CN1535978A - 环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如说明书中结构式(1)所示的cADPR类似物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖或其衍生物，及其制备方法和作为cADPR探针的用途。

Description

环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖类化合物
技术领域
本发明涉及一类内源性Ca2+激动剂环腺苷二磷酸核糖(cADPR)的类似物，即利用化学方法合成的环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖类化合物，及合成方法。
背景技术
环腺苷二磷酸核糖是β-NAD+的代谢物，药理研究表明它不仅具有钙动员活性，而且还能作为细胞内信使传导细胞外信号。由于cADPR易于水解和酶解，因而在某种程度上限制了对其生理作用和药理作用的研究，因此目前急需合成稳定性好且活性高的cADPR类似物来替代cADPR作为探针进行研究。
目前合成cADPR类似物的方法主要有三种，即酶法合成，仿生法合成和化学法合成。由于前两种方法对底物有特异性的要求，因而在某种程度上限制了这两种方法的应用。本发明采用了化学的方法合成了cADPR的类似物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖。
发明内容
本发明的一个目的是提供如以下结构式(1)所示的cADPR类似物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖及其衍生物：
Figure A0310919500041
在本发明的一个特定实施方案中，提供了具有以下通式(2)的化合物，它是结构式1的8-位取代产物：
X＝H，O，Cl，N3.NR2，CF3        R＝alkyl or aryl
其中R各自独立是烷基(包括取代烷基)或芳基(包括取代芳基)，如取代或非取代C1-C10烷基，取代或非取代C6-C10芳基，取代或非取代芳烷基。取代基可以是烷基、羟基、卤素、酸基、胺基等。
如附图2所示，本发明的再一个目的是提供如以上结构式1所示的化合物及其衍生物的制备方法，包括：
以5’-O-被保护的2’，3’-O-异亚丙基肌苷为底物，在过量的DBU(1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯)的存在下，与2-卤代甲氧基乙氧基乙酸乙酯发生亲核取代反应，获得N1位取代产物；
N1位取代产物去除5’-保护基，生成的5’羟基与(PhNH)2PCOCl反应得到了磷酰胺基保护的产物；
磷酰胺基保护的产物脱乙酰，得到了脱乙酰基的产物，脱乙酰基的产物与PSS反应(例如在TPSCl和1-H四唑的存在下)生成了二磷酸酯产物；
二磷酸酯产物连续脱除二苯氨基和苯硫基，得到分子内环合前体产物；
根据Matsuda的方法进行分子内环合反应，获得环化产物；和
脱除环化产物的异丙叉保护基，得到了目标化合物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖，再任选进行取代反应，获得衍生物。
上述通式2的取代产物的制备方法包括：通式1化合物在适宜溶剂中与卤素反应，可以获得8位卤代产物，8-卤代产物与二甲亚砜反应可以获得8-叠氮取代产物，8-位叠氮取代产物进行还原，可以获得8-氨基取代产物，8-氨基取代产物可以与卤代烃反应生成8-脂族或芳族胺基取代产物。
本发明的另一个目的是如以上所述化合物或其衍生物在医学中的用途，尤其作为稳定性好且活性高的cADPR探针的替代物的用途。
本发明还涉及所述化合物作为内源性钙激动剂的应用。
以下结合图2来详细说明本发明化合物的合成过程。
在合成的过程中有两个关键的步骤是嘌呤碱基N1位的烷基化和分子内的环磷酸化。以KCO3和NaH作为碱在嘌呤碱基N9位烷基化的传统方法对于N1位烷基化产物的构建是行不通的。因为嘌呤碱基的N1位具有较弱的亲核性。本发明以5’-O-叔丁基二甲基硅基2’，3’-O-异亚丙基肌苷3为底物，在过量的DBU的存在下，与2-氯甲氧基乙氧基乙酸乙酯发生亲核取代反应，成功得到N1位取代产物4，产率为64％。N1位醚链取代物4的结构是根据UV和H1NMR光谱确定的。4的叔丁基二甲氧基硅基保护基用叔丁基铵氟除去后生成的5’羟基与(PhNH)2PCOCl反应得到了磷酰胺基保护的产物6，产率为85％。6在甲醇钠的作用下得到了脱乙酰基的产物7。