CN1498622A - 含有人参皂苷Rg3或人参皂苷Rh2的谷氨酸介导的神经毒性抑制组合物 - Google Patents

含有人参皂苷Rg3或人参皂苷Rh2的谷氨酸介导的神经毒性抑制组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有谷氨酸介导神经毒性抑制效果的组合物。具体地说，本发明提供一种抑制谷氨酸介导神经毒性组合物，该组合物是包含20(S)－人参皂苷Rg3、20(S)－人参皂苷Rh2以及20(S)－人参皂苷Rg3和20(S)－人参皂苷Rh2的混合物。本发明详细研究了20(S)－人参皂苷Rg3和20(S)－人参皂苷Rh2对神经细胞的作用机理及其效能，本发明的组合物具有优良的神经毒性抑制或神经细胞保护效果，因此，可以用于治疗脑外伤、脑中风、脑缺血、中风、癫痫、阿耳茨海默病或亨廷顿舞蹈病等脑疾病。

Description

含有人参皂苷Rg3或人参皂苷Rh2的谷氨酸 介导的神经毒性抑制组合物
技术领域
本发明涉及具有谷氨酸(glutamate)介导神经毒性抑制效果的组合物。具体地，本发明提供下述抑制谷氨酸介导的神经毒性的组合物：该组合物包含选自20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2混合物的人参皂苷。
人参(Panax ginseng C.A.Meyer(Araliaceae))的根——人参不仅是亚洲，也是世界使用最多的生药之一。人参中具有生物学效果的成分中，作为人参皂苷或人参皂角甙为已知化合物，已经有30种以上的人参皂苷从人参中分离并已知其结构(参照Liu，C.X.等，J.Ethnopharmacol.36，27-38，1996和Baek，N.I.等，Planta Med.1996，62，86-87，1996)。其代表例有人参皂苷-Ra、-Rb1、-Rb2、-Rc、-Rd、-Re、Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2等。
生物体内的人参皂甙的各种功能中，最近的研究开始报告了人参对中枢神经的有益效果。已知人参对动物模型的学习和记忆力显示出效果。特别是已知人参能减缓海马神经细胞损伤导致的记忆力衰退，已知该细胞是东莨菪碱(scopolamine)损伤的动物模型或随着年龄增长而衰退的记忆力、记忆形成的最重要部位(参照Hsieh，M.T.等，Phytother.Res.14，375-377，2000，Wesnes，K.A.，Ward等，Psychopharmacology(Berl)152，353-361，2000和Zhong，Y.M.等，Physiol.Behab.69，511-525，2000)。
除了对学习和记忆力的效果外，还报告了人参对脑出血、脑中风和脑缺血等脑疾病的重要有益效果。外部脑损伤或脑血管堵塞诱发脑损伤时，脑内主要的兴奋性神经递质——谷氨酸的稳定性被破坏，作为谷氨酸诱发的神经毒性而使神经细胞死亡。有报告(参照Wen，T.C.等，Acta.Neuropathol.(Berl)91，15-22，1996和Maffei Facino，R.等，Planta Med.65，614-619，1999)指出，用人参处理心肌或全脑血管闭塞诱发脑缺血的动物模型的结果发现，可以防止神经细胞死亡。
上述人参神经细胞保护效果通过下述事实进一步证明(参照Lim，J.H.等，Neurosci Res.28，191-200，1997和Kim，Y.C.等，J.Neurosci.Res.53，426-432，1998)：人参成分之一的人参皂苷Rb1对脑缺血中最容易受损伤的海马细胞的神经细胞死亡抑制效果，以及人参皂苷Rb1和Rg3对被培养的皮质神经元中的谷氨酸引起的神经毒性的抑制。
但是，虽然人参对中枢神经的上述有益效果已经发表，但目前还不清楚其详细机理，各成分的不同作用也尚处于不明状态中。
发明内容
本发明的目的是明确人参皂苷对谷氨酸诱发的神经毒性的抑制作用，提供含有下述人参皂苷的抑制谷氨酸介导神经毒性的组合物：直接筛选人参皂苷中对神经细胞中的谷氨酸诱发神经毒性中最重要的NMDA受体具有优良抑制效果的人参皂苷，所述组合物含有该皂苷。
