccc tcgccgcggc tcttgtcgcg tcgtgcgcct 4440

ctctcgcgcg gtttgtcctt gtcgcgttgc tcagccggcg acgggggcac ggacattggc 4500

gatgtagccc tgcacgtgtc ggcctctccg ttgatgaatg atgatgtatg tatgtatttt 4560

tttttgtctg aaggaatttg tggggaattg ttgtgtgtgc aggcgctgtc gaacgggagg 4620

tataagagct gcctgcacag ggcggtggtg aaccagcggc gggagcggcg gtcgctggcg 4680

ttcttcctgt gcccgcggga ggacagggtg gtgcggccgc cgccgagcgc cgccacgccg 4740

cagcactacc cggacttcac ctgggccgac ctcatgcgct tcacgcagcg ccactaccgc 4800

gccgacaccc gcacgctcga cgccttcacg cgctggctcg cgccgccggc cgccgacgcc 4860

gccgcgacgg cgcaggtcga ggcggccagc tgatcgccga acggaacgaa acggaacgaa 4920

cagaagccga tttttggcgg ggcccacgcc cacgtgaggc cccacgtgga cagtgggccc 4980

gggcggaggt ggcacccacg tggaccgcgg gccccgcgcc gccttccaat tttggaccct 5040

accgctgtac atattcatat attgcaagaa gaagcaaaac gtacgtgtgg gttgggttgg 5100

gcttctctct attactaaaa aaaatataat ggaacgacgg atgaatggat gcttatttat 5160

ttatctaaat tgaattcgaa ttcggctcat ggatttcgcg aatgtggatg gtggatgccc 5220

gcctcgatga atccgctttg tccgatagag aaatttgaat ttaaatccgg gacctggatt 5280

ttgcaatgtg gacgggtgtg ctttgcgaaa tctgctttgt tcgatagcgc tgcacaaaac 5340

atgcggtggg ccctgcatga gaatccgctt cttctttgtt gccttggtag gcgaaatcgt 5400

atatggtccc aacgattttc tttgtttggt ttcaacataa atgggagttt ttatgaattt 5460

aggcttatct acatcagagc tactcctaac ttgtgatatg atgaaccaat cgtgttcttc 5520

tcatacttgt ttaagttggc caatatagga ttaatgcaga gtatccaagg gtttt 5575

<210>4

<211>389

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>4

Met Val Ala Glu His Pro Thr Pro Pro Gln Pro His Gln Pro Pro Pro

1 5 10 15

Met Asp Ser Thr Ala Gly Ser Gly Ile Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Val Cys Asp Leu Arg Met Glu Pro Lys Ile Pro Glu Pro Phe Val Trp

35 40 45

Pro Asn Gly Asp Ala Arg Pro Ala Ser Ala Ala Glu Leu Asp Met Pro

50 55 60

Val Val Asp Val Gly Val Leu Arg Asp Gly Asp Ala Glu Gly Leu Arg

65 70 75 80

Arg Ala Ala Ala Gln Val Ala Ala Ala Cys Ala Thr His Gly Phe Phe

85 90 95

Gln Val Ser Glu His Gly Val Asp Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ala Leu

100 105 110

Asp Gly Ala Ser Asp Phe Phe Arg Leu Pro Leu Ala Glu Lys Arg Arg

115 120 125

Ala Arg Arg Val Pro Gly Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ser Ala His Ala

130 135 140

Asp Arg Phe Ala Ser Lys Leu Pro Trp Lys Glu Thr Leu Ser Phe Gly

145 150 155 160

Phe His Asp Arg Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asp Tyr Phe Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Gly Pro Asp Phe Ala Pro Met Gly Arg Val Tyr Gln Lys Tyr

180 185 190

Cys Glu Glu Met Lys Glu Leu Ser Leu Thr Ile Met Glu Leu Leu Glu

195 200 205

Leu Ser Leu Gly Val Glu Arg Gly Tyr Tyr Arg Glu Phe Phe Ala Asp

210 215 220

Ser Ser Ser Ile Met Arg Cys Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Glu Pro

225 230 235 240

Glu Arg Thr Leu Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ala Leu Thr

245 250 255

Ile Leu Leu Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Glu Val Leu Val Asp Gly

260 265 270

Glu Trp Arg Pro ValSer Pro Val Pro Gly Ala Met Val Ile Asn Ile

275 280 285

Gly Asp Thr Phe Met Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Cys Leu

290 295 300

His Arg Ala Val Val Asn Gln Arg Arg Glu Arg Arg Ser Leu Ala Phe

305 310 315 320

Phe Leu Cys Pro Arg Glu Asp Arg Val Val Arg Pro Pro Pro Ser Ala

325 330 335

Ala Thr Pro Gln His Tyr Pro Asp Phe Thr Trp Ala Asp Leu Met Arg

340 345 350

Phe Thr Gln Arg His Tyr Arg Ala Asp Thr Arg Thr Leu Asp Ala Phe

355 360 365

Thr Arg Trp Leu Ala Pro Pro Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ala Gln

370 375 380

Val Glu Ala Ala Ser

385

Claims

1.一种根据(a)到(c)中任一用于半矮化植物的DNA：

(a)编码与植物sd1基因转录产物互补的反义RNA的DNA；

(c)编码通过共抑制效果抑制植物sd1基因表达的RNA的DNA。

2.权利要求1的DNA，其中所述植物sd1基因是水稻sd1基因。

3.一种载体，其中包含权利要求1或2的DNA。

4.一种保持权利要求1或2的DNA处于可表达状态的转化植物细胞。

5.权利要求4的转化植物细胞，其中所述植物是水稻。

6.一种植物转化体，其中包含权利要求4或5的转化植物细胞。

7.一种植物转化体，其是权利要求6的植物转化体的后代或克隆。

8.权利要求6或7植物转化体，其中所述植物是水稻。

9.权利要求6到8中任一植物转化体的繁殖材料。

10.制备权利要求6到8中任一植物转化体的方法，其中所述方法包括下述步骤：将权利要求1或2的DNA导入植物细胞，以及从所述植物细胞再生植物体。

11.一种半矮化植物的方法，其中所述方法包括抑制植物细胞中内源sd1基因表达的步骤。

12.权利要求11的方法，包括将权利要求1或2的DNA导入植物。

13.权利要求10到12中任一项的方法，其中所述植物是水稻。

14.一种编码水稻sd1蛋白的DNA。