CN1496993A - 白蛋白纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种纯化重组白蛋白(rHSA)的方法,该方法包括将含rHSA的发酵液上清经以下层析步骤(a)基于双重功能的可耐受高盐型的阳离子交换;(b)疏水层析(HIC);和(c)阴离子交换。进行纯化。具有双重功能的耐高盐阳离子介质能够使发酵液无需稀释直接上柱进行纯化,由于它的高载量使其使用量与对应情况下所使用的传统阳离子介质相比要少。因而,本发明节约了介质体积和上样体积,降低了操作成本。
Description
技术领域
本发明属于蛋白纯化领域,特别是对人血白蛋白的纯化。本发明使用了一系列层析步骤,可适用于大规模操作的有效纯化。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人血中最丰富的蛋白质,其作用为维持渗透压,结合并运输营养物和代谢物,HSA有很大的药用和科研价值。例如:作为药物治疗因白蛋白损失、合成和失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症。最早获得白蛋白的方法是从血液中纯化。然而这一方法存在一些问题,例如:血源的缺乏,不经济,以及受乙肝病毒、AIDS病毒等物质的污染的可能。为避免这些问题,另一基于重组DNA技术方法生产重组人血清白蛋白(rHSA)的多种方法最近已经得到了开发。即使为数不少的重组方法可以使用,但从发酵液中提纯rHSA仍是至关紧要的且随时有待提高的步骤。
EP 0 612 761公开了一种生产高纯度重组人血清白蛋白的方法,其产品中不含自由的非抗原性杂质。这一方法在特定环境下运用了疏水层析色谱(HIC)及其它步骤如:离子交换色谱,硼酸或硼酸盐处理,超滤及加热处理。然而,这一方法因步骤多而变得太复杂,从而难于满足大规模工业生产的经济要求。
EP 0 570 916也公开了用基因操作技术生产rHSA的方法,该方法包括超滤发酵液上清、加热处理、酸处理和再次超滤,随后使用阳离子交换、疏水层析和阴离子交换以及盐析等一系列步骤。然而,与上述专利存在相似的问题,纯化过程太复杂,因周期长成本高而不能成为大规模生产的有效方法。
EP 0 699 687公开的rHSA纯化方法为:加热细胞培养液以灭活蛋白酶,再经阳离子交换微粒的流化床处理,洗脱液再经超滤、HIC和阴离子交换层析而得到纯rHSA。然而,流化床对设备的要求与常规装填的层析设备不同,因而,仍需更经济有效的方法从发酵液纯化rHSA。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种适合于大规模操作的重组人白蛋白的纯化方法,这可通过以下步骤达到:
含rHSA的发酵液上清:经
(a)具双重功能的耐高盐材料为基质的阳离子交换层析;
(b)疏水层析(HIC);
(c)阴离子交换层析。
本发明方法步骤比前述讨论方法的步骤少。另外,用于(a)步的双重功能的高盐耐受型阳离子交换介质可允许发酵液上清不经稀释直接上样,这一优点因可有效减少上样液总体积从而比前述方法相比成本低。
本发明的另一目的是提高rHSA纯化层析过程的吸附量,可由前述步骤(a)使用的阳离子交换介质完成,这种介质含有高盐型配基(HSL),此配基具有一定的双重性质,它至少包含了与目的物作用的两个位点,一个提供电荷相互作用,一个提供基于氢键和/或疏水的相互作用。
本发明另一个目的是进一步降低终产品的色素含量,以便进一步提高终产品纯度。这一目的可由前述方法中使用弱阴离子交换介质来实现。
本发明内容之一是从一种从溶液纯化重组人血白蛋白(rHSA)的方法,该方法包括将发酵液上清中所含的重组人血白蛋白通过层析步骤:
(a)在具双重功能的高盐介质上的阳离子交换;
(b)疏水层析(HIC);和
(c)阴离子交换。