为了筛选具有谷氨酸毒性抑制效果的人参皂苷，本发明人进行反复研究，结果确定下述事实：20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rg3的代谢产物-20(S)-人参皂苷Rh2，以及它们的混合物对谷氨酸受体亚型-NMDA受体具有优良的抑制效果，从而完成本发明。
因此，本发明提供具有抑制谷氨酸介导神经毒性效果的组合物，具体地，本发明提供下述抑制谷氨酸介导神经毒性的组合物：该组合物包含选自20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物的人参皂苷。
通过NMDA受体的谷氨酸神经毒性是神经外伤、脑中风、脑溢血时诱发神经细胞死亡从而导致脑神经非可逆性损伤的最主要的**(Skaper S.D.等，Ann N Y Acad Sci.939，11-22，2001和Massieu L&Garcia O.Neurobiology(Bp)6，99-108，1998)，具有谷氨酸介导神经毒性抑制效果的本发明组合物可以用于治疗包括外伤、脑中风、脑缺血、中风的神经疾病和谷氨酸受体过度活化诱发的癫痫或亨廷顿舞蹈病(ハンチントン病)等脑疾病。
本发明已经明确如下事实：20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物对谷氨酸、特别是NMDA受体的特异性抑制剂具有优良的效果。因此，作为与本发明最接近的在先研究，被培养的皮质细胞中人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3抑制神经细胞死亡的结果是唯一的(参照Kim，Y.C.等，J.Neurosci.Res.53，426-432，1998)，但在该在先研究中，只对20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的混合物的效果进行了试验，并没有提示如本发明所述的不是混合物的20(S)-人参皂苷Rg3具有优良的谷氨酸介导神经毒性抑制效果。
下面详细说明本发明。
本发明就与外部刺激导致的脑损伤或脑血管闭塞诱发的脑梗塞、脑出血、中风等相关的谷氨酸诱发神经毒性的初期机理，对10种主要的人参皂苷进行了研究。将海马神经从白鼠怀孕18天到产后1天的状态分离后，照射***在该神经细胞的病理现象中最先观察到神经细胞死亡，并且所述海马神经作为学习和记忆力中最重要的部位而已知。然后，使用在试管条件中培养一周的细胞。
另外，神经细胞中最主要的神经递质——谷氨酸通过NMDA受体、非NMDA受体和代谢性谷氨酸受体3种受体起作用。谷氨酸诱发的神经毒性中，诱导过量钙进入细胞中的NMDA受体是最重要的，因此，NMDA受体活化时伴随的钙流入，通过细胞内Ca2+-影像化技术，NMDA受体介导的离子流入，通过全细胞膜片钳技术研究其初期机理后，通过现有的神经毒性分析方法——酶分析法(MTT分析)确证了人参皂苷成分的结果。
根据本发明确认的结果，20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及它们的混合物可有效抑制NMDA受体介导的钙流入，这点已经明确。
因此，含有20(S)-人参皂苷Rg3和/或20(S)-人参皂苷Rh2的谷氨酸介导神经毒性抑制组合物可以用于有效治疗包括外伤、脑中风、脑缺血和中风的神经疾病和谷氨酸受体过度活化诱发的癫痫或亨廷顿舞蹈病等脑疾病。
本发明组合物优选按照药剂学领域的常规方法制成适合于口服的单位给药型的制剂、注射剂、糖浆剂等形式后服用。
适合于口服用药的剂型包括硬胶囊、软胶囊、片剂和散剂等。这些口服制剂中，除了药物学活性成分外，还可以包含一种或一种以上没有药物学活性的普通载体，例如含有下列添加剂成分：淀粉、乳糖和高岭土等赋形剂，水、明胶、***胶和黄蓍胶等粘合剂，淀粉、藻酸钠等崩解剂，滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁和液体石蜡等润滑剂。
