CN1523038A - 一种血浆蛋白的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血浆蛋白的分离方法,特别是白蛋白和球蛋白的制备方法,其通过调节血浆的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,用加压过滤的方式分离得上清液和沉淀。因过滤过程可在密闭的管道内进行,分离步骤减少,无需人工取沉淀,使得整个生产周期与现有的低温乙醇法相比减少了一半;而且生产过程易于控制,能够减少产品污染,提高产品质量和产品收率;同时,该方法还可以改善生产环境,降低生产成本。
Description
所属技术领域
本发明涉及人血浆蛋白制品的制备方法,特别是白蛋白和球蛋白的制备方法。
背景技术
影响蛋白质沉淀反应有诸多因素,改变这些因素可容易地从复杂的血浆混合物中提纯蛋白质。在低温乙醇法中影响蛋白质沉淀反应的因素主要有五个,通称五变因素:①pH控制;②温度;③蛋白浓度;④离子强度;⑤乙醇浓度。因而分离可按两种不同的途径考虑:(1)选择要提取的蛋白质溶解度最大,其他蛋白质溶解度最小的条件,将需要的蛋白质保存在溶液中,其余所有的蛋白质被沉淀。(2)选择上述相反的条件,使要提取的蛋白质选择性地沉淀下来,而其余的蛋白质保存在溶液中。
E.J.Cohn教授等利用上述原理,发表了一系列有关从血浆中分离、纯化蛋白质的方法(Cohn1-10法),奠定了血浆蛋白分离技术的基础。1946年发表的Cohn 6法主要用于分离白蛋白,是白蛋白分离的经典方法,今天所使用的有关白蛋白和免疫球蛋白分离的方法都是在Cohn 6法的基础上形成的。
瑞士红会的Nitchmann Kistler等人,在Cohn 10法的基础上进行了改进,于1962年发表了称之为“Kistler和Nitchmann”血浆蛋白分离改良法。该法的优点是适合大规模的分离,简化了生产步骤,生产周期缩短了1/3;该法用95%的乙醇缓慢加入血浆蛋白溶液内,使待分离溶液体积减少,欲处理的最大溶液体积从投产血浆体积的2.2倍减少到1.7倍(包括免疫球蛋白的分离),生产中乙醇的耗量大大降低。同时,通过此法的多级分离,提高了血浆中白蛋白和免疫球蛋白的回收率。
在血浆蛋白低温乙醇分离法中,蛋白质溶液的液-固相分离是分级分离法的关键之一,现有的血浆蛋白多级分离方法是采用离心方法来达到液-固相分离的目的。但由于低温乙醇法要求低温条件和连续冷冻离心机等设备,所以一次性投资相对较高,同时,其生产过程不利于管道化和自动化控制,且工作人员与中间产品的直接接触容易导致人员和产品的污染,影响产品的质量和产率。此外,现有的血浆蛋白低温乙醇分离法仍然存在步骤较多、周期较长的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种有别于传统的分离血浆蛋白液-固相的分离方法,即有别于离心的方法。通过pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度、温度以及血浆蛋白液固相分离方式的改变,克服离心方法一次性设备投资大及由于采用人工取沉淀方式导致的人员和产品污染、产品质量和产率降低的缺陷,,同时克服血浆蛋白分级分离步骤较多、周期较长的缺陷。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种血浆蛋白的分离方法,其特征是:调节血浆的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,用加压过滤的方式分离得上清液和沉淀。
所述的血浆蛋白的分离方法包括:
a、调节血浆的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,得到上清A和沉淀C;
b、取上清A,调节其pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去沉淀B1,得到上清A1;
c、调节上清A1的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去上清A2,得到沉淀B2,即白蛋白;
d、将步骤a的沉淀C溶解,调节其pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去沉淀D1,分离得上清C1;
e、调节上清C1的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去上清C2,得沉淀D2,即球蛋白。
如图1所示,上述步骤c、e分别得到的白蛋白和球蛋白沉淀用注射用水溶解后,经过滤机过滤和超滤进一步去杂质得血浆制品白蛋白原液和球蛋白原液,可以被进一步制备成白蛋白及免疫球蛋白制剂。
上述分离方法中步骤a所述的pH为5.8~6.1,蛋白浓度为5.28%(w/v),离子强度为0.14,温度为-5℃±1℃,乙醇浓度为20%(v/v)。
步骤b所述的pH为5.75~6.00,蛋白浓度为2.42%(w/v),离子强度为0.09,温度为-5℃~-9℃,乙醇浓度为40%(v/v)。
步骤c所述的pH为4.8~4.9,蛋白浓度为1.0~1.3%(w/v),离子强度为0.1,温度为-5℃~-9℃,乙醇浓度为40%(v/v)。
步骤d所述的pH为5.10~5.40,蛋白浓度为1.0%(w/v),离子强度为0.01,温度为-4℃±1℃,乙醇浓度为14%(v/v)。
步骤e所述的pH为7.1~7.3,蛋白浓度为0.4%(w/v),离子强度为0.05,温度为-5℃~-8℃,乙醇浓度为25%(v/v)。