本发明的一个具体的例子:当进行步骤(a)时,发酵液上清电导高于10mS/cm优化为20,例25-50mS/cm,多数情况在25-30mS/cm之间,因为所用的特殊阳离子交换剂含有高盐(HSL)配基,这完全是可行的。因此,本发明一个最重要的优势就在于它避免发酵液上清的稀释,与前述rHSA纯化方法相比,阳离子交换一步上样量大大减小了。
发酵液上清可以是各种类型不含菌体的发酵液,比如可通过离心去除菌体。因而,本发明方法适用于产生rHSA的任何宿主,例如,微生物细胞、大肠***如大肠杆菌、酵母***如啤酒酵母和毕氏酵母等或动物细胞系。对于毕氏酵母宿主细胞效果更好。制备重组宿主细胞的方法及表达象rHSA这样的蛋白的条件已众所周知,例上述EP0612 761即是涉及该领域的多个专利之一。
步骤(a)的主要目的是消除小分子有色物质如带负电的杂质等。因此,(a)步骤使用了阳离子交换剂,其配基为高盐型配基(HSL),这里,“高盐”是指前文提到的高盐浓度下的耐受性,这是这类离子交换剂的特性。这一特性是由配基的性质决定的,这种特殊配基具有双重功能,即每个配基含有2种与被分离物(这里指rHSA)相互作用的位点。主要结合方式是由带电结合基团提供的,例如离子交换基团提供,因而这种高盐类型的介质仍归为离子类型。次要结合方式是与被分离物质间的其它作用,通常,该结合基团提供氢键或疏水相互作用,但其他作用也有,下文会具体谈到这些作用。在本文,要注意“bimodal”这一术语的意义是指涉及2种或2种以上结合方式,故不仅限定于2种结合方式。在本应用中,阳离子交换剂HSL型被使用,且这种阳离子交换剂已在PCT/EP01/08203详细披露,见PCT/EP01/08203(Amersham Pharmacia BiotechAB)。尽管如此,下文仍然对其做一综述。
阳性高盐配基(HSL)上的带电的结合基团可以从含有如下基团如磺酸(-SO3 -/-SO3 -H)、硫酸(-OSO3 -/-OSO3H)、羧酸(-COO-/-COOH)、磷酸(-OPO3 2 -/-OPO3H-/-OPO3H2)及膦酸(-PO3 2-/-PO3 -H/-PO3H2)的基团中选择。可优选的HSL型阳离子交换剂是弱阳离子交换剂,如pKa大于3的阳离子交换剂。另外可选的情况是:pka<3的强阳离子交换介质。弱阳离子交换剂典型的例子是羧酸(-COO-/-COOH)、磷酸(-OPO3 2-/-OPO3H-/-OPO3H2)和膦酸(-PO3 2-/-PO3H-/-OPO3H2)。
次要结合基团至少含有一个氢键作用原子,并且该原子相距阳离子交换基团有1-7个原子的距离。氢键原子是能够参与形成氢键的原子(H原子除外)见Karger et al.,An Introduction into Separation Science,John Wiley&Sons(1973)42页。氢键原子可以从含杂原子的基团中选择,如氧原子(羰基氧原子、醚氧原子、酯氧原子、羟基氧原子、磺酸基氧原子、磺胺氢原子、亚砜氧原子、芳环上的氧原子等),氮原子(氨基氮原子,芳环氮原子等),硫原子(硫醚硫原子,芳环硫原子等);及sp和sp2-杂化碳原子;和卤族基团,如F、Cl、Br、I,特别是F。典型次要结合基团含有不带电荷的原子或随pH变化可带电荷的原子。
步骤(a)中使用的阳离子交换配基的稳定性,通常认定为可以耐受0.1或1mol/L NaOH水溶液至少40小时。本方法步骤(a)所用阳离子交换剂适用的化学配基结构示例见PCT/EP01/08203。本方法的特殊应用在步骤(a)使用了如图1A所示的高盐型基的阳离子交换配基。
本方法步骤(a)中的阳离子交换剂的功能如下:
(a)在相当于0.3MNaCl离子强度的水溶液中,阳离子交换吸附rHSA
(b)在上述的离子强度下,对于rHSA的载量突破性地达到2倍、3倍、5倍甚至10倍于含丙磺酰基团的对照阳离子交换剂对应情况下的交换量。
PCT/EP01/08203详述了这种对照离子交换剂。本发明所使用的阳离子交换剂中阳离子交换配基的浓度通常在1-4000μmol/ml基质之间,例2-500μmol/ml基质,使用更多的为5-300μmol/ml基质。可能的及优选的配基范围取决于基质的性质、配基的性质等。因此,阳离子交换配基的浓度对琼脂糖基质为100-300,葡聚糖基质为10-600μmol/ml基质。