另外，本发明的药物组合物还可以用作吸入剂、舌下片、局部注入剂、局部涂敷剂、肌肉注射剂、皮下注射剂和皮内注射剂。
本发明组合物的静脉给药组合物可以按照常规方法配制。例如，本发明组合物可以通过将冻干结晶溶于生理盐水、蒸馏水、磷酸缓冲液等制成静脉给药制剂，也可以使用脂肪乳剂、脂质体制剂。
本发明组合物一天的给药量随给药对象的年龄、健康状态和并发症等多种因素而变化，以成人为基准时，一般将5～1000mg，优选10～500mg，更优选50～500mg活性成分在一天分1～2次给药。但是，可以根据脑神经疾病领域主治医生的判断施用上述用量以外的给药量。
本发明组合物中包含的人参皂苷是从生药人参中提取的成分，对人体使用具有安全性，这是本领域人员公知的。
附图简述
图1a是利用Ca2+-成像技术测定的NMDA受体活性测定图，图1b是用相同方法利用人参皂苷总成分(GTS)和现有已知的NMDA受体拮抗剂D-APV(D(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸)测定的NMDA受体活性测定图。
图2表示用图1的方法检查人参的10种主要人参皂苷成分(C-20位异构体未分离的状态)后，将最好的成分用全细胞膜片钳(whole-cellpatch-clamp)方法，通过NMDA受体介导流入电流确认的结果图。
图3表示在利用酶的神经毒性分析法(MTT分析)中，人参皂苷Rg3的神经细胞保护效果图。
图4是生物体中存在的微生物代谢的20(S)-人参皂苷的分解图。
图5表示图4所示的共9种20(S)-人参皂苷的NMDA受体介导钙流入的减少效果。
图6表示20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷-Rh2的混合物具有比各人参皂苷单一成分更优良的NMDA受体抑制效果图。
实施例1：海马神经细胞的分离和培养方法
将怀孕18天到产后1天白鼠的海马神经组织在解剖显微镜下分离，往Leibovitz L-15培养基中加入0.05％的木瓜蛋白酶，在37℃处理20分钟。然后，将酶溶液洗涤数次后，调整巴斯德吸移管的空隙大小，用聚-L-赖氨酸(0.5mg/ml)处理机械分离的海马单一神经细胞，在条状盖片上用1.5×105个细胞/ml进行培养。
将细胞在添加了下列成分的Neurobasla/B27培养液中培养：0.5mM L-谷氨酰胺、25μM-谷氨酸、25μM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。每周两次用未添加谷氨酸的培养基替代其1/2进行培养，培养7～15天后用于实验。
实施例2：细胞内钙浓度的测定
用乙酰氧基甲基酯形态的フラ一2(フラ一2/AM；分子探针，美国俄勒冈州Eugene公司产品)作为荧光性Ca2+标记物。用HEPES缓冲溶液(单位mM：150 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、2CaCl2、10HEPES、10葡萄糖，pH＝7.4)，将海马神经细胞与5μMフラ一2/AM和0.001％Pluronic F-127一起在室温进行40～60分钟一次培养和标记后，用HEPES缓冲溶液洗涤数次。稳定10分钟后用倒像显微镜测定细胞内钙离子浓度的变化。
具体地，用氙孤灯进行照射，通过电脑控制过滤轮(computer-controlledfilter wheel)(美国加利福尼亚州Sutter Instruments公司产品)将激发波长(340nm和380nm)选择性地在细胞上暴露。以每2秒的间隔获得数据，在曝光部位设置按钮，防止给细胞带来光毒性。通过515nm高频区域通过滤波器(long-passfilter)进入的发射荧光(emitter fluorescence light)，经由CCD照相机，通过数字荧光分析器转变成比率值和细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)值。所有影像数据和分析，利用Universal Imaging软件(美国宾夕法尼亚州West Chester公司)而得到。