优选的,在上述的分离方法的步骤a、b、d中加入助滤剂后,再加压过滤。具体地,所述的助滤剂是硅藻土和珍珠岩中的一种或两种,其加入量为:0.2~1.0克/L,加入助滤剂后的溶液需以20-60转/分钟搅拌10分钟~2小时。
本发明所述的血浆蛋白加压过滤分离方法的压力为0~3bars,步骤a、b、d中加压过滤的滤板面积为8~15平方米,步骤c中加压过滤的滤板面积为4~8平方米,步骤e中加压过滤的滤板面积为5~8平方米,滤板孔径均为0.2~1.0微米。
本发明的有益效果:采用本发明血浆蛋白分离方法,因过滤过程可在密闭的管道内进行,分离步骤减少,设备投资减少,无需人工取沉淀,使得整个生产周期与现有的低温乙醇法相比减少了一半。而且生产过程易于控制,能够减少产品污染,提高产品质量和产品收率,其白蛋白产率从2.2~2.4g/100ml血浆提高到2.8~3.0g/100ml血浆,球蛋白产率从0.35~0.45g/100ml血浆提高到0.55~0.70g/100ml血浆。同时,该方法还可以改善生产环境,降低操作人员的劳动强度,提高了安全性,大大降低了生产成本。
附图说明
图1本发明血浆蛋白白蛋白和球蛋白的分步分离步骤
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
下面结合附图1对本发明作进一步的说明。
设备名称 生产厂家 型号
夹层反应罐: Mueller 4000L
压滤机: SeitzSchenk NIRO600/2000.D
过滤器: CUNO 12ZPA
(1)、取1000人份经检测合格的血浆混合,按照图1所示步骤进行分步分离,经如下步骤:
a、冰冻血浆置融浆罐中融化,融浆水温30~37℃,不断搅拌直至完全融化;然后,进入夹层反应罐,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH为5.8,用注射用水调整蛋白浓度(P%)为5.28%,用氯化钠调整离子强度(r/2)为0.14,温度(T)为-5℃,用95%(重量)乙醇调整溶液乙醇(EtOH)浓度为20%。
用注射用水或乙醇溶液平衡管道和滤器,按照每升血浆加入0.95克的助滤剂,以20~60转/分钟搅拌10分钟~2小时后,将血浆在0~3bars的压力下,通过15平方米的滤板过滤分离,滤板的孔径为1.0微米,得上清和沉淀,用压缩空气或挤压的方式干燥,然后取出沉淀物;
b、步骤a分离得到的上清液,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH为5.8,用注射用水调整P%为2.42%,用氯化钠调整r/2为0.09,温度(T)为-7℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为40%。
然后用注射用水和缓冲液平衡管道和滤器,按照每升血浆加入0.96克的助滤剂,以20~60转/分钟搅拌10分钟~2小时后,将溶液在0~3bars的压力下通过15平方米的滤板过滤分离得上清和沉淀,滤板的孔径为0.8微米,过滤完成后用压缩空气或挤压的方式干燥,然后取出沉淀物;
c、步骤b过滤分离得到的上清,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH为4.81,用注射用水调整P%为1.0,用氯化钠调整r/2为0.1,温度(T)为-9℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为40%。
然后,用注射用水或缓冲液平衡管道和滤器,将溶液在0~3bars的压力下通过8平方米的滤板过滤分离得上清和沉淀,滤板的孔径为1.0微米,过滤完成后用压缩空气挤压的方式干燥,然后取出沉淀物;
d、步骤a分离得到的沉淀,用注射用水溶解后,进入夹层反应罐中,在搅拌下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH为5.10,用注射用水调整P%为1.0%,用氯化钠调整r/2为0.01,温度(T)为-3℃,用95%7醇调整溶液EtOH浓度为14%。
然后,用注射用水或缓冲液平衡管道和滤器,按照每升血浆加入0.66克的助滤剂,以20-60转/分钟搅拌10分钟~2小时后,将溶液在0~3bars的压力下通过15平方米的滤板过滤分离得上清和沉淀,滤板的孔径为1.0微米,过滤完成后用压缩空气挤压的方式干燥,然后取出沉淀物;
e、步骤d过滤分离得到的上清,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用1mol的NaOH溶液调整pH为7.15,用注射用水调整P%为0.4%,用氯化钠调整r/2为0.05,温度(T):-8℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为25%。
然后,用注射用水或缓冲液平衡管道和滤器,将溶液在0~3bars的压力下通过8平方米的滤板过滤分离得上清和沉淀,滤板的孔径为1.0微米,过滤完成后用压缩空气挤压的方式干燥,然后取出沉淀物。
(2)、在上述步骤(1)中调节了pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度后,溶液通过压滤机过滤,压滤机***的操作步骤如下:
(A)滤器安装和准备:清洗滤器夹板并用65%(v/v)的乙醇喷淋处理,检查滤板是否破损,将滤板和夹板以自下而上的顺序安装到滤芯上,将安装完毕的滤芯正确放入滤器中,并连接好相应管道,调好压力;
(B)滤器预处理:启动滤器夹层制冷,检查滤器管道和开关,开动进液泵排除管道内残余液体并用相应的缓冲液冲洗平衡滤器和管道,然后用压缩空气吹干液体;
(C)过滤:将反应罐出液开关及相应主管道开关调至打开位置,打开进液泵开始过滤,控制过滤速度,进液压力0~3bars;