上文提及的PCT/EP01/08203也对高盐型阳离子交换剂基质材料作了进一步的讨论。简单的说,这种基质可基于有机或无机材料。较好的是具有亲水性的聚合物,并且不溶于水和或多或少在水中可浸润。在这里疏水性聚合物的定义已被衍生为亲水性的。适用的聚合物有多羟基聚合物,例:基于多糖的琼脂糖,葡萄糖,纤维素,淀粉,麦芽糖等,以及全合成聚合物,例:聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羟烷乙烯醚),聚(羟烷丙烯酸酯),和聚甲基丙烯酸酯(如聚甘油甲基丙烯酸酯),聚乙烯乙醇,和以苯乙烯和二乙烯苯为基础的聚体和缩聚物(由两个或更多的上述聚合物的单体形成的物质)。水溶的聚合物,通过例如交联和经吸附或共价连接耦合到一种不溶物质,从而衍生为不溶性的聚合物,在疏水聚合物(如单烯和二乙烯苯的共聚物)上引入亲水基因,可通过含有可转化为-OH基的单体聚合实现,也可通过最终聚合物的亲水化实现,例如:吸附适当的化合物,如亲水聚合物。举一个这种基质的例子:市售可得的球型Sepharose,是瑞典乌普萨拉市安玛西亚公司生产的以琼脂糖为基质的介质,可用做支撑基质的无机物如硅胶,氧化锆,石墨,氧化钽等。
上文提到的PCT/EP01/08203也进一步公开了高盐型阳离子交换剂制备。而且,Hermanzon,G.T.,Mallia,A.K.&Smith,P.K.,(Eds.),Immobilisation AffinityLigand Techniqucs,Academic Press,INC,1992综述了基质表面固定配基的方法。
如上所述,高盐型阳离子交换剂的优点之一是与传统阳离子交换剂,如上文讨论的作为参照的丙磺酰阳离子交换剂相比,在较高的离子强度下,有可能通过例如配基对rHSA的结合被柱吸收。吸附应用的离子强度取决于蛋白本身的性质和基质上配基的类型和浓度。对应NaCl在纯水中的浓度,使用的离子强度经常≥0.1M,如≥0.3M甚至≥0.5M。解析操作时可以如通过增加离子强度或/和改变pH来进行。用于改变离子强度的典型的盐有:可溶性铵盐或磷酸\硫酸的金属盐等,特别是碱金属和/或碱土金属盐。同样的盐也可用于吸附步骤,但经常在较低浓度下使用。
本方法的一个具体应用,步骤(a)中使用的阳离子交换剂的数量为步骤(b)使用HIC介质的数量的一半。因而,与传统试剂相比的一个优点就是具双重功能的离子交换介质非常强的结合能力,故而可以减小样品处理量进而降低操作成本。在高盐浓度,如电导25-30mS/cm市售可得的SP Sephrose对rHSA的吸附量约2-4mg/ml胶,而使用高盐型介质(图1A),至少可达50mg/ml,因而,双功能高盐配基(HSL)显然大大简化并改进了纯化工艺,从而降低了大规模操作时的成本。
本方法的一个具体过程包括步骤(a)前对发酵液上清加热处理,加热处理可在宿主细胞存在时或经离心、超滤(离心)或其他合适的方法去掉宿主细胞后直接进行,加热温度可达50-100℃,时间1到几小时,优选60-75℃,20分到3小时,更优的为68℃约30min。这一加热过程可在有温控的水浴锅中很方便的完成。另一应用,在加热前,调pH6.0加入稳定剂,例如辛酸钠,其它稳定剂如乙酰色氨酸、有机羧酸等也可以。加热后,调低发酵液上清的pH值如pH4.5以有利于被后续阳离子交换剂吸附。
本发明的另一例子,从步骤(a)得到的产品,例如高盐介质的结合组分,在进入步骤(b)前进行热处理。优选加入一种还原剂,如半胱氨酸,其他可用的还原剂如巯基乙醇、还原型谷胱甘肽等,其目的有助于在步骤(b)中有色物质的去除。这一加热处理通常可按前述方法进行,优选低一点的温度如60℃和较长的加热时间如60分钟。