在TPSCl和1-H四唑的存在下，7与PSS反应生成了二磷酸酯产物8，两步产率为81％。8的二苯氨基和苯硫基的连续脱除是在异戊氰和次磷酸的连续作用下完成的，得到分子内环合前体产物9，产率为87％。分子内环合反应是根据Matsuda的方法，在吡啶中，以I2作为促进剂，3分子筛作为除水剂将9用微量注射泵注入反应体系进行反应。经过HPLC纯化得到了环化产物10的三乙胺盐，产率为45％，其结构是根据HR-FABMS和31PNMR坚定的。最后以60％甲酸水容易脱除环化产物10的异丙叉保护基，便得到了目标化合物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2。
附图说明
图1是天然产物环腺苷二磷酸核糖1及由由本发明获得的其类似物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2的结构式。
图2是环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2的合成路线。
图中i：DBU，ClCH2OCH2CH2OAC，CH2Cl2，室温；ii：TBAF，THF，室温；iii：(PhNH)2POCl，Py，室温；iv：甲醇钠，甲醇，室温；v：PSS，TPS，1-H四唑，Py，室温；vi：(a)异戊氰，Py/AcOH/Ac2O(2∶1∶1)，室温；(b)H3PO2，三乙胺.Py，室温；vii：I2，3分子筛，Py，室温；viii：60％甲酸水溶液，室温。
具体实施例
以下通过实施例来说明本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于说明，不限制本发明的范围。
在实施例中，使用以下缩写：
DBU：1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯
TBAF：叔丁基铵氟
PSS：S，S-二苯基-二硫代磷酰基环己基铵盐
TEAA：三乙胺的醋酸盐
实施例1
N1-[(2-乙酰-O-乙氧基)甲基]-5’-O-叔丁基二甲基硅基-2’，3’-O-异亚丙基肌苷4
将化合物5’-O-叔丁基二甲基硅基-2’，3’-O-异亚丙基肌苷3(422mg，1mmol)溶于10ml新蒸二氯甲烷，冰浴下加入DBU(0.76g，5mmol)，室温搅拌，再分次加入氯甲氧基乙酸乙酯(1.52g，10mmol)，室温反应30分钟，蒸干溶剂，常压柱层析得化合物(二氯甲烷-甲醇)4，收率64％。
实施例2
N1-[(2-乙酰-O-乙氧基)甲基]-2’，3’-O-异亚丙基肌苷5
化合物4(308mg，0.5mmol)溶于2ml四氢呋喃，加入1滴乙酸和1mlTBAF 1M四氢呋喃溶液，室温搅拌6～8小时；蒸干溶剂，常压柱层析得189mg化合物5，收率90％。
实施例3
N1-[[2-羟基乙氧基]-甲基]-5’-O-(N，N-二苯基)-磷酰基-2’，3’-O-异亚丙基-肌苷6
189mg(0.45mmol)化合物28，二苯胺基磷酰氯(18mmol，4.8g)和1H四唑(18mmol，1.26g)溶于10ml无水吡啶，室温搅拌72小时；减压蒸干吡啶，以无水乙醇重结晶，残余物柱层析(二氯甲烷-甲醇)共得白色固体6，产率85％。
实施例4
N1-[[2-羟基乙氧基]-甲基]-5’-O-二苯胺磷酰基-2’，3’-O-异亚丙基肌苷7
化合物6(248，0.38mmol)溶于2.5ml甲醇，加入10mg甲醇钠，搅拌过夜，减压蒸干溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇)得7，产率95％。
实施例5
N1-[[[2-(二苯基硫代)磷酰基]O-乙氧基]-甲基]-5’-O-二苯胺磷酰基-2’，3’-O-异亚丙基肌苷8
将7(221mg，0.36mmol)溶于3ml无水吡啶，加入三异丙基磺酰氯(218mg，0.72mmol)、PSS(262mg，0.72mmol)和四氮唑(50mg，0.72mmol)，室温搅拌24小时，蒸干溶剂常压柱层析得化合物8，产率85.6％。
实施例6
N-1-[[[2-(苯基硫代)磷酰基]-O-乙氧基]-甲基]-5’-O-磷酰基-2’，3’-O-异亚丙基肌苷9
化合物8(120mg，0.132mmol)溶于3.5ml吡啶-乙酸-乙酸酐(2∶1∶1)混合溶剂，加入异戊腈(266ul，1.98mmol)室温搅拌10小时；减压蒸干溶剂，加入用吡啶带干的次亚磷酸(128ul)和三乙胺(1mmol，183ul)，室温搅拌15小时。减压蒸干溶剂后以5ml氯仿溶解，水洗(4×3)，合并水洗水相加入5ml吡啶，减压蒸干溶剂，用0.5ml 0.1M TEAA(PH＝7)缓冲液溶解，反向C-18柱HPLC分离，梯度0～40％乙腈，0.1M TEAA，流速3ml/min，检测波长260nm，收集18***峰。浓缩后用反向C-18柱脱氧，梯度洗脱0～20％乙腈，水。冷冻干燥的浅黄色固体9，收率87％。