(D)干燥:滤过完成后用压缩空气吹干过滤***;
(E)刮取沉淀:关闭压力泵,调整过滤***管道开关至“关闭”位置,打开滤器取出滤芯,水平取下滤板放于沉淀车上,用刮刀将滤板上沉淀刮入指定容器内,根据不同反应步骤决定沉淀的进一步处理(溶解或废弃);
(F)清洗过滤***:用注射用水清洗滤器各部分及管道,清洗干净后用65%的乙醇喷淋消毒滤器,用95%的乙醇冲洗管道消毒备用。
(3)、步骤c和e所得的沉淀经常规的溶解,过滤,超滤等步骤得到白蛋白原液和球蛋白原液。
所得的白蛋白产率为2.92g/(100ml血浆);球蛋白产率为0.66g/(100ml血浆)。
实施例1
(1)、取1000人份经检测合格的血浆混合,按照图1所示步骤进行分步分离,经如下步骤:
a、冰冻血浆置融浆罐中融化,融浆水温30~37℃,不断搅拌直至完全融化后;进入夹层反应罐,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:5.81(改为5.9),用注射用水调整蛋白浓度(P%):5.28%,用氯化钠调整r/2:0.14,T:-4℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:20%。
然后,按照每升血浆加入0.31克的硅藻土,以20~60转/分钟搅拌60分钟后,溶液进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板10平方米,滤板的孔径为0.45微米。压滤分离得上清和沉淀;
b、步骤a分离得到的上清液,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:5.9,用注射用水调整P%:2.42%,用氯化钠调整r/2:0.09,T:-5℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:40%。
然后,按照每升血浆加入0.45克的硅藻土,以20~60转/分钟搅拌60分钟,然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板8平方米,滤板的孔径为0.22微米。压滤分离得上清和沉淀;
c、步骤b过滤分离得到的上清,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:4.85,用注射用水调整P%:1.2%,用氯化钠调整r/2:0.1,T:-7℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:40%。
然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板6平方米,滤板的孔径为0.45微米。压滤分离得沉淀和上清;
d、步骤a分离得到的沉淀,用注射用水溶解后,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:5.2,用注射用水调整P%:1.0%,用氯化钠调整r/2:0.01,T:-4℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度:14%。
然后,按照每升血浆加入0.31克的硅藻土,以20~60转/分钟搅拌60分钟,然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板10平方米,滤板的孔径为0.45微米,压滤分离得沉淀和上清;
e、步骤d过滤分离得到的上清, 进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用1mol的NaOH溶液调整pH:7.1,用注射用水调整P%:0.4%,用氯化钠调整r/2:0.05,T:-6℃,用95%乙醇调整ETOH:25%。
然后,然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板4平方米,滤板的孔径为0.45微米。压滤分离得沉淀和上清。
(2)、步骤c和e所得的沉淀经常规的溶解、过滤、超滤等步骤得到白蛋白和球蛋白。
本实施例所得的白蛋白产率为2.82g/(100ml血浆);球蛋白产率为0.56g/(100ml血浆)。
实施例2
(1)、取1000人份经检测合格的血浆混合,按照图1所示步骤进行分步分离,经如下步骤:
a、冰冻血浆置融浆罐中融化,融浆水温30~37℃,不断搅拌直至完全融化后;进入夹层反应罐,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:6.1,用注射用水调整蛋白浓度(P%):5.28%,用氯化钠调整r/2:0.14,T:-6℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:20%。
然后,按照每升血浆加入0.66克的硅藻土,以20~60转/分钟搅拌30分钟,然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板12平方米,滤板的孔径为0.65微米,压滤分离得沉淀和上清;
b、步骤a分离得到的上清液,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:6.0,用注射用水调整P%:2.42%,用氯化钠调整r/2:0.09,T:-9℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:40%。
然后,按照每升血浆加入0.66克的硅藻土,以20~60转/分钟搅拌30分钟后,进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板12平方米,滤板的孔径为0.65微米,压滤分离得沉淀和上清;