如上所述,步骤(b)使用了疏水作用色谱(HIC)。这一步的主要目的是除去rHSA产品中的蛋白降解物,这些降解物分子量通常在10-50Kda。HIC是众所周知的色谱技术,其分离基于蛋白表面疏水性的差异。许多被认为是亲水性的生物大分子,仍然有足够多的疏水基团暴露在外面,使其与连接于色谱基质的疏水基团相互作用。例如在专利EP0699687中,HIC早被建议用于rHSA的纯化。与其他已知的分离原理疏水作用色谱如反相色谱相比,使用的配基浓度低得多。这一特点提高了其选择性,并且可使用温和的洗脱条件以助于保持目的蛋白的生物活性。在本文,HIC用于吸附上述的rHSA的降解片段,而全长的rHSA在未结合部分被洗脱。rHSA与介质疏水基团的疏水作用强度可通过小幅度提高所使用的缓冲液的离子强度而得以加强。目前有许多市售可得的HIC介质,本发明不限定任何特定的基质和/或配基。总之,步骤(b)所用基质可为有机和无机材料,有机材料例如可为天然聚合物如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉等或合成聚合物,如二乙烯苯、苯乙烯。无机材料中硅胶是众所周知的广泛使用的一种。较优的基质是交联琼脂糖,有多家公司在出售这种基质,如安玛西亚公司(瑞典、乌普萨拉市)出售的SepharoseTM。一个具体例子,步骤(b)所使用的与rHSA有一个或多个作用位点的疏水介质,优选自含有苯基、丁基、如正丁基、辛基、如正辛基等的基团,优选以琼脂糖为基质的,另一方面,以二乙烯苯为基质的疏水性配基有:醚、异丙基或苯基,如安玛西亚公司(瑞典、乌普萨拉市)的SourceTM。步骤(b)最尤为应用交联琼脂糖连结苯基配基,介质最好为中空微球,其含水量可达90%以上,最好可到94%左右,湿球的平均粒度例如可在10-150μm之间,优选为小于100μm如90μm左右。介质的配基浓度例如在20-60之间,例如40μmol/ml胶左右。作为特例,所用介质为PhenylSepharose 6FF TM(瑞典乌普萨拉市安玛西亚公司生产)。在这一例中,Fast Flow介质的交联度被优化过,使在1bar压力下通过15厘米高度的流化床运行时,典型流速达300-400cm/hr。但是在这一领域的熟练技术人员可根据操作的范围调整运行参数。这步纯化可以在pH4-8如6.5-7,盐浓度0.01-0.5M,优化为0.05-0.2之间进行。
也如上所述,当前方法步骤(c)使用阴离子交换介质,优化为弱阴离子交换介质,去除步骤(b)中痕量的杂质,尤其是如小分子片断类的多余杂质。本发明可以使用任何专一性的阴离子材料,只要它有足够量的配基,能够结合rHSA终产品中多余的负电荷组份。阴离子层析交换步骤可在例如pH5-8,盐浓度0.01-0.2M条件下去除杂质。至于介质的材料,可为有机或无机材料,如同上面讨论的那样。举一优化的例子,介质由琼脂糖交联成的中空小球组成,如安玛西亚公司(瑞典乌普萨拉市)的SepharoseTM产品。所连的配基是弱阴离子交换,配基上的结合基团例如可为一级和二级胺。这样的结合基团可以和最靠近基质的醚例如通过烷基链连在基质上。文献报道了可通过间臂、分支等多种方式连到基质上。如上所述,本发明不受任何特别结构的限制。具体的示例有-O-CH2CH2-N+(C2H5)2H配基的琼脂糖,如来自于安玛西亚公司的DEAESepharoseTM可以使用,在具体使用中层析柱的结合和未结合部分均有rHSA,DEAE在某些方面的使用中,还是令人满意的。然而一种使终产品更纯的例子是包含两个酯基,最优的还有两个羟基作为配基的琼脂糖。然后结合基团最好是伯胺。采用它纯化的优点在于rHSA只在结合部分出现,这归于rHSA能够与介质适度结合,从而导致更好地提高纯度,也便于操作。对后提及示例的通用的分子式说明见图1,而本发明中,步骤(c)使用了一种方法,此方法使用结构类似的介质,这一点也是可以理解的。
然而,本发明包括使用与上述相似的介质,即建立在一般配基结构基础上的介质,这一点也是可以理解的。在图1A中“Gel”可被理解任意介质,如与步骤(b)相关的在上述讨论提及的。包含上述配基的一个市售可得的例子是ButylSephorose(瑞典乌普萨拉安玛西亚生物科学公司)。在下述的实验中,用到160μmol/ml的配基浓度。因而很显然优化基质的配基浓度可获得极好的结果。当使用最先提到的阴离子介质如DEAE,接峰体积大约是最后提及的BUTYL介质的3倍。因而当前方法优选使用仲胺作为步骤(c)阴离子交换基团,配基浓度至少约为100μmol/ml。