实施例7
环2’，3’-O-异亚丙基-肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖10
称取干燥后的分子筛1.5g置于100ml三口瓶中，反复充氩气，冷至室温，加入升华碘和30ml新蒸吡啶，闭光。取环合前体9(26mg，38.9μmol)溶于12ml新蒸吡啶，用注射泵在24小时注入到上述吡啶溶液。加完后继续在室温下反应3小时。用带硅藻土垫层的砂芯漏斗过滤，水洗，减压蒸干，加入5ml氯仿溶解，水洗三次，合并水相再以***洗涤(2×5)，浓缩，以0.1M TEAA(PH＝7)溶解，反向C-18梯度淋洗0～40乙腈，0.1MTEAA，收集所要组分，浓缩后在以C-18脱盐0～20％A(乙腈)B(H2O)，冷冻干燥得固体10，收率45.5％。
实施例8
环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖2
将环合产物10(12mg，)溶于3ml 60％甲酸，室温搅拌反应5小时，减压蒸干溶剂。再以0.1M TEAA溶解，反相C-18分离，0～40％A梯度洗脱A：乙腈，B：20％乙腈0.1M TEAA溶液，收集所要主峰，浓缩后脱盐，梯度0～10％A(乙腈)B(H2O)，冷冻干燥的固体2，收率44.6％。
实施例9
8位卤代产物的合成
将实施例8的产物溶于醋酸醋酸钠的缓冲溶液，加入溴或氯水，室温搅拌过夜，过滤得粗品，用乙醇重结晶。
实施例10
8位叠氮取代产物的合成
将由实施例9获得的8位溴代的底物溶于二甲基亚砜中，室温搅拌24小时，蒸干溶剂，用甲苯重结晶。
实施例11
8位氨基取代产物的合成
将由实施例10获得的8位叠氮取代的底物溶于乙醇，加入催化剂量的鈀碳，加氢还原3小时，过滤除去鈀碳，蒸干溶剂。
实施例12
8位脂族胺取代产物的合成
将实施例11获得的8-氨基取代产物与溴乙烷在适量碳酸钾的存在下反应，获得了8-二乙氨基取代产物。
实施例13
8位芳族胺取代产物的合成
将实施例11获得的8-氨基取代产物与苄溴在适量碳酸钾的存在下反应，获得了8-二苄氨基取代产物。

Claims (9)

1、如以下结构式(1)所示的cADPR类似物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖或其衍生物：
Figure A031091950002C1
2、具有以下通式(2)的化合物，它属于权利要求1的结构式1化合物的8-位取代产物：
Figure A031091950002C2
        X＝H，Br，Cl，N3.NR2，CF3    R＝alkyl or aryl
其中R各自独立是烷基(包括取代烷基)或芳基(包括取代芳基)，如取代或非取代C1-C10烷基，取代或非取代C6-C10芳基，取代或非取代芳烷基。
3、如以上结构式1所示的化合物或其衍生物的制备方法，包括：
以5’-O-被保护的2’，3’-O-异亚丙基肌苷为底物，在过量的DBU(1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯)的存在下，与2-卤代甲氧基乙氧基乙酸乙酯发生亲核取代反应，获得N1位取代产物；
N1位取代产物去除5’-保护基，生成的5’羟基与(PhNH)2PCOCl反应得到了磷酰胺基保护的产物；
磷酰胺基保护的产物脱乙酰，得到了脱乙酰基的产物，脱乙酰基的产物与PSS反应(例如在TPSCl和1-H四唑的存在下)生成了二磷酸酯产物；
二磷酸酯产物连续脱除二苯氨基和苯硫基，得到分子内环合前体产物；
根据Matsuda的方法进行分子内环合反应，获得环化产物；和
脱除环化产物的异丙叉保护基，得到了目标化合物环肌苷二磷酸乙氧基甲基核糖，再任选进行取代反应，获得衍生物。
4、权利要求1的化合物或其衍生物在医学中的用途。
5、权利要求1的化合物或其衍生物作为稳定性好且活性高的cADPR探针的替代物的用途。
6、权利要求2的化合物在医学中的用途。
7、权利要求2的化合物作为稳定性好且活性高的cADPR探针的替代物的用途。
8、权利要求1的化合物或其衍生物作为内源性Ca2+激动剂的应用。
9、权利要求2的化合物作为内源性Ca2+激动剂的应用。
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