c、步骤b过滤分离得到的上清,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:4.9,用注射用水调整P%:1.0%,用氯化钠调整r/2:1.3%,T:-5℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:40%。
然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板8平方米,滤板的孔径为0.65微米,压滤分离得沉淀和上清;
d、步骤a分离得到的沉淀,用注射用水溶解后,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用醋酸盐缓冲液调整pH:5.4,用注射用水调整P%:1.0%,用氯化钠调整r/2为0.01,T:-5℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:14%。
然后,按照每升血浆加入0.47克硅藻土,以20~60转/分钟搅拌30分钟,然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板12平方米,滤板的孔径为0.65微米,压滤分离得沉淀和上清;
e、步骤d过滤分离得到的上清,进入夹层反应罐中,在搅拌条件下,调整以下参数:用1mol的NaOH溶液调整pH:7.3,用注射用水调整P%为0.4%,用氯化钠调整r/2:0.05,T:-5℃,用95%乙醇调整溶液EtOH浓度为:25%。
然后进入压滤机过滤:压力0~3bars,滤板6平方米,滤板的孔径为0.65微米。
(2)、步骤c和e所得的沉淀经常规的溶解、过滤、超滤等步骤得到白蛋白和球蛋白。
本实施例所得的白蛋白产率为2.89g/(100ml血浆);球蛋白产率为0.62g/(100ml血浆)。
Claims (14)
1、一种血浆蛋白的分离方法,其特征是:调节血浆的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,用加压过滤的方式分离得上清液和沉淀。
2、根据权利要求1所述的血浆蛋白的分离方法,其特征是:包括:
a、调节血浆的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,得到上清A和沉淀C;
b、取上清A,调节其pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去沉淀B1,得到上清A1;
c、调节上清A1的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去上清A2,得到沉淀B2,即白蛋白;
d、将步骤a的沉淀C溶解,调节其pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去沉淀D1,分离得上清C1;
e、调节上清C1的pH值、离子强度、蛋白浓度、乙醇浓度和温度,加压过滤,弃去上清C2,得沉淀D2,即球蛋白。
3、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤a中所述的pH为5.8~6.1,蛋白浓度为5.28%(w/v),离子强度为0.14,温度为-5℃±1℃,乙醇浓度为20%(v/v)。
4、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤b中所述的pH为5.75~6.00,蛋白浓度为2.42%(w/v),离子强度为0.09,温度为-5℃~-9℃,乙醇浓度为40%(v/v)。
5、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤c中所述的pH为4.8~4.9,蛋白浓度为1.0~1.3%(w/v),离子强度为0.1,温度为-5℃~-9℃,乙醇浓度为40%(v/v)。
6、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤d中所述的pH为5.10~5.40,蛋白浓度为1.0%(w/v),离子强度为0.01,温度为-4℃±1℃,乙醇浓度为14%(v/v)。
7、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤e中所述的pH为7.1~7.3,蛋白浓度为0.4%(w/v),离子强度为0.05,温度为:-5℃~-8℃,乙醇浓度为25%(v/v)。
8、根据权利要求2所述的分离方法,其特征是:在步骤a、b、d中加入助滤剂后再加压过滤。
9、根据权利要求8所述的分离方法,其特征是:所述的助滤剂是硅藻土和珍珠岩中的一种或两种。
10、根据权利要求8或9所述的分离方法,其特征是:助滤剂的加入量为:0.2~1.0克/L。
11、根据权利要求8所述的分离方法,其特征是:加入助滤剂后慢速搅拌10分钟~2小时。
12、根据权利要求11所述的分离方法,其特征是:搅拌速度为20-60转/分钟。
13、根据权利要求1、2或8所述的血浆蛋白的分离方法,其特征在于:所述加压过滤的压力为0~3bars。
14、根据权利要求2所述的血浆蛋白分离的方法,其特征在于:步骤a、b、d所述加压过滤的滤板面积为8~15平方米,步骤c所述加压过滤的滤板面积为4~8平方米,步骤e所述加压过滤的滤板面积为5~8平方米,滤板孔径均为0.2~1.0微米。
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