具体体现,阴离子配基浓度在50-300范围内,如50-200优选大约在160μmol/ml。优点是在步骤(c)中纯rHSA可以在结合部分分离出来。而DEAE在结合与未结合部分均存在纯rHSA。
由于这三步纯化建立在间歇洗脱基础上,因此适于大规模操作,在步骤(c)中使用了高配基的butylSepharose,能够有效去除未结合部分的小分子杂质,同时也比用DEAE型的介质能更好地降低A350/A280的比值。
附图说明
图1A-D表明了适用于不同层析步骤(即阳离子交换、疏水相互作用、阴离子交换)可能的基质物质。更为具体的,图1A表明了高盐阳离子配基(HSL)类型,图1B表明基质名为Phenyl Sepharose的层析介质的疏水作用,图1C和1D表明了两种可供选择的阴离子交换介质一即市售可得的DEAE Sepharose的结构(图1C当n=0时)和修饰过的Butyl Sepharose,该介质的配基浓度提高了。以下会有描述。
图2表明的是本发明步骤(a)使用了未稀释的发酵液上清所得到的阳离子交换层析结果,2B组分含有rHSA,如在阳离子交换柱上,未经稀释的147ml发酵上清液进入20ml的柱子内,该介质的配基结构在图1A已提及。峰2B包含着rHSA,可以与代表着杂质部分的峰2A明显分离开。
图3表明图2中组分2B在疏水层析的结果,其中rHSA在组分3A中被洗脱出来。具体为:图2的2B部分在此通过40Phenyl Sepharose柱由疏水作用进行分离,图中的A部分是目标峰。其中疏水介质的结构在图1B中已阐述。
图4表明图3中组分3A在阴离子交换层析中结果。纯rHSA在组分4B中。例如阴离子交换具体为图3中的峰3A部分进入40ml的修饰过的如以下实验部分所述的BUTYL Sepharose柱进行分离,纯rHSA分布在峰4B部分。
图5为使用本发明三步纯化所得主要组分的电泳分析,即Native(8%~25%)和SDS-PAGE(10~15%)电泳分析结果。所展示的Native电泳,每个点上样量大约3.3ug蛋白,采用银染。而SDS-PAGE电泳,有一块每个点上样量约为2ug,银染;另一块每个点上样量约为10ug,考玛斯亮蓝染色。样品顺序为:1发酵上清2高盐阳离子未结合部分3高盐阳离子的结合部分4疏水未结合5疏水结合6修饰BUTYL柱未结合7修饰BUTYL柱结合8作为参照的血源白蛋白箭头指示rHSA位置。
实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
材料和方法:
含rHSA的发酵液上清由基因构建的酵母***进行两周左右或更长时间的发酵,然后过滤所得。绿色的发酵上清分装成200ml一份,冷冻储存在-20℃待用。发酵液上清质量通过凝胶过滤柱Superdex TM 200 HR 10/30(瑞典乌普萨拉安玛西亚公司生产)进行检测,分析结果显示了发酵液上清中的高分子和低分子杂质以及相应的白蛋白单体的相对量。
辛酸钠(八碳酸钠盐)和L-半胱氨酸由Sigma化学公司购进。色谱纯的血源白蛋白是瑞典乌普萨拉安玛西亚公司的血液品制备室I.Andersson赞助提供。各种样品的蛋白浓度用Bio-Rad蛋白分析仪(也称Bradford方法)测定,用牛血清白蛋白(BSA)建立曲线标准。紫外吸收值用日本岛津公司UV-160A。其他所有化学品均为分析或试剂级。
电泳分析用快速电泳***和适当的电泳胶和胶条(均由瑞典乌普萨拉安玛西亚公司提供)。电泳分析按照生产厂家的建议,Native-PAGE使用8-25%的梯度胶,SDS-PAGE(非还原)使用10-15%的梯度胶。每个点的上样量为:Native电泳每个点上样量约3.3ug蛋白,采用银染;SDS-PAGE电泳,有一块每个点上样量约为2ug,也采用银染。SDS处理的另一块每个点上样量约为10ug,采用考玛斯亮蓝染色(CBB)。