实施例3：利用电生理学方法测定NMDA受体介导膜电流
利用穿孔膜片钳(perforated patch-clamp)法进行所有细胞的电压钳记录。室温下在海马神经细胞细胞膜和电极间形成千兆欧姆密封，使电流不往外流，然后固定膜电位等待约10分钟后测定细胞膜电流。膜片(パツチ)电极的电阻保持在3～4MΩ，用120葡萄糖酸钾、20 NaCl、2MgCl2、10HEPES、pH＝7.4(单位：mM)将内部溶液充满。
作为仅使一价离子通过细胞膜而通电的溶液，将真菌素(Nystatin)原液(25mg/ml)稀释至浓度为250μg/ml，加入内部溶液中。根据需要，往细胞膜电流测定溶液(单位mM：150 NaCl、5KCl、2CaCl2、10HEPES、10葡萄糖，pH＝7.4)中，加入用于活化NMDA受体的0.001mM甘氨酸，除去Mg2+后使用。细胞膜电压记录利用EPC-9放大器和Pulse/Pulsefit软件(HEKA，德国)测定。
实施例4：利用NMDA受体介导的钙流入检查NMDA受体抑制剂
海马神经细胞中，通过NMDA受体活化的NMDA受体抑制剂筛选方法如实施例2中所说明，使用称为fura-2/AM的钙依赖性染料的Ca2+-成像技术。
每次短期施用NMDA时，NMDA受体活化引起钙流入细胞内。因此，每4～5分钟给实施例1中准备的海马神经细胞施用NMDA 12次或更多次，观察细胞内的钙流入，结果发现，Ca2+保持恒定值且没有出现灵敏度下降。用公知的NMDA受体拮抗剂-D-APV和人参总皂苷成分(GTS)处理海马神经细胞时，Ca2+浓度明显受抑制(图1)，因此用作人参成分的NMDA受体抑制剂的筛选***。
人参的主要皂苷成分中，将10种人参皂苷(人参皂苷-Rb1、-Rb2、Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2)进行一次检索，在没有分离C-20位的异构体的状态下进行检索的结果发现，人参皂苷Rg3的NMDA受体抑制效果远远优于其它的人参皂苷成分(图2a和2b)。
人参皂苷Rg3的NMDA受体抑制效果不仅直接测定钙的流入，还能直接测定NMDA受体介导的电流流入。采用实施例3记载的电生理学全细胞膜片钳方法可以确认(图2d)，IC50浓度为3.8μM并且表现出依赖性(图2c)。
如上所述，图2a～2c的实验对培养海马细胞施用NMDA时(5～10秒)，NMDA活化导致的钙流入可通过Ca2+-成像技术进行测定，除上述Ca2+离子流入以外，NMDA受体活化使NA+离子等流入细胞内，从而形成流入电流，图2d表示人参皂苷Rg3对该流入电流的抑制。图2的结果是人参皂苷Rg3阻断NMDA受体活化时流入的离子等流入，由此表现出抑制作用。除浓度依赖性实验外，其它实验所用的人参皂苷给药量均为10μM。
为了测定神经细胞中由NMDA导致的细胞兴奋毒性所决定的细胞生存率，进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)分析。将进行过一次培养的白鼠海马神经细胞在24孔平板中培养6～14天，然后，将GTS(100μg/ml)和Rg3(10μM)用含有1μM甘氨酸的未添加Mg2+的缓冲液进行1分钟预处理后，将NMDA同时处理10分钟并作为正常培养液进行交换。处理24小时后，将PBS溶解的MTT(1mg/ml)50μl用于进行直接培养的细胞处理，MTT处理4小时后，除去上清液，将被代谢的甲朁溶于100μl二甲亚砜(DMSO)。用自动分光光度计平板读数器(Automatedspectrophotometric plate reader)测定560nm处的吸光度。
通过上述MTT分析法的分析结果证明，NMDA受体拮抗剂——D-APV、人参总皂苷成分(GTS)、人参皂苷Rg3能有效提高对NMDA诱发的神经毒性的细胞存活能力(图3)。
人参中本身存在30多种人参皂苷，但其中的各种成分可在机体内的代谢过程中由其前体物质追加生成(图4)，以上述1次结果为基础，对人胃肠中存在的微生物产生的代谢产物，特别是以红参中特异性存在的成分为中心，补充研究了C-20位(S)构型的纯水合物(纯水化合物)对海马神经细胞NMDA受体的效果。