质谱分析(目的在于确定纯rHSA和血源HSA的分子量)由瑞典乌普萨拉安玛西亚公司的J.Flensburg博士用MALDI-TOF仪器进行。天然和重组白蛋白的胰酶裂解肽图也是用该仪器。从后面的分析结果确定重组白蛋白的最可能一级序列,并和已知的由纯血源白蛋白产生的胰酶的肽图进行比较。
介质和层析***
层析分离实验用AKTATM Explore 100***通过UNICORETM(3.1版本)软件控制,在室温约23℃下进行(由瑞典乌普萨拉安玛西亚公司提供)。步骤(b)使用的分离介质是Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow(高取代),是瑞典乌普萨拉安玛西亚公司的正规产品。步骤(c),使用市售可得的DEAE SepharoseTMFast Flow或在Butyl SepharoseTM6 Fast Flow基础上改进的介质,该介质与商业化产品配基浓度20-40μmol/ml胶相比有较高的配基浓度(批号为U238025配基浓度为160μmol/ml),此改进的介质称之为:“改进Butyl Sepharose”。而且步骤(a)使用了高盐型阳离子phototype交换介质,见图1A。介质在20%乙醇中的稠状悬浮液装入XK26/20的玻璃柱内,柱床体积40ml。使用300cm/h的线性流速,以2倍柱床体积的去离子水冲洗大部分乙醇,然后在上样之前用合适的缓冲液平衡。每步层析所需缓冲液的总量随介质不同而变化,见下面的表1。
缓冲液
缓冲液A:25mM的醋酸钠,pH4.5
配制:25ml的1M的醋酸钠与40ml的1M的醋酸混合,用去离子水稀释至1L。室温下电导约为2mS/cm(室温RT表示)。
缓冲液B:50mM磷酸钠,0.1M氯化钠,10mM的辛酸钠,pH7.0
配制:155ml的0.2M磷酸氢二钠和95ml的0.2M磷酸二氢钠混合,加入5.8g的氯化钠及1.66g的辛酸钠,用去离子水稀释至1L。室温下电导约为16mS/cm。
缓冲液C:50mM磷酸钠,0.1M氯化钠,pH6.0。
配制:212ml的0.2M磷酸二氢钠和38ml的0.2M磷酸氢二钠混合,加入5.8g的氯化钠,用去离子水稀释至1L。室温下电导约为14mS/cm。
缓冲液D:50mM磷酸钠,0.2M氯化钠,pH6.0
配制:212ml的0.2M磷酸二氢钠和38mL的0.2M磷酸氢二钠混合,加入11.7g的氯化钠,用去离子水稀释至1L。室温下电导约为22mS/cm。
溶液E:在位清洗溶液
30%异丙醇溶于1M氢氧化钠中。
本发明对每种介质优化后的条件汇总如表1。本领域的技术人员按上述步骤可很容易地进行中试或大规模生产的操作。
表1:每一层析步骤所需的平衡、洗脱、再生溶液的体积/柱体积
介质名称 | 平衡条件 | 洗涤条件 | 洗脱条件 | 再生 | 水洗量 |
高盐阳离子 | 4〔A〕 | 3〔A〕 | 5〔B〕 | 2〔E〕 | 4 |
疏水介质 | 3〔C〕 | 2〔C〕 | 2〔*〕 | 2〔E〕 | 4 |
DEAE介质 | 5〔C〕 | 6〔C〕 | 2〔**〕 | 2〔E〕 | 4 |
改进的Butyl介质 | 6〔C〕 | 2〔C〕 | 5〔D〕 | 4 |
*表示去离子水
**表示2M的氯化钠
实施例1:对发酵液上清热处理
在进行阳离子层析前,首先需要加热发酵上清液以灭活在P.pastoris.发酵过程产生的蛋白酶。过程如下:
解冻发酵液上清,加入10mM辛酸钠溶解,pH调至6.0,水浴加热30分钟(水浴温度用热电藕恒温控制在68℃)。样品冷却到室温,调pH至4.5。
如果步骤(a)使用传统的阳离子交换介质如SP Sepharose BB,则要根据样品的电导将样品用去离子水稀释2-8倍,使样品电导处于5-10mS/cm之间。(相当于0.1M的盐浓度)。
然而,本发明的高盐型介质对高盐样品具有更高的耐受性,只要电导低于30mS/cm,样品无需稀释可直接用于步骤(a)中.
由步骤(a)得到部分纯化的rHSA(如高盐型介质的结合部分),在进入步骤(b)之前仍然需要如下的热处理:即用1M氢氧化钠将样品的pH调至6.0,加入半胱氨酸至5mM作为还原剂。样品在60℃水浴加热60分钟。这样处理的目的是便于通过疏水层析去除色素杂质。
实施例2:步骤(a):使用阳离子交换介质捕获样品
阳离子交换介质装入XK16/20的柱内(柱床体积20ml),用2倍柱床体积缓冲液A平衡。加热处理过的样品用150ml的SuperloopTM(由瑞典乌普萨拉安玛西亚公司生产)以300ml/h流速进入柱内。上样总量约1g(如50mg rHSA/ml胶)。上样结束用3倍柱床体积的缓冲液A洗脱未结合部分,然后用5倍柱床体积的缓冲液B洗脱。这两部分分别收取,结合部分用1M/L氢氧化钠将样品的pH调至6.0,如上述进行加热,冷却到室温,通过疏水柱根据下述方法进一步纯化。所收集的每一部分均留1ml的分析小样(如检测蛋白浓度,A350/A280值和电泳分析)
再生处理:使用后的柱子通入2倍柱床体积的的溶液E以便清洗结合更为牢固的物质以恢复介质的功能。介质可以在该溶液中过夜,然后用4倍柱床体积的去离子水洗去大部分氢氧化钠和异丙醇。再生后的柱子在下一次进行吸附/解吸过程前用4倍柱床体积的缓冲液A平衡。
实施例3:步骤(b):利用疏水层析纯化步骤
将上步得到的包含了rHSA的部分液体注入到150ml Superloop TM中,然后进入柱床体积40ml填充了pheylSepharoseTM Fast Flow(高取代)的XK26/20疏水柱进行分离。该柱使用前需用3倍柱体积的缓冲液C平衡,上样结束后,用2倍柱体积的缓冲液C洗涤,来洗脱含有了rHSA的部分,结合部分(主要含有rHSA降解产生的45Kda的杂蛋白)通入2倍柱体积的去离子水沈脱下来。
再生处理:与实施例2相同。
实施例4:步骤(c):使用弱阴离子交换介质精制样品
疏水分离的两部分分别收集后,各留1ml小样做各种分析(如上所述)。用DEAE SepharoseTM Fast Flow或上述提到的改进的Butyl SepharoseTM6 FastFlow介质装一根40ml的XK26/20柱。用2倍柱体积的去离子水洗涤柱子然后用5倍柱体积的缓冲液C平衡,疏水分离的未结合部分注入到150ml SuperloopTM中然后进入两根柱之一进行分离。对DEAE柱未结合部分需用6倍柱体积缓冲液C洗涤,结合部分用2倍柱体积的2M氯化钠洗脱,对改进的Butyl柱未结合部分需用2倍柱体积缓冲液C洗涤,结合部分需用5倍柱体积的缓冲液D洗脱。流速始终保持在90cm/h。
再生处理:与实施例2相同。
Claims (10)
1.一种纯化人重组白蛋白(rHSA)的方法,该方法包括将含rHSA的发酵液上清经以下层析步骤:
(a)基于双重功能的可耐受高盐型的阳离子交换;
(b)疏水层析(HIC);和
(c)阴离子交换。
2.根据权利要求1所述的方法,其中应用于步骤(a)的上柱发酵液上清的电导高于10mS/cm,优化为高于20mS/cm,如25-50mS/cm。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所涉及的双功能的阳离子交换介质是通过电荷作用和氢键和/或者疏水作用与rHSA相互作用。
4.根据前面任一权利要求所述的方法,其中在进入步骤(a)前的发酵液上清进行热处理。
5.根据前面任一权利要求所述的方法,其中也包括步骤(b)前的在还原剂存在下对样品进行热处理。
6.根据前面任一权利要求所述的方法,其中步骤(b)所使用的含有苯基、脂肪族和/或杂环为配基的疏水层析介质。
7.根据前面任一权利要求所述的方法,其中步骤(a)所使用阳离子交换介质的量是步骤(b)疏水介质的使用量的一半。
8.根据前面任一权利要求所述的方法,其中步骤(c)是弱阴离子交换。
9.根据前面任一权利要求所述的方法,其中步骤(c)弱阴离子交换介质的配基浓度每毫升胶大于50μmol/ml,更优大于100μmol/ml,最优为160μmol/ml。
10.根据权利要求9所述的方法,其中纯rHSA只能从步骤(c)的结合部分得到。
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