人参皂苷成分的C-20位(S)构型纯水合物的检查中，利用20(S)-人参皂苷-Rb1、-Rd、-Rg1、-Rg3、-Rh1、-Rh2，20(S)-原人参萜二醇(protopanaxadiol)、20(S)-原人参萜三醇(protopanaxatriol)和化合物K共9种化合物，按照图2a～2c同样的实验方法进行实验。结果表明，其中对NMDA受体活性表现出最好效果的化合物为20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2(图5)。
为了研究20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物的效果，分别将1μM的人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2按1∶1的比例混合后，按照图2a～2c同样的实验方法进行实验。结果如图6所示，上述混合物表现出比各人参皂苷单一成分更好的NMDA受体抑制效果(图6a是从单一细胞获得的结果，图6b表示从各细胞所得的结果和统计类似性(n＞9))。
下述表1比较了人参总皂苷成分(GTS)、C-20位异构体未分离的人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2对NMDA受体介导的钙流入的抑制作用，表示人参皂苷Rg3的C-20位异构体不论是S构型还是R构型，或其混合物，其生物体效能相同，相反，人参皂苷Rh2中，20(S)-构型呈现比混合物更好的效果。
 表1
    浓度 NMDA受体介导[Ca2+]i流入抑制率(％)1
   人参总皂苷含量(GTS)    100μg/ml     62.0±2.1
   人参皂苷Rg3(20(S)-型和20(R)-型的混合物)     1μM     31.2±2.5
   20(S)-人参皂苷Rg3     1μM     30.4±2.3
  人参皂苷Rh2(20(S)-型和20(R)-型的混合物)     10μM     18.6±2.7***
20(S)-人参皂苷Rh2     1μM     47.1±4.3
20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物     1μM     71.9±4.2
1培养的鼠海马神经细胞试验***P＜0.001，由20(S)-人参皂苷Rh2测定的值和比较值1μM时的效果太小，用10μM进行试验。
发明的效果
本发明详细研究了20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及两者混合物对神经细胞的作用机理及其效能，本发明的组合物具有优良的神经毒性抑制或神经细胞保护效果，因此，可以用于治疗脑外伤、脑中风、脑缺血、中风、癫痫、阿耳茨海默病和亨廷顿舞蹈病等。

Claims (4)

1、一种谷氨酸介导神经毒性抑制组合物，该组合物含有选自20(S)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2以及20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物的人参皂苷。
2、按照权利要求1中所述的组合物，其中含有20(S)-人参皂苷Rh2。
3、按照权利要求1中所述的组合物，其中含有20(S)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rh2的混合物。
4、按照权利要求1中所述的组合物，其可用于治疗脑外伤、脑中风、脑缺血、中风、癫痫、阿耳茨海默病或亨廷顿舞蹈病。
CN2003101043063A 2002-10-26 2003-10-24 含有人参皂甙Rg3或人参皂甙Rh2的谷氨酸介导的神经毒性抑制组合物 Expired - Fee Related CN1216607C (zh)

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